UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
GUILHERME AUGUSTO DA SILVA NOGUEIRA
EFEITO DA INTERLEUCINA 17 NA REGULAÇÃO HIPOTALÂMICA DA
HOMEOSTASE ENERGÉTICA
CAMPINAS
2019
GUILHERME AUGUSTO DA SILVA NOGUEIRA
EFEITO DA INTERLEUCINA 17 NA REGULAÇÃO HIPOTALÂMICA DA
HOMEOSTASE ENERGÉTICA
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutor em Ciências
ORIENTADOR: PROF. DR. LICIO AUGUSTO VELLOSO
ESTE TRABALHO CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO/TESE DEFENDIDA PELO
ALUNO GUILHERME AUGUSTO DA SILVA NOGUEIRA, E ORIENTADO PELO PROF. DR. LICIO AUGUSTO VELLOSO.
CAMPINAS
2019
COMISSÃO EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO
GUILHERME AUGUSTO DA SILVA NOGUEIRAORIENTADOR: PROF. DR. LICIO AUGUSTO VELLOSO
MEMBROS:
1. PROF. DR. LICIO AUGUSTO VELLOSO 2. PROF. DR. LUIZ OSÓRIO SILVEIRA LEIRIA 3. PROFA. DRA. ADRIANA SOUZA TORSONI
4. PROFA. DRA. JOANA MARGARIDA NAVALHO GASPAR 5. PROFA. DRA. ANDREZA FABRO DE BEM
Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica da Faculdade de
Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no
SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da
FCM.
Dedicatória
Primeiramente, dedico este trabalho aos meus pais, Rosângela e Nilson, que sempre me apoiaram em todos os aspectos de minha vida e que sempre foram meus modelos de humildade, perseverança e resiliência. Dedico ao meu companheiro, Atila, pelosuporte e paciência dedicados ao longo deste doutorado. Dedico ao meu orientador, Licio, que para
mim sempre foi modelo de inspiração pelo seu brilhantismo, caráter e dedicação por seus alunos e pela ciência. Dedico também a todos os cientistas brasileiros, que mesmo na atual situação caótica do país, se dedicam arduamente na busca da verdade.
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador, Licio Velloso, ilustre cientista, com quem tive a honra
de ser orientado. Graças a sua paciência e dedicação que tem comigo, assim
como com todos os seus alunos. Seu caráter e paixão pela ciência foram meus
moldes para que a condução deste trabalho fosse realizada com maestria.
Obrigado pela oportunidade de trabalhar com uma equipe fantástica e pelas
contribuições ímpares para meu crescimento profissional e pessoal.
À Fundação de Amparo de Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo auxílio-bolsa referente ao projeto 2014/24362-1 e auxílio pesquisa 2013/07607-8, fundamentais para o desenvolvimento deste trabalho.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001.
Ao Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico (CNPq).
À Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) que ao longo desses
anos me proporcionou estrutura para o desenvolvimento de todo este trabalho.
Mais que isso, a universidade sempre minha segunda casa.
Ao corpo técnico do Laboratório de Sinalização Celular, Erika Anne,
Joseane Morari e Gerson Ferraz, por todo suporte técnico-científico oferecido
para realização de todos os experimentos.
Aos meus familiares, especialmente aos meus pais, Rosângela e Nilson,
sempre me incentivaram e deram apoio necessário para que eu pudesse
alcançar todos os meus sonhos. Além disso, minha mãe me ensinou que com
humildade sempre é possível chegar onde se almeja, mesmo que o caminho
seja tortuoso.
Ao meu companheiro, Atila Vendite, por sempre estar ao meu lado
durante o doutorado, sempre paciente e prestativo.
Aos meus colaboradores Carina Solon, Rodrigo Carraro, Albina
Ramalho, Daiane Engel, Rodrigo Gaspar e Davi Oliveira pela excepcional
ajuda, que foi crucial para a elaboração dos experimentos e análise dos dados
deste trabalho.
A todos os colegas do LabSinCel, que contribuíram para meu
desenvolvimento profissional. Foi uma honra compartilhar vários momentos e
vitórias com todos vocês!
Aos professores Marco Aurélio e José Donato, pela generosidade em
ceder os modelos experimentais transgênicos importantes para este trabalho.
Aos meus amigos reconhecidos durante esta etapa, Ariane Zanesco,
Bruna Bombassaro, Carina Solon, Daniela Razzoli, Gabriela Souza, Juliana
Faria, Letícia Pires, Lucas Nascimento, Milena Monfort, Nathalia Dragano,
Pedro Nogueira, Rodrigo Carraro, Thiago Matos e Vanessa Bóbbo. A nossa
trajetória sempre será mais agradável se percorrermos ao lado de pessoas que
nos queiram bem, que nos complete, e tive muita sorte por reconhecer isso em
vocês. Obrigado pelo companheirismo e por dedicarem um generoso espaço
em suas vidas para mim!
Ao Instituto Embraer, que me deu talvez a oportunidade mais importante
na minha vida. Graças ao instituto, tive professores e mentores excepcionais
que foram o pontapé inicial para o desenvolvimento do meu currículo
profissional, do meu perfil científico e da minha noção de cidadania. Além
disso, foram minhas asas durante toda a minha graduação. Atualmente, ainda
tenho muito a agradecer por tudo o que vocês ainda fazem pelos jovens do
Vale do Paraíba e Botucatu. A todos os envolvidos, minha eterna gratidão!
A todos os professores, em especial aos meus, que me ensinaram
desde o ensino primário. Graças ao seu árduo trabalho e paixão por lecionar,
temos as primeiras noções do mundo que nos cerca. Em tempos de rumos
políticos incertos e sombrios que impactam diretamente em suas atividades,
expresso meus imensuráveis agradecimento e admiração pela sua dedicação à
profissão. Reconheço que grande parcela de que sou hoje, como profissional e
indivíduo, devo ao esforço de vocês. Agradeço especialmente aos meus
professores Sávius Castro (biologia), Vera Polese (história), Adriana Tullio
(literatura) e Grasiela Severi-Aguiar (biologia celular, embriologia, histologia e
orientadora de iniciação científica).
Ai de mim! da filosofia,
Medicina, jurisprudência,
E, mísero eu! da teologia
O estudo fiz, com máxima insistência.
Pobre simplório, aqui estou
E sábio como dantes sou!
De doutor tenho o nome e mestre em artes,
E levo dez anos por estas partes,
Prá cá e lá, aqui ou acolá
Os meus discípulos pelo nariz.
E vejo-o, não sabemos nada!
Deixa-me a mente amargurada.
Sei ter mais tino que esses maçadores,
Mestres, frades, escribas e doutores;
Com dúvidas e escrúpulos não me alouco,
Não temo o inferno e satanás tampouco
Mas mata-me o prazer no peito;
Não julgo algo saber direito,
Que leve aos homens uma luz que seja
Edificante e benfazeja.
Nem de ouro e bens sou possuidor,
Ou de terreal fama e esplendor; [...].
Fausto: uma tragédia - Johan Wolfgang
RESUMO
A obesidade decorre da associação entre fatores genéticos, metabólicos, hormonais e ambientais. Uma vez estabelecida, favorece o aparecimento de resistência à insulina, doenças cardiovasculares, hipertensão, dislipidemia e alguns tipos de câncer, impactando na qualidade de vida e nas taxas de mortalidade da população. Por proporcionar gastos elevados à saúde pública e por acometer cerca de 650 milhões de indivíduos no mundo, a obesidade é um dos maiores fenômenos clínico-epidemiológicos da atualidade. Estudos recentes mostram que a citocina próinflamatória interleucina 17 (IL-17) está associada à obesidade. Por ser uma citocina produzida por células residentes no intestino, ter sua secreção regulada pela alimentação e pela microbiota intestinal e estar envolvida no desenvolvimento da obesidade, existe possibilidade da IL-17 participar do controle regulatório central da fome. Através de ensaios de PCR quantitativo real time, Western blot, imunofluorescência, caracterizações metabólicas e fotos termográficas do tecido adiposo marrom (BAT), analisamos a modulação da expressão de neurotransmissores e parâmetros metabólicos mediados por esta citocina em camundongos C57BL/6 e em animais transgênicos repórter para POMC, AgRP e IL-17. Foi observada expressão de IL-17 receptor A (IL-17RA) no tecido hipotalâmico, particularmente em neurônios POMC, NPY, AgRP e MCH. Além disso, a administração via intraperitonial (IP) e intracerebroventricular (ICV) de IL-17 aumentou a expressão de POMC, bem como reduziu o consumo alimentar espontâneo. IL-17 via IP modulou a fosforilação de MEK4 e STAT3 hipotalâmicos e aumentou a temperatura do BAT, já a administração via ICV diminuiu o coeficiente respiratório. Esses dados em conjunto demonstram de forma original que a IL-17 desempenha importante papel no controle da homeostase energética hipotalâmica e termogenese.
