UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Instituto de Biologia
TAINÁ LOUISE PACHECO
“Efeitos da lorcaserina no sistema reprodutor e
mecanismos ejaculatórios de ratos machos”
“Effects of lorcaserin on reproductive system and
ejaculatory mechanisms of male rats”
CAMPINAS
2019
TAINÁ LOUISE PACHECO
“Efeitos da lorcaserina no sistema reprodutor e mecanismos ejaculatórios de
ratos machos”
“Effects of lorcaserin on reproductive system and ejaculatory mechanisms of
male rats”
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural do Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos
exigidos para a obtenção do título de Mestra em Biologia Celular e Estrutural, na área de Biologia Celular.
Thesis presented to the Institute of Biology of the University of Campinas in partial
fulfillment of the requirements fot the degree of Masters in the area of Cellular Biology.
Este arquivo digital corresponde à versão final da dissertação defendida pela aluna Tainá Louise Pacheco e orientada pela Dra. Wilma De Grava Kempinas.
Orientadora: Profa. Dra. Wilma De Grava Kempinas
CAMPINAS 2019
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Biologia Mara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972
Pacheco, Tainá Louise,
P115e PacEfeitos da lorcaserina no sistema reprodutor e mecanismos ejaculatórios de ratos machos / Tainá Louise Pacheco. – Campinas, SP : [s.n.], 2019.
PacOrientador: Wilma De Grava Kempinas.
PacDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia.
Pac1. Lorcaserina. 2. Aparelho genital masculino. 3. Ejaculação. 4. Rato. I. Kempinas, Wilma De Grava. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Effects of lorcaserin on reproductive system and ejaculatory
mechanisms of male rats
Palavras-chave em inglês:
Lorcaserin
Generative organs, Male Ejaculation
Rats
Área de concentração: Biologia Celular
Titulação: Mestra em Biologia Celular e Estrutural Banca examinadora:
Wilma De Grava Kempinas [Orientador] André Sampaio Pupo
Wagner José Fávaro
Data de defesa: 11-01-2019
Programa de Pós-Graduação: Biologia Celular e Estrutural
Profa. Dra. Wilma De Grava Kempinas (Orientadora) Prof. Dr. André Sampaio Pupo
Prof. Dr. Wagner José Fávaro
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
Dedicatória
Este trabalho é dedicado aos meus pais, Tânia e José Donisete, os quais sempre representaramfonte inesgotável de incentivo e apoio. Cada conquista em minha vida é resultado do amor e dedicação de vocês. Agradeço por construírem asas para os meus voos e sempre proporcionarem um ninho caloroso para cada retorno. Amo vocês daqui até a lua, ida e volta.
A Deus, pela proteção e luz. A fé de que meus caminhos são guiados pelas mãos divinas, trouxe coragem e compreensão para cada etapa e desafios. A minha orientadora Profa. Dra. Wilma De Grava Kempinas, pelas inúmeras oportunidades, confiança, aprendizado e inspiração. A senhora é a principal responsável pelo meu crescimento intelectual, profissional e científico nos últimos cinco anos. A Thamiris, minha melhor amiga e irmã por escolha, por tudo o que vivemos. Compartilhamos trabalho e vida; você foi rocha nos momentos difíceis e trampolim nos momentos de felicidade. Gratidão, admiração e amor por você. A Cibele, pela mão sempre estendida, seja para o trabalho ou para um carinho reconfortante;
pelos anos de convívio fácil e muitos ensinamentos de vida e científicos compartilhados. Ao Jorge, pelos memes, conversas sinceras e aventuras, especialmente alimentícias, pelos congressos; Aos demais integrantes do laboratório Reprotox, pela ajuda, torcida e companheirismo não só
nas tarefas diárias, mas também nas conversas sentimentais ou bobas, nos happy hour com junk food e nas zoeiras incontáveis. Ao Luiz, por compartilhar seu conhecimento, por me impulsionar para novos desafios e pela
parceria e paciência enquanto eu navegava em mares desconhecidos. Ao Matheus, meu melhor amigo e encontro genuíno, por acompanhar toda essa jornada com ouvidos atentos as minhas ideias e inseguranças; pelo incentivo constante e colo receptivo; pela cumplicidade, compreensão e amor. Ao José Eduardo, pelas risadas e duetos musicais sertanejos, além de todo o suporte técnico e inúmeros salvamentos. Ao Prof. Dr. Edson Antunes, que abriu as portas de seu laboratório, no qual fui muito bem recebida.
meu crescimento. Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural, A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela bolsa concedida nos primeiros meses do Mestrado. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela bolsa concedida nos meses subsequentes, processo 169694/2017-8.
Epígrafe
“If you can dream it, you can do it. Always remember that this whole thing started with a dream and a mouse” Walt Disney
A obesidade é um grave problema de saúde e entre os tratamentos indicados, destaca-se a farmacoterapia. Diversos medicamentos foram aprovados para este fim, entretanto, alguns apresentaram sérios riscos, inclusive para o sistema reprodutor, e foram retirados do mercado. Sabe-se que os receptores serotoninérgicos, como o 5-HT2C, desempenham um papel na função
sexual masculina. A lorcaserina, fármaco agonista seletivo do receptor 5-HT2C, foi liberada
recentemente como medicamento anorexígeno. Na literatura não existem dados sobre seus efeitos no sistema reprodutor masculino e na ejaculação. Esse trabalho avaliou, em ratos adultos Wistar, parâmetros reprodutivos, com ênfase sobre a qualidade espermática e mecanismos ejaculatórios, utilizando a lorcaserina como agonista. O estudo foi desenvolvido em etapas. Experimento I, piloto, com 4 grupos experimentais: controle (salina) e tratados com 0,5, 1 e 10 mg/Kg de lorcaserina nos ciclos de luz claro ou escuro, por 14 dias; Experimento II, com 4 grupos: tratados com lorcaserina, 10 mg/Kg por 60 dias e 30 mg/Kg por 30 dias, no ciclo claro, e seus respectivos grupos controle. Experimento III, estudo farmacológico in vivo e in vitro, o qual investigou os efeitos da lorcaserina na ejaculação. No experimento I não foram observadas alterações na maioria dos parâmetros, exceto uma diminuição no ganho de peso corpóreo no grupo tratado com 10 mg/Kg no ciclo claro e uma aceleração no tempo de trânsito dos espermatozoides na região da cabeça/corpo do epidídimo no mesmo grupo no ciclo escuro. No Experimento II houve uma diminuição no ganho de peso e no consumo de ração no grupo exposto à lorcaserina por 30 dias. Este mesmo grupo apresentou diminuição no peso da vesícula seminal cheia e vazia, bem como diminuição no número de espermatozoides e aceleração do tempo de trânsito na região de cabeça/corpo do epidídimo. O grupo exposto a 10 mg/Kg apresentou aumento no peso do fígado, diminuição no número de espermatozoides e aceleração do tempo de trânsito na região da cauda do epidídimo. Não houveram alterações na morfologia e contagem espermática nos testículos, bem como nos níveis de gonadotrofinas. Ambas exposições causaram dano à motilidade espermática e apenas os animais tratados por 60 dias apresentaram aumento na concentração de testosterona plasmática e intratesticular. No Experimento III, a lorcaserina não afetou a contratilidade dos órgãos reprodutores in vitro. In
vivo, foi capaz de causar ejaculações completas sem estímulo sensorial no modelo anestesiado
e na avaliação de penile grooming, e melhorou o desempenho de animais sexualmente experientes na cópula, diminuindo o limiar ejaculatório. Todos os resultados foram prevenidos
e ingestão de ração, causou impacto direto sobre a reprodução, uma vez que sua utilização esteve associada a facilitação ejaculatória. Esse trabalho contribui para a caracterização dos efeitos da lorcaserina no sistema reprodutor masculino, para avanços na compreensão da neurofisiologia e farmacologia da ejaculação, bem como fornece uma nova perspectiva de tratamento para homens com ejaculação retardada.
