Título: Mecanismo de Hepatotoxicidade do Paracetamol
Miguel António Mendes Pereira, aluno do 6ºano de Mestrado Integrado em Medicina da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto
Resumo
A intoxicação pelo paracetamol, ou acetaminofeno, constitui uma das principais causas de insuficiência hepática aguda, no entanto, o mecanismo preciso de hepatotoxicidade deste fármaco ainda possui muitas questões em aberto.
Na intoxicação pelo paracetamol, é formado um metabolito extremamente reativo, a N-acetil-p-benzoquinonaimina (NAPQI), que se acumula em quantidades de tal ordem, que superam a capacidade das vias inativadoras, nos hepatócitos. A NAPQI é particularmente tóxica para as mitocôndrias, desacoplando a cadeia respiratória, levando ao stress oxidativo e à disfunção mitocondrial. A disfunção destes organelos, combinada com a fragmentação nuclear associada, culminam na necrose dos hepatócitos. Ao mesmo tempo, o stress oxidativo ativa as vias de sinalização c-jun-N-terminal kinase (JNK), p53, fissão mitocondrial, stress do retículo endoplasmático e aumento do cálcio citoplasmático, que exacerbam a toxicidade hepática do paracetamol, enquanto que vias de sinalização, como a nuclear factor-like 2 (Nrf2) e a mitofagia, mostraram um papel de contrarregulação deste mecanismo.
A seguir à necrose dos hepatócitos, o sistema imune é chamado a intervir e cada um dos tipos de células efetoras poderá ter um papel potenciador ou protetor da lesão hepática.
Abstract
Acetaminophen or paracetamol overdose is a main cause of acute liver failure, however the precise hepatotoxicity’s mechanism of this medicine still has
questions to be answered.
In acetaminophen overdose, is formed one extremely reactive metabolite, N-acetyl-p-benzoquinoneimine (NAPQI), which accumulates so much that overcome the capacity of the inactivation pathways, in the hepatocytes. NAPQI is particularly toxic to mitochondria, uncoupling the respiratory chain, leading to oxidative stress and mitochondrial dysfunction. The dysfunction of this organelles, combined with the associated nuclear fragmentation, culminates in hepatocyte necrosis. Meanwhile, oxidative stress activates metabolic pathways such as c-jun-N-terminal kinase (JNK), p53, mitochondrial fission, endoplasmic reticulum stress and increasing cytoplasmic calcium, which promotes acetaminophen hepatic toxicity, on the other hand, metabolic pathways such as nuclear factor-like 2 (Nrf2) and mitophagy, that have demonstrated a contrarregulatory role of this mechanism.
Next to hepatocyte necrosis, the immune system is called to intervene and each one of the cells types could have a damaging or a protecting role on the liver failure.
1. INTRODUÇÃO
O paracetamol (para-acetil-aminofenol) também designado por acetaminofeno (N-acetil-para-aminofenol) ou, mais corretamente, por N-(4-hidroxifenil)-etanamida segundo a União Internacional de Química Pura e Aplicada (IUPAC)1. O paracetamol é um dos fármacos mais usados em todo o
Mundo, devido à sua ação antipirética e analgésica2. Contém, ainda, uma
modesta ação anti-inflamatória3, atravessando a barreira hematoencefálica4, 5,
inibindo a via das cicloxigenases (COX) no sistema nervoso central6, 7.
É considerado um fármaco seguro quando usado em doses terapêuticas comparado com outros fármacos com a mesma ação. Contudo, a intoxicação pelo paracetamol constitui a principal causa de insuficiência hepática aguda nos Estados Unidos da América8, contando com 30.000 hospitalizações anuais9.
Existem inúmeras combinações de outros fármacos com o paracetamol e estima-se que a população idosa uestima-se mais do que um para síndromes de dor crónica ou aguda10. Apesar da dose máxima ter sido fixada nos 4 gramas diários para
adultos, a 6% dos adultos americanos são prescritas doses superiores 9. Cerca
de metade dos casos de intoxicação pelo paracetamol são provocados por overdose acidental11. Em Portugal, é o medicamento não sujeito a receita médica
mais vendido12.
Após a intoxicação, no tratamento recorre-se à administração do antídoto: a N-acetil-cisteína. . A ação farmacológica da N-acetil-cisteína consiste na síntese de glutationa por doação do seu substrato, uma molécula fulcral para a inativação dos metabolitos reativos formados na intoxicação pelo paracetamol13, 14. Atua, também, através da doação de intervenientes no ciclo de Krebs,
paracetamol. A eficácia do antídoto é tanto maior quanto menor o tempo entre o momento da intoxicação e administração de NAC15. Se tardar o acesso aos
cuidados de saúde, resta apenas o transplante hepático16.
Apesar da sua dimensão no panorama global de saúde, o mecanismo de toxicidade hepática causada pelo paracetamol tem ainda muitas questões em aberto. Esta revisão tem como objetivos: determinar o consenso da literatura em relação ao mecanismo de hepatotoxicidade do paracetamol até ao momento e, ainda, apresentar as diferentes posições relativamente ao papel controverso das várias células efetoras do sistema imune após a lesão hepatocitária.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
Pesquisa bibliográfica realizada na base de dados online Pubmed, usando a query “Acetaminophen [ti] AND (hepatocytes [tiab] OR hepatocyte [tiab] OR hepatotoxicity [tiab])” desde 2012. Dos 574 artigos que preencheram estes
requisitos, foram rejeitados 451 artigos que, após leitura do resumo e/ou do texto integral, não se adequavam ao âmbito desta monografia. Aos 123 artigos restantes, foram adicionados os artigos originais com relevo para a monografia.