ABSTRACT
Obesity results from the association of genetic, metabolic, hormonal and environmental factors. Once established, it favors the development of insulin resistance, cardiovascular diseases, hypertension, dyslipidemia and some types of cancer, impacting on life quality and mortality. Due to its huge impact on the economics of public health and because its prevalence is currently about 650 million people, obesity has grown to become one of the most important clinical and epidemiological problems in the world. Recent studies have provided evidence that interleukin-17 (IL-17) is associated with obesity. IL-17 is produced in the gut in response to changes in the microbiome landscape and food intake, thus, it is possible that it is involved in central the regulation of feeding. Here, we employed real-time PCR, immunoblot, immunofluorescence, metabolic assays, thermographic images, measurement of neurotransmitters to evaluate the actions of IL-17 in C57BL/6 and reporter mice. IL-17 receptor A (IL-17RA) was detected in the hypothalamus, particularly POMC, NPY, AgRP and MCH neurons. Moreover, the intraperitoneal (IP) and intracerebroventricular (ICV) injections of IL-17 resulted in increased POMC expression, which was accompanied by reduced food intake. The IP injection of IL-17 stimulated the phosphorylation of MEK4 and STAT3 in the hypothalamus, increased the brown adipose tissue temperature and its ICV injection resulted in reduction of respiratory quotient. Taken together the results of this original study demonstrate that IL-17 exerts an important function in the regulation of the hypothalamic energy homeostasis and thermogenesis actions.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Página Figura 1. Família de citocinas e receptores da interleucina
17... 28 Figura 2. Via de sinalização da interleucina 17... 30 Figura 3. Interleukin-17 and interleukin-17 receptor A expression in the
hypothalamus……… 42
Figura 4. Hypothalamic single-cell expression of interleukin-17 and
interleukin-17 receptor A.……… 44 Figura 5. Cells expressing interleukin-17 receptor A in mouse
hypothalamus………..……….………. 45
Figura 6. The impact of exogenous interleukin-17 injection on the
expression of hypothalamic transcripts………. 46 Figura 7. Time-course of exogenous interleukin-17 injection and its
impact on the expression of hypothalamic transcripts………… 47 Figura 8. The impact of interleukin-17 injection on the expression of
hypothalamic transcripts in neurospheres………. 48 Figura 9. The effect of interleukin-17 on hypothalamic intracellular
signalling proteins……….………. 49
Figura 10. Impact of interleukin-17 on food intake and energy
expenditure……… 50
Figura 11. Impact of interleukin-17 on brown adipose tissue
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
3V Terceiro ventrículo
ACT1 Ativador de fator nuclear κB 1 AgRP Proteína relacionada ao Agouti BAT Tecido adiposo marrom
C57BL/6 Camundongo C57 black 6
CART Transcrito regulado por cocaína e anfetamina CCL2 Quimiocina C-C Motif ligante 2
CCL7 Quimiocina C-C Motif ligante 2
cDNA Ácido desoxirribonucleico complementar CEPID Centros de Pesquisa, Inovação e Difusão CL CL316243 hidratado
COL Cólon
COX-2 Ciclooxigenase-2
CRH Hormônio liberador de corticotrofina CTL Grupo controle
CTLA-8 Proteína associada a linfócito T citotóxico 8 CXCL1 Quimiocina C-X-C Motif ligante 1
CXCL5 Quimiocina C-X-C Motif ligante 5 CXCL8 Quimiocina C-X-C Motif ligante 8
Cy3 Cianina 3
DMEM-F12 Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 DIO2 Gene deiodinase-2
DUO Duodeno
EE Eficiência energética
EGF Fator de crescimento epidérmico
FDG 18F-fluordesoxiglicose
FDG PET-CT Tomografia por emissão de pósitron com FDG combinada à tomografia computadorizada
FGF-2 Fator de crescimento de fibroblasto 2 FITC Isotiocianato de fluoresceína
GAPDH Gene gliceraldeido 3-fosfato desidrogenase G-CSF Fator estimulador de colônias granulocíticas GEO Gene Expression Omnibus
GFAP Proteína fibrilar ácida da glia GFP Green fluorescente protein
GLP-1 Peptídeo semelhante a glucagon 1
GM-CSF Fator estimulante de colônia de granulócitos e macrófagos GPR120 Proteína G acoplada ao receptor 120
HFD High fat diet
HYP Hipotálamo
IBA1 Molécula adaptadora ligante de cálcio ionizado 1 ICAM-1 Moléculas de adesão intercelular 1
ICV Intracerebroventricular IgG Imunoglobulina G
IKKi Kinase I kappa B kinase i IL-10 Interleucina 10
IL-15 Interleucina 15
IL-15R Receptor de interleucina 15 IL-17 Interleucina 17
IL-17R Receptor de interleucina 17 IL-18 Interleucina 18
IL-1β Interleucina 1 beta IL-21 Interleucina 21
IL-22 Interleucina 22 IL-23 Interleucina 23 IL-26 Interleucina 26 IL-6 Interleucina 6 IL-7 Interleucina 7 IL-8 Interleucina 8 ILE Íleo
IMC Índice de massa corpórea
INS Insulina
IP Intraperitoneal JAK2 Janus Kinase 2
JEJ Jejuno
knn K-nearest-neighbour
LEP Leptina
LHX8 Gene LIM homeobox-8 LPS Lipopolissacarídeo
LTi Células indutoras de tecido linfoide MC3R Receptor de melanocortina 3 MC4R Receptor de melanocortina 4
MCH Hormônio concentrador de melanina MEK4 Mitogen‐activated protein kinase kinase 4 MMP1 Metaloproteína de matriz 1
MMP13 Metaloproteína de matriz 13 MMP3 Metaloproteína de matriz 3 MMP9 Metaloproteína de matriz 9 mRNA Ácido ribonucleico mensageiro MUC5AC mucina 5AC
NeuN Nuclei neuronal NFκB Fator nuclear kapa B NK Linfócitos natural killer NKT Linfócitos natural killer T NPY Neuropeptídeo Y
ob/ob Deficiente de leptina
ORX Orexina
PBS Tampão fosfato-salina
PBS-T Tampão fosfato-salina com tween 20 PCR Reação em cadeia da polimerase PDL Poli-L-lisina
pJAK2 Janus Kinase 2 fosforilada
pMEK4 Mitogen-activated protein kinase kinase 4 fosforilada PMSF Fluoreto de fenilmetilsulfonil
POMC Proopiomelanocortina
pSTAT3 Proteína signal transducers and activators of transcription 3 fosforilada RORγt Fator de transcrição órfão gama relacionado a ácido retinóico RQ Coeficiente respiratório
S100A7 Psorisina S100A8 Calgranulina-A S100A9 Calgranulina-B
scRNAseq Single cell ribonucleic acid sequencing
STAT3 Signal transducers and activators of transcription 3
TAK1 Fator de crescimento transformador beta-ativado kinase 1 TGF-β Fator transformador de crescimento beta
Th1 Linfócitos T helper subtipo 1 Th17 Linfócitos T auxiliares subtipo 17 Th2 Linfócitos T helper subtipo 2
TJ Proteínas de adesão celular tight junction TNF Fator de necrose tumoral
TRAF2 Fator associado de receptor de fator de necrose tumoral 2 TRAF5 Fator associado de receptor de fator de necrose tumoral 5 TRAF6 Fator associado de receptor de fator de necrose tumoral 6 TRH Hormônio liberador de tireotrofina
TUJ1 Beta tubulina neurônio-específica classe III UCP1 Proteína desacopladora-1
VCO2 Volume de dióxido de carbono VO2 Volume de gás oxigênio WAT Tecido adiposo branco
WT Wild-type
ZIC1 Gene zinc finger of the cerebellum 1 α-MSH Hormônio estimulador de melanócitos alfa
SUMÁRIO
Página
INTRODUÇÃO ... 19
OBJETIVOS ... 34
JUSTIFICATIVA PARA O ESTUDO... 34
RESULTADOS ... 35
Abstract ... 36
Introduction... 37
Materials and methods... 37
Results ... 41 Discussion ... 51 Author Contributions ... 55 Ethics approval ... 55 Competing interests ... 55 Acknowledgments ... 55 Funding ... 56
Consent for publication under declaration ……… 56
Data Availability ……… 56
CONCLUSÕES ... 57
REFERÊNCIAS ... 58
INTRODUÇÃO
A obesidade é uma doença crônica, caracterizada pelo acúmulo excessivo de gordura corporal, sendo importante fator de risco para doenças como diabetes, infarto do miocárdio, aterosclerose, doenças hepáticas e alguns tipos de câncer, com reflexo importante na qualidade de vida e nas taxas de mortalidade da população. Em 2016, cerca de 1,9 bilhões de indivíduos adultos no mundo estavam com sobrepeso e desses, 650 milhões eram obesos. Existem previsões indicando que em 2030 haverão 2,16 bilhões de adultos com sobrepeso e 1,12 bilhões com obesidade (somados, serão cerca de 38% da população) (WHO, 2018; KELLY et al., 2008). No Brasil, estudos relacionados à obesidade realizados entre as décadas de 1970 e 2000 revelaram uma tendência ao crescimento do sobrepeso, com IMC maior que 25 em adultos, sendo que esta tendência chega a ser maior que o dobro da observada em 1975 (MONTEIRO et al., 2007). Além disso, em 2016 cerca de 50% da população brasileira estava com sobrepeso e 20% com obesidade (aumento de 26% e 60% em relação aos dados de 2006 sobre incidência de sobrepeso e obesidade, respectivamente) (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2018).
