HECTOR HENRIQUE FERREIRA KOOLEN
APLICAÇÕES DE MOBILIDADE IÔNICA E ESPECTROMETRIA DE MASSAS EM MISTURAS COMPLEXAS: PROTEÔMICA E PETROLEÔMICA
CAMPINAS 2015
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
HECTOR HENRIQUE FERREIRA KOOLEN
APLICAÇÕES DE MOBILIDADE IÔNICA E ESPECTROMETRIA DE MASSAS EM MISTURAS COMPLEXAS: PROTEÔMICA E PETROLEÔMICA
ORIENTADOR: PROF. DR. FÁBIO CESAR GOZZO
TESE DE DOUTORADO APRESENTADA AO INSTITUTO DE QUÍMICA DA UNICAMP PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE DOUTOR EM CIÊNCIAS.
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA POR HECTOR HENRIQUE FERREIRA KOOLEN, E ORIENTADA PELO PROF.DR. FÁBIO CESAR GOZZO.
______________________ Assinatura do Orientador
CAMPINAS 2015
Biblioteca do Instituto de Química
Simone Lucas Gonçalves de Oliveira - CRB 8/8144
Koolen, Hector Henrique Ferreira,
K837a KooAplicações de mobilidade iônica e espectrometria de massas em misturas complexas : proteômica e petroleômica / Hector Henrique Ferreira Koolen. – Campinas, SP : [s.n.], 2015.
KooOrientador: Fábio Cesar Gozzo.
KooTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química.
Koo1. Espectrometria de massas. 2. Ligação cruzada. 3. Asfaltenos. I. Gozzo, Fábio Cesar. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Química. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Applications of ion mobility and mass spectrometry in complex
mixtures : proteomics and petroleomics
Palavras-chave em inglês:
Mass spectrometry Cross-linking Asphaltenes
Área de concentração: Química Orgânica Titulação: Doutor em Ciências
Banca examinadora:
Fábio Cesar Gozzo [Orientador] Luiz Alberto Beraldo de Moraes Norberto Peporine Lopes Marcos Nogueira Eberlin Marco Aurélio Zezzi Arruda
Data de defesa: 02-02-2015
Programa de Pós-Graduação: Química
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“O pensamento racional é linear, ao passo que a consciência ecológica decorre de uma intuição de sistemas não-lineares. Uma das coisas mais difíceis de serem entendidas pelas pessoas em nossa cultura é o fato de que se fazemos algo bom, continuar a fazê-lo não será necessariamente melhor.”
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Ao Professor Fabio Cesar Gozzo pela orientação e ensinamentos durante esta importante etapa.
A minha família que sempre acreditou em mim, e que fizeram de tudo para que este doutorado fosse possível. A minha querida mãezinha Isabel (in memorium). Ao meu pai Henk por ser um exemplo de vida pra mim. A minha namorada Giovana Bataglion por todo apoio durante esta importante etapa.
Aos amigos que fiz em Campinas e que levarei comigo para o resto da vida: Alex, Clécio, Dri, Giovana, Renan, Nicolas, Jandyson e Thiago Neves, sem vocês esta passagem não teria sido tão divertida.
Aos professores da UFAM: Afonso de Souza, Antonia de Souza e Maria Lúcia Belém Pinheiro pelos valiosos ensinamentos e conselhos durante minha formação tanto pessoal como profissional.
Aos colegas do grupo Dalton pela boa convivência: André, Adriana, Állan, Elidiane, Hugo, Luana, Marcel, Mari, Mauro, e Tati.
Ao professor Christopher Michael Reddy do Massachusets Intitute of Technology/Wood Hole Oceanographic Institution joint program pela oportunidade do estágio de sanduíche e pelos ensinamentos que moldaram minha formação como Doutor. Agradeço ao Robert Nelson pelos ensinamentos em GCxGC e ao grande amigo Robert Swarthout por toda ajuda.
Ao professor Marcos Eberlin do laboratório ThoMSon por sempre colaborar com o nosso grupo.
Aos funcionários da Comissão de Pós-Graduação do Instituto de Química, especialmente, a Bel por ser um exemplo de competência.
Agradeço ao Instituto de Química por proporcionar aos seus alunos uma excelente infraestrutura para o ensino e pesquisa.
Agradeço a Capes pela bolsa concedida.
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Hector Henrique Ferreira Koolen
Data de nascimento: 14/09/1986 Endereço eletrônico: hectorkoolen@gmail.com
1. Formação Acadêmica
Ago/2011 - Fev/2015 Doutorado em Ciências (Química Orgânica)
Título: “Aplicação de mobilidade iônica e espectrometria de
massas em amostras complexas: Proteômica e Petroleômica”
Instituto de Química - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Campinas, SP
Orientador: Prof. Dr. Fabio Cesar Gozzo Agência Financiadora: Capes
Mai/2014 - Nov/2013 Estágio de Doutorado (Sanduíche no Exterior)
Título: “Integrative approach in mass spectrometry for
environmental studies”
Woods Hole Oceanographic Institution, Massachussets Institute of Technology (MIT), Falmouth, USA.
Supervisor: Prof. Dr. Christopher Michael Reddy Agência Financiadora: Capes (PDSE)
Mar/2009 - Mar/2011 Mestrado em Química Orgânica
Título: “Metabolismo secundário de fungos endofíticos associados
às plantas Strychnos cf. toxifera e (Loganiaeceae) e Mauritia flexuosa (Arecaceae)”
Universidade Federal do Amazonas (UFAM), Manaus, AM Orientador: Prof. Dr. Afonso Duarte Leão de Souza Agência Financiadora: CNPq
Mar/2005 - Dez/2008 Bacharelado em Química
Universidade Federal do Amazonas (UFAM), Manaus, AM
Título: “Transformações microbianas de substâncias bioativas da
Amazônia”
Orientador: Profª. Drª. Ana Lúcia Queiroz de Assis Galotta Agência Financiadora: CNPq
2. Produção Científica
xiv CID and ECD fragmentation studies. Journal of the American Society for Mass
Spectrometry, 25, 1181-1191, 2014.
• SILVA, F.M.A.; SOUZA, A.D.L.; KOOLEN, H.H.F.; BARISON, A.; VENDRAMIN, M.; COSTA, E.V.; FERREIRA, A.G.; PINHEIRO, M.L.B. ra E. ; Costa, Emmanoel V. ; Ferreira, Antonio G. ; Pinheiro, Maria Lúcia B. . Phytochemical study of the alkaloidal fractions of Unonopsis duckei R. E. Fr. guided by ESI-IT-MSn. Phytochemical Analysis, 25, 45-49, 2014.
• BARBOSA, H.S.; SOUZA, D.L.Q.; KOOLEN, H.H.F.; GOZZO, F.C.; ARRUDA, M.A.Z. Sample preparation focusing on plant proteomics: extraction, evaluation and identification of proteins from sunflower seeds. Analytical Methods, 5, 116-123, 2013.
• KOOLEN, H.H.F.; SILVA, F.M.A.; GOZZO, F.C.; SOUZA, A.Q.L.; SOUZA, A.D.L. Antioxidant, Antimicrobial Activities and Characterization of Phenolic Compounds from Buriti (Mauritia flexuosa L. f.) by UPLC-ESI-MS/MS. Food Research International, 51, 467-473, 2013.
• KOOLEN, H.H.F.; MENEZES, L.S.; SOUZA, M.P.; SILVA, F.M.A.; ALMEIDA, F.G.O.; SOUZA, A.Q.L.; NEPEL, A.; BARISON, A.; SILVA, F.H.; SOUZA, A.D.L. Talaroxanthone, a Novel Xanthone Dimer from the Endophytic Fungus Talaromyces sp. Associated with Duguetia stelechantha (Diels) R. E. Fries. Journal of the Brazilian Chemical Society, 24, 880-883, 2013.
• COSTA, T.O.G.; ALMEIDA, R.A.; MELO, J.T.; KOOLEN, H.H.F.; SILVA, F.M.A.; LEITE, J.R. S.A.; PRATES, M.V.; BLOCH JR, C.; PINTO, A.C. Isolation and amino acid sequencing by MALDI-TOF-MS/MS of a novel antimicrobial anionic peptide from the skin secretion of Osteocephalus taurinus (Anura, Hylidae). Journal of the Brazilian Chemical Society, 23, 2133-2136, 2012.
3. Experiência Didática
• Participação no Programa de Estágio Docente (PED) do Instituto de Química da UNICAMP, nível C, na disciplina QO427 - Química Orgânica I (Teórica).
