Vírus. Virologia. Virologistas. - São agentes infecciosos, não celulares. São parasitas intracelulares obrigatórios e infectam hospedeiros específicos

(1)

Vírus

-

São agentes infecciosos, não celulares.

São

parasitas intracelulares

obrigatórios

e

infectam

hospedeiros específicos

_-

_Bactérias

₍_{chamam-se bacteriófagos ou fagos}₎

-

Fungos

-

Outros microrganismos

-

Animais

-

Plantas

-

Insectos

(alguns, são vectores na

transmissão a animais e humanos)

Doenças

(impacto na Saude Pública, na Agricultura, Economia, etc.)

Virologia

Virologistas

(2)

(Maier, Pepper e Gerba,

Environmental Microbiology, Academic Presss, 2000

Principais vias de transmissão

de infeccções virais aos seres

humanos.

Preocupações em Saúde Pública:

- Vírus emergentes (HIV, Ebola, etc,)

- Facilidade de viajar e

alteração do meio Ambiente, podem contribuir para

espalhar “novos” virus para novas áreas

(3)

-

Muitas epidemias de doenças virais ocorreram antes de se

ter percebido a natureza dos agentes causadores.

(Ex. colonização da América pelos europeus (sec. XVI) P. ex. Varíola (small pox)

contribuiu para dizimar

populações nativas)

1884 – Charles Chamberland (colaborador de Pasteur; inventor da autoclave)

inventou um filtro de porcelana para bactérias –

possibilitou a 1ª descoberta de um virus.

1892 – Dimitri Ivanowski – descobriu o virus mosaico do tabaco;

Extractos de folhas infectadas, filtrados através do

filtro de Chamberland, causavam a doença de mosaico do tabaco em plantas saudáveis.

(4)

(Tortora, Funke e Case, Microbiology – an Introduction, 6th edition)

Aspectos que distinguem os virus de organismos celulares:

• Organização estrutural simples

• Um único tipo de ácido nucleico, DNA ou RNA

• Incapazes de se reproduzir fora das células vivas; usam a maquinaria biossintética da célula hospedeira

(5)

A Estrutura dos virus

(6)

Propriedades estruturais gerais

• Nucleocápside

– Genoma viral (

1 ou mais moléculas de DNA ou RNA

)

envolvido por camada proteica (cápside)

• Cápside

– Camada de proteínas que envolve o genoma viral

– Protege o genoma e medeia a transferência do virus para a

célula hospedeira

– Constituida por muitas cópias de um ou mais tipos de unidades

proteicas denominadas capsómeros (cada capsómero pode ser

constituido por 5 ou 6 subunidades - protómeros).

Capsómeros

Unidades proteicas que se auto-associam para formar a

cápside.

VIRIÃO

OU PARTÍCULA VIRAL – vírus completo, fora da célula hospedeira

Ex. Virus icosaédrico

(7)

Tipos morfológicos da cápside

helicoidal

com invólucro

complexo

icosaédrico

(8)

Cápside icosaédrica

- Poliedro regular com 20 faces triangulares com lados iguais e 12 vértices

- Cada tiângulo pode conter uma ou mais unidades proteícas - capsómeros

- Cada capsómero contém 5 ou 6 proteínas

(Alguns causam infecções respiratórias em humanos; alguns causam tumores em animais)

Adenovirus

(9)

Ebola virus

Morfologia de um virus helicoidal sem envelope (nú)

Cápside helicoidal

- Com forma de tubo oco, com paredes constituídas por

um ou mais tipos de proteínas; p.ex. a cápside do vírus

mosaico do tabaco contem apenas um tipo de

subunidade proteica com 158 aminoácidos

- O material genético encontra-se em espiral dentro da cápside

(10)

Morfologia de vírus com envelope

- Nucleocápside (icosaédrico ou helicoidal) envolvido por

uma membrana externa (constituida por lípidos, proteínas

e hidratos de carbono)

- lípidos e hidratos de carbono têm origem na membrana

plasmática ou na membrana do núcleo da célula hospedeira;

as proteínas são específicas do vírus

- muitos possuem espigões de glicoproteínas que lhes conferem

forma de aderir à superfície das células infectadas.

