Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências do Câmpus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Área de Concentração: Microbiologia Aplicada).
Rio Claro
Estado de São Paulo - Brasil
Agosto - 2006
Aline Zorzetto Lopes Gonçalves
Produção de
αααα
-amilase e glucoamilase termoestável
pelo fungo termofílico Thermomyces lanuginosus
TO-03 por fermentação submersa e em estado sólido
e caracterização das enzimas
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: MICROBIOLOGIA APLICADA)
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS – RIO CLARO
unesp
Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências do Câmpus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Área de Concentração: Microbiologia Aplicada).
Rio Claro
Estado de São Paulo - Brasil
Agosto - 2006
Aline Zorzetto Lopes Gonçalves
Produção de
αααα
-amilase e glucoamilase termoestável
pelo fungo termofílico Thermomyces lanuginosus
TO-03 por fermentação submersa e em estado sólido
e caracterização das enzimas
Orientadora: Profa. Dra Eleni Gomes
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS"Amizade é o sentimento mais precioso do mundo: pois não se
compra, não se pede, se conquista".
Dedico este trabalho aos meus pais que sempre me ensinaram o verbo SER, e contribuíram com meu crescimento pessoal e profissional. Aos meus irmãos, pelos momentos de alegria. E aos meus avós e tios, que sempre acreditaram em mim,
me incentivaram e me ajudaram!!! Sem a ajuda e colaboração de vocês, eu não teria concluído mais essa etapa. A vocês, todo o meu amor e carinho!!!
Recomeçar
“Não importa onde você parou... Em que momento da vida você cansou...
O que importa é que sempre é possível e necessário ‘recomeçar’. Recomeçar é dar uma nova chance a si mesmo...
É renovar as esperanças na vida e, o mais importante... Acreditar em você de novo.
Sofreu muito neste período? Foi aprendizado...
Chorou muito? Foi limpeza da alma... Ficou com raiva das pessoas?
Foi para perdoá-las um dia... Sentiu-se só por diversas vezes? É porque fechaste a porta até para os anjos...
Acreditou em tudo que estava perdido? Era o início de tua melhora...
Onde você quer chegar? Ir alto?
Sonhe alto...
Queira o melhor do melhor... Se pensamos pequeno... Coisas pequenas teremos...
Mas se desejarmos fortemente o melhor e Principalmente lutarmos o melhor... O melhor vai se instalar em nossa vida. Porque sou do tamanho daquilo que vejo,
E não do tamanho da minha altura.”
AGRADECIMENTOS
A Profa. Dra. Eleni, pela confiança, incentivo e orientação.
Aos amigos e colegas de trabalho, pelos momentos de descontração, enriquecimento profissional e ajuda nas dúvidas que surgem ao longo do caminho: Alexandre, Ana Flávia, Ana Paula, Andréia, Carol, Dênis, Eduardo, Ellen, Érika, Fabiana, Gisele, Heloiza, Hamilton, Luis Gustavo, Maira, Marcelo, Natália, Paula, Patrícia, Rodrigo, Rosangela e Prof. Roberto.
Ao Vitor, que sempre me incentivou e me compreendeu nas horas de estress e correria. Muito obrigada pela sua companhia.
SUMÁRIO
Páginas
I. INTRODUÇÃO ... 1
II. REVISÃO DA LITERATURA ... 2
II.1. Estrutura do amido, ação e aplicação das amilases... 2
II.2. Fungos filamentosos e biotecnologia ... 9
II.3. Produção de amilases termoestáveis por microrganismos em Fermentação Submersa (FSm) e Fermentação em Estado Sólido (FES)... 12
III. OBJETIVOS... 16
IV. MATERIAL E MÉTODOS ... 17
IV.1. O microrganismo e a manutenção da cepa ... 17
IV.2. Processos fermentativos e obtenção da enzima... 17
IV.2.1. Fermentação submersa (FSm)... 17
IV.2.2. Fermentação em estado sólido (FES) ... 18
IV.3. Determinação da atividade enzimática ... 18
IV.3.1. Dosagem da atividade enzimática pela quantificação da glicose liberada (Atividade de Glucoamilase) ... 18
IV.3.1.1. Dosagem da atividade de Glucoamilase intracelular ... 19
IV.3.2. Dosagem da atividade amilolítica pelo método de coloração com Iodo (Atividade Dextrinizante)... 19
IV.3.3. Dosagem da atividade amilolítica pela quantificação do açúcar redutor liberado (Atividade Sacarificante) ... 20
IV.4. Caracterização das enzimas produzidas por fermentações sólida e submersa... 21
IV.4.1. Determinação do pH e temperatura ótimos para as atividades enzimáticas... 21
IV.4.2. Estabilidade da enzima frente às variações de pH e temperatura... 21
IV.5.1. Análise dos produtos de hidrólise do amido por Cromatografia em
Camada Delgada (TLC)... 22
IV.6. Avaliação dos efeitos de íons na atividade das enzimas ... 23
IV.6.1. Efeito da adição de íons Ca2+ à mistura de reação ... 23
IV.6.2. Efeito da adição de outros íons à mistura de reação, sobre a atividade das enzimas... 23
IV.6.3. Efeito da adição de EDTA e SDS à mistura de reação ... 24
IV.7. Métodos analíticos ... 24
V. RESULTADOS E DISCUSSÃO... 25
V.1. Produção de α-amilase e Glucoamilase pelo fungo T. lanuginosus TO-03 em FSm... 25
V.2. Produção de α-amilase e Glucoamilase pelo fungo T. lanuginosus TO-03 em FES. ... 34
V.3. Caracterização das enzimas produzidas por FSm e FES... 37
V.3.1. Determinação do pH ótimo e da estabilidade ao pH para Glucoamilase e α-amilase ... 37
V.3.2. Determinação da temperatura ótima das enzimas e termoestabilidade ... 42
V.3.2.1. Estabilidade a 60 ºC ... 47
V.4. Avaliação da ação das enzimas sobre diferentes substratos amiláceos... 50
V.4.1. Análise dos produtos de hidrólise do amido por Cromatografia em Camada Delgada (TLC)... 54
V.5. Avaliação dos efeitos de íons na atividade das enzimas ... 56
V.5.1. Efeito da adição de íons Ca2+ à mistura de reação... 56
V.5.2. Efeito da adição de outros íons, EDTA e SDS à mistura de reação, sobre a atividade das enzimas... 59
VI. CONCLUSÕES... 64
VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 65 VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...Erro! Indicador não definido.
LISTA DE FIGURAS
Páginas Figura 1. Fórmulas estruturais do amido: a) amilose e b) amilopectina... 3 Figura 2. Modelo de ação das enzimas envolvidas na degradação do amido... 7 Figura 3. Produção de Glucoamilase e α-amilase por T. lanuginosus TO-03 em FSm..
... 27 Figura 4. Avaliação da produção de Glucoamilase intra e extracelular pelo T. lanuginosus TO-03 em FSm... 28 Figura 5. Produção de Glucoamilase e α-amilase pelo T. lanuginosus TO-03 por
FES... 37 Figura 6. Caracterização físico–química da Glucoamilase e α-amilase pelo T.