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Aplicações de mobilidade iônica e espectrometria de massas em
misturas complexas: Proteômica e Petroleômica
A espectrometria de massas (MS) consiste no estudo de íons na fase gasosa. O grande salto na utilização da MS é devido ao desenvolvimento dos métodos de ionização por eletrospray (ESI), por J. B. Fenn e ionização/dessorção a laser auxiliada por matriz (MALDI) por M. Karas e F. Hillenkamp no final da década de 80. Desenvolvimentos que permitiram a criação de novos equipamentos, expandindo em muito a capacidade de análise da técnica. Misturas complexas constituem um desafio até hoje, onde diversas técnicas são empregadas com o objetivo de se entender a constituição destas matrizes. Neste contexto a MS vêm sendo aplicada em conjunto com a mobilidade iônica (IM) em estudos com diversos analitos, como por exemplo, em proteômica e petroleômica. Este trabalho é constituído por dois capítulos, onde na primeira parte as técnicas foram utilizadas em experimentos de proteômica estrutural por meio de ligação cruzada. Estudos Fundamentais foram conduzidos de modo a serem exploradas as misturas complexas de peptídeos provenientes de experimentos utilizando-se uma classe pouco explorada de reagentes de ligação cruzada: os imidoésteres. Para o segundo capítulo a mesmas técnicas foram utilizadas nas análises da fração asfaltênica de petróleos brasileiros. A simplificação das amostras aliada a caracterização estrutural destes compostos por meio de suas seções de choque de colisão (CCS) constituíram a estratégia de análise para este capítulo.
Como resultados da primeira parte têm-se o estabelecimento das rotas de fragmentação de peptídeos modificados pelo reagente de ligação cruzada dimetil suberoimidato e a aplicação do mesmo em experimentos com sistemas proteicos reais. A IM foi utilizada de modo a serem separadas as espécies geradas após os experimentos. Os peptídeos não modificados por meio de seus estados de carga foram separados, o que possibilitou uma rápida simplificação desta mistura. Como resultados da segunda parte desta tese, a IM foi empregada na caracterização das CCS de compostos modelo de asfaltenos e posteriormente em íons representativos da fração de asfaltenos. Os resultados foram validados mediante cálculos teóricos e espectrometria de massas de ultra-alta resolução. Os dados obtidos vão de encontro com os modelos de estruturas de arquitetura do tipo ilha previstos no modelo de Yen-Mullins. A abordagem utilizada nesta tese constitui o primeiro estudo estrutural de asfaltenos usando-se estas técnicas combinadas em MS.
xvii
Applications of ion mobility and mass spectrometry in complex
mixtures: Proteomics and Petroleomics
Mass spectrometry (MS) constitutes the study of ions in the gas-phase, being the structural elucidation the main application of MS. With the development of ionization techniques such as electrospray (ESI), by J. B. Fenn and matrix assisted laser desorption by M. Karas and F. Hillenkamp in the later 80’s allowed the development of new instruments, providing an expansion of the array of analytes suitable for MS analysis. Complex mixtures constitute a challenge nowadays, where diverse techniques are employed with the objective of understanding the chemical composition of such matrixes. In this sense MS have been used along with ion mobility (IM) in the study of different analytes (e.g. in Proteomics and Petroleomics).
This works comprises two chapters, where in the first one the techniques were applied in structural proteomics by means of chemical cross-linking experiments. Fundamental studies were carried to explore complex mixtures of tryptic peptides after experiments with imidoesters reagents. For the second chapter the same techniques were applied in the analysis of the polar fraction of Brazilian petroleum’s (asphaltenes), where beyond separations an structural study was carried out to verify the existing models regarding asphaltene structure.
As results of the chapter 1 the behavior at the gas-phase of the peptides upon dissociation techniques was elucidated (fragmentation studies). The validation of imidates as cross-linking reagents was performed to real proteins. IM was applied to separate different charge states created by the modified peptides generated by the imidate reagent. As results from the second chapter IM was successfully applied, were the comparison with model compounds was done employing also other MS techniques such as ultra-high resolution (UHR) MS. The findings of this chapter reinforce the Yen-Mullins model that describes asphaltenes as compounds possessing island structures.
xix ... 1 1. Introdução Geral ... 1 1.1. Espectrometria de Massas ... 2 1.2. Espectrometria de Mobilidade Iônica
Capítulo 1. Estudos de mobilidade iônica e fragmentação na fase gasosa em proteômica ... 9 estrutural: Uso de agentes de ligação cruzada do tipo imidoéster.
... 11 2.1. Introdução
... 11 2.1.1. Proteínas e complexos proteicos
... 13 2.1.2. Técnicas Tradicionais em Proteômica Estrutural
... 14 2.1.3. Espectrometria de Massas aplicada a Proteômica
... 15 2.1.4. Reação por Ligação Cruzada e Espectrometria de Massas
... 16 2.1.5. Imidoésteres como Agentes de Ligação Cruzada
.. 21 2.1.6. Análise de peptídeos por Dissociação Induzida por Colisão (CID) 2.1.7. Análise de peptídeos por Captura e Transferência de Elétrons
... 39 (ECD/ETD) ... 27 2.2. Objetivos ... 29 2.3. Procedimento Experimental ... 29 2.3.1. Reagentes ... 29 2.3.2. Reação do DSS e DMS com peptídeos modelo
... 30 2.3.3. Reação do DMS com as proteínas
... 31 2.3.4. Análise por MS
... 32 2.3.5. Análises de LC-MS
... 32 2.3.6. Identificação dos produtos de ligação cruzada
... 33 2.3.7. Experimentos de mobilidade iônica
... 35 2.4. Resultados e Discussão
2.4.1. Monitoramento da reação de ligação cruzada frente a peptídeos ... 35 sintéticos por ESI(+)-QTOF-MS utilizando-se sais de imidoésteres
... 41 2.4.2. Estados de carga em peptídeos modificados com amidinas
xx ... 46 2.4.4. Formação de espécies intermoleculares e fragmentação por CID
... 51 2.4.5. Fragmentação de espécies intramoleculares por ETD e ECD
... 54 2.4.6. Fragmentação de espécies intermoleculares por ECD
2.4.7. Análise por LC-MS/MS de ligação cruzada com DMS em anidrase ... 56 carbônica II
... 59 2.4.8. Análises por TWIM-MS
... 65 2.5. Conclusões
Capítulo 2. Abordagem integrativa em Espectrometria de Massas e Mobilidade Iônica: ... 67 Caracterização estrutural de asfaltenos e o modelo Yen-Mullins.
