O que há por trás das diferenças individuais? Perfis comportamentais e fisiológicos em Betta splendens

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS – DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PSICOBIOLOGIA. PRISCILLA VALESSA DE CASTRO ANDRADE. O QUE HÁ POR TRÁS DAS DIFERENÇAS INDIVIDUAIS? PERFIS COMPORTAMENTAIS E FISIOLÓGICOS EM BETTA SPLENDENS. Natal 2017.

(2) Priscilla Valessa de Castro Andrade. O QUE HÁ POR TRÁS DAS DIFERENÇAS INDIVIDUAIS? PERFIS COMPORTAMENTAIS E FISIOLÓGICOS EM BETTA SPLENDENS. DEFESA DE DISSERTAÇÃO APRESENTADA AO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PSICOBIOLOGIA DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE, COMO REQUISITO PARA A OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRE EM PSICOBIOLOGIA (ÁREA: COMPORTAMENTO ANIMAL).. Orientadora: Dra. Ana C Luchiari Co-orientadora: Dra. Priscila F Silva. Natal 2017.

(3) O QUE HÁ POR TRÁS DAS DIFERENÇAS INDIVIDUAIS? PERFIS COMPORTAMENTAIS E FISIOLÓGICOS EM BETTA SPLENDENS. PRISCILLA VALESSA DE CASTRO ANDRADE. Natal, 28 de Abril de 2017. Banca Avaliadora Profª Dra Ana Carolina Luchiari Departamento de Fisiologia - UFRN Orientadora Prof ͦ Dr. Renato Hajenius Ache de Freitas Departamento de Ecologia e Zoologia - UFSC Profª Dra Nicole Leite Galvão Departamento de Fisiologia – UFRN.

(4) Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN Sistema de Bibliotecas – SISBI Catalogação da Publicação na Fonte - Biblioteca Central Zila Mamede Andrade, Priscilla Valessa de Castro. O que há por trás das diferenças individuais? Perfis comportamentais e fisiológicos em Betta splendens / Priscilla Valessa de Castro Andrade. - 2017. 57 f. : il. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Biociências, Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia. Natal, RN, 2017. Orientadora: Prof.ª Dr.ª Ana Carolina Luchiari. Coorientadora: Prof.ª Dr.ª Priscilla Fernandes Silva. 1. Peixe de briga – Dissertação. 2. Perfil comportamental – Dissertação. 3. Cortisol – Dissertação. 4. Testosterona – Dissertação. 5. Random Forest – Dissertação 6. Classification Tree – Dissertação. I. Luchiari, Ana Carolina. II. Silva, Priscilla Fernandes. III. Título. RN/UF/BCZM. CDU 597.551.21.

(5) DEDICATÓRIA. Dedico este trabalho à minha mãe Maria de Lourdes que sempre teve orgulho de mim por fazer um curso na universidade federal. Dedico também à minha vó Concepcion Perez de Castro que sempre ficava feliz em saber de minhas conquistas E ao meu pai, Antônio Artur, que me ensinou que devemos fazer o que queremos e o que nos traz alegrias..

(6) AGRADECIMENTOS Agradeço aos meus pais por terem me dado tudo que mais precisei pra chegar até aqui, minha liberdade. Agradeço à minha orientadora Ana Carolina Luchiari por ter me permitido “brincar” com meus peixinhozinhos e a minha coorientadora Priscila Fernandes por tudo que me ensinou mesmo sem saber que estava ensinando. Agradeço imensamente pelo crânio Fúlvio Freire pelo desenvolvimento da análise estatística, que quebrou a cabeça para produzir resultados magníficos. Agradeço a UFRN, ao CEUA e o programa de Pós-Graduação em Psicobiologia por permitir que mais um sonho se realizasse. Agradeço as amigas queridas que estiveram comigo esses anos de pesquisa: Mayara Silveira, pela amizade e idas magníficas à praia; Diana Chacon, pelos conselhos e sabedoria; Clarissa Almeida, pelos puxões de orelhas e conversas sinceras; Bárbara Quadros, por horas e horas e horas e muitos cafés; Thais Agues, pela companhia e carinho (sem você este trabalho não existiria); Jéssica Pollyana e Vanessa Augusta, pela companhia em finais de semanas longos e solitários no CB. Agradeço Raíssa e Cecília, pela ajuda e parceria nas medidas hormonais, aos professores Dra Nicole Leite Galvão e Dr Renato Hajenius Ache de Freitas pela presença em minha banca, e a todos que entraram na minha vida pra mostrar que um mestrado não é o fim do mundo, é apenas uma etapa gostosa que passa muito rápido..

(7) RESUMO. De acordo com as mudanças ambientais, os indivíduos apresentam diferentes estratégias para lidar com os variados estímulos externos. Os diferentes comportamentos compreendem os diferentes fenótipos que compõem uma população. Essas diferenças podem ser explicadas por alterações endógenas, como a secreção hormonal. Por exemplo, os hormônios modulam comportamentos reprodutivos e processos cognitivos. Com o objetivo de caracterizar as diferenças individuais em uma população, o presente estudo teve como objetivo testar a relação entre os perfis comportamental e hormonal em um grupo de machos lutando peixes, Betta splendens. Um grupo de 86 machos foi observado para construção de ninho de bolha, exposições agonísticas em competições coespecíficas e desempenho em um protocolo de aprendizagem espacial. Depois disso, mediram-se os níveis plasmáticos de cortisol e testosterona. Um procedimento estatístico inovador e elegante foi aplicado ao conjunto de dados para separar animais em grupos relacionados ao seu comportamento de construção de ninhos (teste de médias de k) e depois mostrar quais os parâmetros comportamentais e fisiológicos que melhor explicam os perfis dos grupos (Random Forest and Classification Tree). Nossos resultados apontam para três perfis distintos: construtores de ninhos (ninhos de 30,74 ± 9,84 cm²), intermediários (ninhos de 13,57 ± 4,23 cm²) e não-construtores (ninhos de 2,17 ± 2,25 cm²). Estes grupos apresentaram diferenças nos comportamentos agonístico e de aprendizagem, bem como nos níveis hormonais. O cortisol foi o principal preditor apontado pelo teste Random Forest para a separação de indivíduos nos diferentes grupos: construtores de ninhos e intermediários apresentaram níveis mais baixos de cortisol, enquanto os não-construtores apresentaram os maiores valores de cortisol basal. O segundo mais importante preditor foi o desempenho de aprendizagem, que separou os animais intermediários dos construtores de ninhos (aqueles que aprenderam mais rápido), seguidos pelos níveis basais de testosterona e comportamentos agonísticos. Enquanto os níveis de testosterona não foram significativos para explicar as diferenças comportamentais, parece estar relacionado com o perfil de construção. Nosso achado mostra que diferentes perfis investem de forma diferente na reprodução e que o cortisol influencia negativamente o comportamento e a aprendizagem do nidificação. Em resumo, nossos dados sugerem que diferentes perfis em uma população são determinados por respostas hormonais e comportamentais, e essas diferenças conferem flexibilidade à população, permitindo a presença de animais que investem mais na reprodução enquanto outros mostram defesa e agressão como a dominante característica expressa. PALAVRAS-CHAVE: Perfil comportamental, cortisol, testosterona, peixe de briga, aprendizagem, Random Forest, Classification Tree. 1.