lanuginosus TO-03 por FSm e FES. a) efeito do pH sobre a atividade da Glucoamilase obtida por FSm; b) efeito do pH sobre a atividade da Glucoamilase obtida por FES; c) efeito do pH sobre a atividade de α-amilase obtida por FSm; d) efeito do pH sobre a atividade de α-amilase obtida por FES... 40 Figura 7. Caracterização físico–química da Glucoamilase e α-amilase pelo T. lanuginosus TO-03 obtidas por FSm e FES. a) estabilidade da Glucoamilase obtida por FSm, em ausência de substrato, frente à variação de pH; b) estabilidade da Glucoamilase obtida por FES, em ausência de substrato, frente à variação de pH; c) estabilidade da α-amilase obtida por FSm e FES, em ausência de substrato, frente à variação de pH... 41 Figura 8. Caracterização físico–química da Glucoamilase e α-amilase pelo T. lanuginosus TO-03 obtidas por FSm e FES. a) efeito da temperatura sobre a atividade da Glucoamilase obtida por FSm; b) efeito do pH sobre a atividade da Glucoamilase obtida por FES; c) efeito do pH sore a atividade de α - amilase obtida por FSm; d) efeito do pH sobre a atividade de α-amilase obtida por FES.. 45 Figura 9. Caracterização físico–química da Glucoamilase e α-amilase pelo T. lanuginosus TO-03 obtidas por FSm e FES. a) estabilidade da Glucoamilase obtida por FSm, em ausência de substrato, frente à variação de temperatura; b) estabilidade da Glucoamilase obtida por FES, em ausência de substrato, frente à variação de temperatura; c) estabilidade da α-amilase obtida por FSm e FES, em ausência de substrato, frente à variação de temperatura... 46 Figura 10. Caracterização físico–química da Glucoamilase e α-amilase pelo T. lanuginosus TO-03 obtidas por FSm e FES. a) estabilidade da Glucoamilase obtida por FSm, em ausência de substrato, à 60°C, por 8h b) estabilidade da Glucoamilase obtida por FES, em ausência de substrato, à 60°C, por 8h; c) estabilidade da α-amilase obtida por FSm e FES, em ausência de substrato, à 60°C, 8h... 49 Figura 11. Avaliação da atividade de Glucoamilase produzida em FSm (a) e FES (b), sobre diferentes substratos derivados amiláceos... 53 Figura 12: Cromatografia em Camada Delgada de sílica dos produtos de hidrólise do amido com extratos enzimáticos brutos de T. lanugisnosus TO-03. a) hidrólise com o extrato enzimático da FSm; b) hidrólise com o extrato enzimático da FES... 55
Figura 13. Efeito da adição de íons Ca2+ à mistura de reação, sobre a atividade da
Glucoamilase produzida pelo T. Lanuginosus TO-03. a) extrato enzimático obtido por fermentação submersa (FSm); b) extrato enzimático obtido por fermentação em estado sólido (FES)... 57 Figura 14. Efeito da adição de íons Ca2+ à mistura de reação, sobre a atividade da α
-amilase produzida pelo T. Lanuginosus TO-03. a) extrato enzimático obtido por fermentação submersa (FSm); b) extrato enzimático obtido por fermentação em estado sólido (FES)... 58
LISTA DE TABELAS
Páginas
Tabela 1: Efeito da adição de diferentes íons; EDTA e SDS sobre a atividade
da Glucoamilase produzida pelo T. lanuginosus TO-03... 65
Tabela 2: Efeito da adição de diferentes íons; EDTA e SDS sobre a atividade
RESUMO
As amilases, envolvidas na degradação do amido, constituem um grupo de enzimas com diferentes pontos de atuação na molécula de amido, hidrolisando ligações glicosídicas α-1,4 e/ou α-1,6, como as α-amilases e glucoamilases. A característica de termoestabilidade para essas enzimas é bastante desejável visto que, além de serem mais estáveis sob várias condições, ainda permitem a condução de processos de hidrólise do amido em temperaturas elevadas. O presente trabalho visou o estudo da produção de α -amilase e gluco-amilase termofílica por Thermomyces lanuginosus TO-03, por fermentação submersa (FSm) e em estado sólido (FES), avaliando-se os efeitos do tempo de cultivo e da fonte de carbono. Foram estudadas também, as propriedades bioquímicas das enzimas produzidas e o efeito das mesmas na hidrólise dos diferentes tipos de amido na produção de xarope. Os resultados mostraram que as produções máximas de atividade de amilase dextrinizante, sacarificante e da glucoamilase por FES foram 3973,6; 95,2 e 235,2 U/g, em 144, 120 e 168h, respectivamente. Em FSm foram obtidos 181,6; 5,0 e 27,1 U/mL para amilase dextrinizante e amilase sacarificante e para Glucoamilase em 168 h fermentação. A glucoamilase obtida por FSm apresentou as seguintes propriedades: temperatura e pH ótimos de 70ºC e 5,5 quando o amido solúvel foi o substrato e de 65ºC e 4,5 quando o substrato foi a maltose. A α-amilase apresentou temperatura ótima de 60°C e pH ótimo 5,5. Quando obtida por FES, a glucoamilase apresentou temperatura ótima de 65ºC, para hidrólise de ambos os substratos e pH ótimo 5,5 para hidrólise do amido solúvel e pH 4,5 para a hidrólise da maltose. A α-amilase de FES apresentou temperatura E pH ótimos de 60°C e pH 5,5. Ambas as enzimas foram estáveis quando incubadas em temperaturas de 10 a 60°C por 1 hora e em uma faixa de pH 3,5–9,5. A glucoamilase apresentou tempo de “meia vida” de 6 h a 60ºC, enquanto a α-amilase, apenas 3 h a 60°C. A análise cromatográfica em camada delgada de sílica revelou a presença de bandas semelhantes aos padrões glicose, maltose, maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose e maltoheptaose. As glucoamilase dos extratos brutos, dialisado e não dialisado, foram ativadas por 10mM de Ca2+, ao passo
que a α-amilase foi parcialmente inibida. Os íons Fe2+, Al3+, Mn2+ e Hg2+ foram
os principais inibidores da glucoamilase, enquanto que da α-amilase foram os íons Cr3+, Fe2+, Al3+ e Ag+.
Palavras-chaves: glucoamilase, α-amilase, Thermomyces lanuginosus, enzimas termofílicas
ABSTRACT
Amylases, involved in starch degradation, constitute a group of enzymes with different action sites on the starch molecule, hydrolysing glycosidic bonds α-1.4 and/or α-1.6, such as α-amylases and glucoamylases. Thermostability for these enzymes is a very desirable characteristic since it makes them more stable under many conditions and it allows hydrolytic processes of starch to take place at high temperatures. This work had the purpose of studying the production of thermophilic α-amylase and glucoamylase by Thermomyces
lanuginosus TO-03, in submerged fermentation (SmF) and solid state
fermentation (SSF), evaluating the effect of cultivation time and carbon source. Biochemical properties of the enzymes were also studied along with the effect they had on hydrolysis of different types of starch for syrup production. The results show that maximum production of dextrinogenic and saccharogenic amylase and glucoamylase activities by SSF were 3973.6, 95.2 and 235.2 U/g in 144, 120 and 168 h, respectively. In SmF the results were 181.6, 5.0 and 27.1 U/mL for dextrinogenic and saccharogenic amylase and glucoamylase activities in 168 h of fermentation. Glucoamylase from SmF exhibited the following properties: temperature and pH optimum at 70°C and 5,5 when soluble starch was used as substrate and 65°C and 4.5 when maltose was used as substrate. α-amylase from SmF exhibited optimum temperature at 60°C and pH optimum at 5.5. Glucoamylase from SSF exhibited optimum temperature at 65°C, for the hydrolysis of both substrates and pH optimum at 5.5 when hydrolysing soluble starch and 4.5 when hydrolysing maltose. α-amylase from SSF exhibited optimum temperature and pH at 60°C and 5.5. Both enzymes were stable when incubated in temperatures from 10 to 60°C for 1 hour and in pH ranging from 3.5 to 9.5. Glucoamylase exhibited half-life at 60°C of 6 h, while α-amylase exhibited only 3 h at 60°C. Analysis of thin layer chomatography revealed the presence of bands similar to the patterns glucose, maltose, maltotriose, maltotetraose, maltotentaose, maltohexaose and maltoheptaose. Glucoamylase in the crude extracts, dialysed or not dialysed, were activated by Ca2+ 10 mM, while α-amylase was partialy inhibited. The ions
Fe2+, Al3+, Mn2+ and Hg2+ were the main inhibitors of glucoamylase, while Cr3+,
Fe2+, Al3+ and Ag+ inhibited α-amylase.
Keywords: Glucoamylase, α-amylase, Thermomyces lanuginosus, thermophilic enzymes.
I. INTRODUÇÃO
No início do século XX, houve uma intensa valorização da capacidade dos microrganismos em realizar transformações químicas, tanto envolvendo a quebra de substâncias quanto a síntese de novos compostos. Assim, os microrganismos têm surgido como parte do eixo principal da biotecnologia, em virtude da rápida velocidade de crescimento e de sua diversidade de atividades bioquímicas (PELCZAR, 1996).
Como fonte de enzimas para aplicação nos mais variados processos biotecnológicos, os microrganismos surgem como a melhor alternativa, em função da variedade de espécies e linhagens, permitindo o isolamento de enzimas com características diversificadas, as quais podem ser aplicadas nas mais variadas condições fisico-químicas permitindo que cada processo possa ter um tipo de enzima que melhor se adapte a ele (STOLP, 1988; MADIGAN et al., 2004).
A indústria de enzimas, como é conhecida hoje, é o resultado de um rápido desenvolvimento da biotecnologia, visto principalmente durante as quatro décadas passadas. Enzimas encontradas na natureza têm sido usadas desde tempos antigos na produção de produtos alimentícios, como o queijo, cerveja, vinho e vinagre, e no processamento de materiais como couro e linho (KIRK et al., 2002). As amilases realizam importante papel na ciclagem do carbono contido nos amiláceos, hidrolisando a molécula de amido em diversos produtos como as dextrinas e glicose. As dextrinas são muito aplicadas em formulações clínicas, como material para sacarificação enzimática; a maltose é usada em confeitarias, refrigerantes, cervejaria, fabricação de geléias e sorvetes, e a glicose é usada como adoçante, nas fermentações para produção de álcool e outros bioprodutos. Dessa forma, as amilases ocupam importante espaço entre as enzimas comercializadas sendo, principalmente, aplicadas nas indústrias de alimentos, farmacêutica, têxtil, de papel e também fazendo parte da formulação de detergentes (GLAZER; NIKAIDO, 1995; GÚZMAN–MALDONADO;
PAREDES–LÓPEZ, 1995; GOTO et al., 1998; PEIXOTO et al., 2003; NAJAFPOUR;
Atualmente, cerca de 42 a 55% do xarope de milho, com alto teor de frutose, são obtidos por processamentos enzimáticos, mas estima-se que em um futuro próximo, as enzimas serão aplicadas em 100% dos processos de fabricação deste produto (SAID; PIETRO, 2002), uma vez que a especificidade na hidrólise do amido gera produtos com propriedades químicas e físicas conhecidas, poucas reações intermediárias e formação de subprodutos
(VIHINEN; MÄNTSÄLÄ, 1989; NIGAM; SINGH, 1995; VAN DER MAAREL et al, 2002).