Obesity is a serious health problem and among the indicated treatments, pharmacotherapy stands out. Several drugs were approved for this purpose, however, some presented serious risks, including for the reproductive system, and were withdrawn from the market. It is known
that serotonergic receptors, such as 5-HT2C, play a role in male sexual function. Lorcaserin, a
selective 5-HT2C receptor agonist, has been released recently as an anorectic drug. In the
literature there are no data on its effects on male reproductive system and on ejaculation. This study evaluated, in adult Wistar rats, reproductive parameters, with emphasis on sperm quality and ejaculatory mechanisms, using lorcaserin as an agonist. The study was developed in stages. Experiment I, a pilot, with 4 experimental groups: control (saline) and treated with 0.5, 1 and 10 mg/Kg lorcaserin in light or dark light cycles for 14 days; Experiment II, with 4 groups: treated with lorcaserin, 10 mg/Kg for 60 days and 30 mg/Kg for 30 days, in the light cycle, and their respective control groups. Experiment III, a pharmacological study in vivo and in vitro, which investigated the effects of lorcaserin on ejaculation. In experiment I, no changes were observed in most of the parameters except a decrease in body weight gain in 10 mg/Kg group in light cycle and an acceleration in the transit time of spermatozoa in the caput/corpus region of the epididymis in the same group in dark cycle. In experiment II, there was a decrease in weight gain and food intake in the group exposed to lorcaserin for 30 days. This same group showed a decrease in seminal gland weight, as well as a decrease in the number of spermatozoa and acceleration of transit time in the caput/corpus region of the epididymis. The group exposed to 10 mg/Kg had an increase in liver weight, a decrease in the number of spermatozoa and an acceleration of transit time in the cauda region of the epididymis. No changes were observed in morphology and sperm count in the testes, such as gonadotrophin levels. Both exposures caused damage to sperm motility and only animals treated for 60 days showed an increase in plasma and intratesticular testosterone concentration. In experiment III, lorcaserin did not affect the contractility of the reproductive organs in vitro. In vivo, it was able to cause complete ejaculations without sensory stimulation in the anesthetized model and in the evaluation of
penile grooming, and improved the performance of sexually experienced animals in copulation,
reducing the ejaculatory threshold. All results were reversed in the presence of SB 242084
antagonist, indicating a crucial role of 5-HT2C on ejaculation. Thus, we conclude that the
for advances in the understanding of neurophysiology and pharmacology of ejaculation, as well as provides a new perspective of treatment for men with delayed ejaculation.
Introdução ... 14
1. Sistema Reprodutor Masculino ... 14
1.1 Ejaculação ... 18 2. Anorexígenos ... 21 3. Lorcaserina ... 22 Justificativa ... 25 Objetivos ... 26 Materiais e Métodos ... 27 Resultados ... 39 Experimento I – piloto ... 39 Experimento II ... 51 Experimento III ... 58
Experimento III.1 – Experimentos funcionais de contração in vitro ... 58
Experimento III.2 – Ejaculação em modelo experimental anestesiado ... 64
Experimento III.3 – Ejaculação em ratos não anestesiados e sexualmente inexperientes 66 Experimento III.4 – Ejaculação in copula de ratos sexualmente experientes ... 68
Discussão ... 71
Conclusão ... 77
Referências ... 78
Apêndices ... 86
Introdução
1. Sistema Reprodutor Masculino
O sistema reprodutor masculino (Figura 1) é responsável pela produção, emissão e direcionamento do sêmen, além da produção de esteroides. Nos mamíferos, ele é composto pelas gônadas (testículos), vias espermáticas e as glândulas anexas (Dangelo & Fattini, 2011).
Há alguns anos, o estudo do impacto de compostos químicos nesse sistema tornou-se uma importante ferramenta para compreender o fenômeno de infertilidade masculina evidenciado, especialmente, pela diminuição da qualidade espermática ao longo das últimas décadas. Embora por vezes existam dificuldades na translação de resultados, as investigações em modelos experimentais animais contribuem significativamente para o entendimento dos processos envolvidos neste fenômeno (Creasy, 1997).
Figura 1: Esquema dos órgãos do sistema reprodutor masculino no humano. Fonte: Garcia e Fernández, 2012.
Figura 2: Órgãos do sistema reprodutor no rato Wistar.
Fonte: Laboratório de Biologia e Toxicologia da Reprodução e do Desenvolvimento.
Os testículos (Figura 3), órgãos localizados no escroto, são revestidos por uma membrana fibrosa - a túnica albugínea - e divididos em duas regiões: tubular e intersticial (Johnson et al., 2015). É no interstício, composto também por vasos sanguíneos e linfáticos e macrófagos, que as células de Leydig produzem testosterona, o principal hormônio masculino (Junqueira & Carneiro, 2017; Russel et al., 1990). A testosterona é responsável não só pelas características sexuais secundárias, como aparecimento de pelos e mudanças na voz, mas também por arquitetar a espermatogênese. A região tubular é formada por túbulos seminíferos contorcidos, onde ocorrerá a espermatogênese. Estes túbulos são envoltos por uma lâmina basal, tecido conjuntivo e células mioides ou peritubulares, que participam no processo contrátil lento e rítmico dos túbulos seminíferos, auxiliando na movimentação dos espermatozoides e do fluido testicular. Internamente, estes túbulos são formados pelo epitélio germinativo que contém as células de Sertoli e células germinativas (Junqueira & Carneiro, 2017; Russel et al., 1990).
Figura 3: Esquema do testículo e vias espermáticas. Fonte: Garcia e Fernández, 2012.
As células de Sertoli são células somáticas fundamentais para a espermatogênese. Além de propiciar um ambiente restrito e seguro para as células germinativas através da compartimentalização do túbulo seminífero por meio de uma barreira formada por junções estreitas, estas células mantêm a estrutura organizacional e nutrem as células germinativas. Ademais, são responsáveis pela liberação de espermátides tardias no lúmen tubular, secreção de vários fatores, fagocitose das células germinativas em degeneração e dos corpos residuais advindos das espermátides e mediação na produção de testosterona estimulada pelo hormônio folículo estimulante (FSH) e hormônio luteinizante (LH) no testículo (França et al., 2005).
A espermatogênese, que tem duração de 56 dias em ratos e 74 dias em humanos,é um processo cíclico e contínuo pelo qual as células germinativas denominadas espermatogônias geram os espermatozoides e esta sequência de eventos pode ser dividida em três fases. Durante a primeira fase, conhecida como proliferativa, as espermatogônias, que são células diploides, se proliferam por mitose para formar os espermatócitos e, ao mesmo tempo, se autorrenovar. Na segunda fase, os espermatócitos primários e secundários, passam pelo processo de divisão celular, originando ao final células haplóides, as espermátides, caracterizando esta fase como meiótica. Por fim, é na terceira fase, reconhecida como de diferenciação, que as espermátides
passam por múltiplas transformações citológicas que resultam no espermatozoide (Clermont, 1972).
Os espermatozoides imaturos deixam o testículo após a espermiogênese através da
rede testis (Figura 3), uma rede de túbulos anastomosados, que dá origem aos túbulos eferentes
(Figura 3), que penetram no epidídimo formando o ducto do epidídimo (Dangelo & Fattini, 2011).
O epidídimo (Figura 3) é uma estrutura alongada em forma de C, dividida anatômica e funcionalmente em ratos em segmento inicial, cabeça, corpo e cauda, constituída apenas por este ducto altamente enovelado, que desembocará no ducto deferente (Dangelo & Fattini, 2011; França et al., 2005). Durante a passagem dos espermatozoides pelo ducto epididimário, ocorre o processo de maturação espermática, no qual estes espermatozoides morfologicamente formados adquirem capacidade móvel progressiva e de fertilizar o ovócito II (Yanagimachi, 1994; Robaire, 2006; Kempinas & Klinefelter, 2010). Para que esse processo ocorra de maneira adequada, é necessário que o gameta masculino permaneça por um tempo específico, que varia entre as espécies, no epidídimo. Enquanto este período é de 6 dias, sendo 2 dias na cabeça/corpo e 4 dias na cauda, para os homens, em ratos, é de 8 a 10 dias, sendo 3 na cabeça/corpo e 5 na cauda (França et al., 2005).
O ducto deferente (Figura 3) é um ducto único contínuo responsável por transportar os espermatozoides estocados na cauda do epidídimo, além de auxiliar no término da maturação espermática. Uma vez associado aos vasos e nervos testiculares, este forma o funículo espermático, o qual atravessa o canal inguinal e penetra na cavidade abdominal. Na altura da bexiga, sofre um alargamento, denominado ampola, e une-se ao ducto da vesícula seminal, para formar o ducto ejaculatório (Dangelo & Fattini, 2011).
Cada vesícula seminal consiste em um tubo enovelado que inferiormente se estreita e torna-se reto para formar o ducto excretor, o qual formará o ducto ejaculatório em conjunto com o ducto deferente, que desembocará na parte prostática da uretra (Dangelo & Fattini, 2011). Este órgão é responsável pela produção de 70 a 80% do líquido seminal, que compõe o sêmen (Kierszenbaum, 2016). Sua secreção viscosa é constituída de proteínas seminais coagulantes, prostaglandinas e frutose, elementos essenciais para a sobrevivência, bem como para a ativação do espermatozoide (Junqueira & Carneiro, 2017; Risbridger, 2006).
Em conjunto com as vesículas seminais, a próstata faz parte das glândulas anexas andrógeno-dependente (Kierszenbaum, 2016). Este órgão, composto de musculatura lisa, tecido fibroso e glândulas produz o volume restante que constituirá o líquido seminal (Dangelo & Fattini, 2011).A secreção formada por citrato, fosfatase ácida, amilase e fibrinolisina é liberada
diretamente na porção prostática da uretra através dos dúctulos prostáticos. Além de auxiliar na viabilidade espermática, o conteúdo prostático dissolve o plug ejaculatório produzido pelos fluidos da vesícula seminal, tornando o sêmen liquefeito por um período mais longo (Guyton, 2011; Johnson, 2001).
