Instituto de Biociências
Análise de SNPs nos genes
SLC6A3 e DRD2 em portadores de
gagueira desenvolvimental
persistente do Estado de São Paulo
Bianca Santos Domingues
Orientador: Prof. Dr. Danilo Moretti-Ferreira
Co-orientador: Msc. Carlos Eduardo Frigério Domingues
Monografia apresentada ao Departamento de Genética do Instituto de Biociências de Botucatu - UNESP, dentre os requisitos para obtenção do título de Bacharel em Ciências Biomédicas.
Botucatu–SP
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE
Domingues, Bianca Santos.
Análise de SNPs nos genes SLC6A3 e DRD2 em portadores de gagueira desenvolvimental persistente do Estado de São Paulo / Bianca Santos Domingues. - Botucatu, 2010
Trabalho de conclusão de curso (bacharelado - Ciências Biomédicas) - Instituto de Biociências de Botucatu, Universidade Estadual Paulista, 2010
Orientador: Danilo Moretti-Ferreira
Co-Orientador: Carlos Eduardo Frigério Domingues Capes: 20205007
1. Distúrbios da fala. 2. Gagueira. 3. São Paulo (Estado).
Palavras-chave: Gagueira desenvolvimental; Gene SLC6A3; Gene DRD2; SNPs; PCR em tempo real.
Agradecimentos
À Universidade Estadual Júlio Mesquita Filho –UNESP- Campus Botucatu e de todo o corpo docente e funcionários pelo aprendizado e infra-estrutura concedidos.
Ao Instituto de Biociências de Botucatu, sua direção, corpo docente e funcionários.
Ao Departamento de Genética por disponibilizar toda sua estrutura para a realização desse trabalho.
Ao Serviço de Aconselhamento Genético–SAG e todos os seus funcionários.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo–FAPESP- pela Bolsa de Iniciação Científica no período no período de abril de 2010 à dezembro de 2010 (Ref. Proc. 2010/00501-1).
Ao Prof. Danilo Moretti-Ferreira, pela orientação, ensinamentos e auxílio.
Às famílias e controles integrantes deste estudo pela disponibilidade e compreensão da importância do mesmo para outras famílias afetadas.
Agradecimentos Especiais
Aos meus pais, Hoover Domingues Júnior e Eliana Santos Domingues, que abdicaram de tantas coisas para me fazerem feliz e proporcionar um futuro de grande sucesso. À eles que sempre me apoiaram não importando minha escolha, me deram forças para continuar quando eu achava que não conseguiria mais prosseguir e acreditaram em mim mesmo em momentos que eu não acreditava.
Aos meus avôs que me apoiaram e rezavam para que eu conseguisse tudo que desejei.
As minhas amigas, Fernanda Yamamoto, Isabela Romani e Thaís Isabela, que conviveram comigo nestes quatro anos de faculdade fazendo com que mesmo os momentos de mais difíceis ficassem suportáveis. À elas eu agradeço por terem me proporcionado alguns dos melhores momentos da minha vida.
À minha vizinha e caloura, Niele, que se mostrou uma ótima amiga, me consolando ou dando bronca quando achava necessário, mas, acima de tudo, me defendendo quando fosse preciso.
Ao meu co-orientador, Carlos Eduardo, pela paciência e tempo despendidos para me ensinar o cotidiano de um laboratório de genética molecular, além de proporcionar uma amizade sincera.
Aos meus colegas de SAG, Gustavo Henrique Vieira, Bruno Gamba, Breila V. de Oliveira, Deise Helena de Souza e Rosana Bicudo.
“Sonhe com aquilo que você quer ser, porque você possui apenas uma vida e nela só se tem uma chance de fazer aquilo que quer. Tenha felicidade bastante para fazê-la doce. Dificuldades para fazê-la forte. Tristeza para fazê-la humana. E esperança suficiente para fazê-la feliz. As pessoas mais felizes não tem as melhores coisas.
Elas sabem fazer o melhor das oportunidades que aparecem em seus caminhos. A felicidade aparece para aqueles que choram. Para aqueles que se machucam Para aqueles que buscam e tentam sempre. E para aqueles que reconhecem a importância das pessoas que passaram por suas vidas.”
Índice
1. INTRODUÇÃO...7 1.1. Definição...7 1.2. Classificação...8 1.3. Prevalência...10 1.4. Diagnóstico...10 1.5. Etiologia da doença...111.6. Aspectos biológicos da gagueira...13
2. JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS...17
3. MATERIAL E MÉTODOS...17
3.1. Casuística...17
3.1.1.Critérios fonoaudiológicos de inclusão...18
3.1.2.Critérios fonoaudiológicos de exclusão...18
3.1.3.Diagnóstico de gagueira e seleção...19
3.2. Aspectos éticos...19
3.3. Coleta e purificação de material biológico...20
3.4. Análise Molecular...21 4. RESULTADOS...25 4.1. Grupo amostral...25 4.2. Genotipagem...26 4.3. Análise Estatística...29 5. DISCUSSÃO...29 6. CONCLUSÃO...33 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...34 8. ANEXOS...42
8.1. Aprovação do comitê de ética...42
8.2.Termo de Consentimento Livre e Esclarecido...43
1. INTRODUÇÃO
1.1. DefiniçãoA linguagem é todo e qualquer sistema de signos que serve como meio de comunicação de idéias ou sentimentos através de sinais convencionados, podendo ser percebida pelos diversos órgãos dos sentidos (Almeida, 2005). Quando ocorrem dificuldades nos processos de aquisição e desenvolvimento da linguagem oral, podem ocorrer vários distúrbios e, entre eles, encontram-se os relacionados com a fluência (Duarte et al., 2009).
Fluência é o aspecto da produção da fala que se refere a continuidade, suavidade, velocidade e/ou esforço com as quais as unidades fonológicas, lexicais, morfológicas e /ou sintáticas da linguagem são faladas (Andrade et al., 2001). A disfluência é a fala espontânea que apresenta-se com pausas, prolongamentos, repetições, substituições, deleções e inserções (Moniz et al., 2010).