(8) ABSTRACT According to environmental changes, the individuals show different strategies to coping with the varied external stimuli. The different responders comprise the different phenotypes that compose a population. These differences can be explained by endogenous changes, such as hormonal secretion. For instance, hormones modulate reproductive behaviors and cognitive processes. In order to characterize individual differences in a population, the present study aimed to testing the relationship between behavioral and hormonal profiles in a group of males Fighting fish, Betta splendens. A group of 86 males were observed for bubble nest construction, agonistic displays in conspecific contests and performance in a spatial learning protocol. After that, cortisol and testosterone plasma levels were measured. An innovative and stylish statistical procedure was applied to the data set in order to separate animal in groups related to its nest building behavior (k-means test) and then shown which behavioral and physiological parameters better explain the groups’ profiles (Random forest and Classification tree). Our results point to three distinct profiles: nest builders (nests of 30.74 ± 9.84 cm²), intermediates (nests of 13.57 ± 4.23 cm²) and non-builders (nests of 2.17 ± 2.25 cm²). These groups presented marked different in agonistic and learning behavior, as well as hormone levels. Cortisol was the main predictor prepared by the Random Forest test for the separation of individuals in the different groups: nest builders and intermediates showed lower levels of cortisol while non-builders presented the highest basal cortisol values. The second most important predictor was learning performance, that separated animals from the intermediate from the nest builders (faster learners), followed by basal testosterone levels and agonistic behavior displays. While the testosterone levels were not significant to explain behavioral differences, it seems to be related to the construction profile. Our finding shows that different profiles invest differently in reproduction and that cortisol negatively influences nesting behavior and learning. In summary, our data suggest that different profiles in a population are determined by both hormonal and behavioral responses, and these differences confer flexibility to the population, allowing the presence of animals that invest the most in reproduction while other show defense and aggression as the dominant feature expressed. KEY WORDS: Behavioral profile, cortisol, testosterone, fighting fish, learning, Random Forest, Classification Tree.. 2.

(9) SUMÁRIO. Resumo geral ------------------------------------------------------------------------------------ 1 Abstrat ------------------------------------------------------------------------------------------ 2 Sumário ------------------------------------------------------------------------------------------ 3 1. Introdução ------------------------------------------------------------------------------------ 4 1.1 Diferenças individuais no comportamento ------------------------------------------- 4 1.2 Diferenças hormonais no comportamento ------------------------------------------- 9 1.2.1 Cortisol ------------------------------------------------------------------------------ 10 1.2.2 Testosterona ------------------------------------------------------------------------- 13 1.3 O peixe Betta como modelo experimental ------------------------------------------ 15 2. Objetivos ------------------------------------------------------------------------------------ 17 2.1 Objetivo geral -------------------------------------------------------------------------- 17 2.2 Objetivos específicos ------------------------------------------------------------------ 17 3. Materiais e métodos ------------------------------------------------------------------------ 18 3.1 Animais e armazenamento ------------------------------------------------------------ 18 3.2 Caracterização do perfil comportamental ------------------------------------------ 18 3.2.1 Construção de ninho de bolhas -------------------------------------------------- 19 3.2.2 Confronto com coespecífico ----------------------------------------------------- 20 3.2.3 Tarefa de aprendizagem ---------------------------------------------------------- 21 3.3 Caracterização do perfil hormonal -------------------------------------------------- 22 3.3.1 Cortisol ------------------------------------------------------------------------------ 22 3.3.2 Testosterona ----------------------------------------------------------------------- 23 3.4 Análises estatísticas ---------------------------------------------------------------------- 24 4. Resultados ---------------------------------------------------------------------------------- 27 5. Discussão ------------------------------------------------------------------------------------ 37 6. Conclusões --------------------------------------------------------------------------------- 44 7. Referências bibliográficas ---------------------------------------------------------------- 45 8. Anexo ---------------------------------------------------------------------------------------- 57. 3.

(10) 1. Introdução 1.1. Diferenças individuais no comportamento Na natureza, os indivíduos diferem entre si. Essas diferenças ocorrem em características morfológicas, fisiológicas e comportamentais, mas também podem estar relacionadas à espécie, população, gênero, fase do desenvolvimento e história de vida dos indivíduos. No que concerne ao comportamento, é sabido que a resposta comportamental de um indivíduo pode variar em diferentes escalas de tempo (dentro de minutos, horas ou dias) e deve refletir o contexto ambiental no qual o animal está inserido. Portanto, o animal alterna suas respostas em função dos estímulos presentes. Por exemplo, ocorre acentuado aumento da agressividade em machos quando na presença da fêmea e devido ao elevado nível de andrógenos circulantes (Hirschenhauser & Oliveira, 2006), assim como em fêmeas durante o cuidado com a prole (Oliveira & Almada, 1998). Nesse sentido, indivíduos da mesma espécie e gênero que geralmente compartilham o mesmo ambiente, recursos e riscos devem apresentar respostas comportamentais semelhantes. No entanto, o que observamos na natureza são os diferentes comportamentos variando intra e interindivíduos. Além do estado interno do animal como fome ou saciedade,outro fato que interfere nas respostas comportamentais é a experiência prévia. Por exemplo, animais que venceram um confronto tem mais chances de vencerem confrontos futuros (Dugatkin, 1997; Schwartzer et al., 2013), assim como após encontro com predador, os indivíduos podem aprender a avaliar o risco desta situação específica (Sommer-Trembo et al., 2016). Um dos fatores associados à variabilidade de fenótipos comportamentais numa população é a plasticidade, definida como habilidade do organismo de se ajustar às pressões do ambiente, a partir das interações entre o seu genótipo e o meio (Dingemanse et al., 2010). Esses ajustes podem ocorrer em diferentes escalas, desde 4.

(11) mudanças duradouras e irreversíveis que se constroem ao longo do desenvolvimento individual, a mudanças em curto prazo de acordo com o contexto ambiental (Giudice, 2015). Assim, diferentes pressões ambientais podem gerar diferentes fenótipos devido à plasticidade. Enquanto, alguns animais se tornam mais agressivos quando há limitação na oferta de alimento, variações de área de território ou número de coabitantes, outros mantem seu comportamento agressivo padrão independente do tamanho do grupo ou da oferta de alimento (Toobaie & Grant, 2012), indicando plasticidade reduzida. Nesse caso, o comportamento é exibido de forma mais consistente, ou seja, apresentam pouca ou nenhuma variação nas respostas comportamentais. Tais variações interindividuais tem sido estudadas sob diferentes terminologias, como ‘personalidade’, ‘síndrome comportamental’, ‘estratégia de enfrentamento’ e ‘temperamento’ (Gosling, 2001; Sih et al., 2004a; Carere & Eens, 2005). Um problema enfrentado pelos pesquisadores da área é identificar que termo é mais apropriado, uma vez que existem diferenças e sobreposições nos conceitos. De um modo geral, o estudo de ‘personalidade’ trata da repetibilidade da resposta comportamental ao longo do tempo, enquanto o estudo das ‘síndromes comportamentais’ correlaciona as respostas comportamentais entre diferentes contextos ambientais (Sih et al., 2004b). Já ‘estratégia de enfrentamento’ correlaciona a resposta comportamental com aspectos fisiológicos, como variações hormonais (Koolhaas et al., 1999), e o ‘temperamento’ é frequentemente associado ao genótipo de cada indivíduo (Réale et al., 2007). Independente do termo empregado, parecer ser comum entre autores a busca pela identificação de relações entre traços comportamentais e/ou fisiológicos e como estas relações afetam a aptidão (Johansen et al., 2012). Diferentes grupos de animais, de invertebrados até mamíferos, já foram estudados em termos de variações. 5.

(12) comportamentais relacionadas ao perfil individual (Stapley & Keogh, 2005; Boon et al., 2007; Réale et al., 2009; Smith & Blumstein, 2010). Em humanos, o estudo da personalidade é antigo e caracterizado pela existência de dimensões psico-comportamentais. Os investigadores traçam dimensões desde 1936, ano em que Allport & Odbert identificaram as dimensões de personalidade. Ao longo das décadas, esses traços foram sintetizados e condensados em cinco grandes dimensões. Cada nível de organização faz menção a como devemos compreender as diferenças individuais no comportamento (John, 1999). As cinco grandes dimensões são conhecidas pela sigla ‘OCEAN’, composta pelas iniciais dos termos: ‘Openness to experience’, ‘Conscientiousness’,‘Extraversion’,‘Agreeableness’ e ‘Neuroticism’. Cada dimensão é analisada a partir de diferentes traços comportamentais: ‘Openness to experience’ refere-se à abertura ao novo e curiosidade intelectual, proatividade e tolerância ao desconhecido; ‘Conscientiousness’ caracteriza organização e objetividade ao realizar tarefas, persistência e motivação; ‘Extraversion’ relaciona-se a repostas como otimismo e extroversão; ‘Agreeableness’ diz respeito à tendências a ser compassivo e cooperativo; e ‘Neuroticism’ à tendência a experimentar emoções desagradáveis, instabilidade emocional e perturbações psicológicas (Costa & McCrae, 1992). Goldberg (1981) sugere que qualquer modelo de estudo sobre diferenças individuais em humanos deverá abranger essas cinco grandes dimensões. Nas demais espécies, dentre os traços mais investigados estão: exploração, ritmo de atividade, agonismo, sociabilidade e predisposição ao risco (também referido como boldness-shyness continuum) (Sih et al., 2004a Dingemanse et al., 2002; Kurvers et al., 2010), que podem ser associados a diferentes dimensões de personalidade. Sociabilidade, atividade e predisposição ao risco se encaixam na dimensão Extraversion, já exploração pertence à dimensão Openness (Gosling & John, 1999). 6.