... 69 3.1. Introdução ... 69 3.1.1. Petróleo ... 70 3.1.2. Asfaltenos ... 73 3.1.3. Espectrometria de Massas aplicada a Petroleômica
... 76 3.1.4. Espectrometria de massas na caracterização de Asfaltenos
... 81 3.2. Objetivos ... 83 3.3. Procedimento experimental ... 83 3.3.1. Reagentes ... 83 3.3.2. Obtenção das frações de asfaltenos
... 84 3.3.3. Preparo das amostras carbonáceas
... 84 3.3.4. Análises por LDI-MS
... 89 3.3.5. Análises por UHR-MS
... 86 3.3.6. Análises por TWIM-MS
... 86 3.3.7. Cálculos teóricos de otimização estrutural
... 86 3.3.8. Cálculos de CCS teóricos
... 87 3.3.9. Análises por GC-MS em pirólises de asfaltenos
... 89 3.4. Resultados e discussão
... 89 3.4.1. Formação de agregados de asfaltenos em LDI e MALDI
... 92 3.4.2. Medida da massa molecular médio por LDI-MS
xxi ... 116 3.4.5. Análises por APPI-UHR-MS dos asfaltenos
... 119 3.4.6. Análise dos asfaltenos por pirólise-GC-HRMS
... 122 3.4.7. Calibração da cela de TWIM-MS para cálculos de CCS
. 125 3.4.8. Medidas experimentais e teóricas de CCS de compostos modelo 3.4.9. Medidas teóricas de CCS para compostos gerados hipotéticamente a
... 132 partir de modelos de asfaltenos
... 143 3.5. Conclusões
xxiii Figura 1. IM-MS permite a separação de espécies com m/z coincidentes: Separação de agrômeros e confórmeros por ordem oligomérica e conformacional, respectivamente. 4 Figura 2. Esquematização do movimento de íons na cela de TWIM. ... 5 Figura 3. (A) Esquema do SRIG. (B) Deformação do campo causado pela RF. (C) Anéis defasados em 90°. ... 6 Figura 4. Representação esquemática do instrumento SynaptTM HDMS da Waters. .... 7 Figura 5. Representação do complexo proteico PE/PPE de Mycobacterium tuberculosis, bem como indicação dos sítios de interação das proteínas no complexo[41]. ... 12 Figura 6. Representação esquemática de um experimento típico de ligação cruzada com análise por MS para obtenção de dados estruturais de proteínas na forma de restrições espaciais de distância. 1) Reação da proteína alvo com o ALC desejado; 2) Digestão enzimática da proteína modificada, de forma a gerar peptídeos modificados e não-modificados; 3) Análise da mistura de peptídeos por LC-MS/MS, visando identificar os peptídeos modificados pelo ALC para formar espécies de ligação. 4) Agrupamento das restrições de distância obtidas pelo experimento e desenho de um mapa de ligações cruzadas. 5) Uso do conjunto de restrições de distância na determinação de modelos estruturais compatíveis para a proteína alvo. ... 16 Figura 7. Estrutura geral de ésteres de NHS. ... 17 Figura 8. Estrutura do ALC dimetil suberoimidato (DMS) utilizado neste trabalho. ... 18 Figura 9. Espécies após reações de grupos -amino de resíduos de lisina de um ou mais peptídeos com DSS (esquerda, azul) ou DMS (direita, vermelho) ALC. Dependendo de onde os resíduos de lisina estejam localizados: na mesma cadeia intramoleculares (XLINTRA), em diferentes intermoleculares (XLINTER) e em apenas um dos grupos é
denominada dead-end (DE). . ... 20 Figura 10. Ilustração do processo de CID. A energia cinética do íon precursor, após colisão com o gás inerte, é convertida em energia interna e ocorre a fragmentação. .. 21 Figura 11. Esquema da fragmentação em um peptídeo hipotético ASAYK por CID[69].23 Figura 12. Proposta do mecanismo de fragmentação para o peptídeo hipotético ASAYK (+3) por ECD e ETD[78,79]. Após a captura/transferência do elétron, uma clivagem homolítica deve ocorrer, levando a dissociação da ligação αCH-NH. Este tipo de dissociação só é possível em íons multiplamente carregados uma vez que a captura/transferência leva a uma neutralização parcial do precursor. ... 25 Figura 13. Representação esquemática das etapas reacionais para se obter peptídeos com ligação cruzada intramolecular pelo DMS e digestão enzimática de modo a se obter espécies intermoleculares... 30 Figura 14. Espectros de ESI(+)-QTOF-MS para P2 e P5 após reação com DMS por 2 h. ... 36 Figura 15. Espectro de ESI(+)-QTOF-MS para os peptídeos P18 e P19 com tempo reacional de 5 h. ... 36 Figura 16. Ampliação do espectro de MS para o peptídeo 19 após reação com DMS por 5 h na faixa de m/z de 655 a 720. Esquematização do duplo dead-end formado. ... 38
xxiv Figura 18. Simulações dos padrões isotópicos do peptídeo 5 reagido com DMS e DSS utilizando a ferramenta Isotope model do software MassLynx v.4.1 e intensidades observadas para uma mistura equimolar de peptídeos reagidos separadamente com DMS e DSS e as respectivas intensidades relativas para uma concentração cinco vezes maior de peptídeos reagidos com DSS. ... 40 Figura 19. Comparação entre os estados de carga para o peptídeo 2 e o mesmo reagido com DMS. ... 41 Figura 20. Comparativo para as distribuições de estados de carga em espécies do tipo intramoleculares após reação com DMS e DSS. ... 43 Figura 21. Espectros de ESI(+)-QTOF-MS/MS deconvoluídos para as espécies intramoleculares referentes aos peptídeos sintéticos P2, P5 e P19 respectivamente. Os íons assinalados com um asterisco correspondem a fragmentos de uma cadeia peptídica convencional acrescidos de 136 Da referentes a massa da modificação de ligação cruzada. ... 45 Figura 22. Mecanismos de fragmentação por ECD/ETD e CID propostos para espécies intramoleculares do P2 após reação com DMS. Em fragmentações envolvendo elétrons não acontece a dissociação da porção cíclica. Em CID, a fragmentação ocorre linearmente até a porção cíclica, gerando íons b (oxazolonas) e y. A clivagem da ligação amidina e formação de uma cetimina levam a formação de íons b e y acíclicos e a fragmentação ocorre de forma convencional, onde o ALC atua como uma modificação fixa no resíduo de lisina. Alternativamente é proposto um rearranjo no anel oxazolona levando a formação de um acílio, que após a respectiva perda de monóxido de carbono leva a formação de íons a. ... 46 Figura 23. Formação de espécies intermoleculares a partir dos peptídeos P2 e Px. As m/z ilustradas aqui são referentes a utilização de DMS como ALC. ... 47 Figura 24. Estruturas das espécies isóbaras do tipo dead-end e intermolecular possíveis de se obter pelo procedimento de digestão enzimática do peptídeo P2. ... 48 Figura 25. Espectros de ESI(+)-QTOF-MS/MS das espécies intermoleculares formadas a partir dos peptídeos P2, P3 e P18 respectivamente após digestão enzimática com tripsina. ... 51 Figura 26. Espectros de ESI(+)-Orbitrap-ETD-MS/MS para a espécie intramolecular formada após reação com DMS o (A) e o peptídeo intacto (B). ... 52 Figura 27. Espectros de ESI(+)-FTICR-ECD-MS/MS para as espécies intramoleculares de P2 (A) e P5 (B). ... 54 Figura 28. Ampliações de m/z 50-650 e de m/z 600-1300 refentes ao espectro de ESI(+)-FTICR-ECD-MS/MS para a espécie intermolecular de P3. ... 55 Figura 29. Ampliação de m/z 100-800 refente ao espectro de ESI(+)-FTICR-ECD-MS/MS para a espécie intermolecular reagida apenas nas lisinas para Px. ... 56 Figura 30. Estrutura tridimensional da anidrase carbônica II bovina por difração de raios-X76. ... 57
xxv Figura 32. Mapa de superfície baseado na estrutura cristalina da anidrase carbônica II, indicando a ligação cruzada entre K36 e K76. ... 59 Figura 33. Espectros de MALDI-MS para as espécies intermoleculares formadas para os peptídeos P2, P3, P18 e P19 respectivamente. ... 60 Figura 34. Espectro de massas por ESI(+)-QTOF da mistura entre os as espécies intermoleculares geradas após reação com DMS e os peptídeos trípticos adicionados como interferentes na amostra... 61 Figura 35. Mapa das mobilidades iônicas VS. m/z da mistura entre produtos de reação de ligação cruzada e os digestos trípticos utilizados como interferentes. ... 62 Figura 36. Ampliação na região em torno de m/z 464 do Mapa das mobilidades iônicas VS. m/z e ampliação do espectro de MS para a espécie intermolecular do P3 com quatro cargas. As marcações com asteriscos são referentes às mobilidades da espécie intermolecular. ... 63 Figura 37. Ampliação na região em torno de m/z 390 do Mapa das mobilidades iônicas VS. m/z e ampliação do espectro de MS para a espécie intermolecular do P2 com quatro cargas. As marcações com asteriscos são referentes às mobilidades da espécie intermolecular. ... 64 Figura 38. Tubulações em que a instabilidade dos asfaltenos na amostra de óleo cru levou ao entupimento dos oleodutos. ... 70 Figura 39. Modelo Yen-Mullins onde é observado a estrutura teórica básica de um asfalteno, e as estruturas observadas de nanoagregados (∼ 2,5 nm) e agregados (∼ 5,0 nm). ... 71 Figura 40. Estruturas das arquiteturas mais comuns em asfaltenos. (A) Arquitetura em forma de ilha. (B) Arquitetura em forma de arquipélago. ... 72 Figura 41. Espectro de massas por ESI(+)-FT-ICR de uma amostra de petróleo e seu respectivo gráfico de Kendrick. BDE (Equivalentes de ligação dupla) indica o número de instaurações para uma classe de composto orgânico (heteroátomos presentes e número de anéis). A estrutura do carbazol de fórmula C12H9N, quando calculado possuí DBE=9.