Todos os indivíduos apresentam incertezas linguísticas devido a formulação de frases (Perkins, 1990) caracterizando os momentos de disfluências típicas (Yairi et al., 1992a; Bloodstein, 1995), no entanto existem também as repetição ao nível de fonema; alongamento de sons; bloqueios na fonação; pausas silenciosas que caracterizam as disfluências atípicas relacionadas ao comportamento dos indivíduos gagos (Yairi et al., 1992a).
A gagueira é o mais comum e conhecido dos distúrbios da comunicação relacionados a fluência. Segundo a Classificação Internacional de Doenças (Organização Mundial de Saúde/CID-10) e o Manual Diagnóstico e Estatísco de Doenças Mentais (DSM-IV,1994) a gagueira é definida como sendo “a fala que é caracterizada pela frequência de repetições ou prolongamentos de sons, palavras ou sílabas, ou pela frequência de hesitações ou pausas que interrompem o ritmo normal
da fala”, bem como pela perturbação na fluência e padrão de tempo normal da fala influenciando no rendimento escolar, profissional e/ou na comunicação social.
Os indivíduos gagos também podem apresentar determinados comportamentos, chamados de “acessórios”, “secundários” ou “compensatórios”, que envolvem um grupo de reações, estratégias, truques, comportamentos de evitação ou fuga que são usados quando se gaguejam ou em antecipação ou medo de gaguejar (Andrade et al., 2001). O surgimento de comportamentos como o medo e ansiedade podem estar relacionados diretamente à incorporação da idéia de um distúrbio na fala (Bloodstein, 1995), o que ocasionaria frustração em decorrência do tempo excessivo e dos esforços dispensados na fala disfluente, embaraço, vergonha, culpa e até mesmo hostilidade para com os companheiros de conversa seguidos aos episódios de gagueira (Van Riper, 1982).
1.2. Classificação
Segundo Andrade et al. (2001) a gagueira pode ser classificada em três tipos de acordo com sua origem: a) neurogênica, que é iniciada ou mantida como um resultado de injúria ou lesão neurológica específica e identificável (Helm-Estabrooks, 1993); b) psicogênica, refere-se a gagueira que é sintoma principal de alguma forma de psicopatologia verificável (Roth et al., 1989); c) desenvolvimental, que é iniciada durante o desenvolvimento cerebral dos indivíduos (0 à 18 anos) sem causas neurogênicas ou psicogênicas associadas.
Quanto à gagueira desenvolvimental, esta foi subdividida por Yairi et al. (1996b) dependendo do número de indivíduos afetados em uma família, em: familial, presente em dois ou mais indivíduos da mesma família; ou isolada, apenas um caso isolado da afecção na família. Além disso, ainda podem ser subdividida, quanto ao
tempo de instauração da afecção: persistente, quando o indivíduo continua a apresentar gagueira 36 meses ou mais após a instauração; recuperação tardia, quando o indivíduo apresenta recuperação entre 18 e 36 meses após sua instauração; e recuperação precoce, quando o indivíduo apresenta recuperação antes de 18 meses após sua instauração. O organograma abaixo (figura 01) representa esquematicamente todo o processo de classificação da gagueira.
Gagueira
Neurogênica Psicogênica Desenvolvimental
Familial
Persistente Recuperaçãotardia Recuperaçãoprecoce
Isolada
Persistente Recuperaçãotardia Recuperaçãoprecoce
Figura 01. Organograma de classificações da gagueira segundo Andrade et al.(2001) e Yairi et
al. (1996b).
Desta forma, nossos estudos têm como alvo a gagueira desenvolvimental persistente familial, que diferentemente das outras, ocorre à partir dos 6 anos de idade (Bloodstein 1995), na fase de formação de palavras ou frases longas e sintaticamente complexas (Karniol 1995; Natke et al, 2002) e de incorporação da idéia de disfluência na fala fazendo com que nesse período se tornem mais pronunciados os sintomas secundários (Ringo et al., 1995).
1.3. Prevalência
A gagueira desenvolvimental persistente familial pode ocorrer em pessoas de todas as etnias, nacionalidades e classes sociais. Acomete 5% das crianças com média de idade entre os 4 anos, com maior prevalência do sexo masculino (2H:1M) (Yairi et al., 1992b).
Os casos de recuperação espontânea implicam em uma redução da incidência entre os adultos afetados à uma taxa que pode variar de 0,75% a 1% (Buchel et al., 2004), a qual ocorre em crianças antes dos 6 anos, principalmente, em indivíduos do sexo feminino (Ambrose et al.,1997) (4H:1M) (Yairi et al.,1996a; Drayna et al.,1999).
Tendo em vista as frequências de ocorrência da afecção na população mundial estima-se que a prevalência da doença seja de 2,1%, 2,8% em crianças de 2 à 5 anos e 3,4% em crianças de 6 à 10 anos (Craig et al., 2002). Entretanto, o grau de parentesco é um fator que pode alterá-la: 18% em irmãos do mesmo sexo (Andrews,1983) e 41,5% em parentes de primeiro grau (Lewis et al., 1993; Tallal et al.,1989;Tomblin,1989).
1.4. Diagnóstico
Baseando-se no Manual de Diagnóstico e Estatística das Pertubações Mentais (DSM-IV) (1994), os critérios para o diagnóstico da gagueira desenvolvimental persistente são:
x Pertubação na fluência e padrão de tempo normal da fala ;
x Pertubação na fluência interferindo no rendimento escolar e profissional ou na comunicação social;
x Presença de um déficit motor da fala, sensorial, as dificuldades na fala excedem aquelas habitualmente associadas com estes problemas.
1.5. Etiologia da doença
A gagueira é considerada um distúrbio de caráter multifatorial que sofre influência de fatores biológicos e ambientais (Andrade et al., 2001). Como fator ambiental podemos destacar o emocional que pode afetar o desenvolvimento da afecção ou sua severidade por meio de fatores pessoais e conflitos familiares (Brito Pereira, 2002).
Dentre os fatores biológicos, os únicos que podem apresentar significância quanto ao desenvolvimento da doença são: o histórico pré-natal, médico, de desenvolvimento, lingaguem e genético (Cox et al., 1984; Buchel et al., 2004; Felsenfeld et al., 2000). Apesar da contribuição genética para a gagueira não estar totalmente esclarecida, têm-se referência à sua importância pelos estudos com gêmeos monozigóticos e dizígóticos, estudos de adoção e o número de casos de gagueira encaminhados as clínicas fonoaudiólogicas com quadros severos e histórico familiar positivo para esta disfluência (Drayna, 1999).
