SUB-PROJETO DE PESQUISA
Otimização do protocolo de coleta de meristemas e análise do cariótipo de cana de açúcar
Bolsista: Humberto Jorge da Silva Junior Orientador: Prof. Reginaldo de Carvalho
Recife, março de 2012 LABORATÓRIO DE GENOMA
1. INTRODUÇÃO
A cana-de-açúcar pertence ao gênero Saccharum, sendo caracterizada por possuir um genoma complexo. Suas variedades atuais são derivadas de cruzamentos entre genomas de duas espécies principais S. spontaneum e S. officinarum. O número cromossômico é muito variável de espécie para espécie, ocorrendo de 2n=60 a 130 cromossomos. (SREENIVASAN, 1978; D’ HONT et al. 1996; 1998).
Os protocolos para isolamento de DNA de cana-de-açúcar se baseiam no método CTAB de Doyle e Doyle (1990). Aljanab et al. (1999) desenvolveram um protocolo modificado para o isolamento de grande quantidade de DNA de cana de açúcar e de alta qualidade, proveniente meristemas laterais. Contudo, o DNA obtido apresentou altas concentrações de componentes citoplasmáticos contaminantes como polissacarídeos e polifenois. De acordo com Guillermaut e Maréchal-Drouard (1992), compostos fenólicos podem sofrer oxidação e ligarem-se as macromoléculas tornando-as de cor escuras e impróprias para aplicação na pesquisa.
Por outro lado, os protocolos destinados ao estudo dos cromossomos de cana envolvendo desde a coleta em campo do material, processamento em laboratório e preparação de lâminas tem sido escassos. Para estudo dos cromossomos de cana de açúcar, os meristemas de raiz ou pontas de raízes são primeiramente pré-tratadas com antimitóticos tais como hidróxido de quinoleína, colchicina, bromo naftaleno entre outros e em seguida transferidos para solução fixadora contendo três partes de etanol e uma de ácido acético, podendo após esse tratamento serem transferidas para etanol 70%. Em geral, segue-se um protocolo padrão até a preparação das lâminas e análise dos cromossomos. D’Hont et al., (1996) determinaram o percentual de cromossomos das espécies do gênero Saccharum, S. spontaneum e S. officinarum no genoma cultivares híbridas de cana de açúcar atuais.
A visualização dos cromossomos de cana de açúcar pode ser feita com base em técnicas que utilizam corantes convencionais como o Giemsa, orceína, carmim acético, Feugen, entre outros, possibilitando a contagem cromossômica bem como o estudo da morfologia e do tipo de cariótipo (GUERRA e SOUZA, 2002). O procedimento para execução das técnicas citogenéticas inicia-se com coleta em campo ou casa de vegetação podendo, as amostras, ser estocadas a +4o C em etanol 70% ou a -20o C em etanol 70% ou na própria solução fixadora por períodos prolongados. O presente projeto, propôs um método novo de “cultivo” de toletes de cana de açúcar em laboratório de forma simples e sem ocupar grande espaço, por um período de até 90 dias para coleta de raízes, para estudo dos
cromossomos e folhas jovens para isolamento de DNA, livres de compostos fenólicos. Além disso, propôs também a caracterização e indicação das variedades RB de cana de açúcar mais adequadas, ideais para coleta e tratamento.
3
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
Otimização do método de coleta de meristema de raiz e análise cromossômica em variedades de cana de açúcar RB.
2.2. Objetivos específicos
Desenvolver um método mais simples para obtenção de material vegetal para preparação de lâminas para estudo dos cromossomos;
Otimizar um protocolo melhorado de pré-tratamento e fixação;
Indicar as melhores variedades de cana de açúcar para a coleta rápida de raízes; Otimizar o protocolo de preparação de lâminas para análise do cariótipo.
3. MATERIAL E MÉTODO
3.1. Material vegetal
As variedades RB serão provenientes do banco ativo de germoplasma de Devaneio, pertencente Estação Experimental de Cana de açúcar do Carpina, UFRPE localizado no município de primavera, PE.
3.2. Coloração convencional do protocolo padrão
Muitos protocolos serão usados apenas como base para o desenvolvimento do protocolo proposto no presente projeto, como o que segue: Para as análises citogenéticas serão utilizadas raízes jovens pré-tratadas com 8-hidroxiquinoleína por 4 horas a cerca de 10 o
C, fixadas em Carnoy 3:1 (etanol: ácido acético glacial) por um período de 24 horas, e estocadas no freezer até posterior análise. Para coloração convencional, as lâminas serão preparadas pela técnica do esmagamento em ácido acético 45%, congeladas em nitrogênio líquido para remoção da lamínula e coradas com Giemsa 2%, ou hematoxilina 1% (GUERRA E SOUZA,2002).