(13) Entretanto, a forma como o traço de personalidade se manifesta depende da espécie. Na espécie humana um indivíduo bold é mais propenso a interagir com desconhecidos enquanto o shy evita esse tipo de interação (Gosling & John, 1999), já em outras espécies sociais como aquelas que apresentam hierarquia e submissão, os indivíduos bold podem ser mais propensos a se afastarem do grupo e enfrentam riscos enquanto os shy buscam a proteção da presença de coespecíficos. Embora o significado do traço de personalidade e o contexto de sua exibição possam variar entre as espécies, a repetibilidade do comportamento pode trazer consequências em termos de aptidão para o indivíduo que o exibe, e, se hereditário, o traço pode sofrer ação da seleção natural (Dall et al., 2004). Em um determinado grupo podem coexistir diferentes fenótipos comportamentais, aqueles que conferem maior aptidão consequentemente geram maior número de descendentes. Por exemplo, no peixe paulistinha (Danio rerio), os traços boldness e agressividade tem herdabilidade diferente: a característica boldness tem maior influência genética enquanto a característica agressiva parece depender mais do ambiente (Ariyomo et al., 2013). As ocorrências de fenótipos comportamentais diferentes dentro de uma mesma população podem gerar favorecimento de alguns indivíduos em relação a outros sob contextos/situações diferentes (Norman & Jones, 1984; Tricas, 1989). O polimorfismo comportamental existente dentro de uma população pode ser mantido por seleção negativa dependente de frequência (Eliassen, 2006; Wolf et al., 2007). Em seu trabalho, Eliassen (2006) utiliza um modelo matemático para avaliar estratégias de forrageio desenvolvidas por poucos indivíduos em uma população. Este autor observou que características comportamentais apresentadas por minorias, e que conferem sucesso, são passadas adiante e com o passar do tempo, tais estratégias se tornam comuns na população. Com o aumento do número de indivíduos que expressam o comportamento 7.

(14) ‘novo’, a estratégia desenvolvida perde sua eficiência, diminuindo seu sucesso. Em outras palavras, a estratégia desenvolvida por um fenótipo extremo se torna fenótipo ‘comum’. No entanto, em ambientes estáveis, o indivíduo com fenótipo extremo pode ser favorecido por se manter de forma inflexível em populações bem estabelecidas. Os estudos que abordam diferenças individuais têm investigado principalmente como os fatores ambientais e genéticos influenciam o comportamento (Brown, 2007) e que vantagens essas diferenças podem acarretar em termos de aptidão. Bell e Stamps (2004) observaram que populações de peixe esgana-gato (Gasterosteus aculeatus) de rio calmo, com poucos predadores e muita vegetação, ou seja, menor risco a sobrevivência e abrigos abundantes, apresentam comportamento de enfrentamento e tomada de risco diminuídos, enquanto populações habitantes em um rio com variações sazonais severas (ventos, chuvas, aumento do nível da água) e muitos predadores, apresentam maior número de comportamentos agressivos e propensão a risco. Quando duas populações estão sofrendo pressões ambientais distintas, suas estratégias comportamentais se apresentam de modo diferente e os descendentes dessas populações tornam-se casa vez mais distintos em termos comportamentais (Bell et al., 2009; Stamps & Groothuis, 2010). O conjunto de ajustes e respostas comportamentais e fisiológicas consistentes ao longo do tempo, são chamadas de coping styles (Koolhas et al., 1999) e participam da determinação do perfil comportamental individual. Em contexto de agressividade, por exemplo, respostas ativas (proatividade) são compatíveis a indivíduos agressivos e controladores de seu território, já respostas conservadoras (reatividade) incluem imobilidade e baixos níveis de agressão. Ratos (Mus musculus) agressivos quando testados em tarefa de escape, apresentam maior número de escapes de território comparados a ratos não agressivos, sugerindo assim ligação entre comportamento ativo com agressividade nesses animais (Benus et al., 1988). Respostas 8.

(15) como essas podem estar associadas à influência dos níveis de cortisol circulante em cada indivíduo: indivíduos proativos apresentam baixos níveis de cortisol basal comparados a indivíduos reativos (O´Leary et al., 2007; Kempes et al., 2008). Apesar das. investigações. acerca de. coping. styles, síndromes comportamentais. ou. personalidade, ainda existem muitas questões a serem respondidas sobre os mecanismos por trás desses conjuntos de comportamentos.. 1.2. Diferenças hormonais no comportamento Além dos estímulos ambientais que influenciam o comportamento, a resposta do indivíduo é modulada por fatores intrínsecos como expressão gênica e secreção hormonal. Os hormônios, substâncias conhecidas como mensageiros químicos, tem uma série de funções importantes no organismo, como manutenção da homeostase e modulação de respostas adequadas a eventos do ambiente (Adkins-Regan, 2005; Ball & Balthazart, 2008). Também estão envolvidos em mudanças de curto prazo e de longo prazo, como reprodução e migração (Kim et al., 2012; Sudo et al., 2010). Essas substâncias são produzidas em diferentes partes do corpo (principalmente glândulas) e, uma vez na corrente sanguínea, podem afetar um ou múltiplos sistemas ao mesmo tempo. As células que respondem aos hormônios são chamadas células alvo e possuem receptores específicos para cada hormônio secretado (Nilsson et al., 2001). Hormônios apresentam três ações importantes: modulam entradas sensoriais no sistema, atuam diretamente no sistema nervoso central e regulam os efetores (Pfaff et al., 2004; Adkins-Regan, 2005). Eles atuam de forma direta nas respostas comportamentais, e seus efeitos são associados ao estado fisiológico de cada indivíduo, por exemplo, se o indivíduo está em período reprodutivo ou não reprodutivo, se está estressado ou não estressado, ou até mesmo se convive socialmente ou isolado. 9.

(16) Os hormônios regulam a exibição dos comportamentos mais flexíveis e aqueles com repetibilidade elevada. Vários estudos tem discutido o papel dos hormônios como reguladores dos traços comportamentais (Desprat et al., 2017; Schoenle et al., 2017; Pradhan et al., 2015). É sabido que os hormônios agem de forma concomitante em diferentes sistemas do organismo e essa ação pode estar por trás das correlações entre comportamentos, caracterizada como síndrome comportamental (Archad et al., 2012). Além disso, indivíduos podem diferir nos níveis basais de um hormônio ou ainda no quanto um hormônio varia frente a um desafio. Por exemplo, pesquisadores caracterizaram a síndrome comportamental em pássaros chapim-real (Parus major) correlacionando níveis de atividade tanto com predisposição ao risco quanto com os níveis do hormônio corticosterona. Foi visto que, quando submetidos a estresse agudo, indivíduos fast-bold apresentaram baixa elevação nas concentrações de corticosterona quando comparados a indivíduos slow-shy (Wolfgang & Hau, 2015). Dentre os hormônios mais estudados estão cortisol e testosterona. Esses importantes esteroides modulam diferentes comportamentos. Seus níveis de secreção no organismo variam ao longo do dia e estão associados a atividades específicas como acordar ou defender o território. Entretanto, alguns trabalhos já mostram diferenças individuais nos níveis hormonais circulantes durante o mesmo período em animais da mesma população (Pottinger et al., 1992; Higley et al., 1996; Dzieweezynski et al., 2006; Lendvai et al., 2007).. 1.2.1. Cortisol Um dos hormônios mais abordados nos estudos de comportamento animal é o cortisol um glicorcoticóide presente na grande maioria dos organismos, de peixes a mamíferos (Barcellos et al., 2007). Este hormônio é um importante regulador da 10.