3. MECANISMO DE HEPATOTOXICIDADE 3.1. Generalidades
O paracetamol em excesso satura as vias normais de metabolização hepática, levando à formação de N-acetil-p-benzoquinonaimina (NAPQI), um composto altamente reativo que se liga a todo o tipo de moléculas, inativando-as (Figura 1). O principal alvo da NAPQI é a mitocôndria, destruindo os mecanismos normais de produção de energia, provocando a sua disfunção. A disfunção mitocondrial ativa uma via de sinalização chamada c-jun-N-terminal kinase (JNK) e, juntas, provocam o fenómeno de transição de permeabilidade mitocondrial (MPT), que consiste na abertura de poros nas mitocôndrias. O efluxo de moléculas através destes poros é responsável pela necrose dos hepatócitos e, também, provoca a ativação do sistema imune. Consoante a célula do sistema imunitário e as substâncias que liberta, esta pode potenciar a hepatotoxicidade do paracetamol ou promover a regeneração dos hepatócitos necrosados.
Ao longo dos próximos capítulos, serão explicitados em pormenor cada um destes passos.
3.2. Metabolização do paracetamol
A metabolização do paracetamol é feita no fígado. A maior parte é metabolizada por glicuronidação (40-67%) ou sulfatação (20-46%)17, 18 (Figura
2). Uma pequena parcela (5-15%) é metabolizada pela família do citocromo P450 (CYP450), principalmente pelos CYP2E1 e CYP3A4. Daí resulta um intermediário, denominado N-acetil-p-benzoquinonaimina (NAPQI)19.
Em condições normais, a NAPQI é reduzida pela glutationa em conjugados não tóxicos, que são eliminados na bílis e urina20. Pelo contrário, numa
intoxicação por paracetamol, a metabolização por glicuronidação e sulfatação fica saturada 21 22, 23. O paracetamol é então metabolizado pelo CYP450,
formando quantidades crescentes de NAPQI. A própria glutationa acaba também por saturar e não consegue metabolizar toda a NAPQI formada.
A NAPQI é um composto ativo, que reage com ácido desoxirribonucleico (ADN), proteínas e lípidos insaturados24. Como as reservas de glutationa
diminuem muito mais na mitocôndria, do que no citoplasma do hepatócito, é na mitocôndria que predominam os efeitos nefastos da intoxicação pelo paracetamol25.
3.3. Disfunção mitocondrial
Na mitocôndria, a NAPQI reage com a peroxidase do glutatião (GPx) e com a subunidade α da sintetasede adenosina trifosfato (sintetasede ATP)26. A redução
de atividade da GPx leva à diminuição da regeneração da glutationa e, por conseguinte, à acumulação de espécies reativas de oxigénio (ROS) e de azoto (RNS). Por outro lado, a diminuição da atividade da sintetasede ATP leva à diminuição da produção de ATP. 27-29Ambos têm como consequência a disfunção
mitocondrial.
Uma das ROS formadas é o ião superóxido (O2•-). Este radical livre pode ser
metabolizado enzimaticamente pela manganésio-dismutase do superóxido (MnSOD ou SOD2) em peróxido de hidrogénio (H2O2). O peróxido de hidrogénio
da SOD2, tais como a glutationa 30, 31, catálase ou peroxirredoxinas32. Se o
peróxido de hidrogénio não for imediatamente inativado, sofre uma reação não enzimática que resulta na formação do radical livre hidroxilo (HO•)33, que
posteriormente é metabolizado enzimaticamente pela catálase34.
O radical superóxido pode também reagir com outro radical livre, o óxido nítrico (NO•), e formar o ião peroxinitrato (ONO2−)30, 31. No entanto, o peroxinitrato
inibe a enzima MnSOD35, diminuindo a dismutação do superóxido em peróxido
de hidrogénio, aumentando a parcela de superóxido que se transforma em peroxinitrato. O ião peroxinitrato tem um elevado poder oxidante e de nitração, constituindo um estímulo lesivo importante ao hepatócito 30, 36, 37.
3.4. Amplificação pela via de sinalização JNK
As ROS decorrentes da disfunção mitocondrial ativam uma via de sinalização citoplasmática que amplifica o dano mitocondrial, denominada c-jun-N-terminal kinase (JNK), que faz parte da família das mitogen-activated protein kinase (MAPK)38 (Figura 3).
Os alvos diretos das ROS são três cinases: a mixed-lineage kinase 3 (MLK3)39, a glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β)40 e a apoptosis
signal-regulating kinase 1 (ASK1)41. A MLK3 e a GSK-3β tendem a ser ativadas numa
fase inicial, enquanto a ASK1 numa fase mais tardia da intoxicação pelo paracetamol42.
A MLK3 e a GSK-3β formam um circuito de retroação positiva, ativando-se
uma à outra, ao mesmo tempo que ativam a JNK39.Ao contrário das anteriores,
(Trx), num complexo chamado signalossoma43. Em condições normais, a
tiorredoxina encontra-se na sua forma reduzida e inibe a atividade da ASK144.