3.3. Captura de imagem
As imagens serão capturadas utilizando-se câmera de captura Leica DF345 FX acoplada em microscópio Leica DM 2500. As imagens serão processadas por meio do software CW 4000.
5
4. RESULTADOS PRELIMINARES
Colmos das variedades ‘RB72454’, ‘RB867515’ e ‘RB 92579’ foram fornecidos pela estação Experimental de cana-de-açúcar do Carpina – EECAC / UFRPE e utilizados exclusivamente para fins de pesquisa cientifica. O primeiro experimento foi montado para obtenção de raízes de boa qualidade para futura análise citogenética, onde os colmos foram cortados em mini-toletes de aproximadamente 5cm, contendo a região do nódio na qual está contido os primórdios radiculares e em seguida receberam uma numeração seqüenciada a partir do primeiro nódio visível da parte superior até o ultimo próximo a região do corte e especificação quanto ao nome da variedade. Os mini-toletes foram colocados separados por unidades em copos descartáveis de 100ml cada, regados apenas com água mineral (50ml cada) três vezes ao dia por 12 dias seguidos a temperatura ambiente no laboratório. A partir do terceiro dia, as raízes que apresentavam tamanho maior ou igual a 1,0cm, foram coletadas com auxilio de um bisturi e em seguida submetidas ao pré-tratamento com anti-mitótico.
No segundo experimento, com colmos com perfilhos primário, secundário e terciário de cada uma dessas variedades que apresentaram características diferenciadas quanto a emissão de raízes e desenvolvimento da gema, foram submetidos a um experimento semelhante ao primeiro, porém com o objetivo de observar a produção de raiz por nódio/dia em relação ao crescimento das gemas.
As variedades ‘RB 92579’ e ‘RB 72454’ apresentaram como característica comum a emissão de um número maior de raízes para os nódios da parte inferior da planta. A produção de raízes por variedade no período de 12 dias após o plantio foi de 567 para a variedade ‘RB 92579’ e 1.293 na ‘RB 002504’ (valores obtidos a partir da soma dos três perfilhos para cada variedade). As tabelas numeradas de 1 a 6 mostram os valores de produção diária de raízes pelos seguimentos nodais em escala temporal, com as variações características das variedades e perfilhos de origens.
Tabela 1. Produção de raízes dos mini-toletes originados do perfilho primário para a
variedade ‘RB 92579’ no período de 12 dias após o plantio.
RB 92579 NUMERO DE RAIZES DO PERFILHO PRIMÁRIO
MINI TOLETES 28/10/11 29/10/11 30/10/11 31/10/11 1/11/11 2/11/11 3/11/11 4/11/11 5/11/11 6/11/11 TOTAL 1° 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2° 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3° 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4° 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5° 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 6° 0 0 2 7 5 2 6 5 11 1 39 7° 0 0 0 0 0 1 0 0 2 7 10 8° 0 0 3 1 1 0 1 0 0 0 6 9° 0 2 7 1 0 4 1 1 4 3 23 10° 5 10 3 2 1 10 11 1 1 4 48 11° 0 0 1 5 5 2 5 0 3 1 22 12° 10 8 3 8 1 2 8 4 6 0 50 13° 3 0 1 0 0 2 2 1 3 0 12 TOTAL 18 20 20 24 13 23 34 12 30 17 211 F.A 18 38 58 82 95 118 152 164 194 211 M=21,1
Tabela 2. Produção de raízes dos mini-toletes originados do perfilho secundário da variedade
‘RB 92579’ no período de 12 dias após o plantio.
RB 92579 NUMERO DE RAIZES DO PERFILHO SECUNDÁRIO
MINI TOLETES 28/10/11 29/10/11 30/10/11 31/10/11 1/11/11 2/11/11 3/11/11 4/11/11 5/11/11 6/11/11 TOTAL 1° 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2° 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 3° 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4° 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5° 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6° 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7° 0 0 0 0 0 2 1 0 2 0 5 8° 0 0 7 1 5 4 8 9 0 3 37 9° 0 0 7 7 0 4 9 4 0 0 31 10° 0 0 6 4 3 6 5 9 2 0 35 11° 0 4 13 4 1 1 9 0 1 1 34 12° 0 1 2 5 5 3 7 2 0 0 25 TOTAL 0 5 35 21 15 20 39 24 5 4 168 F.A 0 5 40 61 76 96 135 159 163 167 M=16,8
Tabela 3. Produção de raízes dos mini-toletes originados do perfilho terciário da variedade
‘RB 92579’ no período de 12 dias após o plantio.