(17) homeostase do organismo e tem papel importante no desenvolvimento de respostas apropriadas aos desafios do ambiente. Sua secreção no organismo segue o ritmo circadiano com picos de liberação ao longo do dia. Na espécie humana, um pico ocorre logo no início da manhã ao despertar, algumas horas depois seus níveis começam a decrescer alcançando os valores mais baixos durante a noite (Czeisler & Klerman, 1999). O cortisol age na regulação de comportamentos para manutenção e gasto de energia, como busca pelo alimento e locomoção (Wendelaar Bonga,1997). Outra ação importante do cortisol é a regulação das respostas associadas ao estresse. Durante eventos estressantes, o eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA), bem como o eixo hipotálamo-pituitária-interrenal (HPI) em peixes, é um dos primeiros a serem ativados, culminando com a secreção de cortisol (O’Connor et al., 2000). Por esse motivo, a concentração de cortisol no organismo é frequentemente utilizada para avaliar como o indivíduo lida com o estresse (Barcellos et al., 2007). Como dito anteriormente, a liberação do cortisol é importante para produzir respostas adaptativas e manter o equilíbrio do funcionamento do organismo, no entanto se o sistema é desestabilizado e o nível de cortisol liberado é superior ou inferior ao nível homeostátio (ou seja, a quantidade de hormônio basal liberado que mantem a auto regulação) o funcionamento dos sistemas sofre alteração (Lupien et al., 1994; ElSheickh et al., 2008). Por exemplo, concentrações altas de cortisol interferem na ação da insulina e prejudicam processos de cicatrização (Barton, 2002; Lupien et al. 2007). Em hamsters (Phodopus sungorus), o estresse por imobilização prolongada acarreta em níveis altos de cortisol circulante, o que prejudica a cicatrização de incisões cutâneas, dessa maneira podendo comprometer a sobrevivência (Detillion et al., 2004). Em truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss), animais subordinados apresentam concentração alta e prolongada de cortisol (Pottinger et al., 1992), caracterizando os efeitos do estresse 11.

(18) crônico (Øverli et al., 1999, Sloman et al., 2001), o que afeta o desempenho em comportamentos como forrageio, defesa de território e reprodução (Moberg, 1999). Além disso, a continuada ativação do eixo HPA compromete a atividade de diversos sistemas, como o imunológico em que o animal torna-se mais suscetível a infecções (McEwen, 2000; Lupien et al., 2007); reprodutivo, cujo níveis de hormônio luteinizante de animais confinados descresse ao longo do tempo (Matteri et al., 1984) e também metabólico, em que fêmeas de ratos Sprague Dawley apresentam alterações nos perfis neuroquímicos cerebrais após estresse pré-natal (Bowman et al., 2004). Experimentos tem demonstrado que o estresse também afeta habilidades de aprendizagem e memória (McEwen & Bruce, 2007). No cérebro de mamíferos, o cortisol se liga a receptores em áreas como lobos frontais, amígdala e hipocampo, regiões envolvidas nos processos de aprendizagem e memória (Lupien et al., 2007). No entanto, diferentes resultados da ação do cortisol no cérebro tem sido relatados, desde efeitos positivos a efeitos prejudiciais à memória (Roozendaal et al., 1996). Mas, uma vez no sistema, seu efeito corresponderá à quantidade produzida pela ação do eixo HPA e pela quantidade de hormônio circulante, bem como ao fator estressor, genótipo e história de vida do indivíduo (Wingfieldf, 2003). Além da influência do cortisol no comportamento social, alimentar e aprendizado,. comportamentos. reprodutivos. também. sofrem. influência. dos. glicocorticóides. Elevados níveis de cortisol influenciam a secreção de andrógenos, diminuindo, por exemplo, a secreção de testosterona e podendo prejudicar o desempenho sexual (Barton & Iwama, 1991). Tal fato foi observado em esturjão-branco (Huso huso): indivíduos suplementados por cortisol via cápsula subcutânea apresentaram diminuição dos níveis basais de testosterona (Poursaeid et al., 2012).. 12.

(19) Diferenças interindividuais relacionadas a traços de personalidade tem sido associadas a diferenças consistentes nos níveis de cortisol entre indivíduos. Na espécie de salmão Salvelinus fontinalis, animais que se locomovem menos durante o forrageio apresentam níveis basais mais altos de cortisol comparados àqueles que se locomovem mais. No entanto, os mecanismos que relacionam os níveis basais de cortisol com os níveis de atividade ainda não foram completamente elucidados (Farwell et al., 2014).. 1.2.2. Testosterona A testosterona é o hormônio responsável por características sexuais secundárias em machos (Coates et al., 2010) e por alterações no comportamento relativos à reprodução (Pfaff, 1999). Níveis baixos desse esteróide causa prejuízo na reprodução, como baixa quantidade e qualidade de esperma, e diminuição no tamanho e quantidade dos ovos produzidos (Iwama et al., 1997). Em contexto social, a testosterona promove o comportamento agressivo. Tomando como modelo os ratos, os animais com status social elevado apresentam níveis mais altos de testosterona podendo apresentar alta agressividade (Higley et al.,1996; Rowe, 2004; Vermeersch et al., 2010). Por outro lado, animais castrados apresentam diminuição do comportamento agressivo, que é recuperado após administração de testosterona (Breeman, 1947). Indivíduos em fase reprodutiva apresentam níveis elevados do andrógeno comparados àqueles que não estão reprodutivos, como indivíduos juvenis, indivíduos que auxiliam no cuidado à prole ou até mesmo machos castrados (Trainor & Marler, 2001). Ao longo das décadas, várias pesquisas mostram o papel dos hormônios na modulação de comportamentos agonísticos, predatórios e respostas ao estresse crônico em peixes (Moberg, 1999; Moberg & Mench, 2000; Barcellos et al., 2007; Rai et al., 2015). É sabido que em peixes teleósteos o principal andrógeno encontrado é o 1113.

(20) ketotestosterona (11-KT) (Hishida & Kawamoto, 1970; Borg, 1994). Machos de Betta splendens construtores de ninhos, possuem baixo nível de 11- KT circulante, comparados àqueles que não possuem ninho (Dzieweczynski et al., 2006). Ademais, outras espécies, como sapos tropicais (Eleutherodactylus) que apresentam ninhos e estão com filhotes, baixos níveis de testosterona melhoram o desempenho no cuidado à prole (Townsend & Moger, 1987). Como o peixe Beta, outros animais agressivos com altos níveis de testosterona, apresentam prejuízos reprodutivos, pois o cuidado à prole é diminuído (Wingfield et al., 1990). Altos níveis de andrógeno também modulam o status social. Para aves e répteis ocorre a relação direta entre níveis de andrógenos e status social. Por exemplo, fêmeas de estorninho-preto (Sturnus unicolor) e machos de lagarto de cerca do leste (Sceloporus undulatus), com altos níveis de testosterona, são dominantes e tem sucesso de acasalamento, porém a postura de ovos e crescimento individual é prejudicada (Veiga & Polo, 2008; Cox & John-Adler, 2005). Além do seu papel no comportamento sexual/social, assim como o cortisol, a testosterona também tem relação com o desempenho cognitivo de cada indivíduo. Animais agressivos mostram melhor desempenho em tarefas de aprendizagem comparado àqueles menos agressivos (Benus et al., 1989). Em ratos, a castração causa aumento de ansiedade, prejuízo no desempenho em teste de campo aberto e na interação social (Frye & Seliga, 2001). Porém, se indivíduos castrados recebem injeções de metabólitos da quebra da testosterona (3-α-androstanediol glucuronide e 5-αandrostane-3-β-17-β-diol), ocorre melhora no desempenho em tarefas cognitivas como: teste em labirinto elevado, transição luz/escuro e labirinto aquático de Morris (Osborne & Edinger, 2009). Trabalhos realizados em humanos também mostram essa relação: observou-se que níveis baixos de testosterona e di-hidrotestosterona (primeiro metabólito da testosterona) influenciam quadros de depressão e ansiedade bem como 14.