Todavia, neste contexto de stress oxidativo, a tiorredoxina é oxidada e liberta a ASK1 do signalossoma45.
Destas três cinases, só a GSK-3β e a ASK1 é que fosforilam e ativam a MAPK
kinase kinase 4 (MKK4) e é a MKK4 que participa ativamente na fosforilação e ativação da JNK46, 47.
Alternativamente, a fosforilação da JNK pode ser levada a cabo pelas cinasesreceptor interacting protein kinase (RIPK) 1 e 3, que são ativadas no decorrer da acumulação de ROS48, 49. Apesar de estas duas proteínas
normalmente se associarem a outras num complexo intitulado necroptossoma, na intoxicação pelo paracetamol não formam o dito complexo, tal como é classicamente descrito50.
Ao mesmo tempo, o stress oxidativo ativa a fosfatase mitogen-activated protein kinase phosphatase 1 (MKP1)51-55. A MKP1 contraria a fosforilação da
JNK, a fim de diluir a ativação da JNK40, 56.
A JNK é capaz de ativar a sintetasede óxido nítrico indutível (iNOS)57,
representando uma fonte de NO• e consequente formação de peroxinitrato30, 31.
Assim, além da amplificação do efeito das ROS, a JNK participa, de igual forma, na sua formação.
Por fim, a ativação da JNK leva à sua translocação do citoplasma para a membrana externa da mitocôndria, onde ativa a SH3 domain-binding protein that preferentially associates with Btk (Sab), também designada Src homology 3 domain binding protein 5 (Sh3bp5)58.
3.5. Transição de permeabilidade mitocondrial (MPT)
O stress oxidativo, causado pela acumulação de ROS, provoca um fenómeno que se designa por transição de permeabilidade mitocondrial (MPT)59, 60 (Figura
4). A MPT consiste na abertura de um poro na membrana mitocondrial e no desacoplamento da cadeia respiratória, o que potencia um aumento ainda maior da formação de ROS61.
Contudo, o stress oxidativo não é suficiente para o aparecimento da MPT, sendo necessária a sua amplificação pela via de sinalização JNK, cuja ativação é da responsabilidade do próprio stress oxidativo38. A ativação da Sab/Sh3bp5
leva à formação de um poro Bcl2-associated X protein (Bax) na membrana externa da mitocôndria62.
O aumento da permeabilidade membranar permite a libertação para o citoplasma de proteínas que se localizam no espaço intermembranar mitocondrial, tais como a endonuclease G e apoptosis inducing factor (AIF). Ambas chegam ao núcleo do hepatócito e levam à fragmentação do ADN da célula 63, 64.
No seu conjunto, a fragmentação do material genético e a disfunção mitocondrial 65 provocam a necrose do hepatócito48.
Com a necrose dos hepatócitos, há um extravasamento para o espaço extracelular de diversos constituintes celulares, tais como ADN nuclear50,
arginino-succinase69, peptídeos N-formil mitocondriais70, heat shock proteins
(HSPs)71, citoqueratina-18 não truncada (CK-18), high mobility group box-1
(HMGB1) 72e ATP73. As moléculas mencionadas pertencem ao grupo das
damage associated molecular patterns (DAMPs) 71, 74.
3.6. Vias de sinalização complementares
Além do mecanismo principal anteriormente descrito, a intoxicação pelo paracetamol ativa outras vias de sinalização que podem potenciar ou inibir a sua hepatotoxicidade (Figura 5). O stress do retículo endoplasmático, o metabolismo do cálcio, a via de sinalização do p53 e a fissão mitocondrial contribuem para a necrose dos hepatócitos. A via de sinalização do Nrf2 e a mitofagia constituem vias contrarreguladoras, que atenuam a necrose hepatocitária.
Cada uma destas vias sinalizadoras vai ser descrita, individualmente, de seguida.
3.6.1. Stress do retículo endoplasmático (RE)
As ROS formadas no decorrer da intoxicação pelo paracetamol desencadeiam o stress do retículo endoplasmático (RE) (Figura 6). O stress do RE ocorre quando existe uma incapacidade de atribuir às proteínas a sua conformação final, provocando uma resposta designada por unfolded protein response (UPR)75.
O stress do RE e o próprio stress oxidativo convergem na fosforilação da proteína Eukaryotic Initiation Factor 2 (eIF2)76, 77, que participa numa via de
sinalização chamada de Resposta integrada de stress (IRS)78. A fosforilação da
eIF2 leva à inibição da entrada proteica no RE, de modo a inibir a formação de mais proteínas malconformadas, impedindo a propagação da UPR.
Contudo, como a produção de ROS é cada vez maior e, por conseguinte, também o stress do RE aumenta, este mecanismo protetor deixa de ser suficiente. As consequências são a amplificação da disfunção mitocondrial e a saída de cálcio (Ca2+) do RE. O incremento na disfunção mitocondrial, promove
uma maior produção de ROS, fechando um circuito de ampliação da toxicidade hepática79-83.
3.6.2. Metabolismo do cálcio (Ca2+)
Devido à disfunção mitocondrial, os hepatócitos estão privados de ATP e para aumentar a sua produção, aumentam a expressão de recetores membranares purinérgicos P2R (Figura 7). Os P2R têm como função a passagem de Ca2+ do
espaço extracelular para o citoplasma do hepatócito84-86.