1.1 Ejaculação
Em homens, o ciclo sexual é divido em várias fases: surgimento da libido, ereção, excitação sexual, emissão, expulsão e orgasmo (Motofei, 2007). Em ratos, o comportamento sexual do macho também pode ser descrito em etapas. Na fase de iniciação, o rato examina o ambiente a fim de determinar se este está seguro e se há uma fêmea receptiva, na fase de estro do ciclo estral. Durante a fase pré-copulatória, o animal exibe comportamentos exploratórios, especialmente aproximando-se, seguindo e cheirando a fêmea. A ocorrência de uma monta marca a transição da fase pré-copulatória para a fase copulatória. Neste estágio, uma série de sucessivas montas e intromissões (seguidas por autoestimulação genital), conduz, geralmente, à ejaculação (Veening & Coolen, 2014).
Na ejaculação, os sistemas nervosos somático e autônomo atuam em conjunto causando emissão seminal, a secreção das glândulas acessórias, e a expulsão, projeção forçada do esperma através de contrações rítmicas dos músculos estriados perineais, especialmente o músculo bulboesponjoso, associada a contração do colo da bexiga que impede o refluxo do sêmen (Giuliano, 2011).
Portanto, a ocorrência de uma ejaculação é resultado de uma complexa resposta fisiológica, a qual é regulada pelo gerador espinal da ejaculação (GEE) localizado na medula espinal lombossacral e formado, em parte, por uma população de interneurônios na região central cinzenta dos níveis lombares L3-5. Este gerador recebe as informações sensoriais, que podem envolver estímulos somatossensoriais, viscerais, proprioceptivos, relacionados à temperatura e/ou nocivos, e coordena os mecanismos viscerais e somatomotores que culminam na ejaculação. A maioria dos estímulos sensoriais ocorrem via nervo pudendo e nervo dorsal do pênis (NDP). Por sua vez, o GEE está sob controle de influências supraespinais, tanto inibitórias quanto facilitatórias, originadas de áreas do tronco encefálico, mesencéfalo e
hipotalâmica (Figura 4) (Veening & Coolen, 2014).
Os órgãos viscerais envolvidos na ejaculação recebem tanto inervação simpática, quanto parassimpática. Os corpos celulares dos neurônios pré-ganglionares simpáticos que inervam a pelve estão localizados na coluna de células intermédiolaterais e no núcleo central
dorsal (NCD) dos segmentos lombar e torácico inferior (T13-L2, em roedores). Os neurônios pré-ganglionares parassimpáticos localizam-se na coluna de células intermédiolaterais dos segmentos sacrais superiores, denominados núcleos parassimpáticos sacrais (NPS). A ativação de ambos os nervos simpáticos e parassimpáticos estão associados a emissão seminal (Veening & Coolen, 2014).
Os eferentes motores, especialmente os motoneurônios pudendais localizados na medula espinal lombossacral, também estão envolvidos no reflexo ejaculatório. Estes são responsáveis por inervar os músculos perineais estriados, incluindo os músculos isquiocavernoso e bulbocavernoso e os esfíncteres externo uretral e anal, e a contração rítmica desses músculos causa a expulsão do sêmen (Veening & Coolen, 2014).
Figura 4: Neurofisiologia da ejaculação. Fonte: Adaptado de Giuliano, 2011.
A disfunção ejaculatória é a disfunção sexual mais comum em homens. Nos Estados Unidos e Europa, estima-se que mais de 30% dos homens apresentem este problema. Dentre os tipos de disfunção ejaculatória, os mais frequentes são ejaculação precoce, ejaculação retardada e ejaculação dolorosa (Gray et al., 2018).
Cerca de 1 a 4% dos homens sofre de ejaculação retardada, a qual está entre as disfunções ejaculatórias menos compreendidas e normalmente associada a incapacidade de ejacular (anejaculação). Este transtorno pode ser vitalício ou adquirido, situacional ou persistente e está relacionado a um grande estresse para o homem, insatisfação da(o) parceira(o) e é especialmente delicado quando há o desejo de gravidez. Infelizmente, o tratamento envolve apenas abordagens psicológicas, uma vez que as opções farmacológicas são limitadas e não aprovadas por agências regulamentadoras como US Food and Drug Administration (FDA) (Gray et al., 2018).
Vários estudos científicos identificaram a participação de neurotransmissores e seus respectivos receptores no processo ejaculatório. A dopamina e a serotonina (5-HT) emergiram como as principais sinalizadoras neurais para este processo. Inicialmente, os receptores dopaminérgicos caracterizaram-se pela facilitação na ejaculação (Bitran et al., 1989; Hull et al., 1992; Eaton et al., 1991) e os serotoninérgicos, de maneira geral, pela inibição (Hull et al. 2004). Dessa forma, medicamentos inibidores seletivos da recaptura de serotonina, como a paroxetina, fluoxetina e especialmente a dapoxetina são utilizados off label para o tratamento de ejaculação precoce (Gray et al., 2018; Buvat et al., 2009; Pryor et al., 2006).
São reconhecidos 14 receptores serotononinérgicos divididos em sete classes (5-HT1 a 5-HT7). Destes receptores, 13 têm sua ação associada a proteínas G, como a classe
5-HT2, que inclui três subtipos de receptores nomeados como 5-HT2A, 5-HT2B e 5-HT2C (Hoyer
et al., 1994; Halberstadt et al., 2009). Além desta grande variedade de receptores, é importante destacar que suas funções são alteradas de acordo com a via sinalizada, podendo ser excitatórias ou inibitórias. Por isso, a atuação dos receptores serotoninérgicos na ejaculação ainda é incerta e discutida, pois seu comportamento se modifica de acordo com o receptor e via desencadeada.
Yonewaza e colaboradores (2008) investigaram os papeis de alguns subtipos de receptores HT na ejaculação através do m-CPP (1-[3-clorofenil] piperazina), um agonista 5-HT2, e constataram que em baixas doses (0,3 a 1 mg/Kg), houve um efeito erétil e
pró-ejaculatório, possivelmente associado à ativação do 5-HT2C. Stafford e colaboradores (2006b)
observaram em animais no modelo anestesiado, no qual registros são obtidos para medir respostas neuraissemelhantes a ejaculatória a partir do nervo do ducto deferente, que a ativação dos receptores 5-HT2C lombossacrais tanto nos animais com a medula intacta quanto com a
medula espinalizada, pode causar emissão seminal associada a respostas semelhantes a ejaculatória, sugerindo um papel excitatório descendente serotoninérgico, além das vias inibitórias anteriormente descritas.
Além de evidências experimentais em animais, estudos em humanos sugerem que uma mutação natural do 5-HT2C que leva a perda de função deste receptor está associada a
latência ejaculatória mais longa (Janssen et al., 2018; Okada et al., 2004). Portanto, o 5-HT2C
também parece ser um importante regulador da função ejaculatória em homens.
2. Anorexígenos
A obesidade, quinto mais comum fator de risco para morte, é um grave problema de saúde pública que consiste em um acúmulo anormal de gordura consequência de um desequilíbrio no balanço energético. Esta condição médica complexa deixou de atingir apenas países desenvolvidos, tornando-se uma epidemia global, e tem acometido um maior número de pessoas em todo o mundo a cada ano (Kakkar & Dahiya, 2015; Patel, 2015; Tan et al., 2005). Antes associada apenas à adultos, essa doença já apresenta impacto em crianças e adolescentes e estima-se que em 2050 mais da metade da população de homens e mulheres e 25% das crianças serão obesas (Nooijen et al., 2016; Kumar & Kelly, 2017; Kakkar & Dahiya, 2015).
Acredita-se que os principais fatores para o desenvolvimento rápido e exacerbado dessa condição sejam a urbanização e o crescimento econômico, os quais levaram a uma mudança no estilo de vida humano, que incluem diminuição da atividade física e dietas hipercalóricas (Kakkar & Dahiya, 2015), e a predisposição genética (Kumar & Kelly, 2017; Garaulet et al., 2010; Narayanaswami & Dwoskin, 2017).
Além de causar impactos econômicos e sociais, a obesidade está relacionada a síndrome metabólica e aumento da ocorrência de importantes enfermidades como diabetes, doenças cardiovasculares, acidente vascular encefálico (AVC), hipertensão, dislipidemias e câncer (Kakkar & Dahiya, 2015; Patel, 2015; Câmara et al., 2017; Tan et al., 2005; Christopher et al., 2016).
