Técnicas Tradicionais em Proteômica Estrutural

A cristalografia de raios-X é a técnica tradicional no estudo de proteínas, pois oferece análise estrutural de alta resolução, permitindo a descrição de

estruturas espaciais ao nível atômico[44]. A espectroscopia de ressonância

magnética nuclear (NMR) também permite obter informação detalhada acerca de

estruturas espaciais de proteínas[45], no entanto, ambas possuem limitações

intrínsecas, no sentido de que requerem grandes quantidades de material, algo nem sempre possível em proteômica. Além disso, a cristalografia de raios-X é restrita ao baixo número de proteínas que formam monocristais, necessários para a análise, enquanto que em NMR a análise detalhada torna-se inviável para proteínas com massas superiores a 30 kDa, em função da elevada complexidade

dos espectros obtidos[46].

Os reflexos das limitações dessas técnicas podem ser observados nas estatísticas de consórcios de genômica estrutural, tais como o NYSGRC (New

York Structural Genomics Research Consortium), cujo objetivo é realizar estudos

estruturais de proteínas em larga escala. Neste consórcio, até 2011, das 8414 proteínas-alvo selecionadas para o estudo, apenas 449 (aprox. 5,3%) tiveram sua estrutura elucidada. Se considerarmos que as 8414 proteínas selecionadas para o estudo passaram por seleção prévia de viabilidade que já as caracterizavam como potencialmente adequadas para estudos bem sucedidos, a taxa de sucesso é ainda menor. Em resumo, das 8414 proteínas selecionadas, 7965 não tiveram nenhuma informação estrutural determinada.

43

Zhang, S.; Jin G.; Zhang X.S.; Chen L. Proteomics. 2007. 7, 2856-2869.

44

Esposito, L.; Vitagliano, L.; Mazzarella, L. Protein Pept. Lett. 2002. 9, 95-106.

45 _{Ozawa, K.; Wu, P.S.C.; Dixon, N.E.; Otting, G. FEBS Journal. 2006. 273, 4154-4159.} 46

14 2.1.3. Espectrometria de Massas aplicada a Proteômica

Alguns anos após o desenvolvimento das técnicas de ionização de ESI e MALDI foi possível observar que essas técnicas eram suficientemente brandas para a manutenção, pelo menos em parte, da estrutura de complexos proteicos

em fase gasosa[47]. Inicialmente, os primeiros trabalhos mostravam que em muitos

casos, interações não covalentes proteína-ligante podiam ser mantidas em fase gasosa desde que o processo de ionização fosse realizado em condições

controladas[48]. Apesar dos primeiros resultados animadores este método sofria

grandes limitações instrumentais, uma vez que complexos maiores tendem a se dissociar facilmente devido às grandes diferenças de pressão às quais são submetidos na análise por MS, além de os analisadores convencionais apresentarem limitações na faixa de m/z, o que impede a detecção dessas espécies. O desenvolvimento de instrumentação dedicada a essa aplicação contribuiu significantemente para o estudo de proteínas grandes e complexos mais

lábeis[49]. Atualmente a MS tem sido aplicada para a determinação de

estequiometria de complexos[50], determinação da força de ligação das espécies

constituintes de complexos[51], análise de mudanças conformacionais devido a

ação de ligantes[52], cinética de enovelamento e desenovelamento[53], e

determinação de topologia[54].

47 _{Heck, A.J.R.; van den Heuvel, R.H.H.; Mass Spectrom. Rev. 2004. 23, 368-389.} 48

Ganem, B.; Li, Y.; Henion, J.D. J. Am. Chem. Soc. 1991. 113, 7818-7819.

49

Van den Heuvel, R.H.H.; Duijn, E.; Mazon, H.; Synowski, S.A.; Lorenzen, K.; Versluis, C.; Brouns, S.J.; Langridge, D.; Oost, J.; Hoyes, J.; Heck, A.J. Anal. Chem. 2006. 78, 7473-7483.

50 _{Lorenzen, K.; Olia, A.S.; Uetrecht, C.; Cingolani, G.; Heck, A.J. J. Mol. Biol. 2008. 379, 385-396.} 51

Rose, R.R.; Verger, D.; Daviter, T.; Remaut, H.; Paci, E.; Waksman, G.; Ashcroft, A.E.; Radford, S.E. Proc.