1.5.1. Fatores genéticos
Diversos indicativos tem demonstrado uma possível relação de causalidade entre a existência de fatores genéticos predisponentes e a manifestação da gagueira (Yairi, 1998).
Entre os principais argumentos que fundamentam os fatores genéticos na gagueira, são citados: 1) maior concordância entre gêmeos monozigóticos (62,5% a 90%) que em gêmeos dizigóticos (6,6% a 9%) (Howie, 1981; Felsenfeld et al., 2000; Ooki et al., 2005; Dworzynski et al. , 2007), 2) a gagueira, é mais propensa a se desenvolver em indivíduos consangüíneos do que nos casos em que os indivíduos afetados não tenham essa relação (Andrews et al. 1991; Felsenfeld & Plomin, 1997, Felsenfeld et al., 2000) 3) a similaridade da característica fenotípica desenvolvida
entre gagos, como repetições, prolongamentos de sons e sílabas de palavras sem estarem ligadas a diferenças de língua e cultura (Bloodstein, 1995, Wingate, 1964; Felsenfeld e Plomin, 1997; Bloodstein, 1981) .
A busca de genes que influenciem características complexas tem sido muito mais desafiadora do que os estudos genéticos de traços mendelianos (Botstein & Risch, 2003). Existem vários fatores que contribuem para este problema, incluindo a heterogeneidade etiológica e genética e, a necessidade de modelos genéticos complexos com muitas variáveis para efeitos de lócus, interações gene e gene-ambiente, o que justifica o uso de diversos métodos estatísticos. Um método adequado de análise genética para a gagueira exige, uma combinação de passos para a identificação de regiões cromossômicas, nas quais residem variações genéticas e que caracterizam a etiologia complexa desta afecção (Wittke-Thompson, 2007).
O fato da contribuição genética para a gagueira não estar totalmente esclarecido torna o conhecimento sobre sua etiologia complexo. No entanto o modelo mais aceito é aquele em que um gene principal promove a susceptibilidade à doença, e outros fatores (biológicos e ambientais) regulariam-no, o que explicaria, ao menos em parte, as formas variáveis de gagueira: moderada e severa, bem como de sua recuperação espontânea ou não (Yairi, 1998 e 1999), porém sem explicar as formas de herança (Kidd,1977).
Viswanath et al. (2004) ao analisarem a segregação em 56 famílias com gagueira persistente, firmaram a possibilidade da existência de um gene principal com transmissão mendeliana dominante e salientaram que neste modelo a penetrância desse gene dependeria do sexo e da existência ou não, de parentes gagos. Contradizendo seus antecessores, Alm et al. (2006) sugeriram que talvez não existisse um único modelo de transmissão, mas sim vários deles, mais frequentes para cada população.
Devido à possibilidade de existirem várias formas de susceptibilidade à doença, variáveis para cada população, e sendo a população do Estado de São Paulo miscigenada devido a uma história de continuas imigrações para o nosso país, torna a abordagem da gagueira, quanto aos aspectos genéticos, significativamente relevante, ao ponto de estabelecer-se como um marco comparativo em relação à outras populações no estudo dessa doença complexa.
1.6. Aspectos biológicos da gagueira
Na literatura não há casos de gagueira relacionados a alterações em estruturas como: nariz; boca; faringe; e laringe, devido a tradução de uma proteína anômala, causando a gagueira (Yaruss et al., 2003), no entanto em dezenas de estudos de neuroimagem se observaram alterações estruturais e funcionais em indivíduos gagos, não verificadas em pessoas fluentes (Foundas et al., 2001; Sommer et al., 2002).
Estudos de dosagens bioquímicas, tais como: variações nas concentrações de cálcio; prolactina; estrógeno; e estudos dos receptores e transportadores dopaminérgicos, bem como lesões neurológicas e dos níveis de ansiedade tem sido relacionadas como possíveis fatores biológicos colaboradores no surgimento e/ou agravamento da afecção (Wu et al., 1997; Maguire et al., 2004; Alm et al.,2006; Lan et al., 2009).
As diferenças neurais entre indivíduos fluentes e disfluentes, tem sido estudadas por meio de exames de eletroencefalograma (EEG), Tomografia por Emissão de Positron (PETscan), Ressonância Magnética com Imagem Funcional (fMRI) e Tensor de Difusão de Imagem (DTI), os quais têm embasado as teorias fisiopatológicas em relação a gagueira.
Dentre as hipóteses, a de maior impacto no mundo científico é em relação a dominância hemisférica direita presente em indivíduos gagos, indicando uma tentativa
de compensação pelo lado esquerdo anômalo nas áreas pré-motoras, motoras e auditórias (Travis, 1978; Moore et al., 1980; Braun et al., 1997; Salmelin et al., 1998; Fox et al., 1996 e 2000; Buchel et al., 2004).
Nudelman et al. (1992) demonstraram em seus trabalhos, a interação de quatro sistemas neurais na produção do discurso fluente, três deles senso-motores e um cognitivo, o qual foi separado em duas alças (loops): a) uma medial, que programa e monitora os sons que estão sendo emitidos; b) uma lateral, que escolhe as palavras a serem pronunciadas, sendo esta última preservada nos gagos e passível de ativação através do canto; enquanto que a outra, estaria sob influência do neurotransmissor dopamina, portanto permanecendo prejudicada.
Wu et al. (1995; 1997) por meio de PETscan com marcador 6-fluorodopa analisaram as atividades dopaminérgicas pré-sinápticas no cérebro de indivíduos gagos. Os resultados obtidos revelaram sinais de captação significativamente maior em indivíduos disfluentes em relação aos controles, em diversas áreas, tais como: córtex pré-frontal medial, córtex orbital profundo, córtex insular, amígdala extendida, córtex auditório, núcleo caudado, límbico cortico ventral e em regiões subcorticais do cérebro, além de uma diminuição do metabolismo de glicose nas áreas de Broca e Wernicke e pólo frontal relacionadas ao processamento da fala e da linguagem fonológica e semântica. Entretanto, Fox et al (1996) em seus trabalhos, revelaram que a hiperatividade cerebral pré-motora encontrada em indivíduos gagos estaria conectada tanto ao tálamo quanto ao gânglio basal.