A perda de peso é determinante no combate aos efeitos da obesidade. A primeira opção de tratamento para o excesso de gordura é a mudança do estilo de vida, que consiste em uma conciliação entre dieta, atividade física e mudanças de comportamento. Embora seja mais saudável e capaz de prevenir além de tratar a doença, este método esbarra no comprometimento dos pacientes. Para aqueles que desejam resultado imediato, a cirurgia bariátrica aparenta uma oportunidade, pois é eficiente na perda de peso e capaz de eliminar os riscos importantes associados ao acúmulo de gordura, como diabetes e doenças cardiovasculares. Entretanto, este é um método invasivo, caro, com altos riscos e indicado apenas para pacientes
com obesidade extrema e que não reagiram a outros tratamentos, como a mudança de estilo de vida (Patel, 2015; Kakkar & Dahiya, 2015; Narayanaswami & Dwoskin, 2017).
Diante das limitações das opções relatadas acima, a farmacoterapia mostrou-se uma alternativa para auxiliar na perda de peso e diversos medicamentos foram aprovados nas últimas décadas para esta finalidade. Esses fármacos, em sua maioria de ação neural em vias de regulação do balanço energético, podem ser indicados para tratamentos de curta e longa duração. Contudo, após um período de utilização, algumas dessas drogas apresentaram graves riscos e foram retiradas do mercado (Patel, 2015; Kakkar & Dahiya, 2015; Narayanaswami & Dwoskin, 2017; Christopher et al., 2016).
A sibutramina, por exemplo, é um fármaco anti-obesidade que inibe a recaptura neuronal de serotonina e noradrenalina (Padwal & Majumdar, 2007), neurotransmissores relacionados com a modulação do apetite. Dessa forma, seu mecanismo de ação causa a perda de peso aumentando a saciedade e a termogênese (Choi et al., 2011). Contudo, esse medicamento teve sua comercialização proibida em diversos países da Europa e nos Estados Unidos após constatarem um aumento no risco cardiovascular (Choi et al., 2011; Bellentani et al., 2011). Além de causar impacto no sistema cardiovascular, a sibutramina apresentou efeitos no sistema reprodutor masculino. A administração de sibutramina gerou diminuição do peso de órgãos como epidídimo, próstata e vesícula seminal, diminuição do número de espermatozoides e tempo de trânsito espermático na cauda do epidídimo, diminuição da fertilidade e da qualidade espermática e aumento da contratilidade do epidídimo (Bellentani et al., 2011; Borges et al., 2013).
Outro medicamento proibido após graves efeitos adversos é a fenfluramina. Sua eficácia está relacionada ao aumento da concentração de serotonina nas sinapses cerebrais através de diferentes mecanismos: aumentando a liberação deste neurotransmissor pelos terminais pré-sinápticos, inibindo sua recaptação e também aumentando a transmissão serotoninérgica, estimulando diretamente os receptores 5-HT2. Entretanto, seu agonismo no
receptor 5-HT2B foi o responsável por causar disfunção valvular em indivíduos que fizeram uso
contínuo da droga em combinação com a fentermina (Wurtman & Wurtman, 2018; Khorrasani et al., 2015; Halpern & Halpern, 2015).
3. Lorcaserina
A fim de ampliar as alternativas farmacológicas frente a urgente necessidade de novos medicamentos para controle da obesidade - especialmente após a extensa proibição de
medicamentos da categoria - agências de regulamentação, como o FDA, liberaram recentemente uma nova droga denominada lorcaserina, comercializada como Belviq®.
A lorcaserina, [(1R)-8-cloro-2,3,4,5-tetrahidro-1-metil-1H-3benzazepina] é um fármaco agonista seletivo dos 5-HT2C e sua ação anorexígena está associada a sua atuação nos
neurônios pro-opiomelanocortina (POMC) presentes no núcleo arqueado no hipotálamo e, dessa maneira, induz saciedade a partir da produção do hormônio α-estimulante de melanócitos (α-MSH). Muito solúvel, permeável, rapidamente absorvida e de meia vida plasmática de 11 horas, a droga é metabolizada pelo fígado, não possui metabólitos ativos e sua absorção não é alterada pela coadministração com alimentos. Indicado como medicamento para o tratamento de longa duração da obesidade, a dose recomendada é de 10 mg, duas vezes ao dia, via oral. Os efeitos colaterais mais comumente relatados são cefaleia, náuseas, constipação e boca seca (Christopher et al., 2016; Halpern & Halpern, 2015; Narayanaswami & Dwoskin, 2017; Greenway et al., 2016).
Figura 5: Estruturas químicas da serotonina e lorcaserina, respectivamente. Fonte: PubChem; Thomsen et al., 2008.
Visto que a lorcaserina exerce baixa atividade nos receptores 5-HT2A e 5-HT2B,
relacionados a alucinações e efeitos cardiovasculares, respectivamente, este fármaco oferece menos riscos quando comparado aos agonistas de serotonina não seletivos aprovados anteriormente. Portanto, o Belviq® é eficaz contra a obesidade e mais seguro (Kakkar & Dahiya, 2015; Christopher et al., 2016; Weissman et al., 2017).
Diante de sua recente aprovação e estudos que demonstram sua segurança e eficácia (Christopher et al., 2016; Greenway et al., 2016) relacionados a sua aplicação anti-obesidade, a lorcaserina tem sido alvo de novos estudos investigando outras ações como controle de fumo (Shanahan et al. 2016) e consumo de cocaína (Banks & Negus, 2017; Gerak et al., 2016). Abdel-Latif e colaboradores (2017) constataram que o tratamento com lorcaserina em ratas fêmeas em diferentes doses (5, 10 e 30 mg/Kg) por 28 dias causou alterações no ciclo estral, na histologia
ovariana e uterina e nos níveis hormonais. Entretanto, são inexistentes os relatos do impacto deste fármaco no sistema reprodutor masculino e de sua ação sobre a ejaculação.
Justificativa
A alarmante prevalência do excesso de gordura na população mundial e sua associação com doenças graves, estimulou a liberação e uso extensivo de inúmeros medicamentos como método de controle da obesidade. Entretanto, a maioria destes fármacos, principalmente de ação neural, promoveram preocupantes efeitos adversos, inclusive alterações no sistema reprodutor, impactando a fertilidade masculina. A recente liberação da lorcaserina está acompanhada da esperança de que seu mecanismo de ação seletivo no receptor 5-HT2C nãoesteja associado a importantes efeitos colaterais. Contudo, é interessante ressaltar a contribuição deste receptor para o processo ejaculatório. Diante da relevância do combate a obesidade e dos danos que outras drogas, inclusive de influência serotoninérgica, causaram no sistema reprodutor masculino, justifica-se a realização de um estudo experimental, em ratos, sobre o impacto do tratamento da lorcarserina em parâmetros reprodutivos masculinos. Além disso, investigar o papel do receptor 5-HT2C na ejaculação, por meio da lorcaserina.
Objetivos
Este estudo teve como objetivo avaliar as possíveis alterações em parâmetros reprodutivos de ratos adultos Wistar, causadas pelo tratamento em diferentes doses e períodos com a lorcaserina. Além disso, analisar o papel do receptor 5-HT2C na ejaculação, utilizando alorcaserina como agonista.
Objetivos específicos:
- Investigar os efeitos da lorcaserina sobre o peso corpóreo e o consumo de ração dos animais durante o período de tratamento;
- Investigar os possíveis efeitos tóxicos da lorcaserina sobre o sistema reprodutor masculino, com ênfase na espermatogênese e qualidade espermática;
- Investigar os efeitos da lorcaserina sobre a contratilidade de órgãos reprodutores; - Investigar a função do receptor 5-HT2C em diferentes modelos experimentais para
Materiais e Métodos
Animais
Experimentos I e II
Ratos adultos (90 dias de idade, pesando aproximadamente 300g) e fêmeas adultas (60 dias de idade, pesando aproximadamente 200g) da linhagem Wistar, provenientes do Biotério Central da UNESP de Botucatu, foram mantidos no Biotério de Pequenos Mamíferos do Departamento de Morfologia do Instituto de Biociências da UNESP de Botucatu, em condições controladas de luminosidade (12 horas de luz/12 horas de escuro) e temperatura (média de 23ºC). Os animais receberam água à vontade e ração para roedores previamente pesada.
Os animais utilizados neste experimento foram mantidos de acordo com os Princípios Éticos em Experimentação Animal, adotados pelo Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal - CONCEA. O projeto está sob protocolo número 1005 junto à Comissão de Ética em Experimentação Animal do Instituto de Biociências de Botucatu.
Experimento III
Ratos adultos (90 dias de idade, pesando aproximadamente 300g) e fêmeas adultas (60 dias de idade, pesando aproximadamente 200g) da linhagem Wistar, provenientes do Biotério Central da UNICAMP (CEMIB), foram mantidos no Biotério do Departamento de Farmacologia da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP, em condições controladas de luminosidade (12 horas de luz/12 horas de escuro) e temperatura (média de 23ºC). Os animais receberam água e ração para roedores à vontade.