RB 92579 NUMERO DE RAIZES DO PERFILHO TERCIÁRIO
MINI TOLETES 28/10/11 29/10/11 30/10/11 31/10/11 1/11/11 2/11/11 3/11/11 4/11/11 5/11/11 6/11/11 TOTAL 1° 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2° 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3° 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4° 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5° 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 6° 0 0 0 0 0 0 2 0 2 1 5 7° 0 0 0 0 0 0 0 1 10 9 20 8° 0 0 1 0 0 18 9 3 8 4 43 9° 0 3 9 3 3 2 12 3 4 0 39 10° 0 1 2 2 2 14 1 2 3 11 38 11° 0 3 3 2 9 6 9 1 4 5 42 TOTAL 0 7 15 7 14 40 33 10 32 30 188 F.A 0 7 22 29 43 83 116 126 158 188 M = 18,8
7
Na variedade ‘RB 92579’ o perfilho primário emitiu um total de 211 raízes, sendo que os dias com maior produção foram 31/outubro (24 raízes), 03/novembro (34 raízes) e 05/novembro (30 raízes). Esses três dias correspondem a 39,81% do total produzido por este perfilho, o perfilho secundário apresentou um total de 168, sendo os três dias de maior produção 30/outubro (35 raízes), 03/novembro (39 raízes) e 04/novembro (24 raízes), o que correspondeu a 58,33% do total. O perfilho terciário apresentou 188 raízes, sendo os três dias com maior produção 02/novembro (40 raízes), 03/novembro (33 raízes) e 05/novembro (32 raízes) o que correspondeu a 55,85% do total produzido. Mesmo o perfilho primário emitindo mais raízes, o perfilho secundário foi o que apresentou o maior percentual de emissão de raízes para os três dias de maior produção.
Tabela 4. Produção de raízes dos nódios originados do perfilho primário da variedade ‘RB
72454’ no período de 12 dias após o plantio.
RB 72454 NUMERO DE RAIZES DO PERFILHO PRIMÁRIO
MINI TOLETES 28/10/11 29/10/11 30/10/11 31/10/11 1/11/11 2/11/11 3/11/11 4/11/11 5/11/11 6/11/11 TOTAL 1° 0 0 0 0 0 3 2 2 4 1 12 2° 0 0 0 0 4 10 5 8 9 1 37 3° 0 0 0 1 5 14 4 3 1 2 30 4° 0 0 0 4 7 16 4 5 2 3 41 5° 0 0 0 4 4 9 8 2 3 6 36 6° 4 3 0 0 10 2 8 8 11 8 54 7° 0 0 1 2 9 14 11 1 2 4 44 8° 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 9° 0 2 4 3 3 14 7 1 2 0 36 10° 1 2 1 1 4 8 8 11 4 5 45 11° 1 0 0 1 0 12 15 8 6 6 49 12° 0 8 23 6 6 12 4 0 3 2 64 TOTAL 6 15 29 23 52 114 76 49 47 38 449 F.A 6 21 50 73 125 239 315 364 411 449 M=44,9
Tabela 5. Produção de raízes dos mini-toletes originados do perfilho secundário da variedade
‘RB 72454’ no período de 12 dias após o plantio.
RB 72454 NUMERO DE RAIZES DO PERFILHO SECUNDÁRIO
MINI TOLETES 28/10/11 29/10/11 30/10/11 31/310/11 1/11/11 2/11/11 3/11/11 4/11/11 5/11/11 6/11/11 TOTAL
1° 0 0 0 2 5 6 2 6 1 0 22 2° 0 0 0 1 1 15 5 1 0 0 23 3° 0 0 0 0 4 17 4 1 1 0 27 4° 0 0 0 0 2 12 8 5 2 0 29 5° 0 0 0 0 0 0 9 13 10 5 37 6° 0 0 1 0 2 7 6 9 7 3 35 7° 0 0 0 0 0 1 3 13 5 8 30 8° 1 4 2 4 11 23 6 3 5 6 65 9° 1 6 2 2 1 4 3 3 8 3 33 10° 1 0 3 4 5 4 0 0 0 0 17 11° 0 6 10 8 3 11 4 2 0 0 44 TOTAL 3 16 18 21 34 100 50 56 39 25 362 F.A 3 19 37 58 92 192 242 298 337 362 M=36,2
Tabela 6. Produção de raízes dos mini-toletes originados do perfilho terciário da variedade
‘RB 72454’ no período de 12 dias após o plantio.