II. REVISÃO DA LITERATURA
II.1. Estrutura do amido, ação e aplicação das amilases
O amido e a celulose são as duas fontes de carbono mais amplamente distribuídas na natureza. O amido é uma substância de reserva composta de α -D-glicose, armazenado nas raízes, sementes e tubérculos na maioria das plantas superiores (GUZMÁN-MALDONADO; PAREDES-LÓPEZ, 1995; ALVES-PRADO, 2000; NIRMALA; MURALIKRISHNA, 2003). O amido possui as mais variadas aplicações, sendo utilizado na indústria têxtil com a finalidade de gomar as linhas para facilitar a tecelagem e na indústria de papéis, visto que a gomagem das fibras produz papéis com diferentes resistências e alta qualidade de impressão. No entanto, a maior utilização do amido está na indústria de alimentos e bebidas, onde é utilizado como espessante, estabilizante e agente geleificante. A partir do processamento do amido pode-se ainda obter os xaropes de glicose, xaropes de maltose, as maltodextrinas e as ciclodextrinas, utilizados em confeitarias, cervejarias e na indústria farmacêutica (CIACCO; CRUZ, 1981; GUZMÁN-MALDONADO; PAREDES-LÓPEZ, 1995). O amido pode ainda, ser usado como principal substrato para a produção de enzimas e biomassa microbianas. Além disso, o açúcar produzido a partir da hidrólise do amido pode ser fermentado para a produção de etanol (NIGAM; SINGH, 1995; ROY; GUPTA, 2004).
A glicose de amido é ainda amplamente usada na manufatura de ácidos orgânicos como o cítrico, ácido glutâmico, ácido lático, glucitol, aminoácidos
como lisina ou comercializado como glicose cristalina (PAZUR et al.,1990;
AQUINO et al., 2001).
O amido é acumulado nos vegetais na forma de grânulos insolúveis, os quais são formados por dois componentes separáveis por precipitação seletiva, denominados amilose e amilopectina, que aparecem na proporção média de 25 e 75%, respectivamente (Fig. 1). A amilose é um polissacarídeo formado de cadeias lineares helicoidais de resíduos de glicose unidos entre si por ligações glicosídicas α-1,4. Cada volta da espiral pode ser formada por cerca de seis unidades de glicose. A amilopectina constitui a fração altamente ramificada do amido. É formada por várias cadeias de resíduos de glicose unidas entre si por ligações glicosídicas α-1,4 das quais partem ramificações com ligações α-1,6 a cada série de 25 a 30 resíduos de glicose (LASZLO et al., 1986).
a)
b)
Amilopectina
Figura 1. Fórmulas estruturais do amido: a) amilose e b) amilopectina. Fonte: Robyt, 1998.
Várias enzimas são conhecidas por hidrolisar a molécula de amido com liberação de diferentes produtos e são genericamente denominadas de amilases. Uma ação combinada dessas enzimas é requerida para hidrolisar completamente o amido em glicose (GUPTA et al., 2003). As amilases são amplamente distribuídas na natureza sendo sintetizadas em vários tecidos animais, plantas superiores, bem como por fungos, leveduras e bactérias. No entanto, aquelas produzidas por microrganismos termofílicos e termotolerantes são especialmente interessantes por serem normalmente termoestáveis e poderem ser usadas nos processos de sacarificação que ocorrem em altas temperaturas (GÚZMAN-MALDONADO; PAREDES-LÓPEZ, 1995; GOTO et al., 1998;
PEIXOTO et al., 2003).
Com base no local de ação, as amilases podem ser divididas em duas categorias: as endoamilases e as exoamilases. As endoamilases hidrolisam as ligações glicosídicas ao acaso no interior da molécula de amido liberando oligossacarídeos, enquanto as exolamilases hidrolisam as ligações glicosídicas a partir da extremidade não redutora da molécula liberando glicose ou maltose
(GUZMÁN-MALDONADO; PAREDES-LOPEZ, 1995). A Figura 2 sintetiza a ação
conjunta das enzimas que degradam a molécula de amido.
As enzimas amilolíticas e suas especificidades serão descritas a seguir de acordo com o apresentado por Vihinen e Mäntsälä (1989).
As α-amilases (1,4-α-glucano glucanohidrolase, E.C. 3.2.1.1) correspondem a endoamilases, que atuam ao acaso no interior da molécula de amido e hidrolisam as ligações α-1,4 liberando maltooligosacarídeos de diversos tamanhos (dextrinas), no entanto, a especificidade das α-amilases para ligações glicosídicas α-1,4 não é absoluta, algumas α-amilases podem degradar algumas ligações α-1,6, porém, a taxa destas reações é muito menor daquelas ligações α-1,4. Os principais produtos de hidrólise do amido pela ação das α-amilases são maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, maltose e glicose (NAJAFI et al., 2005;EZEJI; BAHL, 2006).
As glucoamilases (1,4-α-D-glucano glucohidrolase. E.C. 3.2.1.3), também conhecidas como amiloglucosidases, são produzidas principalmente por fungos. São exoamilases que catalisam a quebra das ligações glicosídicas
α-1,4 a partir de uma extremidade não redutora da molécula de amido. Ela pode atuar tanto nas moléculas de amilose ou amilopectina do grânulo de amido como em oligossacarídeos relacionados, liberando D-glucose na configuração β. Em uma velocidade menor, as glucoamilases também atuam hidrolisando as ligações α-1,6 e algumas α-1,3. Sugere-se, portanto, que a ação da glucoamilase ocorra por meio de um mecanismo multisseriado no qual a enzima atua aleatoriamente em toda a molécula de substrato.
As β-amilases (1,4-α-D-glucano maltohidrolase, E.C.3.2.1.2) são exoamilases que hidrolisam a penúltima ligação α-1,4 a partir de extremidade não redutora da molécula (amilose, amilopectina e glicogênio) liberando maltose. Além da hidrólise, há uma inversão da configuração anomérica da maltose, que é liberada na configuração β. São encontradas em várias plantas como cevada, trigo, batata doce e feijão, e raramente em microrganismos. Esta enzima não é capaz de hidrolisar ligações α-1,6 dos substratos ramificados. O uso da β-amilase na produção de xarope de alto teor de maltose está restrito pela sua disponibilidade limitada. Na indústria de alimentos e bebida, esta enzima é empregada para converter solução de amido em solução de maltose.
As pululanases (α-dextrina-6-glucohidrolase, E.C. 3.2.1.41) são endoamilases desramificantes que quebram as ligações α-1,6 do pululano, um polissacarídeo linear que consiste de maltotrioses unidas por ligações glicosídicas α-1,6 e que não pode ser degradado por α- ou β-amilase. O produto dessa hidrólise corresponde às maltotrioses. Estas enzimas também são capazes de agir nas ligações α-1,6 das moléculas de amido, amilopectina e dextrina limite, originando um produto de reação sem ponto de ramificação. Dentro dessa categoria estão também as isopululanases (pullulan 4-glucohydrolase, E.C. 3.2.1.57) que são enzimas que quebram as ligações glicosídicas α-1,4 do pululano, mas que não têm nenhuma atividade sobre o amido. O produto da ação dessas enzimas é a isopanose.
As isoamilases (glicogênio-6-glucanohidrolase, E.C. 3.2.1.68) são endoamilases desramificantes que hidrolisam as ligações α-1,6 de amilopectina, glicogênio, várias dextrinas ramificadas e oligossacarídeos, mas
não hidrolisa a ligação α–1,6 do pululano. Estas enzimas são similares as pululanases, porém requerem pelo menos três unidades de glicose na cadeia ramificada para serem capazes de hidrolisá-la. As isoamilases têm sido encontradas em poucas linhagens de microrganismos e são usadas para desramificarem a molécula de amido na produção de glicose e maltose.
As α-D-glucosidases (α-D-glucosídeo glucohidrolase EC 3.2.1.20) ou maltases, são exoamilases que hidrolisam ligações glicosídicas α-1,4 de sacarídeos curtos liberando α-D-glucose a partir da extremidade não redutora. Um outro tipo, as oligo-1,6-α-D-glucosidase (EC 3.2.1.10) hidrolisam ligações
α-1,6 de oligossacarideos. Elas encontram-se amplamente distribuídas entre os microrganismos, incluindo os fungos, leveduras e bactérias.