Os animais utilizados neste experimento foram mantidos de acordo com os Princípios Éticos em Experimentação Animal, adotados pelo Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal – CONCEA. O projeto está sob protocolo número 4888-1/2018 junto à Comissão de Ética em Experimentação Animal da UNICAMP.
Delineamento Experimental
Os ratos, previamente pesados, foram alocados em 8 grupos experimentais (n=6/grupo): controle e tratados, diariamente, com 0,5 mg/Kg, 1 mg/Kg e 10 mg/Kg de lorcaserina, no ciclo claro; os mesmos 4 grupos experimentais, no ciclo escuro. A dose de 10 mg/Kg foi determinada a partir de estudos anteriores realizados com a sibutramina (Bellentani et al., 2011; Borges et al., 2013) e as doses de 0,5 mg/Kg e 1 mg/Kg foram idealizadas a fim de construir um estudo de dose. O tratamento teve a duração de 14 dias a partir do dia pós-natal (DPN) 90. Os animais do grupo tratado receberam lorcaserina, via gavagem, diluída em solução fisiológica (veículo) enquanto os ratos do grupo controle receberam apenas o veículo. Os animais foram eutanasiados no DPN 103 e foram realizadas as avaliações espermáticas, análise histológica e dosagens hormonais.
Experimento II
Os ratos, previamente pesados, foram distribuídos em 4 grupos experimentais (n=6 a 8/grupo), controle e tratado com 10 mg/Kg por 60 dias e controle 2 e tratado com 30 mg/Kg por 30 dias. O tratamento se iniciou no dia pós-natal (DPN) 90. Os animais do grupo tratado receberam lorcaserina diariamente, via gavagem, diluída em solução fisiológica (veículo), enquanto os ratos do grupo controle receberam apenas o veículo. Os animais foram eutanasiados no DPN 120 ou 150 para as avaliações espermáticas e dosagens hormonais.
Experimento III
Ratos sem nenhum tratamento foram submetidos a protocolos descritos adiante para análise da reatividade farmacológica in vitro, avaliação da ejaculação em modelo experimental anestesiado, comportamento sexual, penile grooming e ambulação.
Parâmetros Avaliados
Figura 1: Tratamentos e parâmetros avaliados nos Experimentos I, II e III.
Coleta, Pesagem e Processamento dos Órgãos Reprodutores e Vitais
Ao final dos tratamentos os ratos foram induzidos à narcose em câmara de CO2,
seguida por punção cardíaca, e o sangue foi colhido em tubos falcon.
Testículo e epidídimo esquerdos foram removidos, pesados e fixados em Bouin (75% de ácido pícrico saturado, 5% de ácido acético glacial e 25% de formaldeído 37%), conforme descrito por Russel et al. (1990) para análise histológica. A túnica albugínea testicular foi seccionada nos polos com o auxílio de uma tesoura cirúrgica pequena antes da imersão na solução fixadora de Bouin. Os materiais foram processados histologicamente para inclusão em Paraplast e cortados na espessura de 4µm. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina para avaliação histopatológica. A vesícula seminal (cheia e vazia, sem a glândula coaguladora), a próstata ventral, região mais hormônio dependente da próstata no roedor, e órgãos alvo, como, rins, fígado e adrenal foram pesados e, em seguida, descartados.
Até o momento apenas os testículos dos ratos do Experimento I foram avaliados em ensaios cego e ao acaso.
A inspeção histopatológica foi realizada analisando-se o aspecto do epitélio, conteúdo da luz e interstício dos testículos, de forma que possíveis lesões morfológicas desse órgão foram classificadas segundo diretrizes específicas para estudos toxicológicos (Foley, 2001). Os túbulos foram considerados anormais na presença de células acidófilas, células multinucleadas, espermátides retidas, degeneração de tipos celulares, vacuolização do epitélio ou esfoliação de células na luz. O aspecto do interstício testicular também foi avaliado, de modo qualitativo. Para avaliação da cinética do processo espermatogênico, foram avaliadas 100 secções de túbulos seminíferos em três cortes com distância de 50 µm entre eles.
Os túbulos seminíferos foram classificados em 4 categorias (Favareto et al., 2011): Estágios I-VI: presença de duas gerações de espermátides, ou seja, espermátides redondas e alongadas;
Estágios VII-VIII: presença de espermátide 19 na luz tubular;
Estágios IX-XIII: presença de uma única geração de espermátides, ou seja, espermátides alongadas;
Estágio XIV: presença de espermatócitos em metáfase e/ou anáfase.
Dosagens Hormonais
O sangue foi coletado em tubos falcon de 15 mL e centrifugado a 2400 rpm, por 10 minutos a 4ºC para separação do soro, que foi congelado até o momento dos ensaios hormonais de testosterona, LH e FSH.
Os ensaios hormonais foram realizados em aparelho automatizado no Laboratório de Neuroendocrinologia da Faculdade de Odontologia da USP de Ribeirão Preto, utilizando a metodologia de radioimunoensaio (RIE) de duplo anticorpo através de kits específicos (National Institute of Arthritis, Diabetes and Kidney Diseases – NIADDK,USA) para as dosagens hormonais.
Todas as amostras foram analisadas no mesmo ensaio para evitar variabilidade interensaios.
Contagem do Número e Cálculo da Produção Diária de Espermatozoides por Testículo
O testículo direito foi descapsulado logo após a coleta e congelado até a homogeneização, segundo método previamente descrito por Robb et al. (1978), com as adaptações descritas a seguir.
O parênquima testicular foi descongelado e homogeneizado numa mistura de NaCl (9g), Triton X100 (0,5ml) e Thimerosal (0,1g) (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), passando em seguida por um sonicador durante 30 segundos. Após diluição de 10 vezes na mistura contendo Triton X100, uma pequena amostra foi transferida para câmaras de Neubauer (4 campos por animal), procedendo-se a contagem das espermátides maduras (estágio 19 da espermiogênese), que são resistentes à homogeneização. Para o cálculo da produção diária de espermatozoides (PDE) o número de espermatozoides por testículo foi dividido por 6,1, que é o número de dias em que essas espermátides estão presentes no epitélio seminífero.
Posteriormente, a PDE por grama de testículo foi calculada, a fim de se determinar a eficiência do processo reprodutivo (Ashby et al., 2003).
Contagem do Número e Cálculo do Tempo de Trânsito dos Espermatozoides no Epidídimo
As partes cabeça/corpo e cauda dos epidídimos foram separadas logo após a coleta, congeladas até a homogeneização e passaram pelo mesmo procedimento descrito para o testículo. Após diluições de 20 vezes, a contagem dos espermatozoides foi realizada em câmaras de Neubauer.
A média aritmética dos campos contados resulta no número de espermatozoides expresso em milhões por mL, que multiplicado pelas diluições utilizadas, resulta no número de espermatozoides/órgão que, dividido pela PDE, estima o tempo de trânsito dos espermatozoides em dias (número de dias requeridos para que eles atravessem as diferentes porções epididimárias).
Motilidade Espermática
Imediatamente após a eutanásia, os espermatozoides foram coletados da cauda epididimária direita e diluídos em 2mL de meio de cultura HTF modificado com gentamicina (Spectrun 90126). Uma alíquota de 10 μL foi transferida para a câmara de Mackler e no microscópio de contraste de fase (aumento de 20x), 100 espermatozoides foram analisados e classificados em:
Tipo A: espermatozoides móveis progressivos. Tipo B: espermatozoides móveis não progressivos.
Tipo C: espermatozoides imóveis.
A motilidade espermática foi expressa em porcentagem de espermatozoides em cada uma das categorias listadas acima (Perobelli et al., 2013).
Morfologia Espermática
Para avaliação da morfologia espermática, 100 µL da amostra contendo HTF com espermatozoides dispersos no meio de cultura provenientes da cauda do epidídimo direito perfurada para liberação dos espermatozoides durante a análise da motilidade espermática, foi adicionada a solução de formolsalina. As amostras foram mantidas a 4°C até o momento da análise, quando foram feitos esfregaços em lâminas histológicas e 100 espermatozoides por animal foram avaliados em microscópio de contraste de fase no aumento de 400X (Seed et al., 1996).
As anormalidades morfológicas foram classificadas em duas categorias: anormalidades de cabeça (sem curvatura característica e cabeça isolada) e anormalidades de cauda (isolada, enrolada, quebrada ou dobrada) (Filler, 1993).
Os espermatozoides também foram classificados quanto à presença ou ausência da gota citoplasmática.
Ensaio de reatividade farmacológica: isolamento e preparação dos órgãos para o registro de tensão.