Ludlow e Loucks (2003) ressaltam a função dos gânglios da base no apoio e modulação da comunicação rápida entre as regiões de fala específicas, sugerindo que a gagueira poderia refletir a instabilidade do controle motor da fala mais do que a perda da função. Esta visão é apoiada devido a casos de surgimento de episódios de gagueira em pacientes com doença de Parkinson e com distonia, após a cirurgia de
implante do aparelho de estimulação cerebral profunda que é inserido próximo a área do globo pálido interno (Allert et al., 2010; Nebel et al., 2009; Benke et al., 2000; Koller et al., 1983; Burghaus et al., 2006).
Concomitante aos estudos de neuroimagem em indivíduos disfluentes, realizavam-se estudos funcionais e moleculares em pacientes com Síndrome de Tourette(ST). Os resultados obtidos sugeriram uma redução dos gânglios da base, sendo estes atuantes na coordenação dos movimentos motores, e alteração de gene(s) que auxiliam na metabolização de neurotransmissores, principalmente a dopamina. Devido as semelhanças no esforço de produção da fala disfluente e os tiques vocais apresentados por indivíduos afetados com ST, a hipótese de que ambas afecções fossem ocasionadas pelas mesmas alterações foi levantada (Comings, et al., 1990; Maguire, et al., 2004).
Em busca dos fatores genéticos que explicassem as alterações anatômicas encontradas no sistema nervoso dos indivíduos gagos é que se iniciaram estudos genéticos através de marcadores moleculares específicos em estudos de associação e ligação. Shugart et al. (2004), foram os primeiros, à partir da análise de 68 famílias norte-americanas e européias, que apontaram para diferenças significativas nos marcadores do cromossomo 18 (análise de ligação não-paramétrica escore >5 em 18p e >2,5 em 18q proximal), sugerindo a existência de um locus de predisposição à doença.
Riaz et al. (2005) analisando o genoma de 56 famílias paquistanesas consanguíneas com gagueira, revelaram evidências mais fortes de uma ligação genética. À partir de análises de ligação não-paramétrica, observaram-se resultados significativos na região cromossômica 12q.
Suresh et al.(2006), através da análise de ligação do genoma, pautado no polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) em 100 famílias americanas, suecas e
israelenses, obtiveram indícios de ligação no cromossomo 9 em indivíduos gagos, persistentes e recuperados; e no cromossomo 15 nos gagos persistentes. Além disso, foram observadas evidências de ligação sexo-específico no cromossomo 7 em homens e no cromossomo 21 em mulheres.
Wittke-Thompson et al. (2007), em uma população de isolado consanguíneo, huteritas (grupo consanguíneo norte europeu) foi possível identificar ligações sugestivas nos cromossomos 3, 13 e 15.
Mais recentemente, Lan et al. (2009) estudaram e compararam, em indivíduos gagos e fluentes, cinco SNP para os genes receptores (na região cromossômica 11q23) e transportadores dopaminérgicos (na região cromossômica 5p15.3). Deste estudo verificaram-se que dos cinco SNPs testados o único que apresentou resultados significantes foi um dos relacionados ao gene do receptor de dopamina, DRD2, no qual a presença do alelo T no polimorfismo rs6277 foi tido como um fator protetor para o aparecimento da gagueira e, conseqüentemente, o aumento do genótipo CC foi considerado fator de risco para a afecção.
Em 2010, Kang et al. ao estudarem famílias paquistanesas e casos isolados de gagueira da América do Norte, através da análise de ligação no braço longo do cromossomo 12, observaram a recorrência de uma mutação (G3598A). Tal mutação por alterar o tipo de aminoácido (substituição de um ácido glutâmico por uma lisina) na enzima sintetizada pelo gene GNPTAB (N-acetylglucosamine-1-phosphate
transferase, alpha and beta subunits), implicou numa mudança em sua conformação
estrutural que impede a mesma de conduzir a enzima 6- fosfatomanose ao lisossomo. Raza et al. (2010) estudaram famílias com diversos indivíduos afetados através da análise de ligação paramétrica de 6090 SNP´s. Os resultados mostraram um LOD escore de aproximadamente 4,92 para marcadores na região q do cromossomo 3 em que localiza-se outro receptore dopaminérgico (DRD3) da mesma família.
2. JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS
As descobertas dos fatores moleculares predisponentes da afecção contribuiriam significativamente com a prevenção, diagnóstico, por meio de testes moleculares, e o tratamento dos indivíduos portadores, evitando-se assim, possíveis traumas em crianças submetidas sem necessidade a tratamentos intensivos, por vezes tornando o que seria uma gagueira infantil recuperável em uma gagueira psicogênica persistente. Desta forma, propomos de maneira inédita e pioneira na população do Estado de São Paulo (Brasil) a realização deste trabalho que tem como ojetivo principal:
x Avaliar e comparar, por meio de análises estatísticas e ferramentas de bioinformática, o polimorfismo de cinco SNPs, já descritos na literatura, presentes nos genes receptores e transportadores dopaminérgicos (SLC6A3 e DRD2), em dois grupos: um de portadores de gagueira desenvolvimental persistente familial do Estado de São Paulo e outro de controles fluentes, do Estado de São Paulo, pareados por sexo.
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Casuística
Este projeto contou com a participação de dois grandes núcleos institucionais colaboradores, responsáveis pela triagem, diagnóstico e terapia dos pacientes e familiares com gagueira desenvolvimental persistente familial, o Centro de Estudos da Educação e da Saúde (CEES – Marília – Unesp) e o Departamento de Fonoaudiologia, Fisioterapia e Terapia Ocupacional da Faculdade de Medicina da USP (FOFITO – São Paulo – FMUSP), coordenados pelo Serviço de Aconselhamento Genético – Unesp – Botucatu.
A casuística deste estudo foi composta por 100 indivíduos: a) grupo amostral, com 50 probandos com gagueira persistente desenvolvimental familial, pertencentes à famílias distintas, já selecionadas em estudos preliminares de Canhetti-Oliveira (2004), Costa (2005), Domingues (2009), provenientes das clínicas escolas dos centros supracitados e selecionados independente do número de membros da família, sem distinção de sexo, raça, escolaridade e nível sócio-econômico-cultural, provenientes do Estado de São Paulo; b) grupo controle, com 50 indivíduos fluentes (alunos de graduação e pós-graduação) oriundos do Instituto de Biociências de Botucatu, sem vínculos acadêmicos com o grupo responsável pela pesquisa, e pareados por sexo.
