Identificação de Staphylococcus coagulase negativa

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Identificação de Staphylococcus

coagulase negativa

Paulo Jos

é

Martins

Bispo

, PhD

Postdoctoral Research Associate

Ophthalmology, Microbiology and Immunobiology

Harvard Medical School, Massachusetts Eye and Ear

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Gênero Staphylococcus

1880

• Staphyle - cacho

• Kokkos - grãos

Alexander Ogston University of Alberdeen Scotland “My delight may be conceived when there were revealed to me beautiful

tangles, tufts and chains of round organisms in great numbers, which stood out clear and distinct among the pus cells and debris...”

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Gênero Staphylococcus

Outras Características

• Catalase positiva

• Anaérobios facultativos

• Oxidase negativa

• Sensível lisostafina

• Resistente bacitracina

Variedade de espécies

• 51 espécies

• 27 subespécies

http://www.bacterio.net/staphylococcus.html

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Taxonomia

Staphylococcaceae Staphylococcus* Micrococcus* Macrococcus* _Kocuria Kytococcus Nesterenkonia Arthrobacter Stomatococcus (Rothia)

1) NCBI Taxonomy Browser 2) Taxonomic Outline of the Prokaryotes Bergeys Manual of Systematic Bacteriology, Second Edition. Micrococcaceae Gemella Jeotgalicoccus* Salinicoccus* Aliicoccus* Nosocomiicoccu s*

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Staphylococcus coagulase negativa

• Microbiota da pele a mucosas

– S. haemolyticus (glândula apócrinas) S. capitis (cabeça), S. saprophyticus (TGU)

• Oportunistas

– Formação biofilme dispositivos médicos

• Clinicamente frequentes

– S. epidermidis, S. haemolyticus, S. lugdunensis

• Infecções hospitalares – associadas inserção dispositivos invasivos

– S. saprophyticus

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Importância Clínica Identificação

• S. epidermidis

– Componente permanente da microbiota da pele

– Mais frequente SCoN causando infec. humanas

– Infecções relacionadas biofilme – persistência

– Alta resistência aos antimicrobianos (maior SA)

• Disseminação R a linezolida Americas e Europa

• Resistência intermediária e tolerância (BF) vancomicina

Otto M.Nat Rev Microbiol. 2009 Aug;7(8):555-67 de Almeida LM et al. JAC. 2012 Mar;67(3):768-9. Mendes et al. AAC. 2012, 56(9):4656.

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Importância Clínica Identificação

• S. lugdunensis

– Também positivo clumping factor

– SCoN atípico – maior virulência infecções mais agressivas

– Baixa resistência aos antimicrobianos

• S. saprophyticus

– Segunda causa mais frequente de ITU comunitária

– Baixa taxa R aos ATB

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Multi-R

5 isolados com SCCmec tipo III

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Fluxograma de Identificação Manual

Cocos Gram positivos Catalase _{( - )}

( + )

Streptococcus, Enterococcus, outros

Staphylococcus 2H₂O₂

2H₂+ O₂

Teste da Coagulase ( - )

( + )

Staphylococcus Coagulase positiva

Staphylococcus Coagulase negativa

- S. aureus - S. intermedius (mordedura) - S. schleiferi - S. hyicius Fibrinogênio Fibrina

Micrococcus e correlatos Oxidase. Outras provas Novobiocina ( R ) ( S ) - S. saprophyticus - S. hominis (novobio.) - S. cohnii - S. sciuri - S. epidermidis - S. haemolitycus - S. lugdunensis - Outros

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Teste da Catalase

• Formação de bolhas

–

Positivo: Staphylococcus

• Ausência de bolhas

–

Negativo: Streptococcus, Enterococcus e outros

S. aureus em TSA

2H

2

O

2

2H

2

+ O

2

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Teste da Coagulase e Aglutinação

S. lugdunensis e S. schleiferi positivos

S. lugdusensis negativo Outros SCoP - S.

intermedius, S. hyiciuse S. schleiferi

Coagulase livre

Coagulase ligada (clumping factor) Aglutinação - Clumping Factor e PtnA e Cápsula

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Outras Provas S. aureus vs SCoN

Termonuclease

• S. aureus

produz nuclease

termoestável

–

S. lugdusensis

negativo

–

Outros SCoP - S.