As exo-1,4-α-D-Glucanases (α-D-glucano hidrolase EC 3.2.1.60 e 3.2.1.98) são enzimas similares as α-amilases, porém, liberam grande quantidade de maltotetraose (EC 3.2.1.60) e maltohexaose (EC 3.2.1.98) como principais produtos de sua ação sobre o amido. Essas amilases são capazes de digerir ainda a maltohexaose para maltotetraose e maltose.
Ciclomaltodextrina Glucanotransferase (ciclodextrina glicosiltransferase; 1,4-α-D-(1,4-D-Glucano EC 2.4.1.19) é uma exoamilase que hidrolisa o amido, amilose e outros polissacarídeos, por uma série de reações complexas, formando oligossacarídeos cíclicos não redutores, conhecidos como ciclodextrinas.
Figura 2. Modelo de ação das enzimas envolvidas na degradação do amido. (•) extremidade redutora; (o) extremidade não redutora; (→) indicam o ponto de clivagem preferido na molécula de amido. (Fonte modificada: VAN DER VEEN et al, 2000; HORVÁTHOVÁ et al, 2000; BERTOLDO; ANTRANIKIAN, 2002).
A conversão enzimática do amido na indústria inclui a gelatinização que envolve a dissolução do amido em água em altas temperaturas e sua hidrólise sequencial por diferentes enzimas amilolíticas (α-amilase, α-glicosidase, pululanase) (HAKI; RAKSHIT, 2003). As α-amilases são divididas em duas categorias de acordo com o grau de hidrólise do substrato: as α-amilases sacarificantes, que hidrolisam 50 a 60% do substrato e as liqueficantes, que quebram cerca de 30 a 40% do amido. As propriedades das α-amilases fúngicas são muito similares às das enzimas bacterianas. No entanto, elas são normalmente menos termoestáveis, mas têm uma faixa de estabilidade ao pH mais ampla. As aplicações industriais são inúmeras e, provavelmente, a maior aplicação desta enzima é no processo de liquefação do amido nas indústrias de açúcar, álcool e bebidas fermentadas, para converter 30 a 40% do amido em dextrinas solúveis, com diferentes graus de polimerização, diminuindo a viscosidade da solução de amido (LÉVÊQUE et al., 2000; GOMES et al., 2003).
Elas são utilizadas também, na indústria de panificação, na produção de adesivos, fármacos e detergente, em tratamento de efluentes de esgoto e em ração animal (GOTO et al., 1998; PEIXOTO et al., 2003; NAJAFPOUR; SHAN, 2003;
GUPTA et al., 2003; ASGHAR et al., 2006; MITIDIERI et al., 2006).
A glucoamilase é uma das enzimas industriais mais importantes, tendo como sua principal atuação a degradação do amido, para a produção de xaropes com alto teor de glicose (96 - 98% de glicose) e de xaropes com alto teor de frutose (55% de frutose). Este último tem grande aplicação na indústria panificadora e na fermentação de cervejas de baixa caloria (JAMES; LEE, 1997). No processo de panificação, as glucoamilases aumentam os níveis de açúcares fermentessíveis na massa. A glicose liberada pela ação dessa enzima apresenta um nível perceptível de doçura superior ao produzido pela ação da β-amilase. Assim, as glucoamilases são algumas vezes utilizadas com o objetivo de reduzir a quantidade de açúcar a ser adicionada à massa, dependendo da viabilidade econômica destes ingredientes (KNIGHT; MAZZIEIRO, 2000). Em altas concentrações de glicose, a glucoamilase pode repolimerizar moléculas de glicose, por meio de uma reação chamada ‘reversão’, onde é formado maltose e isomaltose. Porém, este fenômeno é mais pronunciado em altas concentrações de substrato e enzima.
As glucoamliases também são usadas nas indústrias japonesas de fermentação para a fabricação de produtos como, por exemplo, o sake, o shoyu e o miso (HATA et al., 1997). As enzimas disponíveis comercialmente são, na sua maior parte, produzidas por linhagens dos fungos Aspergillus e
Rhizopus. Dentre estas, a Glucoamilase de Aspergillus é a mais termoestável,
apresentando a máxima atividade em torno do pH 4,5, em temperaturas próximas de 50 a 55ºC, sendo rapidamente inativada em temperaturas próximas a 60ºC. Esta termoestabilidade limitada afeta seu uso em processos industriais, nos quais a atuação prolongada em altas temperaturas é necessária (LEMOS et al, 2003).
Além da indústria de alimentos, segundo Glazer e Nikaido (1995), a indústria têxtil tem utilizado as amilases para a remoção da pasta de amido aplicada ao fio com a finalidade de aumentar a resistência do mesmo à frisão
durante o processamento. Essa pasta, quando não totalmente removida, dificulta o processamento final das roupas como tingimento, clareamento ou outro tipo de acabamento.
As α-amilases e glucoamilases têm sido obtidas a partir de diversos microrganismos como as bactérias Bacillus amyloliquefaciens (MORGAN;
PRIEST, 1981), Bacillus sp ANT-6 (BURHAN et al., 2003), Bacillus subtilis
JS-2004 (ASGHAR et al., 2006), Geobacillus thermodenitrificans HRO10 (EZEJI; BAHL, 2006), e os fungos Aspergillus niger UO-1 (HERNÁNDEZ et al., 2006),
Aspergillus tamarii (MOREIRA et al., 2004), Aspergillus awamori (ANINDYAWATI et al., 1998), Talaromyces emersonii (BUNNI et al., 1989), Scytalidium sp. (ODIBO et al., 1992) e Scytalidium thermophilum (AQUINO et al,. 2003), Rhizomucor
pusillus A 13.36 (SILVA et al., 2005).
II.2. Fungos filamentosos e biotecnologia
Os fungos são muito utilizados em inúmeros processos biotecnológicos. Antigos e tradicionais sistemas de produção de pão, vinho, cerveja e antibióticos envolvendo os fungos são bastante conhecidos. O potencial de uso industrial dos fungos filamentosos tem estimulado pesquisas para o desenvolvimento de processos de fermentação em larga escala, para obtenção de inúmeros metabólicos. Métodos de melhoramento de linhagens têm resultado em otimização do uso destes fungos na indústria atual (VERDOES et al., 1995).
Segundo Grandi (1999), Matheus e Okino, (1999), Trufem (1999), os principais benefícios dos fungos filamentosos e leveduras em processos biotecnológicos são:
- Produção de Biomassa fúngica para produzir alguma substância de interesse (enzimas) ou esperar que o microrganismo participe de algum processo.
- Alimentos fermentados utilizados principalmente pelos orientais, como soja, arroz, trigo e outros cereais. Dentre os principais tipos de alimentos obtidos por processos de fermentação estão o temphe, grãos de soja cozidos e fermentados por Rhizopus oligosporus, R. oryzae, R. arrhyzus ou R. stolonifer;
o tofu, “queijo de soja” fermentado geralmente por Actinomucor elegans; o shoyu, também obtido por fermentação da soja, do qual participam linhagens de Aspergillus oryzae e A. soyae.
- Produção de ácidos orgânicos, vitaminas e antibióticos com interesse nas indústrias farmacêuticas, de cosméticos, têxtil, de alimentos e outras; como exemplo têm-se o ácido láctico, que é utilizado como acidificante de embutidos e doces e é produzido industrialmente por várias espécies de Mucor, além de
Rhyzopus arrhyzus, R. stolonifer e R. chinensis. O β-caroteno, utilizado como
fonte de provitamina A, agente oxidante e corante natural de alimentos, produzido, principalmente, por Blakeslea trispora, Phycomyces blakesleeanus e
Choanephora cucurbitarum. A cefalosporina (Cephalosporium acremonium), a
penicilina G e derivados (Penicillium chrysogenum) e a fumagilina (Aspergillus
fumigatus) que são antibióticos com ação bactericida ou amebicida.