(21) decréscimo no desempenho em tarefas cognitivas (Howell & Shalet, 2001; Kaminetsky, 2005), sugerindo assim a relação positiva entre níveis de testosterona e desempenho cognitivo dos indivíduos. No entanto, não há relatos da inter-relação entre testosterona, cortisol e cognição, e qual o papel de diferentes perfis comportamentais nesta relação.. 1.3. O peixe Betta splendens como modelo experimental O peixe Beta (Betta splendens (Regan, 1910), conhecido como peixe de briga, pertence à família Anabantidae e Ordem Perciforme. Com aproximadamente 7 cm de comprimento, é um peixe de água continental originário da região sudeste da Ásia (Tailândia, Indonésia, Vietnã) (Witte & Schmidt 1992), encontrado em regiões alagadas, rasas (até 20 centímetros de profundidade) e pouco oxigenadas. Esses animais são respiradores aéreos facultativos, apresentam órgão auxiliar à respiração, o labirinto, que permite a obtenção de oxigênio diretamente do ar atmosférico (Lesley et al., 2013). O Beta tem alto valor comercial, uma vez que faz parte da cultura de criadores e colecionadores. Em ambiente natural, os animais são encontrados em densidade de 1,7 peixes/m³ de água (Jaroensutanisee & Jaroensutanisee, 2001a) e são normalmente vistos solitariamente (Smith, 1945). Há centenas de anos, os machos foram criados e selecionados para brigas. Os perdedores eram descartados e os ganhadores eram reproduzidos, a fim de garantir a hereditariedade de tal característica (Smith, 1965). Os animais selvagens apresentam morfologia distinta da encontrada em pet shops, possuem o corpo com coloração opaca em tons de marrom e nadadeiras pequenas (Faria et al., 2006). Características. morfológicas. como. coloração. exuberante. e. nadadeiras. exageradas foram selecionadas artificialmente ao longo das gerações (Faria et al., 15.

(22) 2006). Os cruzamentos desenfreados para a comercialização dos animais parecem ter gerado a redução de variabilidade genética, e de fato Meejui et al. (2005) encontraram queda na variação gênica de Betas cultivados em laboratório comparados àqueles encontrados na natureza (8% no número de alelos), como também redução em heterozigose (37,4%), sugerindo que fenótipos extremos estão cada vez mais raros nas populações cultivadas. Os betas são modelos importantes para estudos que relacionam níveis hormonais e respostas comportamentais (Dzieweczynski, 2006; Sebire et al., 2007; Fanouraki, et al., 2008; Norton et al., 2011). Embora muitos estudos anteriormente citados, abordaram aspectos comportamentais e hormonais em peixes, ainda é ausente na literatura uma visão mais abrangente para Betta splendens que incluia níveis de andrógenos e corticóides relacionados a comportamentos sociais, agressivos e cognitivos. A maioria das pesquisas com peixe Beta exploram aspectos de agressividade, defesa de território realizada pelos machos (Galizio et al., 1985), comportamento de corte, escolha de parceiros, construção de ninho e cuidado parental (Bronstein, 1982; Jaroensutasinee & Jaroensutasinee, 2001b; Rüber, 2004). Não há relatos na atual literatura de abordagens psicofisiológicas visando estabelecer perfis individuais neste grupo. Tomando como base as características acima citadas, utilizaremos o peixe Beta como modelo experimental para o presente estudo. Embora existam estudos que descrevem perfeitamente características comportamentais da espécie (Bronstein, 1985; Evans, 1985; Doutrelant & McGregor, 2000), faltam informações sobre as relações dos níveis hormonais com cada perfil comportamental. Diante disso, este trabalho investigará. a. influência. dos. hormônios. cortisol. e. testosterona. nos. perfis. comportamentais expressos por machos de Betta splendens. 16.

(23) 2. Objetivos 2.1. Objetivo geral Caracterizar perfis individuais baseados em múltiplas informações comportamentais e fisiológicas em machos de Betta splendens. 2.2 Objetivos específicos Classificar os animais em diferentes perfis comportamentais quanto ao comportamento de construção de ninho de bolhas, quanto ao número de displays agonísticos diante à confronto com coespecífico e quanto ao desempenho em tarefa de aprendizagem. Investigar níveis basais de cortisol e testosterona de cada indivíduo para construção de um perfil fisiológico basal. 17.

(24) 3. Materiais e métodos: 3.1 Animais e armazenamento Foram utilizados 86 machos de Betta splendens (Regan, 1910), entre três e cinco meses de idade, com comprimento padrão e peso aproximado de 2,5 cm e 3,0 g, respectivamente, padronizados na cor azul por motivos de disponibilidade, pois a maioria dos animais eclodem apresentando essa tonalidade. Os animais foram adquiridos no comércio de peixes local e mantidos por 10 dias para aclimatação no laboratório de peixes da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, onde permaneceram isolados em aquários de 700 ml devido ao alto grau de agressividade entre animais (Bronstein, 1981). O ciclo de luz foi mantido em 12C:12E, a temperatura em torno de 26 °C e a alimentação oferecida duas vezes ao dia (09:00h e 15:00h) com Artêmia salina e ração comercial. Em torno de 30% da água dos aquários foi trocada a cada 48 horas para manutenção da qualidade da água. A fase experimental foi realizada entre os meses de Agosto de 2015 e Março de 2016. O estudo teve aprovação do Comitê de Ética para Uso de Animais da Universidade Federal do Rio Grande do Norte sob protocolo n°: CEUA-006/2016 (Anexo).. 3.2 Caracterização do perfil comportamental Os animais foram individualmente transferidos para aquários experimentais dispostos lado a lado contendo uma planta artificial e revestidos no fundo com papel adesivo branco, com uma divisória opaca entre cada par de aquários para impedir o contato visual (Figura 1). Os indivíduos permaneceram nestes aquários durante toda a fase experimental. Após 24 h da transferência para aclimatação, os registros comportamentais individuais foram iniciados. Foram observadas 3 etapas consecutivas: no período do dia 1 ao dia 4 ocorreu o registro de construção de ninho de bolhas, entre 18.

(25) os dias 5 ao 7 ocorreu o registro com confrontos com coespecíficos, e do dia 8 ao18 ocorreu o registro no desempenho em tarefa de aprendizagem associativa.. Figura 1. Esquema dos aquários experimentais onde os animais foram mantidos. Cada aquário tem dimensões de 15 X 15 X 15 cm (3L). Entre cada aquário, uma divisória removível opaca impediu o contato visual entre os animais.. 3.2.1 Construção do ninho de bolhas O comportamento de construção de ninhos é natural dos machos de Betta splendens. Estes animais, quando adultos, iniciam a construção de ninhos geralmente em locais que tenham apoio para o mesmo (por exemplo, plantas) e mantém o ninho a fim de possibilitar o acasalamento e cuidado com a prole. Em nosso estudo uma planta artificial foi usada para suporte do ninho. A construção dos ninhos foi acompanhada durante os 4 primeiros dias do período experimental. O ninho de cada macho foi fotografado pela parte superior (ângulo de 90°) (Nikon D5000 com objetiva de 18-55 mm) uma vez ao dia (9 – 10h). A área de cada ninho foi estimada através do software Image Measurement®.. 19.

(26) 3.2.2 Confronto com coespecífico Após 4 dias de avaliação da construção de ninho, cada animal passou por confrontos com coespecíficos diferentes, um no primeiro dia e outro após 48 horas.. Devido à disposição dos aquários dos animais em linha, os confrontos ocorreram inicialmente com o vizinho da esquerda e posteriormente com o vizinho da direita (Figura 2). Imediatamente antes do confronto, a placa opaca que isolava visualmente um par de aquários foi removida e a interação entre os animais foi filmada por 10 minutos (câmera JVC FullHD 60x modelo GZ-HM65BU). Os vídeos foram analisados com software ZebTrack - MatLab (Pinheiro-da-Silva et al., 2017) e os displays de agressividade e territorialidade foram quantificados e sequenciados. Registramos os seguintes comportamentos: 1) abertura opercular: a membrana opercular é estendida a partir da mandíbula; 2) investidas bucais: agressão direta realizadas com a boca em direção à superfície do vidro; e 3) balanço corporal: natação leve em ‘forma de S’ perpendicular ao oponente.. 1° oponente. Peixe focal. 2° oponente. Figura 2: Esquema dos aquários para teste de confronto com coespecífico.. 20.