Uma vez estabelecida, a obesidade favorece o desenvolvimento de resistência à insulina, diabetes, doenças cardiovasculares, hipertensão, dislipidemia e alguns tipos de câncer, impactando na qualidade de vida e nas taxas de mortalidade da população. Estima-se que em 2015 cerca de 2,7 milhões de mortes foram devido a doenças cardiovasculares, e 600 mil ao diabetes (GBD 2015 OBESITY COLLABORATORS, 2017).
Para grande parte da população, o acumulo de gordura corporal é resultado de complexas interações genéticas e ambientais (FAROOQI & O’RAHILLY, 2006). Mudanças no estilo de vida contemporâneas têm sido apontadas como responsáveis pelo rápido crescimento da incidência e prevalência da obesidade (KOPELMAN, 2000). A partir da revolução industrial, o fácil acesso a alimentos palatáveis, com grande densidade calórica, fez com que a obesidade chegasse a níveis alarmantes. Na década de 70, nos EUA houve uma mudança nas leis e impostos sobre alimentos processados, permitindo que a indústria investisse neste ramo e que a população tivesse acesso a estes produtos. Desta forma, houve um acréscimo médio de 200 quilocalorias (kcal)/dia na alimentação, que refletiu diretamente no aumento do peso corporal (SWINBURN, 2011; VANDEVIJVERE et al., 2015).
da obesidade. Nas últimas décadas, acreditou-se que o carboidrato era o principal responsável pelo aumento de peso, motivando as pessoas a adotarem dietas com redução deste nutriente. Entretanto, dietas ricas em lipídios, principalmente por ácidos graxos saturados, demonstraram forte associação com aumento do peso corpóreo. Além disso, também foi observado que indivíduos obesos ingeriam menos carboidratos do que os indivíduos magros (RAATZ et al., 2017).
Devido ao aumento da prevalência mundial da obesidade e das comorbidades associadas a ela, buscam-se alternativas a mudanças comportamentais, dietas, exercícios físicos e desenvolvimento de fármacos para perda de peso. Alguns medicamentos induzem perda do apetite, aumento da saciedade ou inibição da absorção de nutrientes, porém nenhum destes mostrou resultados definitivos na perda de peso, e em muitos casos, os indivíduos voltam a ganhar peso depois do tratamento (KIM et al., 2014).
Invariavelmente, o ganho de peso resulta de um desequilíbrio entre a ingestão calórica e o gasto energético. Intuitivamente, parece um problema de fácil solução: a redução da ingestão calórica associada ao aumento de gasto energético seria uma estratégia viável para a manutenção de um peso saudável. Entretanto, na prática, estudos clínicos revelam que poucos indivíduos conseguem modificar seu comportamento de forma suficiente e duradoura para manter o peso perdido definitivamente (VELLOSO & SCHWARTZ, 2011). Estudos feitos nos últimos 15 anos mostram que não só o valor calórico das nutrientes é determinante para o ganho de peso, mas também alterações funcionais causadas por alguns nutrientes, particularmente gorduras saturadas, danificando o regulatório da homeostase energética no hipotálamo.
Os sinais periféricos gerados em decorrência do consumo, absorção e armazenamento de nutrientes regulam respostas cerebrais que tem por finalidade controlar a fome, o gasto energético e disponibilidade de locomoção. O hipotálamo executa essa função através grupos de neurônios especializados que se comunicam através de determinados neurotransmissores (VELLOSO & SCHWARTZ, 2011).
Uma importante subpopulação de neurônios hipotalâmicos de primeira ordem envolvida no controle dos estoques de energia corporal localiza-se no núcleo arqueado hipotalâmico e produz proopiomelanocortina (POMC), que é clivada e origina o hormônio estimulador de melanócitos α (α-MSH). Este por sua vez, interage com receptores melanocortina 3 e 4 (MC3R e MC4R) em neurônio de segunda ordem
e em outras regiões do cérebro, produzindo efeitos catabólicos. Estas células também produzem o transcrito regulado por cocaína e anfetamina (CART), que tem efeito anorexigênico. Outra subpopulação neuronal sintetiza hormônios orexigênicos anabólicos, como a proteína relacionada ao Agouti (AgRP), um antagonista dos receptores MC3R e MC4R, e neuropeptídeo Y (NPY), que atua em receptores Y e estimula a ingestão alimentar (COLL et al., 2007).
Os neurônios de segunda ordem que expressam esses receptores estão localizados, principalmente, em dois núcleos hipotalâmicos: o núcleo paraventricular, cujas células produzem o hormônio liberador de corticotrofina (CRH) e o hormônio liberador de tireotrofina (TRH), com funções anorexigênicas e pró-termogênicas, e o hipotálamo lateral, que expressa orexina e o hormônio concentrador de melanina (MCH), com funções orexigênicas e antitermogênicas (VELLOSO, 2006).
Recentemente, um estudo demonstrou que os neurônios tirosina hidroxilase (TH) do núcleo arqueado também estão envolvidos no controle da homeostase energética, uma vez que foi observado que estas células projetam axônios para regiões hipotalâmicas, importantes neste processo. Além disso, a fotoestimulação dos neurônios TH foi capaz de inibir neurônios POMC, hiperpolarizar neurônios paraventriculares e estimular o consumo alimentar. Em contrapartida, o silenciamento dos neurônios TH com adenovírus levou a redução do peso corpóreo (ZHANG & VAN DEN POL, 2016).
Em estado de jejum, sinais periféricos induzem a expressão de NPY/AgRP e inibição POMC/CART, que coordenam sinais para neurônios de segunda ordem, desencadeando um efeito final orexigênico e de redução de gasto energético. Já em estado pós-prandial, neurônios POMC/CART são estimulados e NPY/AgRP inibidos, o que promove um efeito anorexigênico e aumento do gasto energético (BARSH & SCHWARTZ, 2002).
Inúmeras substâncias circulantes, produzidas principalmente no tecido adiposo, trato gastrointestinal e pâncreas (tais como: leptina, GLP-1, grelina e insulina), além dos nutrientes, podem atuar no hipotálamo e em regiões do sistema nervoso central, como no núcleo do trato solitário, influenciando no comportamento alimentar (SANDOVAL et al., 2008). Além disso, em algumas condições como a obesidade, o funcionamento adequado deste sistema é comprometido, e um dos fatores que pode contribuir para esta disfunção é a inflamação (ARAÚJO et al., 2011).
adiposo marrom (brown adipose tissue – BAT). A principal função deste tecido é armazenar energia durante períodos de balanço energético positivo, em forma de triacilgliceróis, e mobilizá-la quimicamente, a partir da oxidação destes lipídios, gerando calor (termogênese adaptativa) de acordo com a necessidade (HIMMS-HAGEN, 1990, LANGIN, 2010). Diferentemente do tecido adiposo branco (white adipose tissue – WAT), a reserva lipídica do BAT é de seu uso exclusivo (NEDERGAARD; LINDBERG, 1982). Além disso, o BAT também é capaz de utilizar de ácidos graxos provenientes da lipólise do WAT para termogênese (LANGIN, 2010).
O BAT está presente em vários mamíferos, tais como roedores e animais hibernantes, colaborando para a manutenção da temperatura corporal (OBERKOFLER et al., 1997; LANGIN, 2010). Acreditava-se que em humanos ele era presente e ativo somente em recém-nascidos, sendo evolutivamente essencial para termogênese frente à abrupta mudança de temperatura ambiente que ocorre após nascimento, e que desaparecia ao longo da vida (ASTRUP et al., 1985; COULTER et al., 2003). Vários estudos de medicina nuclear utilizando o radiofármaco 18F-fluordesoxiglicose (FDG) demonstraram a presença deste tecido em humanos adultos (MINOTTI et al., 2004; TRUONG et al., 2005; NEDERGAARD et al., 2007). Após sua administração, o FDG é transportado para dentro das células de forma semelhante à glicose, porém não é metabolizado e se acumula, podendo ser anatomicamente detectado devido sua emissão de pósitrons. Tecidos com alta taxa metabólica apresentam hipercaptação de PDG (NEDERGAARD et al., 2007). Em estudos que fizeram análise detalhada de imagens de tomografias por emissão de pósitrons com FDG combinada à tomografia computadorizada (FDG PET-CT) foi possível observar grande densidade de tecidos compatíveis com o BAT em adultos (MINOTTI et al., 2004; TRUONG et al., 2005; CYPESS et al., 2009; SAITO et al., 2009; VAN MARKEN LICHTENBELT et al., 2009; VIRTANEN et al., 2009).