- Biorremediação, biosorção e bioconversão de resíduos lignocelulósicos. A biorremediação juntamente com a biosorção constitui um dos assuntos de maior interesse na atualidade, nos quais representantes de vários grupos de fungos são aplicados na descontaminação de ambientes terrestes e aquáticos, devido à capacidade de degradação de substâncias tóxicas e remoção de metais pesados. A bioconversão de resíduos lignocelulósicos possibilita o processo de fermentação sólida, além de contribuir com a degradação desses resíduos, que são gerados em grandes quantidades e devem ser tratados para que não se transformem em problemas ambientais. A literatura traz inúmeros relatos de zigomicetos como,
Cunninghmella bainieri, C. elegans, Syncephalastum racemosum, Absidia
spinosa, Rhizopus stolonifer, Cunninghmella elegans e basidiomicetos como
Chrysosporioum lignorum, Lentinula edodes, Phanerochaete sordida, Pleurotus
ostreatus, Trametes versicolor que atuam na biorremediação de áreas
contaminadas por compostos recalcitrantes, como naftaleno, antraceno, fluoreno, benzopireno, pentaclorofenol e hexaclorbenzeno, na biosorção de metais pesados como Cd+2, Cr2+, Cu+2, Hg+, Pb2+ e Zn2+ e na bioconversão de
- Na agricultura, os fungos têm grande aplicabilidade como no controle de pragas, principalmente de insetos e nematóides. Dentre esses fungos, estão
Metarhizium ansiopliae, utilizado com sucesso para o controle de cigarrinhas
das pastagens, prejudicial às gramíneas forrageiras, cana–de–açúcar e arrozais; Arthrobotrys botryospora, utilizados no controle de nematóides parasitos de animais de produção. A produção de ácido giberélico, por um ascomiceto, tem ação na estimulação do crescimento de plantas, e as micorrizas, típicas associações com raízes, desempenham papel relevante na nutrição vegetal. Os fungos micorrízicos arbusculares (FMA) instalam–se nas raízes de diferentes grupos de plantas, estabelecendo–se, entre ambos, relação simbiótica mutualista. O grande papel desempenhado pelos FMA refere–se à absorção de íons fosfato que se encontram para além da zona alcançada pela raiz. Esses íons, assim como água e outros minerais, são absorvidos pelas hifas e transferidos à planta hospedeira que, em troca, cede fotossintatos ao fungo.
Os fungos distribuem-se ao redor do globo terrestre explorando habitats diversos como solo, plantas e animais vivos ou mortos, ou outros que contenham matéria orgânica passível de degradação (BONONI; GRANDI, 1999). Essa diversidade de ambientes garantiu, evolutivamente, a esses organismos a capacidade de sintetizar uma série de enzimas com diferentes características, possibilitando–lhes o uso da matéria orgânica do meio, como fonte de carbono (GOUKA et al., 1997).
A correlação entre as condições ambientais do nicho ocupado por um determinado microrganismo e as propriedades de suas enzimas é bastante clara. Os organismos termofílicos apresentam algumas adaptações que permitem o seu crescimento sob altas temperaturas. Suas enzimas e outras proteínas são mais estáveis ao calor que aquelas presentes nos organismos mesofílicos e atuam otimamente sob altas temperaturas. A estabilização de componentes celulares como DNA e membranas, de modo que sua funcionalidade seja mantida em condições de temperaturas que seriam danosas para a maioria das biomoléculas dos organismos mesófilos, são
requisitos necessários para a sobrevivência desses organismos em temperaturas acima das mesofílicas (SANTOS et al., 2001).
Organismos termofílicos crescem de maneira ótima em temperaturas entre 45 e 80°C e os hipertermofílicos crescem otimamente entre 80 e 110ºC. Esses organismos produzem enzimas que são ativas em temperaturas entre 60 e 80°C e em geral, são mais termoestáveis que aquelas produzidas por mesofílicos (LEGIN et al., 1997).
II.3. Produção de amilases termoestáveis por microrganismos em Fermentação Submersa (FSm) e Fermentação em Estado Sólido (FES)
Nos últimos anos, a utilização de microrganismos em bioprocessos ganhou importância devido à produção de inúmeras enzimas com características físico-químicas variadas e com excelentes potenciais para aplicação industrial. A capacidade de síntese em grande escala, bem como a facilidade com que são excretadas para o meio externo constitui algumas dessas características (IWASHITA, 2002).
Dentre as amilases sintetizadas pelos fungos, as α-amilases e Glucoamilases são as que aparecem com maiores freqüências (AQUINO, et al, 2001; GUPTA, et al., 2003; KAUR; SATYANARAYANA, 2004; KUNAMNENI, et al., 2005; SILVA, et al., 2005; ASGHAR et al., 2006; EZEJI; BAHL, 2006; NOROUZIAN, et al., 2006). No entanto, a produção de glucoamilases parece ser rara em termofílicos extremos e bactérias hipertermofílicas e archaea. Entre as Glucoamilases produzidas por bactérias termoanaeróbicas, algumas foram purificadas e caracterizadas. Entre elas têm-se Clostridium
thermohydrosulfuricum 39E e Clostridium thermosaccharolyticum apresentando
atividade ótima a 70°C e pH 5,0 (NIEHAUS et al., 1999).
As enzimas termofílicas microbianas são facilmente produzidas em larga escala em função do rápido crescimento dos microrganismos e da grande diversidade de substratos utilizáveis por estes (PRIEST, 1984). Na produção de enzimas por fungos e bactérias, os efeitos da fonte de carbono, além dos fatores físico-químicos, como pH e temperatura, são muito importantes como
fatores de regulação da biossíntese (ALI; HOSSAIN, 1991; GHOSH et al., 1991;
KILIKIAN, 1996).
As enzimas termofílicas ou hipertermofílicas são chamadas termozimas e, além de serem intrinsicamente estáveis e ativas em altas temperaturas, são mais resistentes a desnaturantes químicos como solventes e a altas concentrações de sais. A desnaturação promove o desdobramento da cadeia polipeptídica que mantém sua estrutura primária devido as ligações covalentes (peptídicas). Contudo, a perda da atividade biológica demonstra que a atividade catalítica não é inerente a estrutura primária da proteína, mas resultado do dobramento único da molécula (NELSON; COX, 2002). A presença de sais, o próprio substrato e as chaperoninas que auxiliam no redobramento de proteínas parcialmente desnaturadas também podem contribuir para a estabilização térmica (BRUINS et al., 2001).
A elevada temperatura de sua atuação reduz a viscosidade do meio, permitindo hidrólise enzimática em misturas com altas concentrações de substrato (VIELLE; ZEIKUS, 2001). A possibilidade de se usar enzima sob temperaturas elevadas também diminui o risco de contaminação por microrganismos mesofílicos, que são a maioria na população à temperatura ambiente, além de aumentar a taxa de difusão, solubilidade e reduzir a viscosidade e tensão superficial dos componentes envolvidos num determinado processo (HOUGH; DANSON, 1989; ANTRANIKIAN et al., 1995; NIEHAUS et al., 1999).
Tradicionalmente, as enzimas, incluindo as amilases, são produzidas por fermentação submersa. Nos últimos anos, entretanto, os processos de fermentação em estado sólido, vem sendo cada vez mais utilizados para a produção de enzimas (KUNAMNENI; SINGH, 2005).
A fermentação submersa (FSm) é muito utilizada pois, permite o controle dos parâmetros físico-químicos do processo e apresenta fácil recuperação das enzimas extracelulares, micélio ou esporos. No entanto, os produtos são diluídos e os extratos enzimáticos podem apresentar menor estabilidade
(PANDEY et al., 2000b; ELLAIAH et al., 2002; SANDHYA et al., 2005). Esta consiste
dissolvido e troca de calor são facilmente controlados. Ainda, permite que se evite a repressão catabólica pelo controle da fonte de carbono e retirada do produto (VINIEGRA-GONZÁLEZ et al., 2002). Um dos maiores inconvenientes desse processo é o fato de gerar grandes volumes de resíduos (RAIMBAULT, 1998; ELLAIAH et al., 2002).
Em contrapartida, a fermentação sólida (FES) utiliza sólidos em ausência de água livre entre as partículas, embora o substrato possua suficiente umidade para suportar o crescimento e metabolismo dos microrganismos. Esse processo é mais aplicado para fungos filamentosos, visto que estes microrganismos crescem na superfície da partícula utilizando o oxigênio presente entre elas e, sua estrutura filamentosa permite a penetração no interior com melhor aproveitamento dos nutrientes nela contidos. A interação entre o fungo e o substrato possibilita a decomposição de substratos sólidos. O processo requer baixa energia, produz menos resíduo líquido e agrega valor a resíduos sólidos, principalmente os agrícolas (RAIMBAULT, 1998;
PANDEY, 2002). Por outro lado, o controle dos parâmetros físico-químicos é um
processo mais complexo.
Fontes de carbono fermentável como glicose, amido, lactose ou frutose são obtidas após o processamento de produtos agrícolas. No entanto, elas possuem custo elevado para serem usadas na produção comercial de amilases. Estes produtos podem ser substituídos no meio de fermentação pelos seus produtos agrícolas altamente disponíveis e economicamente viáveis
(GHOSH; CHANDRA, 1984). Os resíduos agrícolas e agroindustriais são
geralmente considerados os melhores substratos para os processos de FES e produção de enzimas. O aparato enzimático confere aos fungos a capacidade de degradar substratos lignocelulósicos como palha de arroz, de trigo e de outros cereais e resíduos agro-industriais como farelo de algodão e de soja, e bagaço de cana-de-açúcar e de laranja, além de serragens de madeiras. Esses resíduos são gerados em grandes quantidades e devem ser tratados de alguma maneira para que não se transformem em problemas ambientais, uma vez que são resíduos de difícil degradação e podem se acumular no ambiente.