(Ex. muitos virus de animais, alguns de plantas e pelo menos 1 de bactérias)

(11)

Vírus com estrutura complexa

- Tem componentes com estrutura icosaédrica e helicoidal - Cabeça icosaédrica contem o genoma viral

- Alguns têm caudas contrácteis, com uma estrutura em hélice

e várias fibras proteicas responsáveis pela aderência do virus à superfície da bactéria

- Só encontrado em bacteriófagos

(p.ex. colifagos T2, T4 e T6 - infectam E. coli)

(12)

Genoma viral - natureza do ácido nucleico

. Pode ser DNA ou RNA, em cadeia simples (ss) ou cadeia dupla (ds), linear ou circular

(maior parte dos virus têm genomas lineares); alguns virus usam ambos, DNA e RNA, como material genómico em diferentes fases do seu ciclo de vida.

Vírus de animais – dsDNA, ssDNA, dsRNA, ssRNA Vírus de plantas – ssRNA

Vírus de bactérias – dsDNA (mais usual), ssDNA, ssRNA, dsRNA Em geral:

. Muitos genomas apresentam as bases azotadas características do RNA ou do DNA; outros têm bases menos ususais

como hidroximetilcitosina em vez de citosina

(13)

Formação de mRNA e replicação dos genomas em (a) virus de DNA e (b) virus de RNA

(

passos essenciais nos ciclos de vida dos virus

).

(a) _(b)

Convenção (virologia):mRNA – configuração “plus(+)”; cadeia complementar – configuração “minus(-)”)

. Designação de vírus com RNA ou DNA em cadeia simples: - “plus(+)” - virus com cadeia no sentido positivo

(a sequência de bases do RNA genómico do virus tem a mesma orientação que a do mRNA viral)

- “minus(-)” – virus com cadeia no sentido negativo

(14)

Classificação e taxonomia dos vírus

De acordo com:

- Natureza do hospedeiro

- Tipo e tamanho do ácido nucleico

- Simetria e diâmetro da cápside

- Número de capsómeros em vírus icosaédricos

- Presença ou não de envelope a envolver a nucleocápside

- Tipo e composição (

lipidos, proteinas, hidratos de carbono

) do envelope

(

quando existente

)

- Propriedades imunológicas

- Nº de genes e mapa genético

- Modo de transmissão do vírus ao hospedeiro

- Localização intracelular do vírus na célula hospedeira (

após infecção

)

- Forma como o vírus sai da célula (

após replicação

)

- Doença causada, método de transmissão,

- Etc.

viridae -

família

Ex. Retroviridae

(ssRNA)

(15)

BACTERIÓFAGOS OU FAGOS –

vírus que infectam bactérias

Especificidade virus-hospedeiro

Depende da especificidade da ligação do virus a locais receptores na superfície da célula hospedeira;

Consoante o fago e a bactéria hospedeira, os receptores podem ser:

- LPS (lipopolissacárido) - proteínas

- ácidos teicóicos - flagelo

- pili

PERDA DESTES RECEPTORES

Resistência da bactéria à infecção pelo fago

Famílias principais

(Pseudomonas sp) (Pseudomonas sp) (E. coli) (E. coli) (Mycoplasma sp) (lambda, T5) (T2, T4)

(16)

REPRODUÇÃO

DE FAGOS COM

dsDNA

Exemplo.

Fago T4

/ E. coli

Attachment of T4 bacteriophage virion to the cell wall of Escherichia coli and injection of DNA.

(a) Landing and attachment, by the long tail fibers interacting with core polysaccharide

(b) Contact of cell wall by the tail fibers (electrostatic interactions; influenced by Mg2+ _{e Ca}2+ _ions)

(17)

CICLO LÍTICO

Fagos virulentos –

Ciclo de vida culmina na lise da célula hospedeira, para libertação dos viriões novos

- Síntese de proteínas do capsídeo, da cauda e outras necessárias para a montagem do virião

- usa RNA polimerase da célula - Sintese de proteínas que

permitem ao fago bloquear o metabolismo da célula hospedeira,

Degradar DNA da célula hospedeira e Lise enzimática:

-Endolisina (ataca peptidoglicano) -Holina (lesões nas membranas

celulares)

- DNA T4 contém hidroximetilcitosina (HMC) em vez de citosina; - HMC é glucosilado

Glucosilação protege DNA do fago da acção de

endonucleases de restrição das células infectadas

(mecanismo de defesa contra infecção viral)

produzir cópias novas do DNA viral

(Prescott, Harley, Kline, Microbiology, 6th edition, 2005, McGraw-Hill) . Fase latente (entre adsorção do virus e libertação dos viriões maduros): 22 min

(18)

Cultivo de vírus de bactérias (bacteriófagos)

- são cultivados em culturas de células bacterianas - quantificação:

(Madigan, Martinko e Parker, Brock Biology of microorganisms, 10th ed)

“PFU – Plaque Forming Units”

Bacteriófagos Líticos :

- Em meio líquido causam clarificação da suspensão celular de bactérias

- Em meio sólido levam à formação de placas (ou halos)

de lise Bacteriófagos Líticos

- Em meio líquido

(19)

Ex. Fago lambda / E. coli

FAGOS TEMPERADOS E CICLO LISOGÉNICO

Indução do ciclo lítico é um fenómeno raro e pode ser estimulado por radiação UV, temperaturas altas ou stresse químico

(vantagens)

(20)

Taxa de produção dos produtos dos genes cro e cI

determina se ocorre o ciclo lisogénico ou o lítico.