A localização do BAT varia entre as espécies, porém é mais frequente nas regiões do pescoço, interescapular, subescapular, axilar, intercostal e ao longo de alguns vasos sanguíneos abdominais e torácicos (YOUNG et al., 1984; VAN MARKEN LICHTENBELT et al., 2009). Em condições normais, o BAT é constituído principalmente por adipócitos marrons, que são células multiloculadas que possuem várias gotículas de gorduras em seu citoplasma. Essas células apresentam grande número de mitocôndrias que, por não possuírem enzimas necessárias para produção de ATP, oxidam lipídeos para geração de calor (CANNON & NEDERGAARD, 2004). Os adipócitos marrons são amplamente inervados pelo sistema nervoso simpático que
regula sua atividade metabólica e termogênica (HIMMS-HAGEN, 1991; BARTNESS & SONG, 2005).
A geração de calor pelo BAT ocorre classicamente devido a atividade da proteína desaclopadora-1 (UCP-1), expressa na membrana interna das mitocôndrias dos adipócitos marrons. A UCP-1 permite a dissipação do gradiente eletroquímico de prótons, gerado pela cadeia respiratória mitocondrial, e consequentemente liberando energia em forma de calor (RICQUIER & BOUILLAUD, 2000).
A ativação do BAT ocorre principalmente devida a redução da temperatura corporal abaixo da termoneutralidade. Regiões específicas do sistema nervoso central processam essas informações e coordenam estímulos simpáticos ao BAT. Noradrenalina liberada pelos terminais simpáticos adjuntos aos adipócitos marrons se liga em receptores adrenérgicos β3, induzindo a termogênese neste tecido (CONTRERAS et al., 2015). A dieta estimula a produção de calor pelo BAT de forma semelhante ao frio (termogênese por dieta (MERCER & TRAYHURN, 1987).
Alguns fatores, tais como temperatura ambiente (HUTTUNEN et al., 1981; GARCIA et al., 2004), idade (SAITO et al., 2009), sexo (CYPESS et al., 2009), dieta (WILLIAMS & KOLODNY, 2008), variações genéticas (HOFMANN et al., 2001; KOZAK, 2014), fármacos (GELFAND et al., 2005; PARYSOW et al., 2007) e variações de atividade do SNS (FOSTER et al., 1982), podem alterar a função e tamanho do BAT, bem como estimular conversão do WAT em um tecido com características do BAT, processo conhecido como browning (KAISANLAHTI & GLUMOFF, 2019). A exposição ao frio e administração de β adrenérgicos induzem a proliferação de adipócitos marrons no WAT (COUSIN et al., 1992; GUERRA et al., 1998; HIMMS-HAGEN et al., 2000). O frio por período prolongado também pode aumentar a expressão de UCP-1 e induzir a hiperplasia do BAT (JACOBSSON et al., 1985; GUERRA et al., 1998). Em contrapartida, denervação simpática do BAT e uso crônico de β bloqueadores contribuem para atrofia e diminuição da atividade termogênica deste tecido, bem como sua modificação histológica, tornando-se semelhante ao WAT (DESAUTELS et al., 1986; MINOKOSHI et al., 1986; CHAMPIGNY et al., 1991).
A presença e atividade do BAT podem também estar associadas à obesidade. Camundongos db/db apresentam menor geração de calor pelo BAT, bem como são mais sensíveis ao frio (ROMSOS et al., 1981; TSCHÖP & HEIMAN, 2001). A atividade do BAT é menor em indivíduos com sobrepeso ou obesos em relação a indivíduos magros (DEL MAR GONZALES-BARROSO et al., 2000). Além disso, dados da
literatura evidenciam correlação inversa entre o tamanho do BAT e o IMC (CYPESS et al., 2009), bem como elevada quantidade deste tecido tem efeito protetor para desenvolvimento da obesidade induzida por dieta e para diabetes (CINTI, 2005; ALMIND et al., 2007). Estratégias para aumentar a atividade e tamanho do BAT e reduzir o peso corporal tem sido cada vez mais estudadas para controle da obesidade.
A dificuldade do tratamento da obesidade pode ser atribuída, pelo menos em parte, a perdas funcionais hipotalâmicas observadas tanto em pacientes obesos quanto em animais com obesidade induzida pelo consumo de uma dieta rica em gordura saturada, num padrão de alimentação denominado ocidental (MCNAY et al., 2012). O efeito do consumo de dieta rica em gordura saturada na promoção da inflamação no hipotálamo já foi descrito por nosso grupo. O estudo de Milanski et al. (2009) mostrou que o consumo de dieta hiperlipídica por 8 semanas ou administração direta de ácidos graxos saturados no hipotálamo causaram ativação da resposta imune inata em ratos, com produção de citocina pró-inflamatórias. Desde então, na última década o nosso grupo e outros laboratórios demonstraram que o hipotálamo parece ser o primeiro local a desencadear resposta inflamatória devido ao consumo de gordura saturada (DE SOUZA et al., 2005, AMARAL et al., 2006; ZHANG et al., 2008; CAI, 2009; MILANSKI et al., 2009; DENIS et al., 2010; MILANSKI et al., 2012; ARRUDA et al., 2011; THALER et al., 2012; VALDEARCOS et al., 2014).
Sinais inflamatórios gerados no hipotálamo tem capacidade de ativar vias inflamatórias intracelulares, e uma vez ativas, elas regulam de forma inibitória os sinais da insulina e leptina, oferecendo assim uma explicação mecanistica de como ocorre a resistência à insulina e leptina no hipotálamo (GREGOR et al., 2011).
Os primeiros estudos a respeito de distúrbios funcionais por inflamação no hipotálamo foram feitos em modelos animais alimentados com dieta hiperlipídica por quatro ou mais semanas. O estudo de Thaler et al. (2012 e 2013) mostrou que o desenvolvimento da inflamação hipotalâmica precede o estabelecimento do fenótipo obeso. Apenas um dia de dieta rica em gordura saturada é suficiente para desencadear uma resposta inflamatória no hipotálamo, com aumento da expressão de citocinas próinflamatórias, quando não há alterações significativas na massa adiposa. Se o consumo for estendido para uma semana, ocorre dano neuronal e gliose no núcleo arqueado, comprometendo a homeostase energética (THALER et al., 2012). Mais recentemente, um trabalho de nosso grupo mostrou que esse efeito já é detectado após algumas horas de exposição (CARRARO et al., 2018). O papel das citocinas na gênese da obesidade tem sido cada vez mais evidente.
Uma das citocinas que podem estar envolvidas neste processo é a interleucina 17 (IL-17). Há alguns anos, um estudo demonstrou que IL-17 pode controlar a expressão da leptina, predispondo camundongos à obesidade (AHMED & GAFFEN, 2010). Outro estudo observou que a IL-17 foi capaz de inibir adipogênese, modulou acúmulo de gordura no tecido adiposo e regulou glicemia em camundongos. Além disso, animais que apresentavam deficiência de IL-17, quando desafiados com dieta hiperlipídica, eram mais obesos e tinham maior acúmulo de gordura no tecido adiposo (ZÚÑIGA et al., 2010).
A IL-17 é membro de uma família de citocinas pró-inflamatórias que atuam em vários tipos de células, induzindo a expressão de fator estimulante de colônias granulocíticas (G-CSF), interleucina 6, quimiocinas, citocinas, mucinas, metaloproteínas de matriz e peptídeos antimicrobianos (GAFFEN, 2008; CHANG & DONG, 2011), permitindo a expansão e recrutamento de neutrófilos durante a resposta imunológica, ligando a resposta imunológica inata com a adaptativa (KOLLS & LINDÉN, 2004; XU & CAO, 2010), sendo importante também em processos imunológicos em resposta a processos infecciosos (YE et al., 2001; HUANG et al., 2004; HAMADA et al., 2008; LU et al., 2008; RAFFATELLU et al., 2008; ALGOOD et al., 2009; CONTI et al., 2009; ISHIGAME et al., 2009; DA MATTA GUEDES et al., 2010; CHO et al., 2010; MIYAZAKI et al., 2010; XU et al., 2010; SURYAWANSHI et al., 2011), além de estar associada a vários processos inflamatórios, como em doenças autoimunes, desordens metabólicas e câncer (YE et al., 2001; CHUNG et al., 2003; HUANG et al., 2004; OUYANG et al.,2008; ISHIGAME et al., 2009;AHMED & GAFFEN, 2010; MILNER, 2011; KUCHROO et al., 2012; TRINCHIERI 2012; GALLIMORE & GODKIN, 2013). Em humanos, o gene codificador da IL-17 foi mapeado no cromossomo 6p12 (MOSELEY et al., 2003), e seu produto corresponde a uma proteína constituída de 155 aminoácidos, com peso molecular de aproximadamente 15 kilodaltons (kDa), secretada como glicoproteína dimérica de 30-35 kDa com ligação dissulfeto. O polipeptídeo IL-17 é composto de uma sequência sinal de 19 aminoácidos, seguido de um fragmento maduro de 136 aminoácidos. Contém pelo menos um sítio de glicosilação N-ligada, e seis resíduos de cisteína que formam ligações intermoleculares durante a dimerização (YAO et al., 1995a).