... 74 Figura 42. Mistura complexa não resolvida (UCM) na primeira dimensão e ampliação em duas dimensões de uma amostra de petróleo hidrotermal, indicando a co-eluição na primeira dimensão de hidrocarbonetos esteranos triaromáticos, hopanos e esteranos simples e suas respectivas separações na segunda dimensão[131]. ... 76 Figura 43. Esquematização da técnica de L2MS e contraste de análises de LDI com diversas intensidades de laser versus L2MS. ... 77 Figura 44. Diferenças para uma mesma região do espectro de IM-MS de diferentes petróleos e os respectivos mapas de contorno da isoabudância em cada classe de heteroátomos comparando-se o 3 petróleos[135]. ... 79 Figura 45. Espectros de LDI(+)-QTOF-MS sobrepostos para os asfaltenos de APet1. Em vermelho com energia de colisão na cela Trap de 80 eV e em verde sem energia de colisão. ... 89
xxvi Figura 47. Espectros de MALDI(+)-QTOF-MS dos asfaltenos precipitados de Pet1 utilizando-se: (A) ácido gentísico. (B) 9-aminoacridimina. (C) ditranol. (D) ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico. ... 91 Figura 48. Espectro de LDI(+)-QTOF-MS para os diferentes métodos de extração de asfaltenos empregados, para Pet2. ... 93 Figura 49. Espectros de LDI(+)-QTOF-MS das frações obtidas pela precipitação de asfaltenos segundo a norma a partir da amostra de óleo bruto P1 e suas respectivas ampliações na m/z 50 - 1000. (A) Óleo bruto. (B) Maltenos. (C) Resinas. (D) Asfaltenos. ... 96 Figura 50. Espectro de LDI(+)-QTOF-MS do material carbonáceo de folhelho extraído com tolueno do mineral de folhelho. ... 97 Figura 51. Espectro de LDI(+)-QTOF-MS do carvão mineral e principais fulerenos encontrados. ... 98 Figura 52. Ampliações de m/z 50 - 1000 dos Espectros de LDI(+)-Q-TWIM-TOF-MS para os óleos brutos Pet1 (verde) e Pet3 (vermelho) e o comparativo entre as projeções de mobilidades das amostras na faixa de m/z 50-3000. ... 100 Figura 53. Ampliações de m/z 50 - 1000 dos Espectros de LDI(+)-Q-TWIM-TOF-MS. para as frações de maltenos de P1 (verde) e P3 (vermelho) e o comparativo entre as projeções de mobilidades das amostras na faixa de m/z 50-3000. ... 101 Figura 54. Projeções bidimensionais de dT por m/z. do trabalho prévio de Becker et al[161]
(A) Fração de asfaltenos proveniente um petróleo Americano. (B) Óleo deasfaltado (DAO). O comparativo entre os asfaltenos e o DAO é apresentado no gráfico à direita.102 Figura 55. Projeções bidimensionais de dT por m/z na faixa de 50-3000 para as amostras
APet1 e APet3 por LDI(+)-Q-TWIM-TOF-MS. ... 103 Figura 56. Projeção bidimensional de d por m/z na faixa de 50-3000 obtido por APCI(+)-Q-TWIM-TOF-MS para a amostra APet3. ... 104 Figura 57. Ampliações de m/z 50 - 1000 dos Espectros de LDI(+)-Q-TWIM-TOF-MS para as frações de asfaltenos de APet1 (verde) e APet3 (vermelho) e o comparativo entre as projeções de mobilidades das amostras na faixa de m/z 50-3000. ... 106 Figura 58. Sobreposições das ATD para íons na m/z 540 das amostras APet1 e Apet3. ... 106 Figura 59. Ampliações de m/z 50 - 1000 dos Espectros de LDI(+)-Q-TWIM-TOF-MS para as frações de asfaltenos de Pet1 (verde) e APet1 (vermelho) e o comparativo entre as projeções de mobilidades das amostras na faixa de m/z 50-3000. ... 107 Figura 60. Séries homólogas espaçadas por 14 Da (CH2) observadas na projeção
bidimensional da amostra APet3 ao se plotar os picos espectrais das análises por LDI(+)-Q-TWIM-TOF-MS. ... 108 Figura 61. Ampliação da projeção bidimensional de APet3 e indicação do aumento de CCS inversamente proporcional ao valor de DBE. ... 108 Figura 62. Comparativo das mobilidades de diferentes compostos modelo e a relação entre o grau de hidrogenação e a CCS[146] (A) Ácidos naftênicos avaliados por TWIM-MS.
xxvii Figura 63. (A) Cromatograma de ATD para os íons m/z 144 e 145 obtido por MALDI(+)-Q-TWIM-TOF-MS. (B) Espectros de massas referentes aos cada padrões avaliados (1-naftol e 8-quinolinol). ... 110 Figura 64. Gráficos de Kendrick (DBE vs número de carbonos) para as classes N, N2 e
NO dos petróleos Pet1 e Pet3 para as análises por ESI(+)-FFP-TOF-MS. ... 111 Figura 65. Gráficos de Kendrick (DBE vs número de carbonos) para as classes NO2, SO
e S dos petróleos Pet1 e Pet3 para as análises por ESI(+)-FFP-TOF-MS. ... 112 Figura 66. Distribuição de classes entre Pet1 e Pet3 para as análises por ESI(+)-FFP-TOF-MS. ... 113 Figura 67. Gráficos de Kendrick (DBE vs número de carbonos) para as classes N, NO e NO2 dos petróleos Pet1 e Pet3 para as análises por ESI(-)-FFP-TOF-MS. ... 114
Figura 68. Gráficos de Kendrick (DBE vs número de carbonos) para as classes NO3, O e
O2 dos petróleos Pet1 e Pet3 para as análises por ESI(-)-FFP-TOF-MS. ... 115
Figura 69. Distribuição de classes entre Pet1 e Pet3 para as análises por ESI(-)-FFP-TOF-MS. ... 116 Figura 70. Distribuição de classes entre Pet1 e Pet3 para as análises por APPI(+)-FFP-TOF-MS. ... 116 Figura 71. Gráficos de Kendrick (DBE vs número de carbonos) para a classe N dos asfaltenos APet1 e APet3 para as análises por APPI(+)-FFP-TOF-MS. ... 117 Figura 72. Gráficos de Kendrick (DBE vs número de carbonos) para as classes N2, NO,
NO2 e N2O dos asfaltenos APet1 e APet3 para as análises por APPI(+)-FFP-TOF-MS.
... 118 Figura 73. Gráficos de Kendrick (DBE vs número de carbonos) para a classe HC dos asfaltenos APet1 e APet3 para as análises por APPI(+)-FFP-TOF-MS. ... 119 Figura 74. Correntes iônicas totais analisadas por GC-HRMS após pirólise a 700 °C.120 Figura 75. Distribuições relativas para os n-alcanos identificados após a pirólise. .... 121 Figura 76. Esquematização da construção para uma molécula de asfalteno com DBE = 20 e 30 átomos de carbono baseado nos dados de UHR-MS e pirólise... 121 Figura 77. Espectro de MALDI-MS para o digesto da proteína citocromo C. ... 122 Figura 78. Curva de calibração Ω’ versus dT’ para os peptídeos encontrados nos digestos.