Proteina Cro

• Envolvida na regulação dos

genes do ciclo lítico

• Bloqueia a sintese do

repressor lambda

GENOMA DO FAGO

_λ

_{Repressor lambda}

• Produto do gene cI

• Bloqueia a transcrição dos

genes do ciclo lítico,

incluindo do gene cro

Indução está associada a redução nos níveis do repressor lambda - pode ser causada

por radiação UV ou químicos que causam danos no DNA

(21)

Consequências principais da lisogenia

1. Células lisogénicas são imunes a

reinfecção pelo mesmo fago;

2. Células hospedeiras lisogénicas

podem exibir fenótipo alterado.

Por exemplo:

- modificação da estrutura do

lipopolisacárido (LPS) de Salmonella sp.

- produção de toxinas por bactérias patogénicas

(exotoxina da difteria por Corynebacterium

diphtheriae; toxina de Staphylococcus aureus – escarlatina

toxina de Clostridium botulinum - botulismo)

3. Transdução especializada

Transdução – transferência de material genético entre bactérias

mediada por virus

(ver também transdução generalizada em aula sobre

transferência de material genético)

(22)

Transdução especializada

Após indução, quando o profago sofre

excisão do cromossoma da célula

hospedeira, uma porção deste pode

permanecer ligado ao DNA do fago; após o

ciclo lítico, os fagos resultantes infectam

novas células bacterianas e ao incorporar o

seu DNA no cromossoma destas, podem

transportar um ou mais “novos” genes que

podem ser expressos pelas células

infectadas e conduzir a alterações

(23)

(24)

(25)

Purificação de partículas virais: por centrifugação de gradiente de densidade

1º) rotura das células infectadas suspensas em tampão adequado

Particulas mais densas

-

Gradiente de sacarose linear

- Centrifugação pode separar as

partículas com base na sua

densidade e no seu coeficiente de

sedimentação

(função do tamanho

e densidade da particula – virus,

macromolecula ou estrutura biológica).

MISTURA DE PARTICULAS (viriões e

macromoléculas, organelos, etc.

provenientes das células hospedeiras) Particulas menos densas 2º) Centrifugação:

(26)

Purificação de partículas virais: por centrifugação diferencial

Organelos

das células hospedeiras Partículas

virais icosaédricas

Sobrenadante, com moléculas solúveis

(Prescott, Harley, Kline, Microbiology, 6th edition, 2005, McGraw-Hill)

Purificação de partículas virais: digestão enzimática de constituintes

celulares das células hospedeiras

P.ex. Remoção de ácidos nucleicos e proteinas celulares (das células hospedeiras) das preparações de viriões por acção de nucleases e proteases

(27)

Principais familias

de virus que infectam

animais

(Herpes simplex; varicela) (varíola) (constipação; isolados de adenóides) (cancro) (poliomielite; hepatite A) (Ebola; Marbourg) (raiva) (Hepatite B) (rubéola) (gripe)

(28)

- ovo de galinha fertilizado

- Linhas celulares;

cultura de tecidos de células animais

Isolamento e cultivo de virus

O cultivo de virus requer um hospedeiro vivo.

Vírus de animais:

- animal (cobaia de laboratório)

As células infectadas podem sofrer degenerescência, observável por microscopia (EFEITO CITOPÁTICO)

As células infectadas por CERTOS VIRUS também podem sofrer LISE – quando lisam forma-se uma área, localizada, de destruição denominada placa (HALO DE LISE)

(Prescott, Harley, Kline, Microbiology, 6th edition, 2005, McGraw-Hill)

(29)

Photomicrograph of a cell culture

Cell cultures in monolayers grown on a Petri plate and plaques due to virus-induced cell lysis

(30)

(Ex. sarampo; hepatite B; papeira; rubéola, gripe)

(Ex. Cancro)

(Ex. Herpes simplex virus; varicela; citomegalovirus)

(Ex. hepatite A)

(31)

Virus de animais

Penetração do virus na célula hospedeira

(Prescott, Harley, Kline, Microbiology, 6th edition, 2005, McGraw-Hill)

1. Ex. poliomaviridae Plasma membrane 2. Ex. HIV Plasma membrane

(32)

(Tortora, Funke e Case, Microbiology – an Introduction, 6th edition) 3.