A produção excessiva de ROS leva à expressão, nos hepatócitos, de outra família de recetores de membrana, designados por Transient Receptor Potential Melanostatine 2 (TRPM2). Os TRPM2 têm a mesma função dos P2R, favorecendo o aumento da concentração de Ca2+ no citoplasma dos
hepatócitos87.
Existe ainda uma ATPase dependente de cálcio e magnésio (Ca2+-Mg2+
-ATPase), situada na membrana do hepatócito, que é inativada pela NAPQI e contribui também para a acumulação de Ca2+ dentro da célula88.
Todo este Ca2+ em excesso ativa proteínas denominadas calpaínas89 e
endonucleases dependentes de Ca2+90 que provocam a degradação proteica 89
e fragmentação do material genético90, respetivamente. Uma dessas
endonucleases é a desoxirribonuclease dependente de Ca2+ e Mg2+ (DNase1).
A DNase1 ativa uma enzima com o propósito de reparo do ano: a poly-adenosine diphosphate-ribose polymerase-1 (PARP-1)91. No entanto, a PARP-1 utiliza uma
quantidade excessiva de Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) +, o que acaba por exacerbar a necrose dos hepatócitos92.
Além disso, o aumento citosólico da concentração de Ca2+, aliado ao stress
oxidativo, provoca a translocação, para a membrana, da Proteína cínase C-α
dependente de Ca2+ (PKC-α). Os efeitos da PKC-α são a desagregação de
junções apertadas (tight-junctions) entre os hepatócitos93, bem como a ativação
da via de sinalização JNK94. Todos estes fatores contribuem, de forma mais ou
menos direta, para a necrose dos hepatócitos.
3.6.3. Supressor tumoral p53
O gene supressor tumoral p53 leva à expressão da proteína p53. No contexto da intoxicação pelo paracetamol, a p53 é ativada tanto pelo dano no ADN95,
como pelo stress oxidativo96-98 ou pela via de sinalização JNK99 (Figura 8).
A p53 ativa a proteína p21, cujo efeito é a inibição de ciclinas e outros reguladores do ciclo celular, com o consequente envelhecimento e morte dos hepatócitos100, 101.
3.6.4. Fissão mitocondrial
As mitocôndrias são organelos com divisão independente da divisão celular. À divisão da mitocôndria dá-se o nome de fissão mitocondrial. Na fissão
mitocondrial, intervém a proteína dynamin-related protein 1 (Drp1)102 (Figura 9).
A proteína RIPK3, já referida anteriormente, além de fosforilar a proteína JNK, também despoleta a translocação da Drp1 para a mitocôndria48. A fissão
mitocondrial em que a Drp1 participa, promove a produção de ROS em maior quantidade, exacerbando o stress oxidativo103.
3.6.5. Via de sinalização Nuclear factor-like 2 (Nrf2)
As ROS ativam a via de sinalização que pertence ao Nuclear factor-like 2 (Nrf2) (Figura 10). A ativação do Nrf2 ocorre através da desconexão do seu inibidor, a kelch-like ECH associating protein-1 (keap-1). A esta separação, segue-se a translocação do Nrf2 desde o citoplasma até ao núcleo. No interior do núcleo do hepatócito, o Nrf2 liga-se à região reguladora de diversos genes, a que se dá o nome de antioxidant response element (ARE)104.
O Nrf2 promove a transcrição dos genes correspondentes à NAD(P)H quinone oxidoreductase 1 (NQO1), glutamate cysteine ligase catalytic subunit (GCLC), glutamate cysteine ligase modifier subunit (GCLM)105, dismútase do superóxido
(SOD) 1 e 2, peroxirredoxina 1 (Prdx1)106, 107, heme oxygenase-1 (HO-1) 105e
multidrug resistance–associated protein transporter (Mrp) 3 e 4108.
A NQO1 é capaz de inativar a próprio NAPQI109. A GCLC e a GCLM são as
na produção de glutationa110. Tanto a SOD1 e 2111, como a Prdx1 são outros
agentes do sistema antioxidante das células que contraria o stress oxidativo112.
A HO-1 metaboliza o grupo heme libertado durante a metabolização de xenobióticos, diminuindo a formação de ROS94. Os Mrp 3 e 4 participam na
expulsão e conjugação de xenobióticos em compostos inertes108.
Aparentemente, a via de sinalização Nrf2 é um dos mecanismos compensatórios presentes para proteger o hepatócito do dano causado pelo stress oxidativo113, 114. Porém, esta via contrarreguladora pode estar
comprometida, visto que os alvos moleculares do Nrf2 (NQO1, GLC, HO-1, etc.) são alvo de inibição por parte da p5396-98.
3.6.6. Mitofagia
Uma das consequências do stress do RE é a translocação da Parkina do RE para a mitocôndria (Figura 11). Na matriz mitocondrial, a Parkina ativa a proteína Tensin Homolog PTEN-induced Kinase 1 (PINK1), resultando na indução de um fenómeno designado por mitofagia. A mitofagia consiste num subtipo da autofagia, na qual as mitocôndrias disfuncionais são eliminadas dentro de uma vesícula, à qual se fundem lisossomas. Assim, a mitofagia leva à atenuação da disfunção mitocondrial115, 116.