Condições de TWIM-MS: rampa de altura da onda 2 - 30 V, velocidade da onda 500 m/s. ... 125 Figura 79. Compostos modelo utilizados nesta etapa. ... 126 Figura 80. Espectros de LDI(+)-TWIM-TOF-MS para os compostos modelos utilizados nesta etapa. (A) coroneno. (B) (E)-1-(2-(naftalen-1-eno)vinil)pireno. (C) fulereno C60.127
Figura 81. Espectro por APCI(+)-TWIM-TOF-MS para o composto modelo 2,7-diheptilbenzo[lmn][3,8]fenantrolina-1,3,6,8(2H,7H)-tetrona e indicação da perda de monóxido de carbono durante o processo de ionização. ... 128 Figura 82. Cromatogramas de ATD obtidos experiment para os padrões CRN, TNVP, FUL e DHBPT respectivamente. ... 128 Figura 83. Estruturas dos padrões mais rígidos após otimização por cálculos teóricos.130
xxviii Figura 85. Estruturas hipotéticas construídas para os comparativos entre as arquiteturas ilha versus arquipélago. (A) ilha de massa 342. (B) Arquipélago de massa 342. (C) Ilha de massa 437. (D) Arquipélago de massa 437. (E) Ilha de massa 609. (F) Arquipélago de massa 609. ... 133 Figura 86. Estruturas otimizadas dos compostos hipotéticos propostos para as comparações com as amostras reais. ... 134 Figura 87. Gráficos de CCS por intensidade para as m/z 342, 437 e 609 e comparação com as estruturas hipotéticas com arquiteturas dos tipos ilha e arquipélago. As assinalações em cor vermelha são relacionadas às estruturas ilha previstas no modelo Yen-Mullins e as assinalações em azul são aquelas referentes ao modelo de estruturas do tipo arquipélago. ... 137 Figura 88. Simulações de dT para os compostos hipotéticos do tipo ilha e extração para
das respectivas dT para uma amostra real de asfalteno precipitado com n-heptano. . 138
Figura 89. Ampliações dos mapas de mobilidade e seus respectivos espectros de massas para diferenças de 1 Da nas regiões em torno de m/z 100, 200, 300 e 400. ... 139 Figura 90. Ampliação da m/z 400 para o espectro de massas da amostra APet1. .... 140 Figura 91. Cromatograma de ATD para a m/z 720 da amostra APet1. ... 140 Figura 92. Cromatograma de ATD para a m/z 300 da amostra APet1. ... 141
xxix Tabela 1. Valores de MWD, Mn e M2n para os óleos brutos P1 e P3 e suas respectivas frações
obtidas pela norma IP 143/96...100 Tabela 2. Listagem de peptídeos trípticos utilizados para a construção da curva de calibração para a cela de mobilidade por MALDI-TWIM-MS...127
Tabela 3. Listagem de compostos modelo utilizados para os cálculos de CCS por LDI-TWIM-MS...131 Tabela 4. Valores teóricos de CCS para os compostos hipotéticos calculados pelos métodos PA, EHS e TM e seus respectivos desvios em comparação com as CCS medidas experimentalmente para as m/z 342, 437 e 609...136
xxxi ALC Agente de ligação cruzada
APCI Ionização Química à pressão atmosférica APPI Ionização fotoquímica à pressão atmosférica CCS seção de choque de colisão
CID Dissociação induzida por colisão
CRN Coroneno
Da Dalton(s)
DART Análise direta em tempo real DBE Equivalentes de dupla ligação DC Voltagem de corrente direta DCIM Mobilidade iônica do tipo drift cell DDA Análise Dependente dos Dados
DESI Ionização por dessorção de eletrospray
DHBPT 2,7-diheptilbenzo[lmn][3,8]fenantrolina-1,3,6,8(2H,7H)-tetrona
DMF Dimetilformamida
DMS Dimetil suberoimidato
DNA Ácido desoxirribonucleico DSS disuccinidil suberoimidato
dT Tempo de travessia
ECD Dissociação por Captura de elétrons EHS Método de espalhamento de esferas rígidas
EI Ionização por elétrons
ESI Ionização por eletrospray
ETD Dissociação por Transferência de elétrons FAB Bombardeamento de átomos rápidos
FT-ICR Ressonância ciclotrônica de íons com transformada de Fourier
FUL Fulereno
GC Cromatografia Gasosa
GCxGC Cromatografia Bidimensional Abrangente IM-MS Espectrometria de mobilidade iônica
IT Armadilha de íons
KMD Defeito de massa de Kendrick
L2MS Espectrometria de Massas com ionização à Laser em duas fases LC-MS Cromatografia líquida acoplada à Espectrometria de massas LDI Ionização por dessorção à Laser
m/Δm50% Poder de resolução
MCP Placa de micro-canais
MALDI Ionização por dessorção à Laser Auxiliada por Matriz
MeCN Acetonitrila
Mn Massa molecular médio
MS Espectrometria de Massas
MSn Espectrometria de massas sequencial MWD Distribuições de Massas Moleculares
Nd:YAG Granada de ítrio e alumínio dopada com Neodímio
NHS N-hidroxisuccinimidas
NMR Ressonância Magnética Nuclear
NYSGRC New York Structural Genomics Research Consortium
PA Método da projeção
PAH Hidrocarbonetos poliaromáticos PDI Ionização por dessorção de plasma
PEG polietilenoglicol
Q Quadrupolo
xxxii SRIG Eletrodos anelares empilhados
TIC Corrente iônica total
TM Método da trajetória
TNVP (E)-1-(2-(naftalen-1-eno)vinil)pireno
TOF Tempo de voo
TWIM Mobilidade iônica do tipo traveling wave
UHR-MS Espectrometria de massas de ultra-alta resolução UPLC Cromatografia líquida de ultra performance
1
1. Introdução Geral
1.1. Espectrometria de Massas
A espectrometria de massas (MS) é uma técnica que consiste na medida de massa de íons na fase gasosa. Desde o princípio a MS vem sendo empregada na determinação da assinatura isotópica e determinação elementar de moléculas orgânicas e inorgânicas, como uma ferramenta indispensável na elucidação estrutural. A MS tem vital contribuição na ciência desde meados do século XIX,
quando logo após a descoberta dos raios anódicos por E. Goldstein e W. Wien[1],
posterior construção do espectrógrafo de massas (J. J. Thomson)[2] e primeiros
espectrômetros de massas no iniício do século XX (A. Dempster e F. W. Aston)[3]
iniciaram-se os estudos com MS. A primeira metade do século XX foi dedicada ao estudo dos elementos e seus isótopos, estudos estes que tiveram diversas consequências. O projeto Manhattan, no qual espectrômetros de massa com analisador do tipo setor magnético (Calutrons) eram utilizados para enriquecer
urânio[4] com finalidades bélicas é um exemplo. Após a Segunda Guerra Mundial
diversas pesquisas expandiram as aplicações da MS devido ao desenvolvimento
de analisadores do tipo tempo de voo (TOF)[5], quadrupolo (Q)[6], ion trap (IT)[7],
quadrupolo-tempo de voo (Q-TOF)[8] e ressonância ciclotrônica de íons com
transformada de Fourier (FT-ICR)[9]. O desenvolvimento de diferentes métodos de
ionização permitiu a expansão do nicho de aplicações da MS por meio a criação das ionizações por elétrons (EI) e métodos de dessorção baseados na emissão de íons pré-existentes a partir de uma superfície líquida ou sólida, como dessorção
por Plasma (PDI)[10], bombardeamento por átomos rápidos (FAB)[11] e dessorção
1 Griffiths, J. Anal. Chem. 2008, 80, 5678-5683. 2
Thomson, J.J. Proc. R. Soc. A. 1913, 89, 1-20.
3
Dempster, A.J. Phys. Rev. 1918, 11, 316-325.
4
Parkins, W.E. Phys. Today. 2005, 58, 45-51.
5 Weickhardt, C.; Moritz, F.; Grotemeyer, J. Mass Spectrom. Rev. 1996, 15, 139-162. 6
Dawson, P.H. Mass Spectrom. Rev. 1986, 5, 1-37.
7
Douglas, D.J.; Frank, A.J.; Mao, D.M. Mass Spectrom. Rev. 2005, 24, 1-29.
8 Morris, H.R.; Paxton, T.; Panico, M.; McDowell, R.; Dell, A. J. Prot. Chem. 1997, 16, 469-479. 9
Marshall, A.G.; Hendrickson, C.L.; Jackson, G.S. Mass Spectrom. Rev. 1998, 17, 1-35.
10
Cotter, R.J. Anal. Chem. 1988, 60, 781-782.
11 Morris, H.R.; Panico, M.; Barber, M.; Bordoli, R.S.; Sedwick, R.D. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1981, 101, 623-631.
2
por laser (LDI)[12]. A esta altura os primeiros acoplamentos com técnicas de
separação como a cromatografia gasosa (GC) já eram realizados e empregados em diversas áreas.
Um grande salto para a MS se deu com os desenvolvimentos de métodos
de ionização brandos como o eletrospray (ESI) criado por J. B. Fenn[13] e a
ionização/dessorção a laser assistida por matriz (MALDI) por M. Karas e F.
Hillenkamp[14] no final da década de 80, permitindo a aplicação da MS para análise
de proteínas. A introdução destes novos métodos de ionização abriu espaço para a evolução dos antigos analisadores de massas e introdução da espectrometria de
massas sequencial (MSn)[15] e até mesmo novos analisadores de massa tais como
o Orbitrap[16] e TOF’s de diferentes geometrias[17,18]. O acoplamento com sistemas
de cromatografia líquida de ultra- desempenho (UPLC) levou a uma expansão ainda maior das aplicações. Hoje em dia, a MS é uma técnica indispensável em diversas áreas como a metabolômica, proteômica, química ambiental, química de alimentos, combustíveis entre outros. O avanço na MS ainda se faz presente nos dias de hoje com os recentes desenvolvimentos das técnicas de ionização
ambiente tais como a análise direta em tempo real (DART)[19] e dessorção por
eletrospray (DESI)[20], técnicas de imageamento[21] e mais recentemente
mobilidade iônica[22].
1.2. Espectrometria de Mobilidade Iônica
Espectrometria de Mobilidade Iônica (IM-MS) é uma técnica de eletroforese na fase gasosa, a qual permite que analitos sejam separados com base nos seus estados de carga e tamanho/conformações. Estudos em IM-MS iniciaram em
12
Cotter, R.J. Anal. Chem. 1980, 52, 1762-1770.
13
Fenn, J.B.; Mann, M.; Meng, C.K.; Wong, S.F. Science. 1989, 246, 64-71.
