Hemoglobinopatias : contributo da Genética M olecular

(1)

Dia do INSA

A Referência: Função essencial do INSA

Hemoglobinopatias:

contributo da Genética Molecular

João Gonçalves

Unidade de Genética Molecular – Lisboa

Departamento de Genética

joao.goncalves@insa.min-saude.pt

UMOL_2009.09.29 _ Dia do INSA (J.G.)

DEPARTAMENTO DE GENÉTICA

Unidade de Citogenética Unidade de Genética Médica Unidade de Genética Molecular Unidade de Rastreio Neonatal Unidade de Investigação e Desenvolvimento Núcleo de Apoio Unidade de Bioquímica Genética Unidade de Tecnologia e Inovação

Lab. Lisboa João Gonçalves Lab. Porto Rosário Santos

(2)

H em oglobinopatias : contributo da G enética M olecular

Departamento de Promoção da Saúde e Doenças Crónicas

>

Hemoglobinopatias Unid. Lab. de Referência

Departamento de Genética

UnidUnidde Gende Genéética Molecular tica Molecular LisbLisb..

…

Hemoglobinopatias (Genética Molecular) …

> Médico Solicita Análise <

Hospital – Serviço Hematologia

Serviço Genética Centro DPN Lab. Análises Clínicas

Cons. Privado

? Identif. Molecular HB variante

? Identif. Molecular Talassémia

>

Portador <

>

Doente <

>

Casal em Risco, DPN <

>>> Avaliação Hematol. e Bioq.<<<

Coop eraç ão/ parti lha d e res ultado s e de c onhe cimen tos Co_op era_çã o/ pa rtilh a d e r_es ulta_do s e de co_nh ec_im en tos Cooperação/ partilha de resultados e de conhecimentos Co_op era_çã o/ pa rtilh a d_{e r} es ulta_do s e de co_nh ec_im en tos Coop eraç ão/ parti lha d e res ultado s e de co nhec imen tos Departamento de Genética Unidade de Investigação e Desenvolv. > Grupo de Investigação em hemoglobinopatias e metab. Ferro

Contributo da Genética

Molecular integra-se no

Programa Nacional de Controlo das

hemoglobinopatias

Prevalência de portadores de

beta-talassémia na pop. Portuguesa _{hemoglobina S na pop. Portuguesa}Prevalência de portadores de

Martins MC et al (1993) Hereditary anaemias in Portugal: epidemiology, public health significance, and control. J Med Genet 30:235-239.

(15208 indivíduos ♂: ββββtal:0,45%; HbS: 0,32%)

Base Científica

para o

Programa Nacional de Controlo

das Hemoglobinopatias, 1986 (PNCH)

⇒Cooperação com a OMS ⇒Coordenação do INSA DGS: Circ Norm Nº 18/DSMIA de 07/09/2004

Objectivos:

- Prevenção

> Diagnóstico

> Idef. Casais em risco

> Aconselhamento Genético

> DPN molecular

- Tratamento

- Investigação

H em oglobinopatias : contributo da G enética M olecular

(3)

Prevalência de portadores de

hemoglobinopatia β em Portugal

HbS

β-Talassémia

Inez et al, Arq INSA 1993, 19:27

“Bolsas” de alta prevalência:

5-10%

População (2006): 10,9 x 10

6

Nascimentos (2007): 102 x 10

3

Prevalência (global)

de portadores: 1-2%

Incidência:

5-10 casos/ano

SS,

Sβ-Tal,

β-Talβ-Tal

H em oglobinopatias : contributo da G enética M olecular

183

38

89

56 Total

30 (16.4%)

9

14

7 Talassémia

15 (8.2%)

1

7

7 Tal-Drepanocitose

138 (75,4%)

28

68

42 Drepanocitose

Total

Afectado

Portador

Normal

Doença

DPN de Hemoglobinopatias de 1990 a Set2009

H em oglobinopatias : contributo da G enética M olecular

(4)

εεεε

G

γγγγ

A

γγγγ

ϕ

β

3’

δ

5’

Agrupamento génico da β β β β globina (11p15.5)

Gene: HBB

5’

1 pb

93 222

126

3’

2

3

130 850

Cd

1 30 31 104 105 146

CD 6: GAG>GTG

(c.20A>T)

p.Glu6Val ⇒

⇒

Hb S

H em oglobinopatias : contributo da G enética M olecular

Diagnóstico molecular de Drepanocitose - Metodologias

2. BI-PASA (PCR bidireccional específica de alelo)

M N

Mutação: c.20A>T (p.Glu6Val)

AA AA SS AS AA

800 pb

N

C

500 pb 300 pb

C

M 1. PCR e Restrição Enzimática (Bsu 36 I) controlos AS SS AS SS AS AA

Mutação: c.20A>T (p.Glu6Val)

390 pb Dig. Bsu 36 I: Mutação : 390 pb Alelo Normal: 213 e 177 pb M N

f m f

Análise Molecular:

-Amostras de DNA dos pais (SE; casal PNCH) - DNA fetal analisado em duplicado (LA; VC) - Dois métodos de análise molecular (independentes). -Pesquisa de contaminação materna do DNA fetal (VNTRs)