4. SISTEMA IMUNE 4.1. Generalidades
Um grande tópico em que encontramos disparidade nos resultados é no papel do sistema imunitário na hepatotoxicidade do paracetamol. Nos próximos capítulos, descrever-se-à a posição dos diferentes autores relativamente a cada uma das células efetoras do sistema imune e à sua influência na necrose hepatocitária (Figura 12).
4.2. Inflamossoma
4.2.1. Formação do complexo Inflamossoma
As DAMPs atuam em recetores do tipo TLR (Toll-like receptors), sendo o mais relevante o TLR4, que se encontra em células do sistema imune, como os macrófagos 72 (Figura 13). Os principais ligandos do TLR4 são a proteína
HMGB1 e os LPS (lipopolissacarídeos). A HMGB1 é uma das DAMPs libertada durante a necrose dos hepatócitos117. Enquanto que os LPS estão presentes na
superfície de bactérias gram-negativas, que podem entrar no fígado através do sistema venoso porta118.
No macrófago, a ativação do TLR4 leva à transcrição do precursor da interleucina-1β (IL-1β): a pro-IL-1β119-121. O TLR4 provoca a fosforilação do fator
inibidor-kappaB (I-kB), um inibidor que se encontra ligado ao fator nuclear-kappa B (NF-kB). A desconexão do NF-kB permite a migração para o núcleo e a transcrição da pro-IL-1β. A função da IL-1β é o de recrutamento de outras células do sistema imunitário, como os neutrófilos e monócitos. No entanto, a IL-1β para poder exercer a sua ação necessita de ser clivada a partir da pro-IL-1β122.
A clivagem da pro-IL-1β necessita da formação prévia de um complexo
enzimático denominado inflamossoma. Para que este se forme, ATP ativa recetores purinérgicos P2XR7 na membrana dos macrófagos. Como consequência, há uma saída do catião potássio (K+) da célula e, por conseguinte, é ativado o inflamossoma123, 124.
O inflamossoma é composto pela proteína NACHT, LRR and PYD domains containing protein 3 (Nalp3)125, pela apoptosis-associated speck-like protein
containing a CARD (ASC) e pela pro-caspase-1. Este complexo é responsável pela clivagem da pro-caspase-1 em caspase-1126. É a caspase-1 a enzima
responsável pela clivagem e ativação da IL-1β122.
No entanto, para que a IL-1β possa sair da célula, é formado um poro
membranar, através da translocação da proteína gasdermina-D-NT do citoplasma para a membrana celular, onde se liga ao fosfatidilinositol, fosfatidilserina e cardiolipina. A gasdermina-D-NT foi previamente clivada a partir da gasdermina-D pela caspase-1 já referida. Todavia, a gasdermina-D pode também ser clivada pelas caspases 4/5 ou 11, cuja ativação depende dos LPS
127, 128.
4.2.2. Papel do Inflamossoma e da IL-1β
Na ativação pelas DAMPs libertadas pela necrose dos hepatócitos parece não haver dúvidas, porém no que acontece de seguida há um grande debate. O papel do próprio inflamossoma e da IL-1β formada é posto em causa.
Há autores que revelam o seu efeito hepatotóxico: com o recurso de inibidores dos TLR9, observou-se uma mortalidade inferior à do grupo
controlo119. O knockout dos recetores P2X7 revelou uma diminuição da necrose
dos hepatócitos129. A inibição dos recetores da IL-1β (IL-1R) demonstrou que os
níveis das transaminases hepáticas e a necrose dos hepatócitos é inferior à do grupo controlo130.
Enquanto outros autores revelam um efeito hepatoprotetor: Ishibe T et al demonstraram que o knockout dos antagonistas dos IL-1R (permitindo a ação dos IL-1R) verificou-se uma diminuição das transaminases hepáticas e da necrose hepatocitária131.
Outros autores não encontram qualquer efeito: Williams CD et al demonstraram que o knockout dos componentes do inflamossoma (Nalp3, ASC e caspase 1), não se registaram diferenças no recrutamento de neutrófilos ou na necrose dos hepatócitos, comparativamente com o grupo controlo132. O uso de
um inibidor da caspase-1, não registou nenhuma diferença significativa na produção de IL-1β. Para além do mais, o knockout dos IL-1R não revelou
nenhuma diferença na ativação de neutrófilos, nem na necrose dos hepatócitos. Williams CD et al realizaram a administração de IL-1β e apesar de ter encontrado
uma maior ativação dos neutrófilos, não houve alteração na necrose dos hepatócitos133.
4.3. Células de Kupffer
Em relação aos macrófagos que ocupam o fígado, estes podem também ser apelidados de células de Kupffer71. As células de Kupffer reduzem em número no estadio agudo da intoxicação pelo paracetamol e o seu número volta a aumentar na fase de regeneração hepática. A recuperação das células de
Kupffer deve-se aos monócitos que são recrutados, bem como à própria auto-renovação134, 135.
As DAMPs ativam as células de Kupffer através do recetor TLR472. A ativação
das células de Kupffer tem como consequência a produção de citocinas anti e pró-inflamatórias. No ramo das citocinas anti-inflamatórias, destaca-se a interleucina-10 (IL-10) 136, 137. Ao mesmo tempo, são sintetizadas citocinas
pró-inflamatórias: interleucina-6 (IL-6), IL-1β e o fator de necrose tumoral-α (TNF-α)136.