(27) 3.2.3 Tarefa de aprendizagem Esta etapa durou 14 dias e foi dividida em três fases: habituação, treinamento e teste. Durante a habituação, os animais foram individualmente transferidos para o labirinto em cruz 30 X 30 X 30 X 30 cm com área central de 10 cm² (Figura 3), introduzidos inicialmente numa start box em formato cilíndrico (diâmetro de 7,5 cm e altura de 10 cm) localizada no centro do labirinto, na qual permaneceram por um minuto. Após a remoção da start box, cada peixe pode explorar o aquário por 20 minutos no primeiro dia, 15 minutos no segundo dia e 10 minutos no terceiro dia, totalizando três dias para que os animais se habituassem ao ambiente do labirinto. Durante a habituação não foi oferecido alimento no labirinto. A fase seguinte consistiu no treinamento e durou 10 dias com duas sessões de 10 minutos por dia, a primeira com início às 09:00h e a segunda às 13:00h. Durante o treinamento, os animais também permaneceram 1 min na star box e após esse tempo, foram liberados para explorar o labirinto até encontrarem unidades de Artêmia salina dispostas em um alimentador redondo de plástico transparente com 1,5 cm de diâmetro. O alimento serviu como recompensa alimentar e foi disposto sempre em um dos braços do aparato dentro do alimentador (Figura 3). No 14° dia ocorreu o teste. Nesse dia, o alimento não foi oferecido e os animais nadaram livremente no labirinto por 10 minutos. Todas as sessões de treinamento e o teste foram filmadas com uma câmera (JVC FullHD 60x modelo GZ-HM65BU) localizada acima do labirinto (ângulo de 90°). Os vídeos foram analisados com o software ZebTrack utilizando a latência. para chegar à área do alimentador como. parâmetro de aprendizagem.. 21.

(28) Figura 3. Esquema do labirinto com o alimentador em um dos braços. 3.3 Caracterização do perfil hormonal Ao final da etapa de coleta de dados comportamentais, os peixes foram eutanasiados por imersão em dose elevada de óleo de cravo (5 ml/L água) 24 horas após o último dia experimental, armazenados individualmente em tubos Falcon (15 ml) e congelados a – 20° C para posterior análise de parâmetros hormonais. Para extração hormonal, cada animal foi macerado (novatecnica Equipamentos para Laboratórios) e acrescido de 2 ml de solução tampão PBS. A amostra obtida recebeu 4 ml de éter e foi centrifugada por 10 minutos a 3000 rpm. Com o soro separado do resto da amostra, o extrato foi congelado a -20°C (Barcellos et al., 2007).. 3.3.1 Cortisol No dia da dosagem, transferimos as amostras para a geladeira por 30 minutos e depois para a bancada até atingirem temperatura ambiente. Foi utilizado um kit de cortisol salivar SLV 2930 Lot 64K044 DRG Diagnostics. Identificamos os microtubos em tira 1,1 mL (axygen) e pipetamos 250 mL de padrão mais amostra nos respectivos tubos. Transferimos 100 µl das amostras para a placa de fundo chato e colocamos 200 µl de enzima conjugada por poço. Agitamos por 10 segundos em agitador orbital a 300rpm e após incubamos por 1h em temperatura ambiente com a placa selada. 22.

(29) Finalizado o tempo, lavamos manualmente cada poço com 400 µl de solução ‘wash’ diluída. Após isso, adicionamos 200 µl de substrato TMB por poço em um ambiente escuro e incubamos por 30 minutos na temperatura ambiente. Paramos a reação adicionando 100 µl de solução ‘stop’ por poço e realizamos imediatamente a leitura no Leitor de microplacas EPOCK – Biotek a 450 nm. Todas as amostras foram dosadas em duplicata.. 3.3.2 Testosterona Com outra alíquota advinda da metade das amostras de soro dos peixes, foi feito um ensaio de ELISA para 11-Ketotestosterone ELISA Kit ref: 582751 Cayman Chemical (Adaptado de Dziewecznski et al., 2006). No primeiro dia de medição hormonal, iniciamos o procedimento preparando os reagentes (solução tampão, solução ‘wash’, reagentes, AChE, Tracer e anticorpo) de acordo com as recomendações do protocolo. As amostras foram diluídas de 1:100 utilizando 200 µl de amostra com 990 µl de PBS. Com o auxílio de uma pipeta multicanal eppendorf, transferimos 50 µl da amostra para a placa do kit. Além das amostras, pipetamos também o Tracer e o anticorpo, seguindo o protocolo. Foi feita uma duplicata para cada amostra. Após esses procedimentos, a placa selada contendo as amostras, foi incubada no refrigerador a 4°C por 18 horas. No segundo dia a placa foi lavada manualmente por 5 vezes com solução ‘wash’ e acrescidas com reagente Ellman’s. Após, as amostras foram incubadas no orbital shaker (3000 rpm) por duas horas. Ao final, realizamos a leitura no espectrofotômetro de microplacas Epoch - Biotek a 412 nm.. 23.

(30) 3.4 Análises estatísticas Os ninhos com maior e menor tamanho de cada animal, foram descartados e os 2 valores intermediários foram usados para indicar o tamanho médio de ninho de cada indivíduo. Os valores médios de tamanho de ninho foram avaliados pelo teste de K-means para distinção dos grupos. Esse agrupamento foi feito por método de formação de clusters a fim de repartir o n amostral em subgrupos k, seguindo a similaridade relativa ao tamanho do ninho. Como resultado, houve a formação de três grupos denominados: construtores, intermediários e não construtores. Os valores de agressividade em termos de abertura opercular, investida bucal e balanço corporal foram comparados entre os animais construtores, intermediários e nãoconstrutores por One Way Anova. Os valores de tempo para adentrar a área do alimentador durante cada dia de treinamento e no dia da prova do teste de aprendizagem, foram comparados por Anova de medidas repetidas para cada grupo de peixes (construtor, intermediário e não construtor) Os dados foram padronizados utilizando-se Z score (Zuur et al., 2010) devido à diferença apresentada entre unidades e dimensões dos parâmetros analisados. Previamente à realização das análises estatísticas, os dados foram testados quanto à multicolinearidade, normalidade e homogeneidade multivariada das matrizes de variância e outliers. Uma matriz de correlação ranqueada de Spearman foi utilizada para avaliar a multicolinearidade dos dados, sendo preferível por evitar suposições de linearidade entre as variáveis (Zar, 2010). Assim, valores modulares do coeficiente de correlação de Spearman superiores a 0,5 e que foram significativos estatisticamente, foram indicativos da alta colinearidade de uma variável (Booth et al., 1994). Em adição, 24.

(31) os dados ainda foram avaliados através do VIF (fator de inflação da variável). A colinearidade foi considerada para valores maiores que 3 (Zuur et al., 2010). Como resultado, todas as variáveis comportamentais e fisiológicas foram mantidas na análise. Em seguida, as variáveis foram testadas quanto a sua normalidade multivariada, pelo teste de simetria e curtose multivariada (Mardia, 1970 e 1980, com modificações propostas por Doornik & Hansen, 1994 – omnibus test). Em adição, realizou-se um teste M de Box (Anderson, 1958), que avalia a equivalência (homogeneidade multivariada) entre as matrizes de covariância de dois grupos de amostras, com permutações de Monte Carlo para o valor de p. Os resultados mostraram que os dados não apresentaram normalidade e homogeneidade multivariada. Após, realizamos uma análise de componentes principais (ACP ou PCA) para avaliar as cargas (loadings) de cada variável explicativa (cortisol, testosterona, balanço corporal, abertura opercular, ameaça lateral, investida bucal e aprendizado). As variáveis que apresentaram valores modulares maiores que 0,4 foram mantidas para posterior análise. Além disso, a importância das variáveis foi testada a partir da função envfit no pacote “vegan” do software estatístico R (Oksanen et al., 2012) (Tabela 1). Para comparar estatisticamente os 3 grupos pré determinados (construtor, intermediário e não-construtor) foi utilizada uma analise de variância multivariada permutacional, PERMANOVA (9999 permutações). Para classificar as variáveis com maior força de discriminação dos grupos, utilizamos a análise Random Forest (RF) e Classification Tree, pois, são análises que não exigem um tipo específicos de distribuição dos resíduos dos dados ou forma da relação da variável resposta (Perdiguero-Alonso et al., 2008). A técnica de RF utilizada foi do tipo “Bagging” (ensacamento) que efetua uma reamostragem (5000), a partir da amostra original, seleções aleatórias dos dados, com reposição. Uma estimativa da taxa 25.