A IL-17 foi inicialmente descrita por Rouvier et al. (1993), sendo naquela oportunidade denominada CTLA-8, como um transcrito de hibridomas de linfócitos T murinos, que demonstrou grande homologia à proteína codificada pelo gene ORF13 do vírus linfotrófico de células T herpes virus Saimiri. O estudo de Yao et al. (1995b)
caracterizou a CTLA-8 como uma nova citocina, que interage com seu receptor específico, também inédito, passando a serem denominados como IL-17 e receptor de IL-17 (IL-17R), respectivamente. Posteriormente, análises de bancos de dados e de estratégias de reação em cadeia da polimerase degenerada permitiram a identificação de outras cinco citocinas homólogas, e a 17 passou-se a ser designada como IL-17A, indicando ser a primeira citocina descoberta desta família, que agora inclui seis isoformas distintas, IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E (também conhecida como IL-25) e IL-17F (LI et al., 2000; FORT et al., 2001; LEE et al., 2001; HURST et al., 2002; STARNES et al., 2002).
As citocinas que compõem esta família foram identificadas de acordo com a homologia de suas regiões de aminoácidos, e até o momento suas funções especificas não estão totalmente esclarecidas (GAFFEN, 2009). A citocina mais estudada desta família, a IL-17A, está envolvida em processos de autoimunidade (NAKAE et al., 2003; ITO et al., 2008; RIZZO et al., 2011), alergias (NAKAE et al., 2002; ISHIGAME et al., 2009) e tumores (WU et al., 2009; CHAE et al., 2010), e tem papel essencial na defesa imunológica contra infecções (ISHIGAME et al., 2009). A IL-17F tem maior semelhança com a IL-17A entre as demais citocinas (em humanos, cerca de 60% de suas sequências proteicas são homologas), e está envolvida com a defesa imunológica em mucosas (ISHIGAME et al., 2009). Estudos de cristalografia indicam que as IL-17A e IL-17F podem ainda ser secretadas como homodímeros (17A/A e 17F/F) e heterodímeros (17A/F), e o 17A/F é mais potente que a IL-17F, mas menos efetiva do que a IL-17A na indução de expressão de outras moléculas (LIANG et al., 2007; WRIGHT et al., 2007).
A IL-17 é produzida principalmente por linfócitos T auxiliares (Th) CD4+ ativados e especializados, que não secretam citocinas típicas de Th1 e Th2 (HARRINGTON et al., 2005; PARK et al., 2005) e que expressam o fator de transcrição órfão gama relacionado a ácido retinóico (RORγt) para o seu desenvolvimento (IVANOV et al., 2006), conhecidos como Th17 (INFANTE-DUARTE et al., 2000). A diferenciação das células Th17 é dependente de fator transformador de crescimento beta (TGF-β) 1, IL-1β e IL-6 (BETTELLI et al., 2006; MANGAN et al., 2006; VELDHOEN et al., 2006; VOLPE et al., 2008), enquanto a IL-23 é necessária para a maturação das mesmas (MCGEACHY et al., 2009). Após expressão de receptores de IL-23 induzida por IL-6 ou IL-21, a IL-23 associada ao TGF-β induz a expressão de RORγt e, subsequentemente, de IL-17 (CUA & TATO, 2010). As células Th17 também podem secretar outras citocinas pró-inflamatórias, como fator de
necrose tumoral (TNF) alfa, IL-22 e IL-26 (ZHENG et al., 2007). Subgrupos de Th17 secretam IL-10 (XU et al., 2009; RUTZ et al., 2013), uma citocina antinflamatória, que desempenha importante papel protetor, limitando a inflamação e danos aos tecidos, induzidos normalmente pela 17 (RUTZ et al., 2013; SHABGAH et al., 2014). A IL-17A e a IL-17F induzem a secreção de peptídeos antimicrobianos (β-defensina, S100A7, S100A8, e S100A9) (LIANG et al., 2006), mucinas (MUC5B e MUC5AC) (CHEN et al., 2003), citocinas (IL-6, G-CSF, fator estimulante de colônia de granulócitos e macrófagos [GM-CSF]) (INFANTE-DUARTE et al., 2000; KAWAGUCHI et al., 2001; JONES & CHAN, 2002), quimiocinas (CXCL1, CXCL5, CXCL8, IL-8, CCL2, e CCL7) (JONES & CHAN, 2002; MCALLISTER et al., 2005; PARK et al., 2005; LIANG et al., 2007), metaloproteína de matriz (MMP1, MMP3, MMP9, e MMP13) (PARK et al., 2005; YAGI et al., 2007) e proteínas de adesão celular tight junction (TJ) (claudinas) (KINUGASA et al., 2000) de fibroblastos, células endoteliais e epiteliais. Além disso, a IL-17A induz a expressão de moléculas de adesão intercelular 1 (ICAM-1) em queratinócitos (ALBANESI et al., 1999), IL-1 e TNF em macrófagos, óxido nítrico sintase induzível e ciclooxigenase-2 (COX-2) em condrócitos (SHALOM-BARAK et al., 1998), COX-2 dependente de prostaglandina E, mediante a expressão de ligante ativador de receptores de fator nuclear κB (NFκB), em osteoblastos (KOTAKE et al., 1999).
Outras células do sistema imunológico inato e adaptativo, como linfócitos T CD8+ (HE et al., 2006), células Tγδ (SHIBATA et al., 2007), células natural killer (NK) (PASSOS et al., 2010), células NKT (RACHITSKAYA et al., 2008), células indutoras de tecido linfóide (LTi) (TAKATORI et al., 2009), monócitos (STARNES et al., 2001), macrófagos (SONG et al., 2008), microglia (KLEINSCHEK et al., 2007), neutrófilos (FERRETTI et al., 2003), eosinófilos (DOLGACHEV et al., 2009), células de Paneth (TAKAHASHI et al., 2008), bem como células não imunológicas, como astrócitos e oligodendrócitos (TZARTOS et al., 2008), e células colônicas (ISHIGAME et al., 2009), também podem secretar IL-17 em determinadas circunstancias. Em geral, as células produtoras de IL-17 estão presentes principalmente em mucosas de diversos órgãos, como pele, pulmão, rim, baço, timo, fígado, pâncreas, e intestino (CUA & TATO, 2010).
Uma vez secretada, a IL-17 atua sobre receptores IL-17R constituindo uma família composta por cinco isoformas (17RA, 17RB, 17RC, 17RD e IL-17RE) que, assim como seus ligantes, também compartilham sequências protéicas homólogas (WEAVER et al., 2007; GAFFEN, 2009). O gene humano do IL-17R foi
mapeado em clusters presentes no cromossomo 3 (MOSELEY et al., 2003), e seu produto consiste em uma proteína transmembrana de passagem única com aproximadamente 130 kDa. Esta molécula contém um peptídeo de sinal N-terminal de 27 aminoácidos, seguido de um domínio extracelular de 293 aminoácidos, um domínio transmembrana de 21 aminoácidos, e uma cauda citoplasmática longa de 525 aminoácidos. A cadeia destes receptores possui pelo menos sete sítios de glicosilação N-ligada, e o peso molecular da proteína nascente IL-17R tem aproximadamente 128-132 kDa (YAO et al., 1995b). Além disso, tais receptores contêm um domínio de fibronectin III-like em sua parte extracelular (KRAMER et al., 2007) e um domínio SEF/IL-17R (SEFIR) em sua região intracelular (NOVATCHKOVA et al., 2003), associado à proteína adaptadora ACT1, responsável por mediar eventos posteriores à ligação das citocinas em seus receptores (LINDÉN, 2007).
Os IL-17Rs são expressos por vários tipos de células em diferentes tecidos. O IL-17RA está presente principalmente em tecidos hematopoiéticos (GAFFEN, 2009), células epiteliais (KAO et al., 2004; HUANG et al., 2007; FUJISAWA et al., 2009) e endoteliais (HOT et al., 2012; LIU et al., 2012), fibroblastos (MOLET et al., 2001; HWANG et al., 2004) e macrófagos (ISHIGAME et al., 2009). Já o IL-17RC é expresso principalmente em células não imunológicas (ISHIGAME et al., 2009).
