Formação de espécies intermoleculares e fragmentação por CID

Espécies modificadas do tipo intermoleculares provenientes de

experimentos de ligação cruzada são reportadas como as de mais difícil

interpretação[98]. Os fragmentos podem ser oriundos de uma ou ambas as cadeias,

além da possibilidade da ruptura do próprio ALC. Esses peptídeos são

P2 H+ CID b14* c14* ECD/ETD Sem fragmentação na porção cíclica

Fragmentação linear até a porção cíclica b ion Intermediário acílio acíclico a ion Fragmentação convencional CID – y14* z14* y ion CID b ion y ion Fragmentação convencional

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extremamente interessantes do ponto de vista estrutural, visto que conectam resíduos de lisinas distantes na estrutura primária da proteína ou de diferentes proteínas em um complexo. Deste modo, estas informações são extremamente úteis tanto na determinação do tipo de enovelamento de uma proteína bem como na elucidação da topologia de complexos proteicos.

Para os experimentos de ESI(+)-QTOF-MS de espécies intermoleculares os seguintes peptídeos foram testados: Px, P2, P3 e P18. Estes foram reagidos de forma convencional com DMS. Com exceção de Px, os demais possuem um grupo acetil na porção N-terminal e, consequentemente, o sítio reativo frente ao ALC são as lisinas. No caso de Px, conforme ilustrado na Figura 23, o N-terminal livre permite a formação de duas espécies intermoleculares diferentes após a digestão enzimática, entretanto apenas espécies resultantes de ligação do ALC com as lisinas foram observadas (Seção 2.3.2). As espécies intermoleculares utilizadas neste caso foram obtidas de forma similar às espécies intramoleculares, empregando-se apenas uma etapa adicional de digestão enzimática (3 h). Esta etapa leva a formação de espécies intermoleculares devido à sequência dos peptídeos sintéticos. Todos os peptídeos modelo possuem um resíduo arginina entre a lisinas alvo, de modo que a utilização de tripsina leva a formação das espécies de interesse.

Figura 23. Formação de espécies intermoleculares a partir dos peptídeos P2 e Px. As m/z ilustradas aqui são referentes a utilização de DMS como ALC.

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Além das espécies intermoleculares de interesse formadas e indicadas, são observadas diversas m/z referentes à formação de espécies do tipo dead-end e espécies intramoleculares remanescentes, todas estas obtidas ainda na etapa inicial de reação entre o DMS e os peptídeos modelo. As espécies assinaladas apresentam massas próximas a suas respectivas espécies intramoleculares em todos os estados de carga observados (+3 e +4). Foi observado que não ocorre apenas a clivagem por parte da tripsina no resíduo de arginina dentro do ciclo formado pela adição de DMS. Como a perda dos dois primeiros resíduos da porção N-terminal do P2, isto já era previsto pela sequência de aminoácidos dos peptídeos modelo.

Nesse ponto, é importante notar que existe a possibilidade da formação de espécies isóbaras que poderiam interferir no estudo de fragmentação das moléculas de interesse. No caso da formação das espécies intermoleculares, pode haver coincidência de massas para todos os peptídeos entre as seguintes espécies: i) peptídeos intermoleculares, cuja digestão ocorreu em todos os sítios trípticos não modificados; e ii) peptídeo dead-end, onde a modificação se encontra em uma das lisinas e na qual a digestão ocorreu somente no primeiro resíduo tríptico (R em todos os casos). Essa coincidência está exemplificada na Figura 24 para o peptídeo P2.

Figura 24. Estruturas das espécies isóbaras do tipo dead-end e intermolecular possíveis de se obter pelo procedimento de digestão enzimática do peptídeo P2.

A princípio esta possibilidade não pode ser descartada, uma vez que em todos os espectros após a reação com DMS é possível observar a formação de peptídeos do tipo dead-end, com intensidades relativas variando de 10% a 100%.

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Entretanto, existem vários motivos para que se possa afirmar que essas coincidências não acontecem utilizando o procedimento experimental descrito anteriormente. No caso de P1, por exemplo, de modo a se obter a espécie dead-

end isóbara ao peptídeo intermolecular de interesse (m/z 1558,8), seria necessário

que o peptídeo dead-end inicial (m/z 1841,5) se mantivesse intacto à digestão com tripsina por 3 h, tendo como único sítio de clivagem a primeira arginina. Qualquer outro produto de digestão em um sítio tríptico levaria a formação de uma espécie

dead-end com diferente m/z. Além disso, o espectro de dissociação do peptídeo

intermolecular após 16 h de digestão é idêntico ao espectro de digestão após 3 h, o que indica a ausência de fragmentos de outras espécies, que não a de interesse.

As anotações nos espectros de fragmentos comumente observados na dissociação de peptídeos lineares estão de acordo com a nomenclatura proposta

por Roepstorff[70] e modificada por Biemann[99] (Figura 21). A grande maioria dos

íons gerados é proveniente de clivagens da cadeia principal do peptídeo (clivagens na cadeia lateral são mais observadas em regimes energia de colisão muito alta).

Nessa nomenclatura, íons a, b e c são aqueles que retêm a carga na porção N-terminal do peptídeo original, enquanto as espécies x, y e z apresentam a carga localizada no C-terminal. A diferenciação entre esses íons é dada pela ligação que se rompeu na dissociação: ligação Cα-C (a e x), C-N (b e y) e N-Cα (c e z). Íons não previstos na nomenclatura anterior (formados em virtude da reação

de cross linking) estão de acordo com o proposto por Schilling et al[97], onde os

índices α e β indicam as cadeias de maior e menor massa respectivamente.

A análise do espectro de ESI(+)-QTOF-MS/MS de P2 obtido indicam a presença de fragmentos do tipo b e y, comumente encontrados na dissociação de peptídeos lineares, onde observou-se a formação preferencial de íons y. Em todos os casos é possível observar a formação de fragmentos nos quais uma das cadeias tem uma ligação peptídica clivada enquanto a outra cadeia se encontra intacta (por exemplo, no espectro de P2 (Figura 25). O íon em m/z 917,55

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indicando as clivagens das ligações entre a lisina da cadeia β e seus aminoácidos

vizinhos triptofano e glicina, com a manutenção do ALC K-K, restando a cadeia α

intacta). Isso significa que uma das cadeias pode funcionar como se fosse uma modificação no aminoácido da outra cadeia. Para o espectro de ESI(+)-QTOF-

MS/MS de P2 indica uma quantidade uniforme de íons das cadeias α e β, isto

devido ao tamanho similar de ambas as cadeias[100], diferentemente ao observado

para os espectros de ESI(+)-QTOF-MS/MS de P3 e P18 (Figura 25). Para P3 é

observada a formação do fragmento assinalado como DMS + α (m/z 1146,59),

correspondente a dissociação entre o ALC e a cadeia β, fragmento este

dificilmente observado em espectros de MS/MS. O P18 apresentou como

fragmentos os íons αy8βy2 (m/z 1330,68) e αy9βy2 (m/z 1516,77) onde a

dissociação de mais de uma ligação em diferentes cadeias forneceu um fragmento interno característico de espécies intermoleculares.

100 _{Velucci, D.; Kao, A.; Kaake, R.M.; Rychnovsky, S.D. Huang, L. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2010. 21, 1432-}

51 Figura 25. Espectros de ESI(+)-QTOF-MS/MS das espécies intermoleculares formadas a partir dos peptídeos P2, P3 e P18 respectivamente após digestão enzimática com tripsina.