Apesar da associação da IL-10 a uma diminuição do stress oxidativo em certos estudos136, 137, noutros a frenação de citocinas pró-inflamatórias pela IL10
leva à ativação da sintetasede óxido nítrico induzível (iNOS). A produção de NO por esta enzima pode aumentar a produção de ROS e aumentar a necrose dos hepatócitos137.
4.3.1. Papel da TNF-α
Em relação ao TNF-α, a definição clássica de citocina pró-inflamatória
torna-seduvidosa.
Há autores que apoiam o seu papel na potenciação da hepatoxicidade: após a administração de anticorpos anti-TNF-α, observou-se uma diminuição das
transaminases hepáticas, da desidrogénase láctica (LDH) e da necrose dos hepatócitos, bem como uma diminuição do tempo de recuperação hepática, quando comparado com o grupo controlo130. 138. O nível de TNF-α associou-se
a um aumento dos níveis das transaminases hepaticas e da LDH, indicando a função pró-inflamatória desta citocina139.
Outros autores apoiam o papel na proteção contra a hepatotoxicidade: o knockout dos recetores do TNF-α 1 (TNFR1) levou a uma ativação mais rápida e prolongada da iNOS, em relação ao grupo controlo. Ao mesmo tempo, a expressão de macrophage chemotactic protein-1 (MCP-1), matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) e connective tissue growth factor (CTGF), entre outros mediadores anti-inflamatórios, ocorreu muito mais tarde e em menor extensão140. O knockout dos TNFR1 revelou uma diminuição na proliferação de
hepatócitos. Além disso, os níveis de citocinas pró-inflamatórias, tais como a macrophage inhibitory protein-2 (MIP-2), interferon-gamma-inducible protein-10 (IP-10) e monocyte chemoattractant protein 1 (MCP-1), eram superiores no grupo com o knockout dos TNFR1141. O knockout dos TNFR1 prejudicou a
proliferação hepática, observando-se menor expressão de ciclina A e D1 e de cinases dependentes de ciclinas (CDK) 2 e 4142. O knockout dos TNFR1 revelou,
ainda, uma mortalidade e necrose dos hepatócitos superior138. Yang R et al
demonstraram que induzindo farmacologicamente um aumento da concentração de TNF-α no plasma sanguíneo, as transaminases hepáticasdiminuíram. Ao
mesmo tempo, a proliferação dos hepatócitos e os níveis de ciclina D1 aumentaram143.
Outros autores não encontram diferenças significativas: com recurso a anticorpos anti-TNF-α e TNFR1 solúveis, não se detetaram diferenças
significativas na mortalidade, transaminases hepáticas ou na necrose dos hepatócitos, em comparação com o grupo controlo144. Usando a interleucina-13,
um inibidor dos TNFR1, não se registou alteração na hepatotoxicidade com ou sem uso dos anticorpos anti-TNF-α145. Connolly MK et al constataram que
necrose dos hepatócitos146. O knockout dos TNFR1 não provocou um grau de
necrose significativamente distinto do grupo controlo147. Chiu H et al verificaram
que o knockout dos TNFR1, observou-se uma diminuição das transaminases hepáticas e da necrose dos hepatócitos, além de um maior nível de glutationa148.
4.3.2. Papel das células de Kuppfer
Em relação ao papel das células de Kupffer, este é, de igual modo, discutível.
Há autores que afirmam que agravam o dano hepático: Michael SL et al afirmaram que após a inativação farmacológica das células de Kupffer, observa-se uma diminuição das transaminaobserva-ses hepáticas e dos marcadores de stress oxidativo, comparativamente ao grupo controlo149. A depleção farmacológica das
células de Kupffer revelou uma diminuição significativa do grau de necrose. Observou-se ainda que esta diminuição ocorre entre 0,5 a 2 horas após a administração de paracetamol, confirmando a ativação das células de Kupffer num estadio inicial da necrose150. A ativação das células de Kupffer associou-se
a um aumento das transaminases hepáticas, indicando um papel hepatotóxico deste grupo de células do sistema imune151.
Outros autores sugeremque protegem do dano hepático: Jaeschke H et al descrevem que a distribuição das células de Kupffer concentra-se na zona periportal, enquanto que a necrose dos hepatócitos ocorre na zona centrilobular já que aí existe maior densidade de CYP45071. Com recurso à depleção
farmacológica das células de Kupffer, observou-se um atraso na proliferação dos hepatócitos. Além disso, observou-se uma associação das células de Kupffer com a produção de fatores angiogénicos e de crescimento152. Após a depleção
farmacológica das células de Kupffer, ocorre uma diminuição da expressão de Mrp4, um dos alvos da via de sinalização Nrf2153. Stutchfield BM et al
demonstraram que após a indução farmacológica das células de Kupffer, se observou um aumento da proliferação dos hepatócitos, em comparação com o grupo controlo 154 .
Enquanto noutros parece não haver influência no dano hepático: a gp91phox é uma subunidade fulcral para a função da NADPH oxidase, uma enzima característica dos macrófagos, como as células de Kupffer. Não se observou qualquer alteração nas transaminases hepaticas, nem na necrose dos hepatócitos, em nenhum dos dois grupos155, 156.
