Imidoésteres como Agentes de Ligação Cruzada

ALC são compostos orgânicos multifuncionais, contendo geralmente dois ou três grupos reativos, unidos por uma cadeia espaçadora de comprimentos variável. No caso de proteínas, os ALC são capazes de ligar covalentemente as cadeias laterais de certos resíduos de aminoácidos. Os grupos presentes em ALC podem ser idênticos (homobifuncionais) ou distintos (heterobifuncionais),

58

Santos, A.M.; Schechtman, D.; Cardoso, A.C.; Clemente, C.F.M.Z.; Silva, J.C.; Fioramonte, M.; Pereira, M.; Marin, T.M.; Oliveira, P.S.L.; Figueira, A.C.; Torriani, I.L.; Gozzo, F.C.; Neto, J.X.; Franchini, K.G. Nature

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permitindo diferentes especificidades para cada reagente. Dentre os ALC disponíveis atualmente, os de maior destaque são aqueles reativos frente a aminas primárias. Isto devido a alta ocorrência de grupos amino em proteínas, podendo ser resíduos de lisina ou grupos N-terminais. Atualmente os ALC mais utilizados são aqueles do tipo ésteres de N-hidroxisuccinimida (NHS) (Figura 7),

devido a seu alto rendimento, alta especificidade e facilidade de obtenção[59].

Figura 7. Estrutura geral de ésteres de NHS.

Entretanto sabe-se que ésteres de NHS após reação com aminas primárias são formadas amidas, diminuído a basicidade da lisina e consequentemente eliminando um sítio de carga da proteína. Sucessivas reações com ésteres de NHS levam a uma perturbação do balanço geral de cargas na superfície da

proteína[60], e consequentemente podem levar a mudanças no estado nativo da

mesma. Além desta desvantagem, ésteres de NHS têm baixa solubilidade em água e as espécies formadas não são passíveis de purificações por técnicas

cromatográficas de troca iônica (SCX). Em meados de 2010 Lauber e Reilly[60]

apresentaram um novo ALC do tipo tioimidoéster (Figura 8), onde foi demonstrado que este reagente possuía as mesmas características dos ésteres de NHS com uma vantagem; o sítio de carga era mantido, uma vez que amidinas são formadas.

Amidinas possuem pKa cerca de duas unidades acima que o de aminas[61]. Isto

mantém o sítio de carga e torna os peptídeos modificados mais susceptíveis a técnicas de enriquecimento (Figura 8).

59

Lee, Y.J.; Lackner, L.L.; Nunnari, J.M.; Phinney, B.S. J. Proteome Res. 2007. 6, 3908-3917.

60 _{Lauber, M .A.; Reilly, J.P. Anal. Chem. 2010. 82, 7736-7743.} 61

18 Figura 8. Estruturas do ALC dimetil suberoimidato (DMS) utilizado neste trabalho e de seu derivado tioimidato previamente descrito na literatura[62].

Imidoésteres foram utilizados previamente apenas em um único estudo, entretanto os autores relataram que peptídeos modificados com este reagente não

foram encontrados[63]. Pelas similaridades químicas espera-se que este reagente

comporte-se de maneira semelhante aos tioimidoésteres, com diferenças apenas no pH utilizado para a reação uma vez que tióis são melhores grupos

abandonares em relação a álcoois[60]. Imidatos simples em valores de pH abaixo

de 8 perdem amônia, acabando por terem baixos rendimentos[60], sendo a

necessidade de se realizar reações em pH alcalino. Este constitui o único empecilho para o uso de imidoésteres como ALC, uma vez que estes tendem a ter as mesmas características dos tioimidatos, aliado ao fato de serem comercialmente disponíveis. A Figura 9 demonstra os tipos de produtos tipicamente formados em reações de ligação cruzada de proteínas ou peptídeos com reagentes homobifuncionais utilizando-se tanto o éster de NHS DSS (suberato de N,N-disuccinimidila) como o DMS, onde ambos possuem o mesmo tamanho de cadeia espaçadora.

Embora a metodologia de ligação cruzada com análise por MS tenha se mostrado bastante promissora em fornecer informações estruturais de proteínas. Um dos grandes desafios da técnica ainda é a detecção e identificação dos peptídeos modificados no digesto após a reação, uma vez que os mesmos sempre

estão presentes em quantidades subestequiométricas na mistura[56]. Várias

estratégias têm sido desenvolvidas visando contornar esse problema, como o uso

62 _{Roger R.; Neilson, D.G. Chem. Rev. 1961. 61, 179-211.} 63

19

de ALC marcados isotopicamente[64], ALC modificados com grupos específicos

visando purificação por cromatografia de afinidade dos peptídeos modificados[65] e

ALC cliváveis visando facilitar a detecção dos peptídeos modificados[66]. Há

também estudos visando a elucidação dos mecanismos de fragmentação de peptídeos modificados por ALC em experimentos de MS/MS por dissociação induzida por colisão (CID), resultando na descoberta de íons marcadores característicos para esses peptídeos tornando possível a identificação destas

espécies em misturas complexas[67].

64 _{Sinz, A. Angew. Chem. Int. Ed. 2007. 46, 660-662.} 65

Tang, X.; Munske, G.R.; Siems, W.F.; Bruce, J.E. Anal. Chem. 2005. 77, 311-318.