Ex. Gripe (influenza)

(Prescott, Harley, Kline, Microbiology, 6th edition, 2005, McGraw-Hill) citoplasm

(33)

(34)

Libertação de um virus com invólucro (Ex. influenza)

- por gemulação da membrana citoplasmática da célula hospedeira

1º) Hemaglutidina e neuraminidase (proteínas virais) são inseridas na membrana plasmática da célula hospedeira 2º) nucleocápside liga-se à membrana e proteinas da membrana (a verde) são afastadas

3º) membrana sofre gemulação e liberta virião maduro

Neuraminidase – enzima que ajuda o virus a penetrar células do epitélio respiratório do hospedeiro infectado

Hemaglutinina – permite ao virus aderir aos glóbulos vermelhos do sangue causando a aglutinação destes; participa na adsorção do virus à célula hospedeira.

(35)

(36)

(Prescott, Harley, Kline, Microbiology, 6th edition, 2005, McGraw-Hill) FIG. 18.7

Diagrama simplificado do

ciclo de vida de

virus Influenza ( negative ssRNA)

. Entrada por endocitose e transferência da molécula (-) ssRNA viral para o nucleo da célula infectada; . Transcrição do RNA viral (passo 1)

(moléculas RNA da célula hospedeira são cortadas na extermidade 5´ e os fragmentos resultantes

(10-13 nucleotideos) “capped” são usados como iniciadores (“primers”) na síntese de mRNA viral (+)) mRNA viral medeia:

. Passos A - síntese da RNA Polimerase (replicase PBI, que cataliza a replicação do RNA viral) e síntese das proteínas da cápside (NP);

. Passos B – síntese das proteínas do envelope externo do novo virus, HA – hemaglutinina e NA – Neuramidase, que são inseridas na membrana citoplasmática da célula hospedeira.

. Replicação do RNA viral (passo 2)

(A replicase viral (PBI) converte o (-)ssRNA viral numa molécula de RNA em cadeia dupla, que é designada forma replicativa, e a cadeia (+) desta medeia a síntese de várias cópias de novo RNA viral (-ssRNA).

. Associação de cópias novas da cápside e do RNA viral. (Passos C)

. Saída dos viriões maduros da célula por gemulação

A

B

(37)

Gag →large primary gag protein

→core proteins (due to protease activity)

Pol →reverse transcriptase and integrase

Env →envelope proteins

R – direct repeats (replication process)

Some retroviruses have a 4th gene envolved in cellular transformation and cancer

Structure of a retrovirus

Genetic map of a typical retrovirus genome

The retrovirus DNA can be transcribed to yield mRNA (and new genomic RNA)

ssRNA(+) → ssDNA → dsDNA → mRNA (ssRNA +)

or may remain in a latent state.

Retroviruses

are RNA viruses

that replicate through a DNA intermediate. The retrovirus called

human immuno deficiency virus (HIV) causes AIDS.

The retrovirus virion contains an enzyme, reverse transcriptase, that copies the information

from its RNA genome into DNA,

a process called reverse transcription.

Examples of retroviruses:

- Some exist that cause cancer

- HIV – human immunodeficiency virus

(infects a specific kind of T lymphocyte; immune system)

(38)

Processo de replicação em retrovirus:

(são virus com envelope; a partícula viral

contém enzimas: transcriptase reversa,

integrase de DNA e protease).

Passos principais:

Entrada na célula por fusão entre o envelope do virus e a membrana plasmática da célula, em locais da memebrana plasmática com receptores específicos;

o envelope do virus fica na membrana plasmática, e o nucleocápside, contendo o genoma e as enzimas, é libertado no citoplasma;

Transcrição reversa do ssRNA em dsRNA, por acção

da transcriptase reversa viral, e entrada do dsDNA resultante no núcleo da célula hospedeira;

Integração do DNA retroviral (Provirus) no genoma da célula hospedeira (pode permanecer nesse estado estável

indefinidamente);

Transcrição do DNA retroviral, levando à formação de moléculas de mRNA viral e do genoma viral (ssRNA);

Montagem e encapsidação do RNA genómico em nucleocápsides, no citoplasma;

Aquisição do envólucro na membrana plasmática e saída do virus completo por gemulação.