Após a avaliação fonológica dos indivíduos afetados, os pais, os próprios indivíduos (adultos) ou a família receberam a devolutiva dos resultados da avaliação. Informações sobre a gagueira foram oferecidas por meio de orientações e instruções com o auxílio de um informe especialmente elaborado para esta finalidade. Os casos que necessitaram de terapia foram mantidos nas clínicas dos centros colaboradores supracitados para a intervenção fonoaudiológica.
3.1.1. Critérios fonoaudiológicos de inclusão
Os requisitos de inclusão dos indivíduos foram: ser falante nativo do português brasileiro; ter idade acima de 6 anos; apresentar histórico familial positivo para a gagueira, ou seja, apresentar no mínimo outro parente gago; e apresentar quadro de gagueira há mais de seis meses, sem remissão.
3.1.2. Critérios fonoaudiológicos de exclusão
Os critérios de exclusão para o grupo de probandos foram: apresentar qualquer distúrbio neurológico, genético ou não, nos probandos ou familiares, tais como distonia, doenças extras piramidais, deficiência mental, epilepsia, transtorno do déficit de atenção e hiperatividade (TDAH); sintomas ou condições psiquiátricas; apresentar
alterações de comunicação oral não compatíveis com a idade; apresentar perda auditiva condutiva ou neurossensorial; e outras condições pertinentes que possam gerar erros no diagnóstico.
3.1.3. Diagnóstico de gagueira e seleção
O diagnóstico de gagueira do participante foi estabelecido a partir da metodologia de coleta da amostra de fala proposta por Andrade (2000) – fala auto-expressiva obtida num mínimo de 200 sílabas expressas (fluentes), eliciada por estímulo visual de figura (adaptada às diferentes faixas etárias).
A partir da análise da amostra de fala foram considerados participantes do estudo aqueles que apresentaram no mínimo 3% de rupturas gagas (Yairi et al., 1992b) e receberam 11 pontos ou mais (gravidade = leve) no Stuttering Severity
Instrument – 3 (SSI-3) (Riley, 1994). Em cada centro colaborador, foi solicitado o
parecer de dois profissionais com experiência no diagnóstico e na intervenção fonouadiológica dos distúrbios da fluência de modo a garantir a confiabilidade do diagnóstico. As análises das disfluências foram realizadas
a partir do registro audiovisual da fala dos candidatos à pesquisa (probando e seus familiares).
3.2. Aspectos éticos
Para a participação nos estudos prévios, todos os responsáveis presentes na consulta fonoaudiológica foram informados sobre os objetivos da pesquisa e esclarecidos sobre os procedimentos adotados para a anuência e assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE). Com a concordância em participar da pesquisa, foi solicitado, em cada instituição envolvida no projeto, o preenchimento do TCLE específico e nos termos da Resolução CONEP/CNS196/1996, 340/2004 e 347/2005, no qual consta também um formulário de autorização, por parte dos
indivíduos, para o armazenamento de amostras de DNA em um banco, em freezer - 80°C, sob responsabilidade do Instituto de Biociências de Botucatu/UNESP, conforme o protocolo 3440-2010, aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina de Botucatu (Anexo 8.1).
Desta forma foi constituído o Banco de DNA das 50 famílias, das quais os 50 probandos com gagueira desenvolvimental persistente foram analisados neste presente estudo. A todos os indivíduos foi, solicitado novo TCLE, específico, nos termos das resoluções do CONEP, supracitados (Anexo 8.2).
Para a constituição do grupo controle, realizou-se um convite aos alunos para participar do projeto. Uma vez aceito, estes foram submetidos aos mesmos critérios de inclusão e exclusão e, após assinatura de TCLE, foi realizado diagnóstico, a fim de certificarmos de que se tratavam de apenas indivíduos fluentes. Isto posto, foram coletadas amostras de material biológico para a construção de um banco de DNA de indivíduos controles.
3.3. Coleta e purificação de material biológico
De todos os indivíduos participantes deste projeto foram coletados 4 ml de sangue periférico , armazenado em tubo contendo anticoagulante EDTA a 6% (frasco Vacuette® EDTA 4 ml) os quais foram purificados com o kit comercial de extração Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega, Madison, WI - USA). Após seu processamento as quantificações foram realizadas através de leitura em espectrofotometria UV - plataforma ND-1000 Spectrophotometer da NanoDropTM (Thermo Fisher Scientific Inc.- Wilmington, Delaware - USA) a partir de 1 ȝl de solução estoque.
As amostras tiveram sua concentração final ajustada para 20ng/ȝl as quais foram quantificadas em triplicata, visando minimizar possíveis erros de pipetagem e garantir a sua reprodutibilidade nos ensaios.
3.4. Análise Molecular
3.4.1. Técnica de PCR em tempo real
A técnica de PCR (reação em cadeia de polimerase) permite a amplificação de regiões específicas do genoma milhares de vezes. A técnica do PCR em tempo real, também conhecida como PCR cinético, permite além da amplificação, a quantificação de uma determina molécula de DNA presente em uma reação de PCR. Existem dois tipos de PCR em tempo real: os baseados em sondas (TaqMan) e em agentes intercalantes (SyberGreen). Ambos os métodos requerem um termociclador especial equipado com uma câmera sensível que monitora a fluorescência em cada poço da placa em intervalos freqüentes durante a reação de PCR.
O sistema TaqMan® utiliza uma sonda que consiste de dois fluoróforos (quencher e repórter), enquanto a sonda encontra-se integra e ligada a fita de DNA molde, o quencher reduz a fluorescência do corante repórter. Durante o processo de PCR a sonda TaqMan ® e os iniciadores se anelam ao DNA, enquanto a Taq polimerase inicia a criação de uma cadeia complementar a fita de DNA molde. Ao adicionar os nucleotídeos, a Taq polimerase remove a sonda Taqman®, separando o quencher e o repórter e permitindo que o mesmo emita sua energia que será quantificada pelo programa específico para a interpretação do sinal de fluorescência.