RB 72454 NUMERO DE RAIZES DO PERFILHO TERCIÁRIO
MINI TOLETES 28/10/11 29/10/11 30/10/11 31/10/11 1/11/11 2/11/11 3/11/11 4/11/11 5/11/11 6/11/11 TOTAL
1° 0 0 0 3 8 3 4 5 5 3 31 2° 0 2 4 9 9 3 3 0 3 0 33 3° 0 0 0 15 18 9 6 6 2 0 56 4° 0 0 0 5 9 9 14 11 6 3 57 5° 0 0 0 0 0 3 3 1 0 0 7 6° 0 0 2 12 2 0 18 3 2 14 53 7° 0 5 3 0 13 11 3 5 14 3 57 8° 0 5 4 0 2 8 15 10 4 7 55 9° 0 0 0 1 9 28 10 5 6 2 61 10° 5 3 3 0 0 7 2 0 0 0 20 11° 6 1 0 4 6 9 7 8 13 4 58 12° 11 7 1 5 5 2 3 5 1 0 40 TOTAL 22 23 17 54 81 92 88 59 56 36 528 F.A 22 45 62 116 197 289 377 436 492 528 M=52,8
Para a variedade RB 72454, o perfilho primário emitiu um total de 449 raízes, sendo os três dias de maior produção 1/novembro (52 raízes), 2/novembro (114 raízes) e 3/novembro (76 raízes), o que corresponde a 53,89% do total produzido por este perfilho, o secundário com o total de 362, sendo os três dias de maior produção 2/novembro (100 raízes), 3/novembro (50 raízes) e 4/novembro (56 raízes), o que corresponde a 56,9% do total, e o perfilho terciário com 528 raízes, sendo os três dias de maior produção 1/novembro (81 raízes), 2/novembro (92 raízes) e 3/novembro (88 raízes), os três dias correspondendo a 49,43% do total produzido.
A realização de teste de qualidade do material vegetal na preparação de lâminas e análise de células mitóticas foi realizado com coloração convencional com Giemsa, e com o fluorocromo DAPI associado ao glicerol para seleção das melhores metáfases. Na figura 1, a foto a mostra as raízes que foram coletadas de vasos utilizando-se o protocolo de citogenética padrão. Fotos b, c e d, raízes coletadas dos mini-toletes desenvolvidas em água mineral e com duas fixações, apresentando um melhor resultado para uso em diversas técnicas citogenéticas.
9
Figura 1. Teste de qualidade do material vegetal na preparação de lâminas e análise de
células mitóticas. Coloração convencional com Giemsa: a) RB 92579, b) RB 72454 e c) RB 92579 e d) RB 92579. Coloração com o fluorocromo DAPI associado a glicerina segundo Barros e Silva (2010). Na foto a, as raízes foram coletadas de vasos utilizando-se o protocolo de citogenética padrão. Fotos b, c e d, raízes coletadas dos mini-toletes desenvolvidas em água mineral e com duas fixações, apresentando um melhor resultado para uso em diversas técnicas citogenéticas.
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Barros e Silva AE, Guerra M (2010) The meaning of DAPI bands observed after C-banding and FISH procedures. Biotech Histochem. 4:1–11. Doi: 10.1080/10520290903149596.
Aljanab SM, Forget L, Dookun A (1999). An improved and Rapid Protocol for the Isolation of Polysaccharide- and Polyphenol-Free Sugarcane DNA. Plant Mol Biol Report 17: 1–8, Doyle JJ and Doyle JL (1990) Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12: 13–15. D’Hont A, Rao PS, Feldmann P, Grivet L, Berding N, Glaszmann JC (1996). Characterization
of double genome structure of modern sugarcane cultivars (Saccharum ssp.) by molecular cytogenetics. Mol. Gen. Genet. 250: 405-413.
D’Hont A, Ison D, Alix K, Roux C e Glaszmann JC (1998). Determination of basic chromosome numbers in the genus Saccharum by physical mapping of ribosomal RNA genes. Genome, 41: 221-225
Guerra M, Souza MJ (2002). Como observar cromossomos: um guia de técnicas em citogenética vegetal, animal e humana. Ribeirão Preto: Ed. Funpec, 131p.
Guillemaut P, Maréchal-Drouard L (1992) Isolation of plant DNA: a fast, inexpensive, and reliable method. Plant Mol Biol Reptr 10: 60–65.
Sreenivasan TV, Ahloowalia BS, Heinz DJ (1987) Cytogenetics. In: Heinz D.J. (ed) Sugarcane improvement through breeding. Elsevier, Amsterdam, pp. 211-253.