Natl. Acad. Sci. 2008. 105, 12873-12878.

52 _{Mazon, H.; Gábor, K.; Leys, D.; Heck, A.J.; Oost, J.; van den Heuvel, R.H.H.; J. Biol. Chem. 2007. 282, 11281-}

11290.

53

Pinske, M.W.; Maier, C.K.; Kim, J.I.; Oh, B.; Heck, A.J.R. J. Mass Spectrom. 2003. 38, 315-320.

54 _{Synowsky, S.A.; van den Heuvel, R.H.H.; Mohammed, S.; Pijnappel, W.W.M.P.; Heck, A.J.R. Mol. Cell.} Proteomics. 2006. 5, 1581-1592.

15 2.1.4. Reação por Ligação Cruzada e Espectrometria de Massas

O método de reação por ligação cruzada (Chemical Cross-linking) consiste em uma alternativa aos métodos tradicionais aplicados em proteômica estrutural. O método é baseado na reação específica de agentes de ligação cruzada (ALC)

com proteínas e complexos proteicos[55]. As ligações covalentes formadas entre

grupos funcionais de diferentes partes de uma estrutura proteica são regidos pelas restrições de distância espaciais entre as cadeias laterais destes grupos. A interpretação das possíveis estruturas que atendam às ligações formadas leva a modelos estruturais que são comparadas com estruturas cristalográficas de

proteínas homólogas e dados de modelagem molecular[56].

A técnica utilizada para a análise de espécies oriundas de experimentos de ligação cruzada é a MS, onde proteólises enzimáticas são utilizadas permitindo que o tamanho dos analitos seja ilimitado. Vantagens incluem a velocidade da análise, pouca quantidade de amostra utilizada, possibilidade de análises

tridimensionais das proteínas em solução e a análise de misturas complexas[57].

O experimento de ligação cruzada acoplada a espectrometria de massas consiste na reação de proteínas e complexos proteicos com ALC que reagem especificamente com certos resíduos de aminoácidos. Após o período reacional o analito é submetido a uma proteólise enzimática e os peptídeos modificados resultantes analisados por LC-MS e LC-MS/MS de forma contínua. Os íons de peptídeos são então automaticamente submetidos a experimentos de MS/MS durante a corrida de LC, o que permite sequenciá-los e localizar as modificações do ALC. Essa abordagem experimental é bastante semelhante aos métodos de proteômica shotgun empregados em análises de misturas complexas de proteínas. A partir deste tipo de experimento é possível saber quais pares de resíduos de aminoácidos da proteína alvo sofreram ligação cruzada e, consequentemente, se estavam espacialmente próximos na estrutura nativa (Figura 6). Nos últimos anos diversas estruturas de proteínas e complexos não

55

Sinz, A. Mass Spectrom. Rev. 2006. 25, 663-682.

56

Singh, P.; Panchaud, A.; Goodlett, D.R. Anal. Chem. 2010. 82, 2636-2642.

57 _{Herzog, F.; Kahraman, A.; Boehringer, D.; Mak, R.; Bracher, A.; Walzthoeni, T.; Leitner, A.; Beck, M.; Hartl,}

16

passíveis de serem analisadas por NMR e difração de Raios-X vem sendo

resolvidas por ligação cruzada acoplada a MS[58].

Figura 6. Representação esquemática de um experimento típico de ligação cruzada com análise por MS para obtenção de dados estruturais de proteínas na forma de restrições espaciais de distância. 1) Reação da proteína alvo em seu estado nativo in vitro com o ALC desejado; 2) Digestão enzimática da proteína modificada, de forma a gerar peptídeos modificados e não- modificados; 3) Análise da mistura de peptídeos por LC-MS/MS, visando identificar os peptídeos modificados pelo ALC para formar espécies de ligação. 4) Agrupamento das restrições de distância obtidas pelo experimento e desenho de um mapa de ligações cruzadas. 5) Uso do conjunto de restrições de distância na determinação de modelos estruturais compatíveis para a proteína alvo. Fonte: www.daltonlab.iqm.unicamp.br.