4.4. Macrófagos derivados de Monócitos (MoMF)
Além dos macrófagos residentes no fígado (células de Kupffer), ocorre ativação de macrófagos derivados de monócitos (MoMF). As células de Kuppfer chamam monócitos circulantes por quimiotaxia, por meio da libertação de chemokine C-C motif ligand 2 (CCL2)157.
Dambach DM et al e Holt MP et al revelaram que o recetor C-C chemokine receptor 2 (CCR2) a que liga a CCL2, pode também ligar-se ao ligando monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) produzido pela necrose dos hepatócitos, sem a intervenção das células de Kupffer158, 159. Assim, o recrutamento dos MoMF pode ser feito diretamente pelos hepatócitos.
No entanto, a maturação dos monócitos circulantes imaturos em MoMF maduros deve-se ao conjunto da ação da CCL2 e da IL-6160. Os monócitos
complex, locus C (Ly6C) - Ly6Chigh - enquanto os MoMF maduros têm uma baixa expressão de Ly6C - Ly6Clow. Esta diferença tem implicações na expressão de citocinas. Os monócitos infiltrantes Ly6Chigh expressam sobretudo citocinas pró-inflamatórias: interferão-γ (IFN- γ), IL-6, a IL-1β e o TNF-α. Enquanto que os
MoMF Ly6Clow expressam sobretudo citocinas anti-inflamatórias, destacando-se a IL-10161.
Apesar da classificação clássica de citocinas pró-inflamatórias, em relação à IL-6 162 e MCP-1, o seu papel revelou-se benéfico para a regeneração dos
hepatócitos, mostrando um efeito protetor da lesão hepática163.
O papel dos MoMF na hepatotoxicidade é discutível.
Alguns autores apontam um efeito prejudicial: no grupo em que se inativaram farmacologicamente os MoMF, observou-se uma diminuição das transaminases hepáticas e dos marcadores de stress oxidativo, em comparação com o grupo controlo149. A inibição farmacológica do CCL2 ou do recetor CCR2/CCR5,
revelou níveis inferiores de transaminases hepáticas e de necrose dos hepatócitos164.
Outros autores indicam um efeito benéfico: a ativação dos MoMF associou-se a um aumento de citocinas com papel regenerativo nos hepatócitos, tais como a chemokine (C-C motif) ligand (CCL) 2 e 3, o transforming growth factor-β1 (TGF-β1), a IL-6 e a IL-10, comparativamente ao grupo controlo162. Com recurso
à depleção farmacológica das MoMF, observou-se um atraso na proliferação dos hepatócitos. Além disso, observou-se uma associação dos MoMF com a produção de fatores angiogénicos e de crescimento, tais como o vascular endotelial growth factor (VEGF) e as matrix-metalloproteinases (MPP) e
promovem a limpeza de resíduos necróticos152. O knockout dos CCR2
demonstrou um atraso na resolução do dano hepático. Além disso, este estudo revelou a capacidade dos MoMF fagocitarem resíduos necróticos e induzirem a apoptose dos neutrófilos159. Stutchfield BM et al afirmaram que após a indução
farmacológica do recrutamento de MoMF, se observou um aumento da proliferação dos hepatócitos154. O knockout dos CCR2 revelou uma diminuição
dos níveis de mediadores anti-inflamatórios, tal como a matrix metalloproteinase-9 (MMP-metalloproteinase-9) e connective tissue growth factor (CTGF)134. A depleção
farmacológica dos MoMF resultou num atraso na proliferação dos hepatócitos135.
Enquanto outros estudos não identificaram nenhum efeito: uma das enzimas características dos macrófagos, tal como os MoMF, é a NADPH oxídase. Nem James LP et al ou Williams CD et al observaram qualquer alteração nas transaminases hepaticas, nem na necrose dos hepatócitos155, 156.
Diversos autores justificam a divergência entre o efeito prejudicial e benéfico dos MoMF com o tipo de população e a temporalidade. A população de monócitos infiltrantes Ly6Chigh que chega primeiro ao fígado terá um papel prejudicial, enquanto que os MoMF Ly6Clow que chegam depois terão um efeito benéfico 165-168.
4.5. Neutrófilos
As células de Kupffer são capazes de realocar neutrófilos circulantes para o fígado por quimiotaxia, recorrendo às citocinas chemokine C-X-C motif ligand (CXCL) 1, 2 e 8169. Para chegar às zonas de necrose propriamente dita, os
ativação pelos peptídeos N-formil recorre à ligação aos recetores formyl peptide receptor-1/CXC chemokine receptor-2 interaction (FPR1/CXCR2) dos neutrófilos70.
À semelhança dos MoMF, os neutrófilos podem ser recrutados diretamente pelos hepatócitos. Um estudo mostrou que na ausência de sinalização pelo TLR4, as DAMPs, neste caso concreto, o HMGB1 liga-se ao recetor receptor for advanced glycation endproducts (RAGE) presente nas membranas dos neutrófilos, ativando-os171.
A participação dos neutrófilos na lesão hepática é controversa.
Certos autores afirmam que agravam: com o uso de anticorpos contra os recetores FPR1/CXCR2, registou-se uma diminuição da necrose dos hepatócitos, em relação ao grupo controlo70. Liu ZX et al revelaram que após a
depleção farmacológica dos neutrófils se observou uma diminuição das transaminases hepáticas, da necrose dos hepatócitos e da mortalidade172.