3.4.2. Genotipagem
A genotipagem foi realizada através da PCR em tempo real e sistema Taqman® o que permitiu a quantificação da sequência alvo acumulada ao final da
reação (Saiki et al., 1985), para tal duas sondas foram inseridas em cada reação o que permitiu avaliar duas variantes para cada um dos polimorfismos de nucleotídeo único estudados. O corante VIC se anelou a extremidade 5´do alelo 1 e o corante FAM, à extremidade 5´do alelo 2.
As reações foram realizadas em um termociclador ABI StepOne™ Real-Time
PCR System (Applied Biosystems) de acordo com o protocolo da empresa, porém
uma versão otimizada. O programa StepOne™ v2.1 foi utilizado na captação, análise e caracterização dos genótipos.
Neste projeto foram genotipados três SNP´s presentes no gene SLC6A3 e dois presentes no gene DRD2 . A escolha destes polimorfismos foi realizada a partir do trabalho de Lan et al. (2009), através do banco de dados dbSNP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/) e do programa ABI SNPbrowser™ v 4.0 (Applied Biosystems) os quais já apresentavam esses ensaios disponíveis (tabela 01).
Tabela 01. Caracterização dos SNPs selecionados.
Região
cromossômica Gene Éxon RefSNP ID Troca de alelo mutação Tipo de Alteração de aa
5p15.3 DRD2 2 rs2617604 124C>T Não-sinônima Leu42Phe 13 rs28364998 1692C>T Sinônima Ile564Ile rs28364997 1676CC>T Não-sinônima Ala559Val 11q23 SLC6A3 7 rs6277 957C>T Sinônima Pro319Pro rs6275 939T>C Sinônima His313His
De acordo com a base de dados dbSNP
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/) e o HapMap
gene DRD2 (rs6275 e rs6277) está bem caracterizada apresentando-se polimórfica nas mais diferentes populações, porém quanto ao gene SLC6A3 (rs2617604, rs28364998 e rs28364997) estes têm-se apresentado não informativos (não polimórficos) ou mesmo sem caracterização quanto as suas frequências alélicas (tabela 02 e 03).
Tabela 02. Frequência alélica para SNPs rs6275 e rs6277 no gene SLC6A3
Populações Ref SNP rs6275 rs6277 Europeus Asiáticos(HCB) Asiáticos(JPT) Africanos 0.716 0,284 0,466 0,534 0.558 0,442 0,944 0,056 0.466 0,534 0,951 0,049 0.360 0,640 0,966 0,034
Tabela03. Frequência alélica para SNPs rs2617604, rs28364997 e rs28364998 no gene DRD2
Populações
Ref SNP
rs2617604 rs28364997 rs28364998
Europeus N/A N/A
Asiáticos(HCB) 1,000 N/A N/A Asiáticos(JPT) 1,000 N/A N/A Africanos 1,000 N/A N/A 1,000
As reações de PCR em Tempo Real e genotipagem foram compostas por:
TaqMan® SNP Genotyping Master Mix (Applied Biosystems); TaqMan® Genotyping
Assay Mix (Applied Biosystems); água livre de RNAse e DNA à 20ng/μl. As reações foram preparadas conforme as especificações do fabricante e posteriormente otimizadas a um volume final de reação menor (tabela 04).
Tabela 04. Componentes da reação de PCR.
Reagentes Concentração (reação) Volume (μl)
TaqMan® Genotyping Master Mix (2X) 1X 5,0
SNP Genotyping Assay Mix (20X) 1X 0,5
DNA molde diluído em água (20ng/ μl) 3,3 ng/μl 1,0
Água estéril (RNAse free) 3,5
Volume Final
10,0
Em cada ensaio realizado, além das amostras de DNA foram aplicados dois controles negativos, a fim de garantir de que não havia qualquer tipo de contaminação passível de interferência nas análises.
3.4.3. Procedimentos Analíticos
As freqüências alélicas dos SNPs, bem como o estudo de associação dos fenótipos (gago e fluente) em relação aos marcadores, utilizando-se do teste do Qui-quadrado, pautado no equilíbrio de Hardy-Weinberg foram estimadas usando o programa Haploview (Broad Institute – Cambridge – MA - USA) disponível gratuitamente em (http://www.broadinstitute.org/haploview).
4. RESULTADOS
4.1. Casuística
A partir de 50 famílias com gagueira desenvolvimental persistente, foram obtidos os 50 probandos, os quais foram pareados por sexo, a 50 indivíduos controles. Dos 50 indivíduos com gagueira desenvolvimental persistente familial selecionados, 86% foram do sexo masculino e 14% do feminino, implicando em uma razão sexual de 6,14M:1F, semelhante as obtidas em outros trabalhos (tabela 05).
Tabela 05. Distribuição dos grupos amostral e controle
Sexo Grupos
Amostral Controle
Masculino 43 43
Feminino 07 07
4.2. Genotipagem
Dos cinco SNPs inicialmente proposto para a genotipagem (rs6275, rs6277, rs2617604, rs28364998 e rs28364997) apenas dois (rs6275 e rs6277) relacionados ao gene DRD2 tiveram sucesso quanto ao processo de genotipagem. Os três marcadores restantes (rs2617604, rs28364998 e rs28364997) relacionados ao gene SLC6A3, apesar do sucesso das reações o processo de genotipagem foi comprometido, uma vez que o software StepOne™ v2.1, utilizado para a determinação dos genótipos, processa as informações a partir da análise e comparação de três clusters bem definidos (homozigose: alelo 1, homozigose: alelo 2 e heterozigose: alelos 1 e 2). Assim, devido à ausência de um ou dois destes clusters, ou seja, de heterozigose, não houve parâmetros suficientes para o processamento e genotipagem dessas informações. A tabela 06, apresenta os genótipos obtidos para os marcadores rs6275 e rs6277, para os 100 indivíduos analisados.
Tabela 06.