14
Hillenkamp, F.; Karas, M.; Beavis, R.C.; Chait, B.T. Anal. Chem. 1991, 63, 1193-1203.
15 Shukla, A.K.; Futrell, J.H. Mass Spectrom. Rev. 1993, 12, 211-255. 16
Hu, Q.; Noll, R.J.; Li, H.; Makarov, A.; Hardman, M.; Cooks, G.R. J. Mass Spectrom. 2005, 40, 430-443.
17
Satoh, T.; Tsuno, H.; Iwanaga, M.; Kammei, Y. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2005, 16, 1969-1975.
18 Klitzke, C.F.; Corilo, Y.E.; Siek, K.; Binkley, J.; Patrick, J.; Eberlin, M.N. Energy Fuels. 2012, 26, 5787-5794. 19
Cody, R.B.; Laramée, J.A.; Durst, H.D. Anal. Chem. 2005, 77, 2297-2302.
20
Takáts, Z.; Wiseman, J.M.; Gologan, B.; Cooks, R.G. Science. 2004, 306, 471-473.
21 McDonnell, L.A.; Heeren, R.M. Mass Spectrom. Rev. 2007, 26, 606-643. 22
3
meados dos anos 50 por E. W. McDaniel[23]. A mobilidade de um íon é definida
como o quão rapidamente este íon em fase gasosa sob a influência de um campo elétrico se move através de um gás, e isto depende diretamente de dois fatores: a seção de choque de colisão (CCS) e o estado de carga. Pela medida do tempo de
travessia (dT) do íon através de uma distância conhecida é possível determinar
sua CCS com precisão. O acoplamento da mobilidade iônica com a espectrometria de massas deu-se no fim dos anos 60, onde foram realizados
acoplamentos com espectrômetros contendo analisadores do tipo Q[24] e TOF[25].
Tipicamente experimentos de mobilidade iônica são realizados em celas do tipo drift cell (DCIM), que é constituída basicamente de um tubo linear preenchido com hélio onde um campo elétrico fraco leva ao deslocamento dos íons através do tubo. A condição primária deste campo elétrico é que a energia térmica causada pelas colisões do gás deve ser maior que a energia que os íons obtêm desse campo elétrico. Quando isto ocorre, os íons acabam por possuir energia similar às moléculas do gás e consequentemente o processo de difusão passa a ser
dominante[26]. Sob estas condições de baixo campo elétrico, a velocidade do íon
passa a ser regida pelo próprio campo, e esta proporcionalidade é denominada constante de mobilidade (K), que está relacionada diretamente a CCS pela Eq.1:
K =
16𝑁3𝑞x (
2𝜋𝑘𝑇)
1/2x (
𝑚+M𝑚M)
1/2x (
Ω1)
(Eq. 1)Onde q é a carga do íon, N é o número da densidade do gás, k é a constante de Boltzmann, T é a temperatura absoluta, m é a massa do gás, M é a massa do íon e Ω é a CCS do íon. Outro parâmetro interessante é o estado de carga do íon que leva a diferentes valores de K, tornando possível separar m/z coincidentes baseado em suas ordens oligoméricas e/ou estados confomacionais. (Figura 1).
23
McDaniel, E.W.; Martin, D.W.; Bames, W.S. Rev. Sci. Instrum. 1962, 33, 2-7.
24
Albritton, D.L.; Miller, T.M.; Martin, D.W.; McDaniel, E.W. Phys. Rev. 1968, 171, 94-102.
25 Edelson, D.; Morrison, J.A.; McKnight, L.G.; Sipler, D.P. Phys. Rev. 1967, 164, 71-75. 26
4
Nos últimos anos IM-MS tem ganhado importância como uma ferramenta na análise estrutural e particularmente usada para revelar a conformação de proteínas e complexos proteicos. Logo após o desenvolvimento das técnicas brandas de ionização no início dos anos 90 iniciaram-se os trabalhos com compostos de relevância biológica. Alguns dos trabalhos mais influentes foram
desenvolvidos por M. Bowers[27], M. Jarrold[28], D. Clemmer[29] e R. Hill[30] e suas
investigações levaram a formação de diversos outros grupos voltados a estudos com IM-MS bem como o desenvolvimento de equipamentos comerciais.
Figura 1. IM-MS permite a separação de espécies com m/z coincidentes: Separação de agrômeros e confórmeros por ordem oligomérica e conformacional, respectivamente. Fonte: modificado de Wu
et al[30].
Devido ao seu potencial, a técnica de IM adiciona uma nova dimensão na separação de compostos com grande aplicabilidade em misturas complexas. Diversos grupos de pesquisa e empresas investiram em melhorias no acoplamento com MS, redução do ciclo de trabalho além do aumento da resolução
27
Wyttenbach, T.; Witt, M.; Bowers, M.T. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 3458-3464.
28
Hudgins, R.R.; Ratner, M.A.; Jarrold, M.F. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 12974-12975.
29 Liu, Y.S.; Clemmer, D.E. Anal. Chem. 1997, 69, 2504-2509. 30
Wu, C.; Siems, W.F.; Asbury, G.R.; Hill, H.H. Anal. Chem. 1998, 70, 4929-4938. Separação de íons
por ordem oligomérica (agrômeros)
Seperação de íons por conformação (conformeros isobáricos) p u lso d e ío n s m/z co inci d en tes Separação de íons por estado de agregação
Separação de íons por conformação (conformeros isóbaros)
5
de separação. Como consequência destes investimentos em IM-MS uma configuração instrumental diferente denominada Traveling Wave (TWIM) foi
disponibilizada em equipamentos comerciais, sendo a única até então[31].
Diferentemente de celas de mobilidade tradicionais onde um baixo campo elétrico é aplicado continuamente na cela, em TWIM um alto campo de voltagens de radio frequência (RF) são aplicadas nos segmentos da cela levando ao aprisionamento de pacotes de íons em vales de potencial. Pulsos de voltagem de corrente direta (DC) são aplicados de modo a sobrepor o potencial RF fazendo com que os íons viagem através da cela preenchida com gás descrevendo um movimento
ondulatório[32] (Figura 2).
Figura 2. Movimento de íons na cela de TWIM sob influência de um campo de RF. Fonte: modificado de www.waters.com.
Instrumentalmente a cela de TWIM é composta por um guia de íons RF
composto por eletrodos anelares empilhados (SRIG)[33] em posição perpendicular
ao feixe de íons. A estes eletrodos adjacentes do SRIG são aplicadas voltagens RF defasadas de 90°, gerando uma barreira radial de potencial (Figura 3). Tais características permitem a separação por mobilidade iônica.
31 Pringle, S.D.; Giles, K.; Wildgoose, J.L.; Williams, J.P.; Slade, S.E.; Thalassinos, K.; Bateman, R.H.;
BowersM.T.; Scrivens, J.H. Int. J. Mass Spectrom. 2007, 261, 1-12.
32
Shvartsburg, A.A.; Smith, R.D. Anal. Chem. 2008, 80, 9689-9699.
33 Giles, K.; Pringle, S. D.; Worthington, K. R.; Little, D.; Wildgoose, J. L.; Bateman, R. H. Rapid Comm. Mass Spectrom. 2004. 18, 2401-2414.
íons
sentido
6 Figura 3. (A) Esquema do SRIG. (B) Deformação do campo causado pela RF. (C) Anéis defasados em 90°. Fonte: modificado de www.waters.com.
TWIM foi incorporado inicialmente ao instrumento SynaptTM HDMS,
fabricado pela Waters (Manchester, UK), cuja geometria é apresentada na Figura 4. Este instrumento possui geometria Q-TOF, porém com uma seção de TWIM entre os dois analisadores. Esta seção compreende três celas consecutivas (TriWave). A primeira denominada trap tem como função aprisionar os íons vindos do quadrupolo e em intervalos regulares injeta-los na cela de TWIM. A terceira cela transfer é utilizada para guiar os íons ao TOF, mantendo a separação da
mobilidade[33]. Pelo fato da cela de mobilidade do tipo TWIM operar de maneira
totalmente diferente dos instrumentos com celas DC, a relação entre a CCS e o dT
de um íon não é a mesma que a observada em DCIM, e uma relação matemática direta ainda não foi determinada. Dessa maneira, medidas de CCS em instrumentos com celas TWIM são atualmente realizadas mediante calibração com íons de CCS conhecida, um método que fornece valores experimentais de CCS
em concordância com valores teóricos, sendo também bastante reprodutíveis[34].