Os ratos foram induzidos à narcose em câmara de CO2, seguida por deslocamento
cervical. Após o isolamento da cauda do epidídimo (CE), esta foi desenovelada e segmentos de aproximadamente 1,5cm da parte distal da cauda foram separados (Hinton et. al., 1979). O ducto deferente (seccionado em duas partes, epididimal [DDe] e prostática [DDp]) e a vesícula seminal inteira (VS) foram limpos de seus tecidos adjacentes e lavados internamente com o uso de uma seringa e agulha contendo solução nutritiva. Posteriormente, os tecidos foram montados em câmaras musculares para registro difital de desenvolvimento de tensão isométrica. Todos os tecidos foram mantidos sob 10mN de tensão basal em solução nutritiva de Krebs com a seguinte composição (mM): NaCl 119, NaHCO3 25, glicose 5,5, KCl 4,7, KH2PO4 1,2, MgSO4
1,2. 7H20 e CaCl2 2,5, pH 7,4, sob uma temperatura constante de 30ºC e continuamente aerada
com misturas carbônicas (95% O2 e 5% de CO2).
Neste experimento, animais sem nenhum tratamento foram submetidos ao protocolo acima descrito. Após 30 minutos de estabilização da preparação, a contração ao KCl 80mM foi observada em duas ocasiões separadas entre si por 30 minutos para a avaliação da viabilidade tecidual e estabilização da contração máxima do tecido. Decorridos os 30 minutos da última contração ao KCl, uma curva concentração-resposta à noradrenalina, um agonista adrenérgico, foi construída pela adição cumulativa da droga ao banho (10nM-10µM). O mesmo protocolo foi realizado para a construção de curvas concentração-resposta à serotonina, um agonista endógeno de receptores serotoninérgicos de alta eficácia, (1nM-10µM) e lorcaserina (1nM-1mM). A Figura 2 sintetiza o protocolo experimental.
Figura 2: Protocolo experimental reatividade farmacológica in vitro.
As curvas à serotonina foram repetidas na presença de veículo ou do SB 242084, um antagonista seletivo para o receptor 5-HT2C, nas concentrações de 3nM e 30nM, as quais
segundo a equação de Hill-Langmuir (Neubig et al., 2003) ocupam a seguinte porcentagem dos receptores serotoninérgicos do tipo 2 (Bromidge, et al. 1997):
Tabela 1 – Concentração de SB 242084 e % ocupação de 5-HT2.
5-HT2A 5-HT2B 5-HT2C
3nM 1,8% 2,9% 75%
30nM 15,2% 23% 96,7%
Curvas à serotonina foram obtidas na presença de um coquetel contendo: prazosin 100nM (antagonista de adrenoceptores α1), idazoxan 100nM (antagonista de adrenoceptores
α2), propranolol 100nM (antagonista de adrenoceptores β) e paroxetina 1µM (bloqueador de
Figura 3: Protocolo experimental reatividade farmacológica in vitro com SB 242084.
Foram avaliadas a contração máxima induzida por cada agonista (Emax) e a potência dos diferentes agonistas, estimada a partir do –log EC50 (pD2), na indução de contração, com auxílio do software GraphPadPrism (versão 5).
Ensaio de estímulo de campo elétrico
Neste experimento, animais sem nenhum tratamento foram submetidos ao protocolo de isolamento e preparação dos órgãos para o registro de tensão. Após 30 minutos de estabilização da preparação, a contração ao KCl 80mM foi observada em duas ocasiões separadas entre si por 30 minutos para a avaliação da viabilidade tecidual e estabilização da contração máxima do tecido. Decorridos os 30 minutos da última contração ao KCl, uma sequência de pulsos elétricos foi realizada. CE, DDe e DDp foram estimulados com pulsos de 80V e 1ms de duração repetidos a frequências de 1, 2, 4, 8, 16 e 32Hz, e na VS de 4, 8, 16, 32 e 50Hz durante trains de 10s de duração. Após o estabelecimento desta sequência de estímulo na ausência de tratamento (controle), os tecidos foram lavados e deixados por 30 minutos sem estimulação. Decorrido este tempo, uma nova curva frequência-resposta foi obtida na presença de lorcaserina 300nM (ocupação teórica de 99,7% dos 5-HT2C) incubada por 5 minutos (Figura
4).
Figura 4: Protocolo experimental estímulo de campo elétrico.
Contrações ao EFS na ausência e presença de lorcaserina foram comparadas, com auxílio do software GraphPadPrism (versão 5).
Ratos Wistar machos adultos (90 dias de idade) foram anestesiados com uretano (1,5 g/Kg, intraperitonial) e a veia jugular direita e a artéria carótida esquerda foram canuladas para injeção de drogas e registro da pressão arterial, respectivamente. Os músculos bulboesponjosos foram expostos através de incisão no escroto e um par de eletrodos de prata foi inserido no músculo bulboesponjoso ventral lateral direito (BSP) (McKeena & Nadelhaft, 1986) e conectado a um sistema de aquisição PowerLab (ADInstruments) para o registro eletromiográfico (ganho 1000, freqüência de aquisição 1000Hz, filtro bandpass 5-1000Hz). Adicionalmente, os órgãos sexuais acessórios masculinos foram expostos através de uma incisão transversal no abdômen. O DD foi amarrado na intersecção entre a região epididimal e a cauda do epidídimo e preso com fio de algodão a um transdutor de força sob 15 mN de tensão para o registro isométrico do desenvolvimento de tensão. A VS esquerda foi canulada com uma cânula de polietileno preenchida com óleo mineral para o registro das variações de pressão intraluminal.
Os ratos foram distribuídos nos seguintes grupos: lorcaserina (0,1 mg/kg, intravenosa), lorcaserina (0,3 mg/kg, intravenosa), lorcaserina (0,6 mg/kg, intravenosa) e lorcaserina (1,0 mg/kg, intravenosa). Visto que o veículo utilizado para a dissolução de lorcaserina (NaCl 0.9%, salina) não é capaz de induzir ejaculações neste modelo experimental (resultados obtidos em nosso laboratório e Kozyrev et al., 2016) um grupo tratado somente com veículo não foi incluído. Entretanto, para demonstrarmos a ausência de efeito do veículo nos resultados apresentados a seguir, a atividade da VS, DD e BSP foi registrada após a administração de salina (0,2 ml, intravenosa) nos ratos dos diferentes grupos de tratamento.
Após o período de 30 minutos de estabilização, ratos dos diferentes grupos receberam veículo (0,2 ml, intravenosa) e a pressão da VS, tensão do DD e atividade elétrica do BSP foram registrados continuamente por um período de 30 minutos. Após o período de observação dos efeitos do veículo, os ratos receberam lorcaserina em uma das diferentes doses especificadas acima e a atividade da SV, DD e BSP foi registrada por 1 hora (Figura 5).
Figura 5: Protocolo experimental ejaculação no modelo anestesiado.
Porcentagem de animais que demonstram ao menos uma ejaculação após a administração do tratamento (veículo ou lorcaserina);
Número de emissões seminais: número de contrações coordenadas da VS e DD; Número de ejaculações: número de eventos com contração coordenada do VS, DD e BSP;
Latência ejaculatória: intervalo entre a administração da lorcaserina e a ocorrência da primeira ejaculação;
Após o término do período de análises, os ratos foram eutanasiados por overdose de uretano por via intravenosa.
O mesmo protocolo foi repetido na presença do antagonista SB 242084 nas doses de 0,1 e 0,3 mg/Kg. Este foi administrado 10 minutos antes da injeção da lorcaserina (Figura 6).
Figura 6: Protocolo experimental ejaculação no modelo anestesiado com SB 242084.
Comportamento sexual
Ratos Wistar machos adultos (90 dias de idade) foram treinados para o comportamento sexual durante quatro semanas consecutivas (uma avaliação por semana) e divididos em três grupos de acordo com o tipo de ejaculação: sluggish (0-1 ejaculação/30min), normal (2-3 ejaculações/30min) e rápido (4 ou mais ejaculações/30min) (Pattij et al., 2005). Estes animais sexualmente experientes foram tratados com veículo (NaCl 0,9%, salina, gavagem), lorcaserina (1, 4 ou 10 mg/Kg, gavagem), SB 242084 (0,3 mg/Kg, intraperitoneal) ou com tratamento combinado de lorcaserina 4 mg/Kg (gavagem) + SB 242084 0,3 mg/Kg (intraperitoneal) 30 minutos antes das análises. No grupo lorcaserina + SB 242084 o antagonista foi administrado 15 minutos antes da lorcaserina. Para a observação do comportamento sexual, os ratos machos foram colocados em caixas de acrílico transparente, medindo 44x31x16 cm, 15 minutos antes da introdução de uma fêmea adulta ovariectomizada estimulada hormonalmente. Os animais foram observados no período escuro do ciclo com auxílio de lâmpada vermelhas. Durante os 30 minutos subsequentes os seguintes parâmetros foram
analisados: 1- latências para a primeira monta ou intromissão (intervalo entre a introdução da fêmea na caixa e a primeira monta ou intromissão); 2- latência ejaculatória (intervalo de tempo entre a primeira intromissão e a ejaculação em cada série ejaculatória); 3- número de intromissões até a primeira ejaculação, 4- período refratário pós ejaculatório (intervalo de tempo entre a ejaculação e a primeira monta ou intromissão da próxima série ejaculatória), 5- número de ejaculações em 30 minutos. Neste experimento também foi investigado a movimentação dos animais nos 15 minutos de aclimatização a caixa de comportamento (Figura 7).