O uso da FES para a produção de enzimas e outros produtos tem muitas vantagens em relação à FSm (RAMESH; LONSANE, 1990; PANDEY et al., 2000b). Uma das vantagens citadas com freqüência é que os níveis de concentração de enzimas são maiores em relação à FSm, quando se compara extratos enzimáticos obtidos por uma mesma linhagem. Uma outra vantagem, já mencionada, é o baixo custo. Um estudo realizado por Castilho e colaboradores (2000), comparou a análise econômica dos processos de FES e FSm para a produção de lipases. Nessa análise, foram avaliados parâmetros como investimento de capital total, custo do produto unitário, dos materiais brutos utilizados nos processos fermentativos e dos fermentadores, quantidade de fermentadores e tempo de produção, manutenção dos equipamentos e retorno financeiro do investimento total.
Para uma escala de produção de 100m3 de lipase concentrada por ano,
um investimento de capital total para o processo submerso foi 78% maior do que aquele necessário para o processo de fermentação em estado sólido. A FSm apresentou um custo do produto unitário 68% maior que o preço de venda do produto, enquanto que o produto obtido de FES apresentou um custo 47% menor que o preço de venda. Além do mais, o custo da produção pode variar em função da concentração do produto final, para se obter uma atividade desejada. O produto obtido da FES apresentou um custo 32% menor que o preço de venda quando sua concentração foi aumentada em 40%, enquanto que o produto obtido da FSm, apresentou um custo unitário 10% maior que o preço de venda, uma vez que sua concentração foi diminuída em 40%. Isso mostra que os processos de FES são mais baratos que os processos de FSm. A grande vantagem dos processos de FES é o uso de materiais brutos extremamente baratos como principal substrato.
Em função da grande aplicação das amilases e do aproveitamento de resíduos e subprodutos como substrato para fermentação em estado sólido, foi realizado um trabalho no qual estudou-se a produção de α-amilase e glucoamilase por FES e FSm pelo fungo termofílico Thermomyces lanuginosus TO - 03, cujas características físico-químicas foram avaliadas.
III. OBJETIVOS
1) Estudar e comparar a produção de α-amilase e glucoamilase pelo fungo filamentoso termofílico Thermomyces lanuginosus TO-03 por fermentação submersa e por fermentação em estado sólido.
2) Avaliar o efeito da fonte de carbono, tempo de cultivo e pH do meio sobre a produção da enzima nos dois tipos de fermentação.
3) Estudar as características bioquímicas das enzimas produzidas. 4) Estudar as propriedades das enzimas quando aplicadas na hidrólise de diferentes substratos amiláceos.
IV. MATERIAL E MÉTODOS
IV.1. O microrganismo e a manutenção da cepa
Foi utilizado no experimento, o fungo Thermomyces lanuginosus TO-03, isolado de silagem de milho, em projeto anterior, e que faz parte da coleção de microrganismos do Laboratório de Bioquímica e Microbiologia Aplicada IBILCE/UNESP. A preservação da cultura foi feita por manutenção da cepa em meio Sabouraud inclinado coberto com óleo mineral e água destilada estéreis, em temperatura ambiente.
IV.2. Processos fermentativos e obtenção da enzima
IV.2.1. Fermentação submersa (FSm)
Foi utilizado o meio nutriente conforme descrito por Mandels e Sternberg (1976) com pequena modificação: 0,20% de (NH4)2SO4; 0,01% de
MgSO4.7H2O; 0,5% de extrato de levedura; 0,2% de peptona; 0,1% de
K2HPO4; 0,7% de KH2PO4 e 0,05% de solução de micronutriente (0,1%
FeSO4.7H2O; 0,005% MnSO4. H2O; 0,02% ZnSO4 . 7H2O; 0,005% CaCl2;
0,025% CuSO4 . 5H2O). O pH do meio de cultura foi ajustado a 5,5. A fonte de
carbono, que consistiu de amido solúvel (Reagem) foi acrescentada ao meio nutriente na concentração de 1%.
A fermentação submersa foi realizada em frascos Erlenmeyer de 250mL, contendo 50mL de meio. O material de cada frasco foi inoculado com dois cortes de 1cm2 cada, de cultura miceliada em meio Sabouraud. O cultivo foi realizado a 45°C, 100rpm, por 240 horas. A cada 24h, foi retirado um frasco Erlenmeyer com o material fermentado e este foi filtrado a vácuo, utilizando–se papel Whatman no 1, e o meio de cultivo livre das células foi utilizado como
O crescimento fúngico foi avaliado por quantificação da biomassa seca. A massa micelial obtida pela filtração foi lavada com água gelada e mantida em estufa a 60°C por 48 horas ou até peso constante.
IV.2.2. Fermentação em estado sólido (FES)
A FES ocorreu em frascos Erlenmeyer de 250mL utilizando-se 5g de farelo de trigo, adquirido no comércio local. O material de cada frasco foi inoculado da mesma forma como descrito no item 2.1. Após a inoculação, 11mL de solução nutriente (item 2.1, com exceção do extrato de levedura e peptona), foram adicionados ao frasco de modo a suplementar e hidratar o substrato com nutrientes minerais (umidade de 70%). O cultivo foi feito a 45ºC, durante 10 dias. A cada 24 horas, um frasco foi retirado, ao qual foram adicionados 40mL de água destilada. O material foi homogeneizado e posteriormente ficou sob leve agitação em “shaker” a 100rpm, por 30 minutos. O material foi filtrado com gase e centrifugado a 10000 g durante 10 minutos, a 10ºC. O sobrenadante foi utilizado como solução enzimática bruta.
IV.3. Determinação da atividade enzimática
As atividades das amilases foram investigadas pela quantificação dos açúcares redutores totais e glicose, liberados por hidrólise enzimática do amido e por reação com iodo, para quantificar a atividade dextrinizante sobre a molécula de amido.
IV.3.1. Dosagem da atividade enzimática pela quantificação da glicose liberada (Atividade de Glucoamilase)
A mistura de reação enzimática foi constituída de 0,4mL de solução de maltose (Sigma) ou amido (Hexis) 0,5% em 0,25M de tampão acetato pH 5,0 e 0,1mL de solução enzimática bruta. Após a incubação da mistura de reação a 60°C por 10 minutos, as amostras foram submetidas ao resfriamento em banho de gelo. Dessa mistura de reação, foi tomada uma alíquota de 0,30mL, quando o substrato foi o amido solúvel, e 0,20mL quando o substrato foi a maltose. A
esta alíquota foi acrescentado tampão fosfato 0,2M pH 7,0, até volume final de 0,5mL. A glicose liberada foi quantificada pelo método enzimático peroxidase/glicose-oxidase modificado (BERGMEYER; BERNT, 1974) utilizando Kit comercial (Glicose-Enz-Color/Biodiagnóstica). A leitura foi realizada em 500nm, contra um branco constituído por água destilada e reagente. O sistema foi padronizado por uma curva de concentração molar de glicose.
O controle da reação foi preparado conforme o processo descrito, substituindo-se a enzima por volume equivalente de água destilada (controle do substrato). Um outro controle foi realizado substituindo-se a solução de maltose ou amido por volume de tampão acetato (controle da enzima).
Uma unidade de Glucoamilase (U/mL) foi definida como a quantidade de enzima necessária para liberar 1 µmol de glicose, por minuto, nas condições do ensaio.
IV.3.1.1. Dosagem da atividade de Glucoamilase intracelular
Para quantificar a atividade de glucoamilase intracelular, a massa micelial formada durante o processo fermentativo submerso separada por filtração a vácuo em filtro de papel Whatman no 1, e transferido para tubo falcon
(tarado) com pérolas de vidro. Foram adicionados 4,0 mL de tampão acetato 10mM pH 5,0 (gelado) e agitado em vórtex por 1 minuto. Esse procedimento foi repetido por 3 vezes, intercalando a agitação com o banho de gelo. Após a maceração, o conteúdo foi separado das pérolas de vidro e submetido à centrifugação a 10000g por 5 minutos, a 10 ºC. O sobrenadante foi utilizado para dosar a atividade de Glucoamilase intracelular, seguindo - se o método descrito no item IV. 3.1.
IV.3.2. Dosagem da atividade amilolítica pelo método de coloração com Iodo (Atividade Dextrinizante)
A atividade dextrinizante foi determinada medindo-se a diminuição da capacidade de complexação amido–iodo segundo (MEDDA; CHANDRA, 1980) com algumas modificações.
Neste ensaio, a mistura de reação foi constituída por 0,7mL de solução de amido a 0,3% em tampão acetato 0,2M, pH5,0 e 0,3mL de solução enzimática bruta, convenientemente diluída. As amostras foram incubadas em banho a 60°C por 10 minutos. A reação foi paralisada com 4,0mL de HCl 0,2M e em seguida, 0,5mL de solução de iodo (0,3% KI + 0,03% I2) foi adicionada.