-Utilização dos controlos necessários que nos permite a validação interna de cada ensaio

H em oglobinopatias : contributo da G enética M olecular

(5)

Sequenciação automática

de fragmentos de DNA obtidos por PCR

(c.20A>T)

p.Glu6Val ⇒

⇒

Hb S

GAG>GTG

H em oglobinopatias : contributo da G enética M olecular

DPN de Drepanocitose

pai mãe feto feto C. Neg MPM

Pesquisa de contaminação materna

no DNA fetal: VNTR (DXS52)

Portador de Hb S

Portadora de Hb S

Mutação: c. [20A>NT] + [=] (p.Glu6Val)

Mutação: c.20A>T (p.Glu6Val) c.[20A>T] + [20A>T]

H em oglobinopatias : contributo da G enética M olecular

Feto não possui alelo

c

materno a b c Mutação: c. [20A>NT] + [=]

(p.Glu6Val)

(6)

Natural de S. Tomé e Príncipe C/ Anemia (Hb A2:3,6%;

Hb S

: 35%) Pede-se estudo fetal de hemoglobinopatia

Sangue materno

(enviado para Lab Hematologia (PNCH))

Não foi possível fazer o estudo

do marido desconhecendo-se se tem anemia. Pai inacessível.

LA; Gestação de 16 semanas

?

H em oglobinopatias : contributo da G enética M olecular

DPN de Drepanocitose

-Utilização dos controlos necessários que nos permite a validação interna de cada ensaio

Feto: Heterozigótico composto para as mutações HBB:c.19G>A (HbC); p.Glu6Lys e HBB:c.20A>T (HbS); p.Glu6Val

HbC

HbS

Natural de S. Tomé e Príncipe

(Hemog: 11,3 g/dL; VGM: 86,0 fL; HGM: 28,9 pg) Hb F: 2,0%;

Hb C:38,0%)

Pede-se estudo fetal de hemoglobinopatia Não foi possível fazer o estudo do marido

desconhecendo-se se tem anemia. Inacessível

LA; Gestação de 16 semanas: Afectado –

Hb SC

?

H em oglobinopatias : contributo da G enética M olecular

(7)

Confirmação hematológica e bioquímica

Portador de Hb S Confirmação hematológica e bioquímicaPortadora de Hb S

Despiste de contaminação

materna do DNA fetal

(VNTR)

f P M f CN MP

DPN

Análise Molecular:

-

Amostras de DNA dos pais.

- DNA fetal em duplicado.

- Dois métodos de análise molecular (independentes).

-

Pesquisa de contaminação materna do DNA fetal (VNTRs)

-

Utilização dos controlos necessários que nos permite a validação interna de cada ensaio

H em oglobinopatias : contributo da G enética M olecular

Mutação: c. [20A>NT] + [=]

?

p1

p2 m

feto

Pai

mãe

Feto: 6/9 alelos não se encontram no (pai)

STR

D3S1 358 AM GX AMG Y D5S8 18 vWA1 2p12 D21S 11 D13S 317 FGA 4q28 D7S8 20 D18S 51 D8S1 179

(8)

Confirmação hematológica e bioquímica

Portador de Hb S Confirmação hematológica e bioquímicaPortadora de Hb S

Despiste de contaminação

materna do DNA fetal

(VNTR)

f P M f CN MP

DPN

Análise Molecular:

-

Amostras de DNA dos pais.

- DNA fetal em duplicado.

- Dois métodos de análise molecular (independentes).

- Pesquisa de contaminação materna do DNA fetal (VNTRs)

H em oglobinopatias : contributo da G enética M olecular

Mutação: c. [20A>NT] + [=]

?

p1

p2 m

? ?

Sequenciação completa

do gene HBB

Portador de Hb S Portadora de Hb S

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(9)

Diagnóstico e prevenção de hemoglobinopatia

Portador

População

Caso-índice

História familiar

Rastreio

(doentes e portadores)

STOP

Rastrear parceiro

Portador?

N

S

STOP

N

S

Aconselhamento

DPN?

N

STOP

S

Amniocentese ou

biópsia do córion

Afectado?

STOP

N

S

IVG?

S

STOP

N

IVG

DPN-

LAB

Doente?

Portador?

H em oglobinopatias : contributo da G enética M olecular

Lab./Unidade Genética Molecular -

Qualidade/Referência

DPN de Hemoglobinopatia

- Recepção de produtos Biológico (colheitas)

> Registos

- Extracção de DNA (diferentes métodos)

> Dif. produtos biológ. (SP; LA; Vil.)

-

Diferentes métodos de análise

> PCR - Dig. enzimática

> BI-PASA

> ARMS

> Sequenciação

- Leitura e Interpretação dos resultados por TDT e TSS

- Registo de resultados

- Validação final/global dos resultados

- Elaboração de relatórios directivas internacionais

- Participa em ensaios de avaliação externa da qualidade

Validação

interna dos

resultados

H em oglobinopatias : contributo da G enética M olecular

Lab.

Referência

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