66

Back, J.W.; Artal Sanz, M.; de Jong, L.; de Koning, L.J.; Nijtmans, L.G.J.; de Koster, C.G.; Grivell, L.A.; van der Spek, H.; Muijsers, A.O. Prot. Sci. 2002. 11, 2471-2478.

67

20 Figura 9. Espécies após reações de grupos -amino de resíduos de lisina de um ou mais peptídeos com DSS (esquerda, azul) ou DMS (direita, vermelho) ALC. Dependendo de onde os resíduos de lisina estejam localizados: na mesma cadeia intramoleculares (XLINTRA), em diferentes

intermoleculares (XLINTER) e em apenas um dos grupos é denominada dead-end (DE).

DSS DMS

pKa_AMINE

pKa_AMIDINA> pKa_AMINA pKa_AMIDINA> pKa_AMINA

pKa_AMIDINA> pKa_AMINA

pKa_AMIDA< pKa_AMINA

pKa_AMIDA< pKa_AMINA

pKa_AMIDA< pKa_AMINA

+136.10 Da +136.10 Da +156.08 Da +138.07 Da +138.07 Da R1= NH, R2= OCH3,+168.12 Da R1= NH, R2= OH, +154.11 Da R1= O, R2= NH2, +154.11 Da

XL_INTER

XL_INTRA

DE

DE

XL_INTRA

XL_INTER

21 2.1.6. Análise de peptídeos por Dissociação Induzida por Colisão

(CID)

A fragmentação de peptídeos por MS é utilizada rotineiramente para a identificação de proteínas. Este processo é comumente realizado por meio de

dissociação induzida por colisão (CID)[68]. Apesar de outras metodologias para a

fragmentação de peptídeos terem sido desenvolvidas, CID é o método mais amplamente empregado, além de ser o de maior disponibilidade em espectrômetros de massas comerciais. Utilizando uma descrição cabível para a maior parte dos equipamentos comercialmente disponíveis os peptídeos protonados (modo positivo de polaridade) são selecionados em um primeiro analisador de m/z e acelerados para uma região do espectrômetro preenchida

com um gás inerte (He, Ar ou N2) proporcionando, assim a colisão entre os íons

selecionados e as moléculas do gás inerte. Como resultado, a energia cinética transferida em cada colisão é convertida em energia interna, e o processo de redistribuição desta energia ao longo das ligações dos íons ocasiona a

fragmentação[15] (Figura 10).

Figura 10. Ilustração do processo de CID. A energia cinética do íon precursor, após colisão com o gás inerte, é convertida em energia interna e ocorre a fragmentação. Fonte: http://www.chm.bris.ac.uk/ms.

68

Tabb, D.L.; Smith, L.L.; Breci, L.A.; Vysocki, V.H.; Lin, D.; Yates, J.R. Anal. Chem. 2004. 75, 1155-1163.

Gás de colisão Íon fragmento Perda neutra Cela de colisão Íons precursores Íons ativado Íons

fragmentando Fragmento ativado

(fragmentação) Íons fragmentos aumento de energia interna Íons precursores Íons fragmentos

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Para explicar a fragmentação de peptídeos, Dongre et al[69] propuseram o

modelo do próton móvel, que descreve como a energia interna adquirida induz a transferência dos prótons em cada peptídeo protonado, culminando no enfraquecimento das ligações amida da cadeia polipeptídica e, por consequência, induzindo a formação de íons fragmentos. O efeito do próton móvel muda drasticamente dependendo do estado de carga do peptídeo além da presença de resíduos básicos na sequencia do peptídeo. Este próton pode migrar e produzir sub-populações de peptídeos com diferentes estruturas referentes a cada porção protonada. Estes sítios de protonação são quem direcionam as fragmentações, de modo que cada sub-população fragmenta de forma distinta. A inclusão de um ou mais resíduos básicos leva a formação de íons multiplamente carregados (apenas ESI), onde aqueles presentes nas porções mais básicas são fixos ao passo que aqueles nas porções menos básicas são os prótons móveis.

Em nomenclatura proposta por Roepstorff e Fohlman[70] aqueles íons que

retém a carga na porção N-terminal são classificados como a, b e c dependendo da ligação que é quebrada. Aqueles onde a carga fica retida na porção C-terminal são classificados como x, y e z. Considerando-se que as ligações amida são as mais lábeis em peptídeos espera-se que os íons b e y sejam os mais frequentes em espectros de MS/MS obtidos por CID, facilitando assim a interpretação dos mesmos. A Figura 11 ilustra como o modelo do próton móvel deve ocorrer para um peptídeo duplamente protonado em experimentos de CID, levando a formação de íons b e y. As etapas envolvem no processo a transferência do próton, seguida pela formação de um anel oxazonalol e posterior clivagem na ligação peptídica[71,72].

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Dongre, A.R.; Jones, J.L.; Somogyi, A.; Wysocki, V.H. J. Am. Chem. Soc. 1996. 118, 8365-8374.

70 _{Roepstorff, P.; Fohlman, J. J. Biomed. Mass Spectrom. 1984. 11, 601-602.} 71

Yalcin, T.; Khouw, C.; Csizmadia, I.; Peterson, M.R.; Harrison, A.G. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1995. 6, 1164-1174.

72 _{Yalcin, T.; Khouw, C.; Csizmadia, I.; Peterson, M.R.; Harrison, A.G. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1996. 7, 233-}

23 Figura 11. Esquema da fragmentação em um peptídeo hipotético ASAYK por CID[69].

2.1.7. Análise de peptídeos por Captura e Transferência de Elétrons