Al
elos obtidos pela
ge notipa gem do g rup os amo stral e control e. Indivíduos Sexo SNP 6275 SNP 6277 Indivíduos S exo SNP 6275 SNP 6277 Indivíduos Sexo SNP 6275 SNP 6277 Alel o 1 Alel o 2 Alel o 1 A lel o 2 A lel o 1 A lel o 2 A lel o 1 Alel o 2 Alel o 1 A lel o 2 Alel o 1 Alel 1.1 M A G G G 22.1 M A G A G 44.1 F A A G 2.1 M A G G G 23.1 M G G A G 45.1 M A G A 3.1 M A G G G 24.1 F A G A G 46.1 M A G A 4.1 M A G A G 25.1 M A A G G 47.1 F G G A 5.1 M G G A G 26.1 M A A G G 48.1 M G G A 6.1 F A G A G 27.1 M A G G G 49.1 M G G A 7.1 M G G A A 28.1 M A A G G 50.1 M G G A 8.1 M A G A G 29.1 M G G A G 51.1 M A G A 9.1 M G G A A 30.1 M A G A G 52.1 M A A G 10.1 M A G A G 31.1 M A A G G 53.1 F G G G 11.1 M G G A A 32.1 M A G A G BRCO0001 F A G A 12.1 F G G A G 33.1 M G G A A BRCO0005 F G G G 13.1 M A G G G 34.1 M A G A G BRCO0006 F G G A 14.1 M G G A A 37.1 M A A G G BRCO0007 F A G A 15.1 F A G G G 38.1 M G G A A BRCO0008 F A G A 16.1 M G G G G 39.1 M A G G G BRCO0013 M A A G G 17.1 M A A G G 40.1 M G G A A BRCO0015 M G G A 19.1 M A G A G 41.1 M G G A G BRCO0017 M A A G 20.1 M G G A A 42.1 M A G A G BRCO0018 M A G A 21.1 M G G A G 43.1 M A G A G BRCO0019 M G G A
Tabela 06.
Al
elos obtidos pela
genotipagem dos
grupos amostral e control
e(continuação). Indivíduos Sexo SNP 6275 SNP 6277 Indivíduos Sexo SNP 6275 SNP 6277 Alel o 1 Alel o 2 Alel o 1 A lel o 2 A lel o 1 A lel o 2 A lel o 1 A lel o 2 BRCO 0020 M G G A A BRCO 0048 M G G A A BRCO 0021 M G G A G BRCO 0049 M A G G G BRCO 0022 F A G G G BRCO 0050 M A G A G BRCO 0023 F G G A A BRCO 0051 M G G A A BRCO 0024 M A G A G BRCO 0052 M A G G G BRCO 0025 M G G A A BRCO 0053 M G G A A BRCO 0026 M A G A G BRCO 0054 M A G A G BRCO 0029 M A G A G BRCO 0055 M G G A A BRCO 0030 M A G A G BRCO 0056 M G G A G BRCO 0031 M A G A G BRCO 0057 M A A G G BRCO 0032 M A A G G BRCO 0058 M G G A G BRCO 0033 M G G A G BRCO 0059 M A G A G BRCO 0034 M A G A G BRCO 0060 M A G A G BRCO 0035 M A A G G BRCO 0061 M G G A G BRCO 0038 M G G A G BRCO 0062 M A G A G BRCO 0040 M A G A G BRCO 0063 M G G A A BRCO 0042 M A G G G BRCO 0064 M A G A G BRCO 0043 M A G A G BRCO 0065 F G G A A BRCO 0044 M A G G G BRCO 0066 M A G A G BRCO 0045 M A G A G BRCO 0047 M A G A G
4.3. Análise Estatística
Os genótipos obtidos com os marcadores rs6275 e rs6277 para as 100 amostras foram tabulados e utilizados para gerar arquivos de entrada do programa Haploview (Broad Institute – Cambridge – MA - USA) para o cálculo das freqüências alélicas e de simples associação dos fenótipos (gago e fluente), utilizando-se do teste do qui-quadrado, pautado no equilíbrio de Hardy-Weinberg (tabela 07).
Tabela 07. Frequência alélica e associação alélica para dois SNPs no gene DRD2 nos grupos
amostral e controle. rs6275 (C/T) Grupos rs6277 (T/C) Grupos Amostral (n=50) Controles (n=50) Amostral (n=50) Controles (n=50) CC 19 20 TT 11 9 CT 26 22 TC 28 24 TT 5 8 CC 11 17 T freq. 0,36 0,38 C freq. 0,50 0,58 P value 0,77 0,26
5. DISCUSSÃO
Os gânglios da base (GB) são as maiores estruturas subcorticais do prosencéfalo e podem influenciar o comportamento motor, emotivo e cognitivo (Graybiel, 2000). Eles consistem de um conjunto de núcleos interligados, sendo o estriado e o globo pálido alguns destes núcleos. A substância negra compacta é importante junto aos gânglios da base, uma vez que apresenta duas vias que podem gerar comportamentos motores distintos: a via direta, que têm receptores excitatórios D1, e promovem a desinibição motora e comportamental generalizada; e a indireta, que têm receptores inibitórios D2, e conduzem a uma inibição geral de movimentos e impulsos nervosos.
Cunnington et al. (1996) sugeriram que a área motora suplementar (AMS), envolvida em movimentos auto-iniciados, bem aprendidos, complexos e seqüenciais, depende mais do sincronismo dos movimentos do que da programação espacial propriamente dita, o que sugere sua importância na produção das falas espontâneas. Além disso, os gânglios da base, através da AMS, proveriam dicas para facilitar o sincronismo interno dando início aos submovimentos em uma sequência motora bem aprendida.
A execução de uma seqüência motora complexa exige o controle do padrão espacial de ativação muscular e do tempo exato de cada movimento. Em indivíduos gagos, o tempo “interno”, possivelmente é modificado devido a alterações nos gânglios da base, gerando interrupções no ritmo continuo da fala. Durante o canto, isso não acontece, pois, o ritmo do som da melodia proporciona ao cérebro uma representação “interna” do tempo, cadenciando a pronuncia das sílabas. Jeffries, Fritz e Braun (2003) ao compararem indivíduos gagos em dois momentos, ao cantar e ao falar espontaneamente, a partir de estudos de neuroimagem (PETscan) observaram aumento da atividade do putâmen esquerdo dorsal (circuito motor dos gânglios basais) somente durante o canto.