Recorrendo ao knockout do CXCR2, o recetor da CXCL2, observou-se uma diminuição da expressão da iNOS173. A ativação farmacológica dos neutrófilos
demonstrou um aumento das transaminases hepáticas e da necrose hepatocitária174.
Ao mesmo tempo, outros autores não detetam este impacto: com o knockout da CD18, uma integrina responsável pela adesão dos neutrófilos, não se demonstrou nenhuma diferença significativa na necrose dos hepatócitos, nem nos marcadores de stress oxidativo, em comparação com o grupo controlo175.
Williams CD et al revelaram que após a administração de IL-1β se registou maior
hepatócitos133. A neutralização com anticorpos anti-neutrófilos, não demonstrou
diferenças nos níveis das transaminases hepáticas ou na necrose dos hepatócitos176. A depleção farmacológica de neutrófilos não resultou em
alteração nos níveis das transaminases hepaticas, nem da necrose dos hepatócitos177. Williams CD et al observaram que apesar de existir ativação dos
neutrófilos após a intoxicação pelo paracetamol, este aumento encontra um plateau que persiste mesmo após a saída dos doentes do hospital. Concluindo-se que os neutrófilos não têm um papel na hepatotoxicidade156.
4.6. Linfócitos T
Os linfócitos T subdividem-se em diferentes populações, de entre as quais os linfócitos T citotóxicos (Tc), os linfócitos T auxiliares/helper (Th), os linfócitos T γδ e os linfócitos T Natural Killer (NKT)178.
Os linfócitos Tc favorecem a necrose dos hepatócitos, por intermédio de citocinas pró-inflamatórias, entre as quais, o TNF-α, a perforina e a granzima179
(Figura 12).
O grupo dos linfócitos Th pode ser subdividido em Th1 e Th2. Os linfócitos Th1 caracterizam-se por um perfil de citocinas pró-inflamatórias, tendo como exemplo o interferão-γ (IFN- γ). No outro espetro, temos os linfócitos Th2 que
segregam citocinas anti-inflamatórias, como as interleucinas (IL) 4, 5 e 13178. A
sobrevida é superior quando favorecida laboratorialmente a resposta Th2, em relação à resposta Th1180.
As células de Kupffer ativam a população de linfócitos T γδ, com recurso à libertação da interleucina-23 (IL-23). Por sua vez, os linfócitos T γδ têm a
capacidade de chamar neutrófilos para o local de necrose, servindo-se da interleucina-17 (IL-17)181.
Wang X et al observaram um efeito hepatotóxico, em que a depleção farmacológica de linfócitos T γδ levou à atenuação da lesão hepática182.
As células de Kupffer são capazes de chamar os NKT por quimiotaxia, através da secreção de chemokine C-X-C motif ligand 16 (CXCL16)183. A ativação dos
NKT despoleta a secreção de interleucina-4 (IL-4) e de IFN-γ. A IL-4 tem o poder de conseguir ativar os neutrófilos, enquanto o IFN-γ tem o poder de os inibir184.
Ainda assim, o IFN-γ é uma citocina pró-inflamatória que contribui para a necrose
dos hepatócitos185.Neste caso, os NKT são o tipo de linfócitos T mais frequente
que existem em volta dos sinusóides hepáticos186.
Martin-Murphy BV et al constataram o efeito protetor das NKT, utilizando o knockout destas células que se associou a um aumento dos níveis das transaminases hepáticas e da mortalidade187.
No entanto, Liu ZX et al verificaram o efeito oposto, utilizando anticorpos anti-NKT, registou-se uma diminuição das transaminases hepáticas, da necrose dos hepatócitos, enquanto a mortalidade foi superior à do grupo controlo188. Todavia,
Masson MJ et al replicaram a mesma experiência, utilizando um solvente diferente nas preparações, e não conseguiram observar estas diferenças189.
À imagem dos NKT, as células Natural Killer (NK) também libertam IFN-γ, para além de outras citocinas pró-inflamatórias, como o TNF-ɑ, a perforina e
granzima. Apesar disso, as NK segregam igualmente citocinas anti-inflamatórias, tal como a IL-10190.
O estudo de Liu ZX et al que revelou a hepatotoxicidade das NKT188 e o estudo
de Masson et al que não observou diferenças significativas alterando o solvente utilizado revelaram os mesmos resultados para as NK189.
5. CONCLUSÕES
Em suma, a toxicidade hepática provocada pela intoxicação pelo paracetamol assenta na disfunção das mitocôndrias dos hepatócitos, que combinada com a destruição subsequente do material genético nuclear, origina a necrose hepatocitária. Em paralelo, a disfunção mitocondrial é capaz de ativar diversas vias de sinalização complementares que interagem, positiva ou negativamente, em diferentes passos deste mecanismo.
Após a necrose dos hepatócitos, são chamados distintos tipos de células efetoras do sistema imune, cujo papel na proteção ou potenciação do dano hepático permanece controverso.
Nesta revisão, possíveis alvos farmacológicos foram explorados e, com o aumento dos estudos nesta matéria, espera-se que surjam cada vez mais e melhores estratégias terapêuticas para lidar com uma etiologia de insuficiência hepática tão prevalente no Mundo desenvolvido.
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