Figura 1: Família de citocinas e receptores da interleucina 17. A família da citocina IL-17 apresenta seis isoformas distintas (A a F). A família dos seus receptores apresenta cinco isoformas diferentes, os quais apresentam o domínio SEFIR em sua porção citoplasmática. O IL-17RA, isoforma comum em todos os receptores, também apresenta domínio inibidor CBAD. (Adaptado de Amatya et al., 2017)
Após o estímulo gerado pela ligação da IL-17, o IL-17RA inicia a ativação de vias de sinalização para induzir a produção de mediadores pró-inflamatórios. Entretanto, a configuração monomérica do receptor é insuficiente para mediar o sinal da IL-17A e IL-17F, sendo necessária a formação de um heterotrímero para desencadear este processo, compostos de IL-17RA e IL-17RC. Acredita-se que a ligação da IL-17 ao IL-17RA altera a afinidade e especificidade do evento de ligação secundário, promovendo a formação de receptores heterotriméricos preferencialmente, ao invés de homodiméricos (TOY et al., 2006).
Convencionalmente, após a ligação da IL-17 aos IL-17R, no domínio SEFIR do receptor ocorre o recrutamento da ACT1, que possui o domínio enzimático U-box, que atua como E3-ubiquitina ligase. A ACT1 cria sítios de ligação para o fator associado de receptor de TNF 6 (TRAF6) e promove sua ubiquitinação. O TRAF6 poli-ubiquitinado ativa TGF-β dependente de TRAF6 (TAK1), que, por sua vez, ativa o NFκB (LIU et al., 2009), importante fator de transcrição gênica associado à indução da inflamação (YAO et al., 1995b). Entretanto, a IL-17 é um ativador fraco para NFκB, podendo atuar de forma sinérgica com outras citocinas, como TNFα, para promover uma resposta pró-inflamatória prolongada. Uma vez que TNFα, um forte ativador de NFκB, promove a expressão de mRNA pró-inflamatórios altamente instáveis, a IL-17 promove aumento da expressão destas quimiocinas através da estabilização de seus mRNA. Este processo se inicia após a estimulação da IL-17 e formação do completo IL-17R-ACT1, que recruta IKKi, e fosforila a ACT1, criando sítios de ligação para TRAF2 e TRAF5. O complexo ACT1-TRAF2-TRAF5 formado seqüestra o fator de splicing rico em serina/arginina 1, inibindo sua ligação à região 3’ não traduzida de mRNA pró-inflamatórios para clivagem, aumentando a estabilidade destas moléculas (HARTUPEE et al., 2007; BULEK et al.,2011; SUN et al.,2011).
Figura 2: Via de sinalização da interleucina 17. O complexo formado pelas isoformas do receptor da IL-17RA e RC é amplamente expresso em vários tipos teciduais e celulares e seus ligantes incluem os heterodímeros IL-17A/A, F/F e A/F. Após a ligação da IL-17, a proteína adaptadora ACT1 ativa múltiplas vias atuando em diferentes proteínas TRAF. A ativação do TRAF6 resulta no desencadeamento das vias f NF-kB, C/EBPb, C/EBPd, e MAPK. A ligação da 17 também pode ativar MEKK3 e MEK5 via TRAF4, que ativam ERK5. A sinalização da IL-17 via TRAF6 e TRAF4 resultam na ativação de genes inflamatórios, enquanto a ativação via ACT1 – TRAF2 – TRAF5 resulta no controle da estabilidade de mRNAs de genes alvo da IL-17. (Adaptado de Amatya et al., 2017)
A IL-17 desempenha importante papel em processos inflamatórios e na progressão de algumas patologias. No contexto do sistema nervoso, já foi demonstrado que a IL-17 pode estar envolvida no desenvolvimento de esclerose múltipla (MATUSEVICIUS et al., 1999). Na barreira hematoencefálica de camundongos com encefalopatia autoimune, a IL-17A aumenta o estresse oxidativo, aumentando a contração do endotélio, acompanhado da redução da expressão de ocludina, favorecendo sua ruptura (HUPPERT et al., 2010). Além disso, este efeito é menor quando se neutraliza a IL-17A (HUPPERT et al., 2010; SETIADI et al., 2019). Na obesidade, a ruptura da barreira hematoncefálica ocorre de forma semelhante. O aumento da expressão sistêmica de citocinas inflamatórias em indivíduos obesos pode
aumentar a permeabilidade da barreira, bem com a diapedese de células imunológicas para o SNC, aumentando a neuroinflamação observada nesta patologia (RHEA et al., 2017). Esta é uma das evidências de que a IL-17 demonstra importante participação na homeostase do SNC.
Além de participar destes processos, a IL-17 apresenta outros importantes papéis fisiológicos. Estudos revelaram que um dos mais importantes sítios de expressão e ação da IL-17 é a barreira mucosa do trato digestório (CUA & TATO, 2010). Nesta região, a IL-17 proveniente principalmente de células Th17 (RUBINO et al., 2012) induz a expressão de transcritos tais como, moléculas de adesão TJ e anti-microbianas, que auxiliam na manutenção da barreira intestinal. A mucosa intestinal representa a maior superfície contato entre o meio interno do organismo e o ambiente externo (KATO & OWEN, 2005), sendo abundantemente exposta a microorganismos, a maioria dos quais são comensais importantes para prevenção do crescimento excessivo de bactérias patogênicas e necessárias para homeostase imune. Desta forma, o sistema imunológico desenvolveu mecanismos importantes para distinção entre os residentes intestinais nocivos e benéficos (MARKS & CRAFT, 2009), e a IL-17 tem importante papel neste processo.
A microbiota do intestino tem papel crucial na homeostase imune intestinal, incluindo o desenvolvimento e a regulação das células Th17 intestinais. Algumas bactérias filamentosas segmentadas podem promover a geração de células Th17, enquanto bactérias intestinais comensais, como Bacteroides fragilis, reprimem a produção de IL-17, sugerindo que a microbiota intestinal desempenhe importante papel no equilíbrio entre a produção e a resposta à IL-17 (GABORIAU-ROUTHIAU et al., 2009; IVANOV et al., 2009; ROUND et al., 2011). Além disso, animais tratados com antibióticos ou germ-free apresentam redução significativa das células Th17 intestinais (ATARASHI et al., 2008; IVANOV et al., 2008). Ademais, distúrbios na microbiota levam à redução da expressão das TJ, aumentando a permeabilidade intestinal, o que favorece a translocação de lipopolissacarídeos bacterianos (LPS) de bactérias Gram negativas, e consequentemente pode levar a endotoxemia metabólica associada com o aumento do perfil inflamatório, ganho de peso corporal e resistência à insulina (GOMES et al., 2014).
Existem alguns indícios que a IL-17 esteja envolvida na obesidade. Camundongos com obesidade induzida por dieta apresentaram maior quantidade de Th17, bem como maior quantidade de IL-17 sérica (WINER et al., 2009). Mulheres obesas tiveram maior secreção de IL-17 plasmática (SUMARAC-DUMANOVIC et al.,
2009).
Também já foi demonstrado que a alimentação é capaz de modular a secreção de IL-17. Um estudo realizado com voluntários que estavam com sobrepeso demonstrou que imediatamente após uma única refeição rica em gorduras já é possível observar aumento dos níveis plasmáticos dessa interleucina (PELUSO et al., 2012).
Apesar de terem vários estudos mostrando o envolvimento da IL-17 em algumas doenças, inclusive com diabetes (BRADSHAW et al., 2009; JAGANNATHAN-BOGDAN et al., 2011; SUMARAC-DUMANOVIC et al., 2013) seu envolvimento na obesidade ainda não está totalmente esclarecido.
O papel da IL-17 produzida no intestino já tem sido bastante estudado no contexto do controle da permeabilidade intestinal em resposta a danos patogênicos, porém devido a falta de dados que relacionem a localização da expressão dessa citocina em resposta a passagem de alimentos, já que está é a função principal desse órgão, o nosso grupo desenvolveu um projeto focado nessa questão.
Num estudo desenvolvido no Laboratório de Sinalização Celular e financiado pela FAPESP (CEPID 2013/07607-8 e Bolsa de Doutorado da aluna Carina Solon 2010/52378-9) observou-se que a expressão do mRNA da IL-17 é maior no duodeno, jejuno e íleo, e que após uma hora com uma realimentação com high fat diet (HFD) a expressão dessa interleucina é aumentada no íleo. A fonte da expressão dessa citocina é atribuída aos linfócitos Th17 residentes no trato gastrointestinal, já que a expressão do mRNA da IL-17 no intestino não é vista em camundongos NUDE, cepa que não apresenta linfócitos T. E ainda que o aumento da expressão do mRNA da IL-17 no intestino reflete em um aumento plasmático dessa citocina que desempenha um importante efeito na secreção de insulina, de maneira semelhante a hormônios incretínicos. Esses dados colocam a IL-17 numa posição de destaque como uma molécula potencialmente envolvida na comunicação entre o sistema imune e o metabolismo glicêmico. Vale ressaltar que estes dados são confidenciais e estão sob submissão à revista internacional (processo FAPESP 2010/52378-9).