Estudos têm demonstrado que os neurônios, em diferentes partes do globo pálido (GP) produzem um pulso elétrico intenso ao final de um submovimento motor conhecido, o que sugere tratar-se de uma sinalização interna, gerada pelos gânglios da base, para marcar o fim em uma sequência de movimentos. Desta forma, este sinal serviria como um gatilho à AMS, sinalizando a mudança para o próximo componente da sequência do movimento (Brotchie, Iansek & Horne, 1991; Mushiake & Strick, 1995). Assim, a partir deste modelo, acredita-se que o movimento, ou frase seriam iniciados por outras estruturas, que não os gânglios basais (Mink, 1996), porém, no desenrolar deste processo, os gânglios da base produziriam um sinal que marcaria o
final deste primeiro estágio e, portanto, a ausência desta sinalização resultaria em repetições de palavras, caracterizando a gagueira.
Os neurônios presentes nos gânglios da base são dependentes de interneurônios, chamados “neurônios tonicamente ativos'' (TAN) capazes de modular respostas comportamentais através de sinais temporalmente coordenados pelo núcleo estriado (Graybiel et al.,1994; Blazquez et al., 2002), sincronizando assim os movimentos. Além disso, suas respostas são mais intensas e definidas após a repetição de determinados comportamentos (Brotchie et al, 1991;Graybiel et al, 1994). Uma vez a gagueira estando relacionada a modificação do tempo “interno” promovida por alteração nestes neurônios é esperado que a disfluência diminua após a prática de uma sequência de fala, a qual já foi comprovada em indivíduos gagos que ao empregarem palavras bem conhecidas do vocabulário ou ler o mesmo texto diversas vezes apresentaram redução das difluências (Bloodstein, 1995; Dayalu et al. , 2002).
Estudos envolvendo neuroimagem funcional têm apontado para indícios de que os gânglios da base e a secreção do neurotransmissor, dopamina, estão envolvidos diretamente ao longo de todo o processo de aprendizagem, através do reforço (Mink, 1996; Reynolds, Hyland, & Wickens, 2001) o que permite o núcleo estriado reagir de determinadas maneiras a padrões de ativação cortical.
Na década de 1950, iniciaram-se testes com medicamentos para o tratamento da gagueira, principalmente, bloqueadores de dopamina, como o haloperidol, o qual a princípio parecia atuar mais no que tange, a intensidade do que em relação a manifestação da gagueira. O haloperidol exerce seu efeito na redução da ativação do centro motor durante a gagueira, e não na redução do número de interrupções ao longo do processo de fala. Desta forma, levando-se em conta a importância funcional dos ganglios basais para o desenvolvimento da gagueira e a diminuição dos sintomas da mesma quando tratadas com medicamentos bloqueadores dopaminérgicos, tem
sido sugerido que uma das formas de ação no combate a gagueira envolva os receptores de dopamina D2, que por estarem localizados principalmente nos neurônios estriais constituindo a via indireta, estariam reforçando a inibição difusa da atividade motora.
Visando compreender melhor o papel da dopamina, Wu et al. (1997) realizaram estudo de PETscan usando o 6-FDOPA (6-[18F]-fluorodopa) (análoga à L-DOPA endógena) como um marcador dopaminérgico pré-sinaptico o qual, foi utilizado para quantificar a taxa de síntese de dopamina no cérebro (Barrio, Huang & Phelps, 1997). Em indivíduos gagos, houve uma captação de 6-FDOPA três vezes maior em diversas partes do cérebro, em comparação aos controles, o que pode ser associada à superatividade do sistema dopaminérgico pré-sináptico em regiões que modulam a verbalização.
Assim, baseando-se em evidências da possível relação da hiperatividade dopaminérgica no cérebro de indivíduos gagos Lan et al. (2009), a partir dos genes SLC6A3 e e DRD2, responsáveis, respectivamente, pela sintese de transportadores e receptores dopaminérgicos, foram avaliados cinco possíveis e pontuais polimorfismos (SNP) dessas duas regiões. Das estimativas de associação realizadas, foi observado que a presença, em indivíduos disfluentes, do alelo C, (rs6277 - DRD2) quando compado aos fluentes apresentaram-se significativamente associados (p=0,001) sugerindo que a presença deste alelo pode ser considerada como um fator de risco para o aparecimento da afecção.
Desta maneira, visando verificar esta possível associação na população brasileira foram realizadas, análises semelhantes, e que não apresentaram associação positiva (p0,05) no SNP rs6277 em relação à gagueira desenvolvimental persistente familial. Entretando, trabalhos realizados por Kang et al. (2010) mostraram através de análises de genoma completo em indivíduos gagos paquistaneses, ligação
de outra região contendo o gene DRD3, pertencente a mesma família dos receptores dopaminérgico DRD2, fundamentando e relacionando ainda o papel da dopamina no processo de desenvolvimento da gagueira em algumas populações.
A substituição do alelo timina pela citosina, carcteriza uma mutação do tipo silenciosa, pois não implica na troca efetiva do aminoácido, estudos tem revelado recentemente que esse tipo de mutação pode interferir nas proteínas sintetizadas uma vez que estariam alterando os níveis de afinidade receptor/transportador/substrato, os quais desequilibrados, poderiam influenciar nos processos fisiológicos (Chamary e Hurst, 2009) . Além disso, a possível associação observada nas demais populações, para o marcados rs6277 (Lan et al., 2009), bem como nos estudos recentes (Kang et al., 2010) no gene DRD3, em uma análise mais refinada podem apontar para regiões distintas dentro destes genes, porém ligadas aos marcadores até o momento apresentados, e que não foram descobertas até o momento.
6. CONCLUSÃO
Apesar de nossos resultados não demonstrarem uma correlação positiva entre a presença do alelo C nos SNP rs6275 e rs6277 e a gagueira, acreditamos que tal fato possa estar relacionado a dois principais motivos: primeiro, de que não exista esta associação de fato, na população composta por indivíduos com gagueira desenvolvimental persistente familial, bem caracterizada em nosso grupo amostral, ao contrário do grupo estudado por Lan et al. (2009); segundo, de que não exista esta associação devido ao reduzido número de indivíduos analisados, contribuindo com redução poder estatístico das análises. Acreditamos que a combinação de uma boa caracterização do grupo amostral, como tem sido feito por nosso grupo, associado ao aumento significativo no número de indivíduos, poderá nos dar respostas mais sólidas
ao ponto de comprovar ou refutar os achados chineses em relação à população brasileira.
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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8. ANEXOS
8.2.Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