(32) de erro foi obtida usando os dados não utilizados em cada interação de bootstrap, chamados os dados "fora do saco", ou “out-of-bag” (OOB), como um conjunto de dados de teste. Uma estimativa de erro de OOB foi obtida e, segundo Liaw & Wiener (2002), este valor é resultado das classificações baseadas nos dados OOB. Uma matriz de confusão das predições (baseado nos dados de OOB) foi obtida, para quantificar a precisão de classificação entre os grupos construtor, intermediário e não-construtor preditos. As variáveis comportamentais e fisiológicas foram classificadas em níveis de importância, a partir do índice de Gini (Diminuição média de Gini) e Diminuição da precisão média (Liaw & Wiener, 2002). Para quantificarmos a precisão global do modelo de classificação, utilizamos a porcentagem de grupos corretamente classificados (PCC). Foram obtidos, também, informações de especificidade e sensibilidade (porcentagem de grupos não ameaçados corretamente classificadas e porcentagem de grupos ameaçadas corretamente classificadas, respectivamente). Pelo fato dos dados comportamentias serem quantitativos contínuos, foi utilizado um teste estatístico de coeficiente de correlação intraclasse (CCI), do tipo “oneway” (somente as linhas da matriz de dados foram considerados como efeito aleatório). Uma análise de árvore de inferência condicional foi utilizada para se testar os principais comportamentos classificadores dos grupos. A proposta é criar uma árvore formada por nós (cada nó respresenta uma variável importante estatísticamente). Cada nó se divide em dois ramos explicando, por fim, quais variáveis separam os grupos comportamentais (Figura 4). Todas as análises foram realizadas utilizando o software R (R Development Core Team 2012) adotando o nível de significância de 5% (Zar, 2010). As análises de PCA e PERMANOVA foram realizadas no pacote ”vegan” (Oksanen et al., 2012), Random forest utilizando no pacote ‘Random forest’ (Liaw & Wiener, 2002), 26.

(33) coeficiente de correlação intraclasse no pacote “irr” (Gamer et al., 2012) e a árvore de inferência condicional no pacote “party” (Hothorn et al., 2006).. 4. Resultados Todos os animais testados apresentaram uma classificação inicial de acordo com o tamanho de ninho apresentado: construtores, intermediários e não-construtores (Figura 4).. Figura 4: Divisão entre os animais testados em: construtores, intermediários e nãoconstrutores. Análise baseada no tamanho de ninho de bolhas de cada animal. Os ninhos foram classificados de acordo com a medição em cm2.. Em termos de comportamento agressivo, os valores totais de abertura opercular, investida bucal e balanços corporais estão apresentados na figura 5. Houve diferença estatística entre os grupos para os três tipos de comportamento agressivo (One Way. 27.

(34) Anova, abertura opercular F2,83 = 6,75 p< 0,001; investida bucal F2,83 = 8,6 p< 0,001; balanços corporais F2,83 = 5,19 p= 0,007).. *. a ab. b *. Figura 5: Número de displays agonísticos observados durante 2 confrontos entre coespecíficos diferentes em Betta splendens. Os animais foram separados em grupos conforme a medição dos ninhos prévia aos confrontos. A comparação do mesmo display agonístico entre os grupos foi significativa (One Way Anova p<0,05). Letras diferentes indicam diferença estatística para o comportamento de balanço corporal. * indica diferença estatística para os comportamentos de abertura opercular e investidas bucais.. Para os dados de latência para entrar na área de recompensa alimentar (teste de aprendizagem), RM Anova mostrou que o grupo construtor mostrou diminuição no tempo para aprender a tarefa (F5,45 = 31,47 p<0,001), assim como o grupo intermediário (F5,150 = 15,78 p<0,001) e o grupo não-construtor (F5,220 = p<0,001) (Figura 6). No dia da prova, em que a recompensa alimentar não estava disponível, One Way Anova mostrou diferença significativa entre os grupos (F2,83 = 11,54 p<0,001), sendo o grupo de não-construtor aquele que demora mais a chegar à área do ninho.. 28.

(35) *. Figura 6: Latência para entrar na área do alimentador ao longo dos dias de treinamento e durante a prova. Os dias de treinamento foram agrupados em blocos de 4. As últimas barras representam o dia de teste (prova), no qual o alimento não estava disponível. Ao longo do tempo é possível observar diminuição na latência para entrar na área do alimentador mostrando que os peixes associam o lugar do alimentador com a recompensa. Os 3 grupos experimentais apresentaram diminuição significativa na latência ao longo do tempo (RM Anova p<0,05). * indica diferença significativa entre os grupos no dia da prova (One Way Anova p<0,05).. O teste de Correlação de Spearman mostra correlações positivas (valores entre 0 e 1) e negativas (valores entre -1 e 0). A figura 7 mostra que a construção do ninho correlaciona-se negativamente com os valores de cortisol (p<0,001), o número de comportamentos de investidas bucais, correlacionaram-se positivamente com balanços corporais, abertura opercular e valores de cortisol (p<0,01).. 29.

(36) Figura 7. Correlação entre as variáveis comportamentais e fisiológicas coletadas de 86 Betta splendens machos (teste de Spearman). A barra de cores ao lado do gráfico indica que colorações para o vermelho indicam correlação negativa entre as variáveis, enquanto colorações positivas são representadas pelos tons azuis. O tamanho do círculo representa a grandeza da correlação, sendo alta correlação indicada por círculos maiores e baixa correlação indicada por círculos menores. Os valores de p estão apresentados dentro de cada círculo.. Na análise de componentes principais (PCA), foram avaliadas as três primeiras componentes. que. totalizaram. 82,3%. da. variação. total. dos. fatores. comportamentais/fisiológicos amostrados. Foi possível observar tendência de formação de grupos de peixes construtor, intermediário e não-construtor, através das variáveis 30.

(37) amostradas (Fig. 8a e 8b). A PCA sugere-se maior relação do grupo não-construtor com os comportamentos agressivos (Figura 8a) e também com o nível de cortisol (Figura 8b). Os grupos construtor e intermediário mostram-se mais relacionados com os níveis de testosterona (Figura 8a e 8b). Para a aprendizagem, sugere-se mais relação com o grupo intermediário, seguido pelo grupo construtor (Figura 8).. a). 31.

(38) b). Figura 8 – Análise de componentes principais (PCA) das respostas comportamentais e parâmetros fisiológicos coletados de 86 Betta splendens machos. (a) refere-se à PCA dos componentes 1 e 2, (b) refere-se à PCA dos componentes 1 e 3. C – peixes construtores (n=10), I - peixes intermediários (n=31), e NC - peixes não-construtores (n=45). A inspeção dos autovalores nas três primeiras componentes principais e na análise do envfit não indicou qualquer variável com baixa relevância na variação dos dados. Na PERMANOVA foram identificados diferenças significativas entre os grupos de peixes construtor, intermediário e não-construtor (F2,42 = 14,41 p<0,001; Tabela 1 e 2).. 32.