Após a homogeneização, a mistura de reação foi diluída com 10,0 mL de água destilada, novamente homogeneizada. Em seguida foi relizada a leitura a 600nm contra um branco constituído de água destilada.O controle da reação foi preparado conforme o processo descrito, substituindo-se a enzima por volume equivalente de água destilada (controle do substrato). Um outro controle foi realizado substituindo-se a solução de amido por volume de tampão acetato (controle da enzima), considerando a possibilidade da existência de resíduos de amido na mesma.
Uma unidade enzimática amilolítica dextrinizante foi definida como a quantidade de enzima requerida para hidrolisar 1,0 mg de amido por minuto, nas condições do ensaio.
IV.3.3. Dosagem da atividade amilolítica pela quantificação do açúcar redutor liberado (Atividade Sacarificante)
Neste ensaio, a mistura de reação foi constituída por 0,9mL de solução de amido a 0,5% em tampão acetato 0,2M pH 5,0 e 0,1mL de solução enzimática bruta. O controle da reação foi preparado conforme o processo descrito, substituindo-se a enzima por volume equivalente de água destilada (controle do substrato). Um outro controle foi realizado substituindo-se a solução de amido por volume de tampão acetato (controle da enzima).
A mistura de reação foi incubada a 60°C por 10 minutos. A reação foi paralisada pela adição de 1,0 mL de DNS (ácido 3’,5’-dinitrosalicílico), segundo Miller (1959). As amostras foram fervidas em banho de ebulição por 10 minutos, resfriadas em banho de gelo e o volume foi completado para 10 mL com água destilada. A leitura foi realizada em 540 nm contra um branco constituído pelo reagente e água destilada. O sistema foi padronizado por uma curva de concentração molar de glicose.
Uma unidade de atividade amilásica sacarificante foi determinada como a quantidade de enzima necessária para liberar 1 µmol de açúcar redutor por minuto, nas condições de ensaio.
IV.4. Caracterização das enzimas produzidas por fermentações sólida e submersa
IV.4.1. Determinação do pH e temperatura ótimos para as atividades enzimáticas
Para a determinação do pH ótimo para a atividade das enzimas, foram utilizados tampões com pH entre 2,5 a 8,0 (2,5 a 5,5 tampão acetato 0,25M; 5,5 a 7,0 tampão citrato-fosfato 0,25M; 7,0 a 8,0 tampão Tris-HCl 0,25M), seguindo-se o procedimento dos itens IV.3.1 e IV.3.3.
Para a determinação das temperaturas ótimas, as misturas da reação foram incubadas em temperaturas entre 40°C a 85°C, no pH ótimo de atividade das enzimas, por 10 minutos, seguindo–se procedimento dos itens IV.3.1 e IV.3.3.
IV.4.2. Estabilidade da enzima frente às variações de pH e temperatura Para este estudo, foi utilizado o tampão Mcllvaime com pH 3,0 a 8,0, 0,1M e tampão Glicina-NaOH para pH 8,0 a 10,0. Uma alíquota de 0,5mL de solução enzimática bruta foi misturada a 0,5mL de tampão em cada valor de pH, sendo a mistura mantida a 25°C por 24 horas. Após esse período, a atividade residual foi determinada no pH e temperatura ótimos de cada enzima, seguindo–se procedimento do item IV.3.1.
O efeito da temperatura sobre a estabilidade das enzimas foi avaliado incubando–se as soluções enzimáticas, em ausência de substrato, em temperaturas de 40°C a 95°C por uma hora, sendo o controle, a atividade da enzima no início do ensaio. Foi também mantida uma amostra em geladeira (+/- 10°C) por uma hora.
As soluções enzimáticas foram também incubadas em ausência de substrato, a 60°C, sendo retiradas amostras a cada 1 hora, por um período de
8 horas. A atividade residual foi determinada na temperatura e pH ótimos de cada enzima, seguindo–se o procedimento do item IV.3.1.
IV.5. Avaliação da ação das enzimas sobre diferentes substratos amiláceos
Foram realizados experimentos de hidrólise enzimática, utilizando-se diferentes tipos de amido 0,5%: amidos gelatinizados e crús de mandioca, batata e milho, os quais foram doados pelo laboratório de Engenharia e Ciências de Alimentos – IBILCE/UNESP. Foram também utilizados derivados do amido com duas a sete unidades de glicose (maltose, maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose e maltoheptaose - Sigma) e a sacarose, na concentração de 0,2%. A determinação da atividade enzimática sobre esses substratos seguiu o procedimento descrito no item IV.3.1.
As atividades da glucoamilase foram também avaliadas, sobre os substratos sintéticos ρ-nitrofenil α-D-glucopiranosídeo, ρ-nitrofenil β -D-glucopiranosídeo (Sigma). As misturas de reações para os substratos sintéticos foram compostas por 0,2mL de tampão acetato de sódio 0,1M pH 5,0, 0,05mL de solução de ρ-nitrofenil α-D-glucopiranosídeo/ ρ-nitrofenil β -D-glucopiranosídeo 2,0mM e 0,1mL de solução enzimática bruta. Após a incubação das misturas de reação na temperatura ótima da enzima por 10 minutos, estas foram paralisadas com a adição de 1,0mL de Na2CO3 2,0M, e o
nitrofenol liberado, foi quantificado por espectrofotometria a 410 nm utilizando uma curva padrão de p-nitrofenol. Uma unidade de atividade enzimática foi definida como a quantidade de enzima necessária para liberar 1 µmol de ρ -nitrofenol por minuto de reação.
IV.5.1. Análise dos produtos de hidrólise do amido por Cromatografia em Camada Delgada (TLC)
Os produtos de hidrólise do amido solúvel (Reagen) pelas amilases foram avaliados por cromatografia ascendente em camada delgada de sílica, em palcas de 10 x 20cm (DC-Alufolien Kieselgel 60 sem indicador fluorescente, Merck), seguindo a metodologia descrita por Fontana e colaboradores (1988).
A hidrólise enzimática ocorreu pela mistura de 200µL de enzima bruta com 200µL de substrato a 1% em tampão citrato de sódio 100mM, pH 5,5, a 60°C. Alíquotas do hidrolisado foram retiradas a 1, 10, 30 e 60 minutos e fervidas por três minutos. Um volume de 5µL foi aplicado nas placas de sílica. Foram utilizados como padrões, glicose, maltose, maltotriose, maltotetraose, maltopentaose e maltohexaose (Sigma) a 1% (p/v). A solução de corrida foi preparada com n-butanol, etanol e água destilada nas proporções 5:3:2, respectivamente. Após a primeira corrida (± 6h) os cromatogramas foram deixados à temperatura ambiente para secar (± 12h), e então submetidos a uma segunda corrida. As bandas foram reveladas por borrifamento das placas com solução de orcinol 0,2% (p/v) em metanol e ácido sulfúrico nas proporções 9:1, respectivamente, e secadas em estufa bacteriológica a 100°C até o aparecimento das bandas (± 5 minutos).
IV.6. Avaliação dos efeitos de íons na atividade das enzimas
IV.6.1. Efeito da adição de íons Ca2+ à mistura de reação
Para detectar o efeito dos íons Ca+2 nas atividades das enzimas brutas, 10 µL de solução de cloreto de cálcio de 2, 5, 10, 20, 40 e 60 mM foram adicionados à mistura de reação. As amostras foram submetidas aos ensaios para determinar atividades de glucoamilase e α-amilase, descritos anteriormente. O mesmo procedimento foi seguido utilizando–se a solução enzimática bruta dialisada contra tampão acetato 10 mM, pH 5,0.
IV.6.2. Efeito da adição de outros íons à mistura de reação, sobre a atividade das enzimas
Para detectar o efeito de outros íons sobre a atividade das amilases, foi seguido o procedimento descrito no item IV.6.1, porém utilizando–se 50 µL de soluções de NaCl, KCl, BaCl2 x 2H2O, CoCl2, NiCl2 x 6H2O, HgCl2, ZnCl3, CrCl3
x 6H2O, FeCl3 x 6H2O, AlCl3 x 6H2O, MnSO4, Ag2SO4, MgSO4 x 7H2O, CuSO4,
correspondente na mistura de reação. As amostras foram submetidas aos ensaios para glucoamilase e α-amilase, descritos anteriormente. O mesmo procedimento foi seguido utilizando–se a solução enzimática bruta dialisada contra tampão acetato 10 mM, pH 5,0.
IV.6.3.Efeito da adição de EDTA e SDS à mistura de reação
Foram testados também, os efeitos de SDS e do EDTA na concentração de 10 mM, seguindo-se o mesmo procedimento dos itens anteriores.
IV.7. Métodos analíticos
Os teores de açúcares redutores totais foram determinados pelo método colorimétrico de Miller, 1959.
Para a determinação de proteínas extracelulares e intracelulares totais foi utilizado o método de Hartree-Lowry (1972), utilizando soroalbumina bovina como padrão.