Um estudo-piloto realizado no Laboratório de Sinalização Celular demonstrou que, camundongos da linhagem C57BL/6, mantidos em jejum de ração padrão overnight, seguido de 2 horas de oferta de ração novamente e, por fim, 4 horas de jejum, recebendo em seguida uma aplicação intraperitoneal de IL-17 em concentração previamente descrita (WITOWSKI et al., 2000) apresentaram aumento significativo da expressão de mRNA do neuropeptídeo POMC em hipotálamo após 2 horas da
administração da citocina, em relação a animais controle, que receberam soro fisiológico 0,9%. Este resultado sugere que a IL-17 pode estar envolvida na modulação da fome e homeostase energética hipotalâmica, porém até onde atinge nosso conhecimento, os mecanismos envolvidos neste processo não estão estabelecidos. Considerando este fato, foram definidos os objetivos deste estudo.
A IL-17 é produzida no intestino, pode ser regulada pela alimentação e pela microbiota intestinal. Outros peptídeos que também são secretados por células intestinais, são regulados da mesma forma desempenham papel importante no sistema nervoso central. O glucagon-like peptide 1 (GLP-1), por exemplo, é um peptídeo é secretado por células intestinais e sua secreção é modulada por nutrientes. Além disso, mostrou-se ter atividade em células hipotalâmicas, controlando a homeostase energética devido a sua capacidade de gerar um efeito anorexigênico (SHAH et al., 2014).
Baseando-se em todas essas informações, aventou-se a hipótese de que se IL-17 é um fator intestinal que está relacionado com à alimentação, existe possibilidade dela participar do controle regulatório da homeostase energética. Desta forma, os objetivos deste estudo foram delineados.
OBJETIVOS Gerais
• Avaliar os efeitos da IL-17 no hipotálamo e tecido adiposo marrom (BAT); Específicos
• Avaliar a expressão de IL-17 tecidual e sérica após ingestão alimentar em camundongos e humanos, respectivamente;
• Avaliar expressão curso-temporal de neurotransmissores hipotalâmicos e marcadores inflamatórios após tratamento com IL-17 in vivo e in vitro;
• Caracterizar da distribuição celular do receptor de IL-17 no hipotálamo;
• Avaliar do efeito de IL-17 na sinalização hipotalâmica;
• Avaliar o consumo alimentar espontâneo após injeção de IL-17 por via IP e intracerebroventricular (ICV);
• Avaliar consumo de O2, produção de CO2, atividade locomotora espontânea após injeção de IL-17 por via IP e intracerebroventricular (ICV);
• Avaliar temperatura do BAT e expressão de marcadores de termogênese após injeção de IL-17 por via IP.
JUSTIFICATIVA PARA O ESTUDO
Existe grande recorrência de ganho de peso em pacientes obesos submetidos aos mais diferentes procedimentos terapêuticos para esta doença. Estudos realizados nos últimos 15 anos revelaram que, tanto em modelos animais como em humanos, a região do cérebro envolvida com o controle da ingestão alimentar e gasto calórico sofre perdas funcionais que resultam no desequilíbrio de subpopulações de neurônios envolvidos com estes processos. Aparentemente, a inflamação do hipotálamo induzida por consumo de dietas ricas em ácidos graxos saturados é uma das principais causas do dano hipotalâmico. No momento, exploram-se os mecanismos desencadeadores da inflamação hipotalâmica da obesidade, e, fatores produzidos no intestino em resposta a dietas ricas em gordura, emergem como potenciais candidatos envolvidos neste processo. Neste contexto, acreditamos que a IL-17 possa desempenhar papel
importante na resposta precoce do hipotálamo ao consumo de alimentos. Nosso estudo deverá contribuir para avanços na caracterização da regulação fisiológica do hipotálamo e poderá ter implicações compreensão da fisiopatologia da obesidade, ao explorar um mecanismo inflamatório que pode conectar o trato digestório ao cérebro.
RESULTADOS
Full-length research report
Interleukin-17 acts in the hypothalamus reducing food intake and increasing brown adipose tissue thermogenesis
Guilherme Nogueira1, Carina Solon1, Rodrigo S. Carraro1, Daiane F. Engel1, Albina F. Ramalho1, Davi Sidarta-Oliveira1, Rodrigo S. Gaspar1, Bruno Geloneze2, Marco A. Vinolo3, Jose Donato Junior4, Licio A. Velloso1
1Laboratory of Cell Signalling-Obesity and Comorbidities Research Center, University of Campinas, Campinas, Brazil
2Laboratory of Investigation in Metabolism and Diabetes, University of Campinas, Campinas, Brazil
3Laboratory of Immunoinflammation, Department of Genetics, Evolution, Microbiology and Immunology, University of Campinas, Campinas, Brazil
4Department of Physiology and Biophysics, Institute of Biomedical Sciences, University of Sao Paulo, Sao Paulo, Brazil
The Laboratory of Cell Signalling belongs to the National Institute of Science and Technology on Neuroimmunomodulation (INCT-NIM)
Corresponding Author: Lício A. Velloso
Laboratory of Cell Signaling, Obesity and Comorbidities Research Center University of Campinas, Campinas, SP, Brazil
Email: lavellos@unicamp.br
Key words: Hormone; Neurotransmitter; Brain; Food; Inflammation; Obesity Running title: IL-17 controls food intake
Number of figures: 9
Highlights
• Interleukin-17 is produced in the intestine in response to food intake
• Interleukin-17 receptor A, but not interleukin-17, is expressed in hypothalamic neurons
• Systemic and intracerebroventricular injection of interleukin-17 reduce caloric intake
• Interleukin-17 increases the expression of POMC in the hypothalamus
Abstract
Interleukin-17 (IL-17) is expressed in the intestine in response to changes in the gut microbiome landscape and plays an important role in intestinal and systemic inflammatory diseases. There is evidence that dietary factors can also modify the expression of intestinal IL-17. Here, we hypothesised that, similar to several other gut-produced factors, IL-17 may act in the hypothalamus to modulate food intake. We confirm that food intake increases IL-17 expression in the mouse ileum and human blood. There is no expression of IL-17 in the hypothalamus; however, IL-17 receptor A was found to be expressed in pro-opiomelanocortin (POMC) and agouti-related peptide (AgRP) neurons. Upon systemic injection, IL-17 promoted a rapid increase in hypothalamic POMC expression, which was followed by a late increase in the expression of AgRP. Both systemic and intracerebroventricular injections of IL-17 promoted a reduction in calorie intake and increased the temperature of brown adipose tissue without affecting whole-body energy expenditure. Thus, IL-17 is a gut-produced factor that is controlled by diet and modulates food intake by acting in the hypothalamus. Our findings provide the first evidence of a cytokine that is acutely regulated by food intake and plays a role in the regulation of eating.
Introduction
Interleukin-17 (IL-17) is highly expressed in the intestine, where it plays a critical role in the coordination of immune responses to modifications in the gut microbiome landscape (GABORIAU-ROUTHIAU et al., 2009; IVANOV et al., 2008; LI et al., 2000). Food is one of the most important environmental factors affecting the number and proportion of microbes living in the gut (TURNBAUGH et al., 2006). In fact, gut microbes undergo remarkable changes in number and composition according to a circadian rhythm, with the most profound fluctuations occurring after the consumption of food (THAISS et al., 2016). Accordingly, intestinal IL-17 is also regulated by dietary factors, and this has been correlated with abnormal systemic metabolism that occurs in obesity and type 2 diabetes (GARIDOU et al., 2015; LI et al., 2017).
Food intake is controlled by specialised neurons of the hypothalamus that respond to a number of hormonal, nutritional, and neural signals (ANDERMANN and LOWELL, 2017; CHALLET, 2019; ROSSI and STUBER, 2018). Some of these signals are provided by gut peptides that are regulated in response to changes in food availability (FETISSOV, 2017; MAYER et al., 2015). Thus, during fasting, the stomach produces ghrelin, which acts in the hypothalamus to increase hunger (TSCHOP et al., 2000). Conversely, following a meal, distinct regions of the gut produce peptides such as glucagon-like peptide 1 (GLP-1), cholecystokinin (CCK), and peptide tyrosine-tyrosine (PYY) that activate a brain anorexigenic response (BATTERHAM et al., 2003; GELONEZE et al., 2017; SECHER et al., 2014; WILLIS et al., 1984).
Changes in gut microbiota can indirectly regulate hypothalamic function by changing the systemic levels of leptin (SCHELE et al., 2013), modifying nutrient harvesting from the gut (COTA et al., 2006; LI et al., 2018), or controlling intestinal autonomic signals to the brain (HYLAND and CRYAN, 2016). However, it is currently unknown whether IL-17 can act directly in the hypothalamus to modulate food intake.
Here, we show that gut IL-17 was rapidly regulated by food intake, and this was followed by changes in blood IL-17 levels. The injection of exogenous IL-17 reduced food intake and increased the expression of the precursor of the anorexigenic neuropeptide, POMC.