34 Scarff, C. A.; Thalassinos, K.; Hilton, G. R.; Scrivens, J. H. Rapid Comm. Mass Spectrom. 2008. 22,
3297-3304. Circuitos elétricos Entrada de gás Placa lateral Abertura T-Wave Eletrodos anelares Saída T-Wave RF (+) RF (–) (A) (B) (C)
7 Figura 4. Representação esquemática do instrumento SynaptTM HDMS da Waters. Fonte: modificado de www.waters.com.
9
Capítulo 1.
Estudos de mobilidade iônica e fragmentação na fase
gasosa em proteômica estrutural: Uso de agentes de ligação cruzada
do tipo imidoéster.
11
2.1. Introdução
2.1.1. Proteínas e complexos proteicos
Proteínas constituem um dos tipos de macromoléculas biológicas mais abundantes, versáteis e complexas. Sua complexidade se deve ao fato de que estas podem ser constituídas por diferentes sequências de aminoácidos que podem ou não estar modificados, além de apresentarem uma ampla faixa de tamanho (variando de alguns poucos kDa a alguns MDa) e estruturas. Em decorrência dessa diversidade, são atribuídas a essas macromoléculas as mais diversas funções, tais como catálise (enzimas em geral), transporte (desde
moléculas simples como O2 até outras proteínas), estrutura, defesa (anticorpos),
dentre outras[35].
Uma das principais características das proteínas é que muitas de suas funções celulares tais como replicação de DNA, transcrição, tradução, splicing, secreção e controle de ciclo celular não são realizados individualmente, mas na forma de complexos proteicos, que podem variar desde pequenos oligômeros (dímeros, trímeros) a complexos formados por dezenas de cadeias polipeptídicas,
além da presença de ácidos nucléicos e cofatores (Figura 5)[36]. Muitas destas
funções dependem de uma determinada mudança conformacional induzida pelo
ligante [37]. Desse modo, interações entre proteínas, descritas como “sociologia
molecular” da célula, são vitais para a manutenção de qualquer processo biológico
e, consequentemente, da vida de determinado organismo[38].
A determinação do modo de interação entre proteínas (composição, cinética, estrutura, estequiometria, termodinâmica) pode trazer um grande número de informações que auxiliam na compreensão de inúmeros problemas biológicos. Um dos exemplos mais atraentes relacionados à interação entre proteínas pode ser visto na medicina, uma vez que o número de doenças humanas associadas a proteínas é superior ao número de genes no genoma. O que significa que muitas
35 Nelson, D.L.; Cox, M.M. Lehninger Principles of Biochemistry. Fourth Edition. Cambrigde, W.H. Freeman.
2004.
36
Robinson, C.V.; Sali, A. Nature. 2007. 450, 973-782.
37 Boehr, D.D.; Wright, P.E. Science. 2008. 320, 1429-1430. 38
12
doenças podem estar relacionadas à ausência das condições necessárias para a formação de complexos proteicos, fato este que fez com que interações proteína-proteína tenham se tornado alvos de muitas drogas nos últimos anos, como por exemplo, inibidores de receptores somastatina, receptores tromboxana A2 e
receptores de protease ativa[39,40].
Figura 5. Representação do complexo proteico PE/PPE de Mycobacterium tuberculosis, bem como indicação dos sítios de interação das proteínas no complexo. Fonte: Strong et al[41].
Além disso, a compreensão das interações pode elucidar algumas questões relacionadas ao projeto genoma, uma vez que o número de genes de um organismo tão complexo quanto o ser humano é próximo do número de genes de um dos eucariotos mais simples (Caenorhabditis elegans) e bem inferior ao de alguns vegetais, como soja e arroz. O que indica que em parte a complexidade está relacionada ao modo como esses produtos gênicos interagem entre si para
realizar suas funções biológicas[42]. Finalmente, outra grande importância
relacionada ao conhecimento do modo de interação entre proteínas está na descoberta da função de outras proteínas. Uma vez que a grande maioria dos processos biológicos é mediada por interações desse tipo, se a função de pelo
39
Keskin, O.; Gursoy, A.; Ma, B.; Nussinov, R. Chem. Rev. 2008. 108, 1225-1244.
40 Archakov, A.; Govorun, V.M.; Dubanov, A.V.; Ivanov, Y.D.; Veselovsky, A.V.; Lewi, P.; Janssen, P. Proteomics. 2003. 3, 380-391.
41
Strong, M.; Sawaya, M.R.; Wang, S.; Phillips, M.; Cascio, D.; Eisenberg, D. Proc. Natl. Acad. Sci. 2006. 103, 8060-8065.
42
13
menos um dos parceiros de interação é conhecida o assinalamento da função da
proteína de interesse pode ser facilitado[43].
2.1.2. Técnicas Tradicionais em Proteômica Estrutural
A cristalografia de raios-X é a técnica tradicional no estudo de proteínas, pois oferece análise estrutural de alta resolução, permitindo a descrição de
estruturas espaciais ao nível atômico[44]. A espectroscopia de ressonância
magnética nuclear (NMR) também permite obter informação detalhada acerca de
estruturas espaciais de proteínas[45], no entanto, ambas possuem limitações
intrínsecas, no sentido de que requerem grandes quantidades de material, algo nem sempre possível em proteômica. Além disso, a cristalografia de raios-X é restrita ao baixo número de proteínas que formam monocristais, necessários para a análise, enquanto que em NMR a análise detalhada torna-se inviável para proteínas com massas superiores a 30 kDa, em função da elevada complexidade
dos espectros obtidos[46].
Os reflexos das limitações dessas técnicas podem ser observados nas estatísticas de consórcios de genômica estrutural, tais como o NYSGRC (New
York Structural Genomics Research Consortium), cujo objetivo é realizar estudos
estruturais de proteínas em larga escala. Neste consórcio, até 2011, das 8414 proteínas-alvo selecionadas para o estudo, apenas 449 (aprox. 5,3%) tiveram sua estrutura elucidada. Se considerarmos que as 8414 proteínas selecionadas para o estudo passaram por seleção prévia de viabilidade que já as caracterizavam como potencialmente adequadas para estudos bem sucedidos, a taxa de sucesso é ainda menor. Em resumo, das 8414 proteínas selecionadas, 7965 não tiveram nenhuma informação estrutural determinada.
43
Zhang, S.; Jin G.; Zhang X.S.; Chen L. Proteomics. 2007. 7, 2856-2869.
44
Esposito, L.; Vitagliano, L.; Mazzarella, L. Protein Pept. Lett. 2002. 9, 95-106.
45 Ozawa, K.; Wu, P.S.C.; Dixon, N.E.; Otting, G. FEBS Journal. 2006. 273, 4154-4159. 46
14 2.1.3. Espectrometria de Massas aplicada a Proteômica
Alguns anos após o desenvolvimento das técnicas de ionização de ESI e MALDI foi possível observar que essas técnicas eram suficientemente brandas para a manutenção, pelo menos em parte, da estrutura de complexos proteicos
em fase gasosa[47]. Inicialmente, os primeiros trabalhos mostravam que em muitos
casos, interações não covalentes proteína-ligante podiam ser mantidas em fase gasosa desde que o processo de ionização fosse realizado em condições
controladas[48]. Apesar dos primeiros resultados animadores este método sofria
grandes limitações instrumentais, uma vez que complexos maiores tendem a se dissociar facilmente devido às grandes diferenças de pressão às quais são submetidos na análise por MS, além de os analisadores convencionais apresentarem limitações na faixa de m/z, o que impede a detecção dessas espécies. O desenvolvimento de instrumentação dedicada a essa aplicação contribuiu significantemente para o estudo de proteínas grandes e complexos mais
lábeis[49]. Atualmente a MS tem sido aplicada para a determinação de
estequiometria de complexos[50], determinação da força de ligação das espécies
constituintes de complexos[51], análise de mudanças conformacionais devido a
ação de ligantes[52], cinética de enovelamento e desenovelamento[53], e
determinação de topologia[54].
47 Heck, A.J.R.; van den Heuvel, R.H.H.; Mass Spectrom. Rev. 2004. 23, 368-389. 48
Ganem, B.; Li, Y.; Henion, J.D. J. Am. Chem. Soc. 1991. 113, 7818-7819.
49
Van den Heuvel, R.H.H.; Duijn, E.; Mazon, H.; Synowski, S.A.; Lorenzen, K.; Versluis, C.; Brouns, S.J.; Langridge, D.; Oost, J.; Hoyes, J.; Heck, A.J. Anal. Chem. 2006. 78, 7473-7483.
50 Lorenzen, K.; Olia, A.S.; Uetrecht, C.; Cingolani, G.; Heck, A.J. J. Mol. Biol. 2008. 379, 385-396. 51
Rose, R.R.; Verger, D.; Daviter, T.; Remaut, H.; Paci, E.; Waksman, G.; Ashcroft, A.E.; Radford, S.E. Proc.