Figura 7: Protocolo experimental comportamento sexual.
Ovariectomia
Ratas Wistar fêmeas adultas (60 dias) foram anestesiadas com ketamina e xilazina (70 mg/Kg ket + 15mg/Kg xil, intraperitonial) e ambos ovários foram removidos após incisões (1,5 – 2,0 cm) laterodorsais bilaterais. O músculo e a pele foram suturados separadamente com linha de sutura e as ratas foram utilizadas nos experimentos de análise do comportamento copulatório 15 dias após a cirurgia.
A receptividade sexual foi induzida através da administração subcutânea de benzoato de estradiol (20 µg/rata) e progesterona (1 mg/rata) dissolvidos em óleo de milho 52h e 4 h antes dos testes, respectivamente (Agmo, 1996). As ratas foram utilizadas nos diferentes testes em intervalos de sete dias.
Penile grooming e ambulação
Ratos Wistar machos adultos inexperientes (90 dias de idade) foram tratados com veículo (NaCl 0,9%, salina, gavagem), lorcaserina (1, 4 ou 10 mg/Kg, gavagem), SB 242084 (0,3 mg/Kg, intraperitoneal) ou com tratamento combinado de lorcaserina 4 mg/Kg (gavagem) + SB 242084 0,3 mg/Kg (intraperitoneal) imediatamente antes das análises. No grupo
lorcaserina + SB 242084 o antagonista foi administrado 15 minutos antes da lorcaserina (Figura 8).
Figura 8: Protocolo experimental penile grooming e ambulação com SB 242084.
Para a observação do penile grooming e ambulação, os ratos machos foram colocados em caixas de acrílico transparente, medindo 44x31x16 cm, marcadas com fitas que formavam seis quadrados idênticos. Os animais foram observados no período escuro do ciclo com auxílio de lâmpada vermelhas durante 1 hora. Os seguintes parâmetros foram analisados: número e latência de penile grooming e ambulação estimada a partir do número de quadrados explorados.
Análise Estatística
Para a comparação dos resultados entre os grupos experimentais, foram utilizados, no experimento I, dependendo da natureza da distribuição dos dados, o teste ANOVA seguido pelo teste de Tukey ou o teste Kruskall Wallis seguido por teste de Dunn; no experimento II, dependendo da natureza da distribuição dos dados, os testes t de Student ou o teste de Mann-Whitney; no experimento III, o teste ANOVA seguido pelo teste de Tukey. As diferenças foram consideradas significativas quando p< 0,05.
Resultados
Experimento I – piloto
O ganho de peso e consumo de ração dos animais do experimento I estão apresentados nas Figuras 1 e 2, respectivamente. Observa-se que os ratos do grupo exposto à dose de 10mg/Kg de lorcaserina no ciclo claro apresentaram menor ganho de peso quando comparado ao grupo controle. Entretanto, não houve diferença estatística no ganho de peso entre os grupos expostos à lorcaserina no ciclo escuro e no consumo de ração em ambas exposições.
Figura 1: Ganho de peso dos animais do experimento I, expostos à lorcaserina no ciclo claro (A) e escuro (B). Valores expressos como média ± EPM. *p<0,05 (ANOVA seguido por teste de Tukey).
Figura 2: Consumo de ração dos animais do experimento I, expostos à lorcaserina no ciclo claro (A) e escuro (B). Valores expressos como média ± EPM. (ANOVA seguido por teste de Tukey).
Os resultados referentes ao peso de órgãos do experimento I do ciclo claro e escuro estão apresentados nas Tabelas 1 e 2, respectivamente. Nota-se que não houve diferença estatística entre os grupos experimentais em ambas exposições.
A contagem espermática dos animais do experimento I dos ciclos claro e escuro está apresentada nas Tabelas 3 e 4, respectivamente. Observa-se os animais expostos à dose de 10 mg/Kg de lorcaserina no ciclo escuro apresentaram uma aceleração no tempo de trânsito espermático na cabeça/corpo do epidídimo.
Os resultados referentes a motilidade e a morfologia espermática dos animais do experimento I estão apresentados nas Figuras 3 e 4 e Tabelas 5 e 6, respectivamente. Nota-se que não houve diferença estatística nas duas análises entre os grupos experimentais em ambas exposições.
Tabela 1 – Peso de órgãos – experimento I (ciclo claro).
Parâmetros Grupos experimentais (n=6)
Controle 0,5 mg/Kg 1 mg/Kg 10 mg/Kg Peso corpóreo (g) 453,40 ± 21,22 437,90 ± 16,59 431,90 ± 10,86 419,00 ± 7,978 Peso de órgãos Testículo (g) 1,72 ± 0,04 1,73 ± 0,06 1,72 ± 0,04 1,72 ± 0,06 Epidídimo (mg) 530,10 ± 20,75 565,00 ± 30,13 562,20 ± 28,60 575,90 ± 20,90 Próstata ventral (mg) 489,20 ± 44,54 441,10 ± 24,95 501,40 ± 38,27 413,30 ± 47,54 Vesícula seminal cheia (g) 1,01 ± 0,08 1,21 ± 0,12 1,23 ± 0,12 0,98 ± 0,09 Vesícula seminal vazia (mg) 450,40 ± 31,09 452,70 ± 24,64 465,60 ± 34,39 473,40 ± 42,47
Rim (g) 1,49 ± 0,10 1,43 ± 0,05 1,56 ± 0,08 1,47 ± 0,03
Adrenal (mg) 37,24 ± 3,38 39,60 ± 2,22 41,90 ± 3,94 29,25 ± 2,26 Fígado (g) 16,47 ± 1,12 14,84 ± 0,61 16,19 ± 0,62 14,90 ± 0,42
Peso relativo de órgãos
Testículo (g/100g) 0,38 ± 0,02 0,40 ± 0,02 0,40 ± 0,01256 0,41 ± 0,01 Epidídimo (mg/100g) 120,61 ± 12,17 129,30 ± 6,10 131,02 ± 8,89 137,40 ± 3,84 Próstata ventral (mg/100g) 108,20 ± 8,41 101,60 ± 7,26 115,90 ± 7,71 98,14 ± 10,02 Vesícula seminal cheia (mg/100g) 223,40 ± 1,29 280,40 ± 3,56 285,30 ± 2,85 232,70 ± 1,78 Vesícula seminal vazia (mg/100g) 100,00 ± 6,94 104,00 ± 6,53 108,20 ± 8,59 112,40 ± 8,13 Rim (g/100g) 0,33 ± 0,01 0,33 ± 0,01 0,36 ± 0,01 0,35 ± 0,01 Adrenal (mg/100g) 8,09 ± 0,51 9,11 ± 0,73 9,63 ± 0,74 7,00 ± 0,66 Fígado (g/100g) 3,62 ± 0,12 3,40 ± 0,15 3,75 ± 0,11 3,56 ± 0,07 Valores expressos como média ± EPM (ANOVA seguido por teste de Tukey).
Tabela 2 - Peso de órgãos – experimento I (ciclo escuro).
Parâmetros Grupos experimentais (n=6)
Controle 0,5 mg/Kg 1 mg/Kg 10 mg/Kg Peso corpóreo (g) 410,20 ± 14,15 419,30 ± 17,85 424,20 ± 10,10 417,60 ± 10,38 Peso de órgãos Testículo (g) 1,76 ± 0,08 1,69 ± 0,04 1,76 ± 0,04 1,76 ± 0,03 Epidídimo (mg) 581,60 ± 49,16 640,60 ± 30,26 632,30 ± 27,06 619,40 ± 15,74 Próstata ventral (mg) 499,70 ± 42,60 541,10 ± 19,07 477,10 ± 42,89 404,20 ± 39,80 Vesícula seminal cheia (g) 1,15 ± 0,04 1,05 ± 0,13 1,13 ± 0,09 1,01 ± 0,06 Vesíula seminal vazia (mg) 471,50 ± 25,73 505,80 ± 42,18 441,20 ± 8,92 458,50 ± 30,44
Rim (g) 1,45 ± 0,06 1,56 ± 0,09 1,57 ± 0,05 1,57 ± 0,05
Adrenal (mg) 34,14 ± 3,23 36,50 ± 2,56 38,35 ± 4,38 41,37 ± 4,18 Fígado (g) 13,21 ± 0,76 13,96 ± 1,01 14,35 ± 0,35 14,59 ± 0,49
Peso relativo de órgãos
Testículo (g/100g) 0,43 ± 0,02 0,41 ± 0,03 0,42 ± 0,01 0,42 ± 0,01 Epidídimo (mg/100g) 142,80 ± 1,30 154,09 ± 9,28 149,69 ± 6,34 148,64 ± 4,09 Próstata ventral (mg/100g) 121,10 ± 6,96 130,10 ± 7,13 112,30 ± 9,43 96,43 ± 8,83 Vesícula seminal cheia (mg/100g) 279,90 ± 9,87 247,70 ± 24,64 268,30 ± 23,35 240,90 ± 12,78 Vesícula seminal vazia (mg/100g) 115,00 ± 5,49 121,90 ± 11,39 104,50 ± 4,13 109,60 ± 6,15 Rim (g/100g) 0,35 ± 0,01 0,37 ± 0,01 0,37 ± 0,01 0,37 ± 0,00 Adrenal (mg/100g) 8,09 ± 0,55 8,77 ± 0,69 9,04 ± 1,03 9,84 ± 0,81 Fígado (g/100g) 3,21 ± 0,10 3,31 ± 0,11 3,39 ± 0,07 3,49 ± 0,07 Valores expressos como média ± EPM (ANOVA seguido por teste de Tukey).