Materials and Methods
Experimental model. Eight-week-old male C57BL/6 mice were obtained from
the Animal Facility of the University of Campinas. IL-17-GFP transgenic mice (C57BL/6-Il17atm1Bcgen/J) were originally obtained from the Jackson Laboratory (Stock
No: 018472). POMC reporter mice were produced by breeding the POMC-Cre transgenic mouse (Stock No: 005965; the Jackson Laboratory) with the Cre-inducible enhanced GFP-reporter mouse (Stock No: 004178; the Jackson Laboratory). To visualise AgRP neurons, we bred the AgRP-IRES-Cre mouse (Stock No: 012899; the Jackson Laboratory) with a mouse carrying a loxP-flanked STOP cassette that prevents transcription of the red fluorescent tdTomato protein (Stock No: 007914; the Jackson Laboratory). All mice were kept in cages at 21 ± 5°C, in 12/12 h light/dark cycle, with water and chow ad libitum. All experiments were conducted according to the "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals of the Institute of Laboratory Animal Resources, US National Academy of Sciences" and were approved by the Ethics Committee (CEUA IB/UNICAMP nº 3826-1, and 3826-1(D)/2018). The human experiments were approved by the Institutional Human Ethics Review Board at the University of Campinas (#801/2008). All participants provided written informed consent prior to participation. A total of 11 lean subjects were included. Information regarding subjects is presented in Supplementary Table 1. Following an overnight fast (12 h), subjects were submitted to a standard meal tolerance test (MTT) (PMID:28101843), based on a mixed meal containing 515 kcal (41.8% fat, 40.7% carbohydrates, and 17.5% protein). Blood samples were collected prior to intake of the mixed meal and 120 min after meal intake, from which serum IL-17 levels were determined. Serum samples were stored at -80°C for no longer than three months. IL-17 levels were determined by ELISA according to the recommendations of the manufacturer (R&D Systems, kit #D1700).
Characterisation of IL-17A and IL-17RA tissue expression. Mice were
submitted to an overnight fast; at 8 AM, chow was offered for 2 h and then fasting was undertaken again for 4 h to synchronise the fasting time. Subsequently, mice were anaesthetised with lidocaine [1.0 mg/kg, intraperitoneal (IP)] and thiopental (100 mg/kg, IP). The hypothalamus and fragments of the duodenum, jejunum, ileum, and colon were extracted and prepared for analysis of gene expression by quantitative real-time PCR or immunofluorescence staining.
Stereotaxic surgery. Mice were submitted to cannula implantation in the right
lateral ventricle under xylazine (10 mg/kg, IP) and ketamine (100 mg/kg, IP) anaesthesia. The coordinates were as follows: anteroposterior, 0.34 mm; lateral, 1.0 mm; and depth, 2.2 mm. The efficiency of cannula placement and viability was confirmed by intracerebroventricular (ICV) administration of angiotensin II and measurement of the drinking response.
Food intake. A single administration of 2 µL IL-17 (2.5 pg/µL), leptin (10-6 M), or vehicle ICV, or 100 µL IL-17 (5.0 pg/µL) or vehicle IP were injected in fasted mice, and
food intake was measured for 6 hours. For neuropeptide, cytokine, and IL17-RA gene expression analysis, the hypothalamus was extracted 2 h after treatment.
Time-course experiments. Fasted mice were treated with a single injection of
100 µL IL-17 (5.0 pg/µL) or vehicle IP. The hypothalamus was extracted 1, 2, 4 or 6 h after IL-17 administration, and PCR was performed to determine the expression of neuropeptides, cytokines, and IL-17.
Immunoblotting. Fasted mice were acutely treated with 100 µL IL-17 (5.0
pg/µL), insulin (100 UI/mL), leptin (10-5 M), or vehicle IP. The hypothalamus was extracted after 30 or 60 minutes and homogenised in an anti-protease cocktail (10 mmol/L imidazole, pH 8.0, 4 mmol/L EDTA, 1 mmol/L aprotinin, 2.5 mg/L leupeptin, 30 mg/L trypsin inhibitor, 200 μmol/L DTT, and 200 μmol/L phenylmethylsulphonyl fluoride) using a tissue homogeniser (Polytron-Aggregate, Kinematica, Littau/Luzern, Switzerland). An aliquot of the homogenised tissue was collected, and the total protein was determined by a colorimetric assay kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Samples containing 75 μg protein were incubated for 5 minutes at 95°C in 4-fold Laemmli buffer (1 mmol sodium phosphate/L, pH 7.8, 0.1% bromophenol blue, 50% glycerol, 10% SDS, and 2 % mercaptoethanol) and then separated on 10% or 12% polyacrylamide gels for approximately 2 h. Electrotransfer of the proteins to nitrocellulose membranes (Bio-Rad) was performed using a Trans Blot SD Semi-Dry Transfer Cell (Bio-Rad) for 1 h at 15 V (constant) in buffer containing methanol and SDS. The membranes were blocked with 5% albumin in Tween/Tris-buffered saline (10 mmol Tris/L, 150 mmol NaCl/L, and 0.5% Tween 20), followed incubation with antibodies against the target proteins overnight at 4°C.
Immunofluorescence staining. Fasted C57BL/6, IL-17-GFP, POMC-GFP, and
tdAgRP mice were anaesthetised with a solution of xylazine (10 mg/kg, IP) and ketamine (100 mg/kg, IP), and perfused with saline and 4% paraformaldehyde. The whole brain was removed and placed in 4% paraformaldehyde for 24 h, followed by a 48-h incubation in 30% sucrose solution. The brain was frozen, and coronal sections at a thickness of 20 μm were obtained using a cryostat (LEICA Microsystems, CM1860, Buffalo Grove, IL, USA). The sections were blocked in 5% albumin and 0.2% Tween in PBS solution for 2 h at room temperature, followed by overnight incubation at 4°C with a primary antibody against IL-17RA in blocking buffer. Fragments of the intestine were removed and placed in 4% paraformaldehyde for 24 h; thereafter, specimens were dehydrated, embedded in paraffin, sectioned, and stained. For double immunofluorescence staining, antibodies against GPR120, GFAP, NeuN, TUJ1, or MCH were used. The sections were subsequently incubated for 2 h with FITC and Cy3 secondary antibodies at room temperature, followed by nuclear staining with
TO-PRO®-3 Iodide (642/661) T3605 (1:1000; Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) in PBS for 15 min. Images were obtained using a Leica TCS SP5 II confocal fluorescence microscope. Negative controls, without primary antibodies, were performed for all experiments.
Indirect calorimetry and determination of spontaneous locomotor activity.
Fasted mice were submitted to a single administration of 2 µL IL-17 (2.5 pg/µL) or vehicle ICV. Subsequently, the oxygen consumption, carbon dioxide production, respiratory quotient, and spontaneous locomotor activity were measured in open-circuit calorimeter system chambers (LE405 Gas Analyzer, Panlab-Harvard Apparatus, Holliston), as previously described (RAZOLLI et al., 2015).
Thermographic images. Non-anaesthetised mice, acclimatised at 22−24°C,
were submitted to a snapshot of the dorsal region with a ThermovisorFlir T430SC – INCL WiFi (T6201), and the subscapular temperature was measured using the software according to the manufacturer’s instructions (SMRIGA et al., 2000). The images were obtained prior to and following treatment with a single injection of 100 µL IL-17 (5.0 pg/µL), CL316,243 hydrate (1 mg/kg) (Sigma-Aldrich, #C5976), or vehicle IP.
Bioinformatics analysis. Screening of IL-17RA mRNA levels across different
tissues of a mouse reference panel (ANDREUX et al., 2012) was performed using databases available on Genenetwork (http://www.genenetwork.org). A bar graph containing the mean values for each tissue was constructed using the GraphPad Prism 7 software. For analysis of the public scRNAseq data, raw count matrices were downloaded from Gene Expression Omnibus (GEO). Cells were then filtered according to the following quality control metrics: from Campbell’s data (CAMPBELL et al., 2017), 1000−30000 counts per cell and 200−5000 genes per cell; from Yoo’s data (YOO et al., 2019), 1000−18000 counts per cell and 800−5000 genes per cell. Cells that passed filtering were subsequently embedded in a SPRING force-directed layout based on a K-nearest-neighbour (knn) graph for interactive visualisation (Weinreb et al., 2018) was performed by the Louvain Algorithm in the resulting layout. Reported metadata were then included to allow cluster annotation in Campbell’s dataset (CAMPBELL et al., 2017). For cluster annotation in Yoo’s dataset (YOO et al., 2019), the top 5 differentially expressed genes in each cluster were considered. IL-17 and IL-17RA expression was then visualised using the SPRING web-server (https://kleintools.hms.harvard.edu/tools/spring.html).
Topographical evaluation of gene expression using the Allen Brain Atlas.
In-situ hybridisation data of Il17ra mRNA expression in the mouse brain was retrieved from the Allen Brain Atlas, experiment accession #73520990 (LEIN et al., 2007).