(39) Tabela 1: Resultados estatísticos de análise de componentes principais (PCA) das respostas comportamentais e parâmetros fisiológicos coletados de 86 Betta splendens machos. Análise de Componentes Principais CPs. Autovalor. Var (%). CumVar (%). 1. 1.64. 45. 45. 2. 1.17. 23. 68. 3. 0.93. 14. 82. CP1. CP2. CP3. Abertura opercular. 0.45. 0.23. -0.23. Investida bucal. 0.55. -0.02. -0.08. Balanço corporal. 0.43. 0.31. -0.44. Aprendizagem. -0.01. 0.67. 0.59. Cortisol. 0.46. -0.07. 0.56. Testosterona. -0.31. 0.62. -0.28. Loadings. CP - Componente principal, Var – Proporção de variância, CumVar – Proporção de variância cumulativa.. Tabela 2: Resultados de análise de componentes permutável multivariada (PERMANOVA) entre os grupos de animais analisados. Diagonal superior indica valores de F e diagonal inferior valores de p. Construtor. Intermediário. Não-construtor. -. 11.24. 13.58. Intermediário. 0.001. -. 16.33. Não-construtor. 0.001. 0.001. -. Construtor. A taxa de erro da estimativa OOB, a partir do modelo de classificação entre os grupos construtor, intermediário e não-construtor e variáveis comportamentais, foi de 13,3%, obtendo sucesso médio preditivo de 86,7% (modelo RF). A Tabela 3 apresenta a matriz de confusão entre os grupos construtor, intermediário e não-construtor e suas respectivas taxas de erros. Observa-se que o maior percentual de erro é encontrado nos 33.

(40) grupos construtor e intermediário, visto que dos 7 animais construtores, 3 podem encaixar-se somente no grupo intermediário só, e dos 11 animais intermediários, 1 pode ser construtor e 1 pode ser não-construtor. O grupo com menor erro foi não- construtor, no qual dos 21 animais classificados, apenas 1 pode encaixar-se no grupo intermediário.. Tabela 3: Matriz de confusão apresentando a matriz de validação cruzada do modelo RF, para os grupos construtor, intermediário e não-construtor e seis variáveis comportamentais. Observado/Predito. C. I. N. % de erro. C. 7. 3. 0. 0,3. I. 1. 11. 1. 0,15. NC. 0. 1. 21. 0,05. A figura 9 mostra os valores do índice de Gini (IG) e diminuição da precisão média (DPM). É possível observar que a variável com maior domínio de classificação foi cortisol (IG=4,9; DPM=94,5), seguidos de aprendizagem (IG=5,0; DPM=50,0), testosterona (IG=4,9; DPM=39,4), investidas bucais (IG=4,2; DPM=31,1), abertura opercular (IG=1,7; DPM=3,9) e balanços corporais (IG=1,4/ DPM=1,5). O modelo de classificação entre os grupos e variáveis comportamentais foi estatisticamente significativo, de acordo com coeficiente de correlação intraclasses (CCI: F(44,225)= 2,27; p<0,001).. 34.

(41) Figura 9: Importância relativa em ordem ranqueada dos fatores fisiológicos e comportamentais dos animais classificados quanto à construção de ninho. (a) A importância foi medida pelo decaimento na acurácia de classificação após a remoção de cada preditor em um Random Forest de 5000 ‘árvores’. O primeiro preditor (cortisol) foi significativamente distinto, os próximos três preditores (aprendizagem, testosterona e investidas bucais) foram significativamente mais importantes do que os demais preditores amostrados (aberturas operculares e balanços corporais). (b) Resultado da homogeneidade dos subgrupos de dados medidos pelo índice de Gini.. A Figura 10 apresenta a análise de árvore de inferência condicional, ordenada hierarquicamente. Das seis variáveis apresentadas nos dados, apenas cortisol e aprendizagem foram significativos. A variável cortisol (primeiro nó) separou os animais não construtores do resto da amostra. Já a variável aprendizagem (segundo nó) separou os animais restantes em grupos de construtores e intermediários, assim resultando nos nós seguintes: terceiro nó: construtores de ninho; quarto nó: construtores intermediários de ninhos e quinto nó: não construtores de ninho.. 35.

(42) Figura 10: Árvore de decisão (Classification Tree) mostrando a separação dos grupos baseada em fatores fisiológicos e comportamentais. Em cada nó intermediário, um ramo vai para a esquerda do nó se, e somente se, a condição for satisfeita. A classe preditiva é dada abaixo de cada nó. A variável resposta cortisol compõe o primeiro nó, separando o grupo de não construtores de ninho dos demais animais. A variável resposta aprendizagem (em termos de latência para cumprir a tarefa) compõe o segundo nó separando o grupo intermediário do grupo de construtores de ninho.. 36.

(43) 5. Discussão Neste trabalho, utilizamos respostas comportamentais e hormonais para caracterizar diferenças individuais em machos de Betta splendens. Com base no comportamento de construção de ninho, identificamos três perfis comportamentais: construtores, intermediários e não-construtores. O cortisol foi o principal preditor dessas diferenças: animais com níveis mais altos desses hormônio não constroem ninho e mostram maior propensão à agressividade. Por outro lado, a testosterona parece estar relacionada ao perfil construtor de ninho. Além disso, peixes do perfil construtor e intermediário, destacam-se no desempenho em tarefa de aprendizagem. Nossos dados mostram que numa mesma população, os perfis comportamentais existentes investem de forma diferente em reprodução, o que pode gerar, em longo prazo, diferenças marcantes em termos de sucesso reprodutivo e de representatividade de cada perfil na população. Nosso estudo abrange tanto aspectos comportamentais quanto fisiológicos relacionados ao perfil individual. Outros estudos na temática das diferenças individuais foram menos abrangentes, se atendo a apenas poucos aspectos do comportamento dos animais se utilizando de técnicas menos robustas para a separação de grupos (Clotfelter & Paolino, 2003; Koolhaas et al., 2006; Dzieweczynski et al., 2006; Oliveira, 2009). Neste estudo, além da proposição de perfis para a espécie foco (Betta splendens), apresentamos uma alternativa para a classificação dos animais e para o estudo da força explicativa das variáveis analisadas com base em testes estatísticos mais robustos. O uso de teste de K-means para a separação de grupos, baseado em respostas comportamentais consistentes (que se mantem ao longo do tempo), diferencia nosso estudo dos demais, e a utilização de técnicas pouco usuais e de alta confiabilidade científica, conferem valor ao presente estudo. Ademais, para estudos de personalidade/perfil comportamental, o 37.

(44) uso das técnicas estatísticas aqui propostas é inovador e pode contribuir para o entendimento das relações entre variáveis explicativas em conjunto de dados mais amplos. Em nosso estudo, utilizamos o comportamento de construção de ninhos como elemento separador de grupos. A construção do ninho de bolhas faz parte do repertório de corte em varias espécies de peixes e anfíbios (Bronstein, 1982; Méndez-Narváez et al., 2015.) Em Betta splendens, um ninho robusto com bolhas fartas e duradouras é um investimento custoso, mas importante para a sobrevivência da prole (Braddock & Braddock, 1955). No ninho ocorre a manutenção dos ovos por hidratação e oxigenação oferecidos pelo pai, além de servir de proteção aos filhotes (Méndez-Narváez et al., 2015). Apesar do seu valor para reprodução, parte dos indivíduos testados não construiu ninho. Segundo (Simpson, 1968), os fatores limitantes à reprodução no Betta splendens são disponibilidade de alimento para as fêmeas e território para os machos: ao adquirir o território, o macho inicia a construção do ninho e o mantém até o desenvolvimento da prole. No nosso estudo, todos os machos possuíam território, sem variação na sua qualidade (em termos de tamanho e qualidade da água), e, além disso, os animais tinham a mesma idade e características físicas semelhantes. Portanto, acreditamos que as diferenças na construção do ninho foram derivadas de diferenças individuais apresentadas por cada peixe (Figura 8 e 10). De acordo com as técnicas de Random Forest e Cassification Tree, o nível de cortisol foi o fator dominante para a separação entre grupos de animais não-construtor de ninho vs. construtor e intermediário (Figura 10). O cortisol é o principal hormônio na reposta ao estresse (Romero, 2002) e também atua como regulador do comportamento reprodutivo, incluindo o cuidado parental, pois as concentrações de corticosteróides influenciam a síntese de hormônios sexuais responsáveis por comportamentos 38.