Tabela 3 – Contagem espermática – experimento I (ciclo claro).
Parâmetros Grupos experimentais (n=6)
Controle 0,5 mg/Kg 1 mg/Kg 10 mg/Kg
Contagem espermática no testículo
Número de espermátides (x106/testículo) 178,40 ± 6,91 179,60 ± 11,78 161,00 ± 15,96 177,60 ± 11,63
Número relativo de espermátides (x106/g/testículo) 112,60 ±5,95 115,40 ± 8,55 102,30 ± 8,65 110,10 ± 18,40
Produção espermática diária (x106/testículo/dia) 29,25 ± 1,13 29,44 ± 1,93 26,40 ± 2,62 29,12 ± 1,91
Produção espermática diária relativa (x106/testículo/dia) 18,46 ± 0,97 18,92 ± 1,40 16,78 ± 1,42 18,04 ± 1,23 Contagem espermática no epidídimo
Cabeça/corpo
Número de espermatozoides (x106/epidídimo) 147,70 ± 12,21 148,20 ± 9,28 136,20 ± 6,67 132,50 ± 6,85
Número relativo de espermatozoides (x106/g/epidídimo) 484,80 ± 39,75 449,60 ± 15,96 429,40 ± 20,60 406,00 ± 17,34
Tempo trânsito espermático (dias) 5,13 ± 0,51 5,09 ± 0,36 5,33 ± 0,40 4,63 ± 0,31
Cauda
Número de espermatozoides (x106/epidídimo) 160,40 ± 7,93 159,80 ± 19,45 174,30 ± 15,89 179,00 ± 28,67
Número relativo de espermatozoides (x106/g/epidídimo) 247,40 ± 24,38 263,10 ± 34,25 279,20 ± 23,87 274,40 ± 37,65
Tempo trânsito espermático (dias) 5,52 ± 0,33 5,44 ± 0,63 6,74 ± 0,61 6,10 ± 0,93 Valores expressos como média ± EPM (ANOVA seguido por teste de Tukey).
Tabela 4 – Contagem espermática – experimento I (ciclo escuro).
Parâmetros Grupos experimentais (n=6)
Controle 0,5 mg/Kg 1 mg/Kg 10 mg/Kg
Contagem espermática no testículo
Número de espermátides (x106/testículo) 159,70 ± 7,72 171,60 ± 9,49 186,40 ± 17,37 197,40 ± 10,77
Número relativo de espermátides (x106/g/testículo) 97,21 ± 3,34 103,60 ± 5,69 115,80 ± 10,22 120,80 ± 6,30
Produção espermática diária (x106/testículo/dia) 26,18 ± 1,27 28,13 ± 1,56 30,56 ± 2,85 32,36 ± 1,77
Produção espermática diária relativa (x106/testículo/dia) 15,94 ± 0,55 16,99 ± 0,93 18,99 ± 1,68 19,80 ± 1,03 Contagem espermática no epidídimo
Cabeça/corpo
Número de espermatozoides (x106/epidídimo) 128,20 ± 25,33 179,00 ± 21,78 141,50 ± 10,59 124,20 ± 8,41
Número relativo de espermatozoides (x106/g/epidídimo) 374,20 ± 71,93 497,30 ± 35,12 395,80 ± 22,95 369,20 ± 22,00
Tempo trânsito espermático (dias) 5,90 ± 0,37a 6,35 ± 0,65a 4,78 ± 0,47a 3,87 ± 0,28b
Cauda
Número de espermatozoides (x106/epidídimo) 236,20 ± 34,11 225,40 ± 13,74 170,50 ± 25,11 204,20 ± 24,64
Número relativo de espermatozoides (x106/g/epidídimo) 356,40 ± 35,33 351,50 ± 22,58 304,30 ± 40,56 304,70 ± 21,97
Tempo trânsito espermático (dias) 8,88 ± 0,84 8,13 ± 0,66 5,88 ± 1,11 6,44 ± 0,88 Valores expressos como média ± EPM (ANOVA seguido por teste de Tukey). Letras diferentes indicam significância estatística de <0,05.
Figura 3: Motilidade espermática dos animais do experimento I, expostos à lorcaserina no ciclo claro. Valores expressos como mediana e intervalos interquartílicos. (Kruskall Wallis seguido por teste de Dunn).
Figura 4: Motilidade espermática dos animais do experimento I, expostos à lorcaserina no ciclo escuro. Valores expressos como mediana e intervalos interquartílicos. (Kruskall Wallis seguido por teste de Dunn).
Tabela 5 - Morfologia espermática - experimento I (ciclo claro). Morfologia espermática – Ciclo claro Grupos experimentais Controle 0,5 mg/Kg 1 mg/Kg 10 mg/Kg Espermatozoides normais (%) 98,5 (92,88-99,50) 98,5 (93,75-99,50) 98,75 (98,00-99,13) 98,5 (95,25-99,25) Anormalidades de cabeça 2,00 (0,75-5,00) 0,50 (0,00-2,25) 1,50 (0,75-2,25) 2,50 (0,00-9,00) Anormalidades de cauda 1,50 (0,00-9,25) 2,50 (0,75-11,00) 1,50 (0,00-2,00) 0,50 (0,00-2,00) Gota citoplasmática (%) 22,75 (15,13-31,00) 22,25 (8,25-32,38) 31,50 (23,63-46,75) 20,00 (10,13-25,25) Valores expressos como mediana e intervalos interquartílicos (Kruskall Wallis seguido por teste de Dunn).
Tabela 6 - Morfologia espermática - experimento I (ciclo escuro). Morfologia espermática – Ciclo escuro Grupos experimentais Controle 0,5 mg/Kg 1 mg/Kg 10 mg/Kg Espermatozoides normais (%) 98,50 (62,25-99,13) 99,00 (94,75-99,63) 99,00 (97,38-99,63) 98,00 (90,00-99,13) Anormalidades de cabeça 1,00 (0,75-2,50) 1,00 (0,00-2,00) 1,00 (0,00-2,50) 3,50 (1,00-18,00) Anormalidades de cauda 1,00 (0,00-9,00) 1,00 (0,75-8,50) 1,50 (0,00-2,75) 1,00 (0,00-2,00) Gota citoplasmática (%) 17,50 (10,13-37,13) 25,75 (15,13-33,00) 42,50 (27,75-47,38) 21,00 (10,88-27,88) Valores expressos como mediana e intervalos interquartílicos (Kruskall Wallis seguido por teste de Dunn).
As dosagens hormonais dos animais do experimento I do ciclo claro e escuro estão apresentados na Figura 5. Observa-se que não houve diferença estatística entre os grupos experimentais em ambas exposições.
Figura 5: Dosagens hormonais dos animais do experimento I, expostos à lorcaserina nos ciclos claro (A) e escuro (B). Valores expressos como média ± EPM. (ANOVA seguido por teste de Tukey).
Os resultados referentes ao estagiamento dos túbulos seminíferos dos animais do experimento I estão apresentados na Figura 6. Nota-se que não houve diferença estatística nesta análise entre os grupos experimentais em ambas exposições.
A histopatologia do testículo dos animais do experimento I do ciclo claro e escuro estão apresentadas nas Figuras 7 e 8. Observa-se que não houve diferença estatística entre os grupos experimentais em ambas exposições.
Figura 6: Estagiamento dos túbulos seminíferos dos animais do experimento I, expostos à lorcaserina nos ciclos claro (A-D) e escuro (E-H). Estágio I-VI (A e E), VII-VIII (B e F), IX-XIII (C e G) e XIV (D e H). Valores expressos como mediana e intervalos interquartílicos (Kruskall Wallis seguido por teste de Dunn).
Figura 7: Histopatologia do testículo dos animais do experimento I, expostos à lorcaserina nos ciclos claro (A) e escuro (B). Valores expressos como mediana e intervalos interquartílicos (Kruskall Wallis seguido por teste de Dunn).