O crescimento microbiano foi determinado pela quantificação da biomassa seca e biomassa úmida. Para a obtenção da biomassa seca, o material fermentado foi filtrado a vácuo utilizando papel Whatman no 1 e a biomassa fúngica retida no papel, foi lavada com água destilada e mantida em estufa a 60°C, até peso constante. Para a quantificação da biomassa úmida, utilizou–se a biomassa retida no papel após a filtração a vácuo e lavagem.
V. RESULTADOS E DISCUSSÃO
V.1. Produção de αααα-amilase e glucoamilase pelo fungo T. lanuginosus TO-03 em FSm.
A produção das enzimas por FSm foi realizada com quatro repetições, sendo apresentadas as médias das mesmas (Fig. 3a e 3b).
Para a dosagem da atividade de glucoamilase foram utilizados como substrato de reação o amido solúvel e a maltose. Para a detecção de α-amilase foi utilizado apenas o amido solúvel.
Os dados mostrados na Figura 3a representam a média dos valores encontrados para a produção de glucoamilase e indicam diferenças acentuadas na atuação da enzima, produzida por FSm, sobre a maltose e o amido solúvel, havendo uma maior quantidade de glicose liberada, quando foi utilizado o amido solúvel como substrato. O perfil de atividade ao longo do período fermentativo, também foi diferente, com dois picos de atividade enzimática sobre o amido (96 e 168 h) e apenas um sobre a maltose (168 h). A produção máxima de glucoamilase foi de 27.1 U/mL (reação com amido), e 6.5 U/mL (reação com maltose). Essa diferença pode estar relacionada com o tamanho da molécula do substrato, uma vez que a taxa de hidrólise de ligações
α-1,4 pelas glucoamilases aumenta com o grau de polimerização do substrato, sendo mais eficientes em seqüências maiores que maltopentaose e cerca de cinco vezes menor em maltose do que em amido (MANJUNATH et al., 1983).
A Figura 3b apresenta a média dos valores encontrados para a produção de amilase dextrinizante e sacarificante. Nesta figura, pode–se observar que o pico de atividade dextrinizante ocorreu em 168 h de cultivo e o de atividade sacarificante ocorreu em 216 h. A produção máxima foi de 181,6 U/mL para atividade dextrinizante e 5,0 U/mL para atividade sacarificante.
A comparação das curvas de produção de enzima (Fig. 3a e 3b) e produção de biomassa (Fig. 3d) permite inferir que a secreção das enzimas iniciou ao final da fase de crescimento logarítmico com pico de atividade após o
final da fase log, ou seja, após 72h de cultivo. Os níveis de enzimas começaram a diminuir lentamente, após 168 h, enquanto o teor de biomassa caiu após 72 h de fermentação.
a) 0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264 0 4 8 12 16 20 24 28 At iv id ade GA ex tr acel ul ar (U /mL) At iv id ade Especí fica ( U /mg pr ot. ) Tempo de Cultivo (h) b) 0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264 0 5 10 50 100 150 200 A tiv idad e am ila se (U /mL) Tempo de cultivo (h) c) 0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 va lo re s p H Tempo de Cultivo (h) 0 50 100 150 400 800 1200 Aç úc ar r edutor ( ug/mL) d) 0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Biom as sa S eca (m g/mL ) Tempo de cultivo (h) 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 P rot eí na s Tot ai s ( m g/ m L )
Figura 3. Produção de glucoamilase e α-amilase por T. lanuginosus TO-03 em FSm. a) (■)-atividade Glucoamilase extracelular sobre amido solúvel; (□)–atividade Glucoamilase extracelular sobre maltose; (∇)-atividade glucoamilase extracelular (U/mg proteína); b) atividade amilásica dextrinizante (●) e sacarificante (○); c) (▼) – açúcar redutor (mg/mL); (♦) – variação do pH no meio em FSm; d) (●) Biomassa seca (mg/mL) e (▲) Proteínas Extracelulares Totais (mg/mL).
a) 0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264 0 5 10 15 20 25 30 40 50 60 A tiv . G lu co am . ( U /g ; mg ) Tempo de Cultivo (h) b) 0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264 0 2 4 6 8 15 20 25 30 35 40 cr es ci m ent o m ic el ial ( m g) Tempo de Cultivo (h)
Figura 4. Avaliação da produção de glucoamilase intra e extracelular pelo T. lanuginosus TO-03 em FSm. a) (▲) – atividade glucoamilase intracelular (U/mg proteína celular total); (●) – atividade glucoamilase intracelular (U/g biomassa seca); b) (■) – peso úmido (mg/mL do meio); (●) = peso seco (mg/g peso seco); (▲) proteína celular total (mg).
A diminuição nos níveis de atividade enzimática e de proteínas extracelulares totais (Fig. 3a, 3b, 3d) pode estar relacionada à desnaturação das enzimas, causada pela interação com outros componentes do meio, ação de proteases ou ainda pela desnaturação térmica, ao serem mantidas a 45 °C por vários dias (RAMACHANDRAN et al., 2004).
Os dados apresentados diferem daqueles relatados para A. niger e de outros presentes na literatura, nos quais a secreção de glucoamilase e produção de proteína total ocorreram na fase de crescimento logarítmico
(KILIKIAN, 1996; JIN et al., 1999; PAPAGIANNI; MOO-YUNG, 2002;STAMFORD et al.,
2002; AALBAEK et al., 2002; SONI et al., 2003; KAUR; SATYANARAYANA, 2004). Carlsen e colaboradores (1996) observaram que a produção específica de α -amilase estava associada ao crescimento do fungo, sugerindo que o crescimento do micélio é crucial para a alta produção de proteínas extracelulares.
Além dos ensaios para a detecção de α-amilase e glucoamilase extracelulares foram também realizados ensaios para a medida de atividade de glucoamilase intracelular.
Quando avaliado em termos de proteína intracelular, o crescimento fúngico alcançou um máximo à 48h (Fig. 4b). A proteína acumulada na hifa durante a fase log foi então liberada ou degradada após 72h de fermentação. Quando a biomassa úmida foi o parâmetro para medir a taxa de crescimento o pico ocorreu entre 48 e 72h. Entretanto, quando o crescimento foi avaliado com base no peso seco, o pico foi observado em 72h (Fig. 3d e 4b). Enquanto a queda na biomassa úmida e proteína foram significativas a 96 h (mais de 50%), o peso seco diminuiu apenas 25%. A diminuição no conteúdo de proteína celular total não foi correlacionada com um aumento na proteína do meio (figura 3d). Para comparar a atividade de glucoamilase extracelular e intracelular, a quantidade de enzima foi expressa em unidades por grama de massa seca e unidades por proteína total (mg) no meio e na célula, respectivamente. Ambas as produções de glucoamilase extracelular e intracelular exibiram dois picos (Fig. 3a e 4a). O primeiro pico de glucoamilase intracelular ocorreu em 72h de crescimento diminuindo para um mínimo até
96h, exatamente quando o primeiro pico de glucoamilase ocorreu. O mesmo foi observado para o segundo pico: a glucoamilase intracelular atingiu o pico em 168h e a glucoamilase extracelular em 192h de fermentação, quando a atividade celular foi diminuindo. Esses dados sugerem um controle coordenado de ativação e secreção de glucoamilase associada à célula, durante todo processo fermentativo. Uma vez que o método usado para extração de proteína celular não permite separar a enzima presente no citoplasma da enzima associada com a parede celular, não é possível inferir que haja um mecanismo de ativação da enzima nos compartimentos intracelular ou periplasmático. É possível que a síntese proteica ocorra na fase estacionária, portanto, a suposição da modificação pós-tradução efetuando a ativação da enzima associada à célula e sua secreção pode então explicar o padrão observado.
Esses resultados não poderiam ser atribuídos à ruptura da hifa ou ação proteolítica, uma vez que a hifa continuou intacta até 168 h, segundo análise microscópica, e a atividade de protease não foi encontrada significativamente no meio (dados não mostrados). Esses dados demonstraram que a avaliação do crescimento fúngico pela medida de proteína celular pode não ser precisa em todos os casos.
Dois picos de glucoamilase extracelular (Fig. 3a) e associada à célula (Fig. 4a), sugerem a presença de isoformas. A maioria dos estudos de isoformas de glucoamilase tem sido realizada apenas com enzimas extracelulares. Dados de glucoamilase obtidas de espécies de Aspergillus mostraram que a existência de isoformas estava associada principalmente ao processamento pós–tradução de enzimas no meio de cultura por proteases ou por desglicosilação (PASZCZYNSKI et al., 1985; NEUSTROEV et al., 1993;
NASCIMENTO et al., 1998; DUBEY et al., 2000; SUTTHIRAK et al., 2005), embora a
síntese de diferentes mRNA derivados de um transcrito primário tem sido considerada (BOEL et al, 1984). glucoamilases fúngicas são geralmente, glicoproteínas com conteúdo de carboidratos que varia entre 5 e 20%. Estas enzimas possuem regiões ricas em treonina e serina que são ideais para O – glicosilação (SAHA; ZEIKUS, 1989; JAMES; LEE, 1997). A glicosilação confere as