Natl. Acad. Sci. 2008. 105, 12873-12878.
52 Mazon, H.; Gábor, K.; Leys, D.; Heck, A.J.; Oost, J.; van den Heuvel, R.H.H.; J. Biol. Chem. 2007. 282,
11281-11290.
53
Pinske, M.W.; Maier, C.K.; Kim, J.I.; Oh, B.; Heck, A.J.R. J. Mass Spectrom. 2003. 38, 315-320.
54 Synowsky, S.A.; van den Heuvel, R.H.H.; Mohammed, S.; Pijnappel, W.W.M.P.; Heck, A.J.R. Mol. Cell. Proteomics. 2006. 5, 1581-1592.
15 2.1.4. Reação por Ligação Cruzada e Espectrometria de Massas
O método de reação por ligação cruzada (Chemical Cross-linking) consiste em uma alternativa aos métodos tradicionais aplicados em proteômica estrutural. O método é baseado na reação específica de agentes de ligação cruzada (ALC)
com proteínas e complexos proteicos[55]. As ligações covalentes formadas entre
grupos funcionais de diferentes partes de uma estrutura proteica são regidos pelas restrições de distância espaciais entre as cadeias laterais destes grupos. A interpretação das possíveis estruturas que atendam às ligações formadas leva a modelos estruturais que são comparadas com estruturas cristalográficas de
proteínas homólogas e dados de modelagem molecular[56].
A técnica utilizada para a análise de espécies oriundas de experimentos de ligação cruzada é a MS, onde proteólises enzimáticas são utilizadas permitindo que o tamanho dos analitos seja ilimitado. Vantagens incluem a velocidade da análise, pouca quantidade de amostra utilizada, possibilidade de análises
tridimensionais das proteínas em solução e a análise de misturas complexas[57].
O experimento de ligação cruzada acoplada a espectrometria de massas consiste na reação de proteínas e complexos proteicos com ALC que reagem especificamente com certos resíduos de aminoácidos. Após o período reacional o analito é submetido a uma proteólise enzimática e os peptídeos modificados resultantes analisados por LC-MS e LC-MS/MS de forma contínua. Os íons de peptídeos são então automaticamente submetidos a experimentos de MS/MS durante a corrida de LC, o que permite sequenciá-los e localizar as modificações do ALC. Essa abordagem experimental é bastante semelhante aos métodos de proteômica shotgun empregados em análises de misturas complexas de proteínas. A partir deste tipo de experimento é possível saber quais pares de resíduos de aminoácidos da proteína alvo sofreram ligação cruzada e, consequentemente, se estavam espacialmente próximos na estrutura nativa (Figura 6). Nos últimos anos diversas estruturas de proteínas e complexos não
55
Sinz, A. Mass Spectrom. Rev. 2006. 25, 663-682.
56
Singh, P.; Panchaud, A.; Goodlett, D.R. Anal. Chem. 2010. 82, 2636-2642.
57 Herzog, F.; Kahraman, A.; Boehringer, D.; Mak, R.; Bracher, A.; Walzthoeni, T.; Leitner, A.; Beck, M.; Hartl,
16
passíveis de serem analisadas por NMR e difração de Raios-X vem sendo
resolvidas por ligação cruzada acoplada a MS[58].
Figura 6. Representação esquemática de um experimento típico de ligação cruzada com análise por MS para obtenção de dados estruturais de proteínas na forma de restrições espaciais de distância. 1) Reação da proteína alvo em seu estado nativo in vitro com o ALC desejado; 2) Digestão enzimática da proteína modificada, de forma a gerar peptídeos modificados e não-modificados; 3) Análise da mistura de peptídeos por LC-MS/MS, visando identificar os peptídeos modificados pelo ALC para formar espécies de ligação. 4) Agrupamento das restrições de distância obtidas pelo experimento e desenho de um mapa de ligações cruzadas. 5) Uso do conjunto de restrições de distância na determinação de modelos estruturais compatíveis para a proteína alvo. Fonte: www.daltonlab.iqm.unicamp.br.
2.1.5. Imidoésteres como Agentes de Ligação Cruzada
ALC são compostos orgânicos multifuncionais, contendo geralmente dois ou três grupos reativos, unidos por uma cadeia espaçadora de comprimentos variável. No caso de proteínas, os ALC são capazes de ligar covalentemente as cadeias laterais de certos resíduos de aminoácidos. Os grupos presentes em ALC podem ser idênticos (homobifuncionais) ou distintos (heterobifuncionais),
58
Santos, A.M.; Schechtman, D.; Cardoso, A.C.; Clemente, C.F.M.Z.; Silva, J.C.; Fioramonte, M.; Pereira, M.; Marin, T.M.; Oliveira, P.S.L.; Figueira, A.C.; Torriani, I.L.; Gozzo, F.C.; Neto, J.X.; Franchini, K.G. Nature
17
permitindo diferentes especificidades para cada reagente. Dentre os ALC disponíveis atualmente, os de maior destaque são aqueles reativos frente a aminas primárias. Isto devido a alta ocorrência de grupos amino em proteínas, podendo ser resíduos de lisina ou grupos N-terminais. Atualmente os ALC mais utilizados são aqueles do tipo ésteres de N-hidroxisuccinimida (NHS) (Figura 7),
devido a seu alto rendimento, alta especificidade e facilidade de obtenção[59].
Figura 7. Estrutura geral de ésteres de NHS.
Entretanto sabe-se que ésteres de NHS após reação com aminas primárias são formadas amidas, diminuído a basicidade da lisina e consequentemente eliminando um sítio de carga da proteína. Sucessivas reações com ésteres de NHS levam a uma perturbação do balanço geral de cargas na superfície da
proteína[60], e consequentemente podem levar a mudanças no estado nativo da
mesma. Além desta desvantagem, ésteres de NHS têm baixa solubilidade em água e as espécies formadas não são passíveis de purificações por técnicas
cromatográficas de troca iônica (SCX). Em meados de 2010 Lauber e Reilly[60]
apresentaram um novo ALC do tipo tioimidoéster (Figura 8), onde foi demonstrado que este reagente possuía as mesmas características dos ésteres de NHS com uma vantagem; o sítio de carga era mantido, uma vez que amidinas são formadas.
Amidinas possuem pKa cerca de duas unidades acima que o de aminas[61]. Isto
mantém o sítio de carga e torna os peptídeos modificados mais susceptíveis a técnicas de enriquecimento (Figura 8).
59
Lee, Y.J.; Lackner, L.L.; Nunnari, J.M.; Phinney, B.S. J. Proteome Res. 2007. 6, 3908-3917.
60 Lauber, M .A.; Reilly, J.P. Anal. Chem. 2010. 82, 7736-7743. 61
18 Figura 8. Estruturas do ALC dimetil suberoimidato (DMS) utilizado neste trabalho e de seu derivado tioimidato previamente descrito na literatura[62].
Imidoésteres foram utilizados previamente apenas em um único estudo, entretanto os autores relataram que peptídeos modificados com este reagente não
foram encontrados[63]. Pelas similaridades químicas espera-se que este reagente
comporte-se de maneira semelhante aos tioimidoésteres, com diferenças apenas no pH utilizado para a reação uma vez que tióis são melhores grupos
abandonares em relação a álcoois[60]. Imidatos simples em valores de pH abaixo
de 8 perdem amônia, acabando por terem baixos rendimentos[60], sendo a
necessidade de se realizar reações em pH alcalino. Este constitui o único empecilho para o uso de imidoésteres como ALC, uma vez que estes tendem a ter as mesmas características dos tioimidatos, aliado ao fato de serem comercialmente disponíveis. A Figura 9 demonstra os tipos de produtos tipicamente formados em reações de ligação cruzada de proteínas ou peptídeos com reagentes homobifuncionais utilizando-se tanto o éster de NHS DSS (suberato de N,N-disuccinimidila) como o DMS, onde ambos possuem o mesmo tamanho de cadeia espaçadora.
Embora a metodologia de ligação cruzada com análise por MS tenha se mostrado bastante promissora em fornecer informações estruturais de proteínas. Um dos grandes desafios da técnica ainda é a detecção e identificação dos peptídeos modificados no digesto após a reação, uma vez que os mesmos sempre
estão presentes em quantidades subestequiométricas na mistura[56]. Várias
estratégias têm sido desenvolvidas visando contornar esse problema, como o uso
62 Roger R.; Neilson, D.G. Chem. Rev. 1961. 61, 179-211. 63