intermedius, S. hyicius

e

S. schleiferi

- positivos

Fermentação Manitol

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Micrococcus e relacionados

• Microbiota pele humana - raramente isolado de infecções humanas – M. luteus, Kocuria kristinae e Rothia mucilaginosa

• Pigmento amarelo - Micrococcus

• Arranjo - Tétrade

• Oxidase - Micrococcus e Kocuria

• Sensíveis bacitracina

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Painéis de Identificação

API ID32 Staph – Biomerieux

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Métodos Automatizados

• Acurácia entre 70% - >90% (species level) • Meta-análise - 9 estudos incluídos para SCoN

ID

Identificação Correta de SCoN (%)

P value

N isolados Phoenix N isolados Vitek2

Gênero 670 98.7 372 99.7 0.113

Espécie 895 88.4 740 91.9 0.489

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Métodos Automatizados

• Problemas (entre SCoN relevância clínica)

– S. hominis = não identificado ou identificado erroneamente

– S. epidermidis = identificado como S. hominis ou outras espécies

– S. capitis = identificado como S. haemolyticus

– S. haemolyticus = S. lentus ou S. warneri

F. Layer et al. JCM, Aug. 2006, p. 2824-2830 Carroll KC et al. JCM, Jun 2006, p. 2072-2077 Hwang SM et al. JCM, Dec. 2011, p. 4142-4149

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Identificação Molecular

• 16S rDNA

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Identificação Molecular

• 16S rDNA

Públicos

• GenBank / BLAST (NCBI / NIH) • RDP - Ribossomal Data Project • DDBJ - DNA Data Bank of Japan

• RIDOM - Ribossomal Differentiation of Medical Microorganisms

Comerciais

• MicroSeq (Applied Biosystems) • SmartGene IDNS (Smart Gene)

≥ 99% - Identificação espécie

<99% - ≥95% - Identificação gênero

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Outros Alvos para Sequenciamento

Al v o s M o le c u lare s Poder discriminatório 16S rDNA gap groEL sodA tuf rpoB

dnaJ Seq. Parcial

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Identificação por Multiplex PCR

Baseado no gene nuc

1 – S. hominis 2 – S. epidermidis 3 – S. aureus 4 – S. haemolyticus 5 – S. capitis 6 – S. lugdunensis 7 – S. saprophyticus 8 – S. warneri 9 – S. caprae 10 – Controle negativo

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Idenficação por MALDI-TOF

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Implementação MALDI-TOF na Rotina

• Johns Hopkins - 12 semanas, 952 isolados testados

• ID MALDI vs Rotina (Phoenix + Manual)

Tan KE et al. J Clin Microbiol. 2012;50(10):3301-8.

Day of Workup

% of Identified Organisms

MALDI-TOF

Standard Protocol

1

st

day

87.2%

9.4%

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Implementação MALDI-TOF na Rotina

Tempo para identificação reduzido em até 1.45 dias em média

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Implementação MALDI-TOF na Rotina

$ 102,413.00

Custos

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• ATCC (n=25) e Isolados clínicos (n=117)

• MALDI-TOF – Bruker Daltonics (BioTyper V3 database)

• Seq. tuf utilizado como padrão para casos discordantes

Loonen AJ et al. J Clin Microbiol. 2012 Apr;50(4):1437-9

Método (%)

MALDI-TOF 99.3*

VITEK2 92.3

API ID32 Staph 85.9

16S rDNA 70.4

Taxa de espécies de SCoN corretamente identificadas

* 1 S. hominis não foi identificado

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Impacto ID rápida por MALDI-TOF combinada com intervenção antimicrobiana

em pacientes adultos com bacteremia e candidemia

• University of Michigan

• 501 pacientes (256 preinterv. vs. 245 interv.)

• Sem diferenças importante baseline demographics, co-morbidades e etiologias entre os grupos

• MRSA % maior no grupo intervenção (3.7% vs. 9.7% P= 0.005)

• Impacto primário: tempo para identificação

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Impacto ID rápida por MALDI-TOF combinada com intervenção

antimicrobiana em pacientes adultos com bacteremia e candidemia

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Concluindo

• Testes automatizados

–

Boa acurácia

–

ID espécies

• MALDI-TOF

–

Acurária semelhante ou melhor que

testes automatizados

–

Rápido e simples na rotina

–

Possível impacto clínico

• Molecular

–

Melhor acurácia – Gold Standard

–

Laboratórios referência (maior

complexidade)

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paulo_bispo@meei.harvard.edu

OBRIGADO!

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