ESPECTROMETRIA A LASER COMO FERRAMENTA DA
DETERMINAÇÃO DA ASSINATURA ISOTÓPICA DE CARBONO
Aluna: Carolina Y. K. Japiassú Orientador: José Marcus Godoy Coorientadora: Gisele Birman Tonietto
Introdução
A determinação da composição isotópica de elementos estáveis tem grande importância em muitas áreas, como por exemplo, a química e a medicina, e é encontrada em diversas aplicações como: análise de alimentos e bebidas, análise de fármacos, estudos arqueológicos, determinação de doping, identificação isotópica da origem dos solos, estudos hidrológicos, traçar padrões e verificar mecanismos fisiológicos em organismos; traçar fluxos energéticos em cadeias alimentares, no entendimento de paleo-dietas, entre outros [1] [2].
Além disso, a técnica dos isótopos estáveis tem sido utilizada como ferramenta de controle de qualidade nas indústrias de alimentos e bebidas, bem como nas instituições oficiais de fiscalização como instrumento de atuação de produtos fraudados.
A maioria das técnicas isotópicas requer a utilização de banco de dados oriundo de valores isotópicos das matérias-primas como referência de comparação para estimar a composição dos produtos a serem analisados [3].
A técnica analítica utilizada nesse projeto foi a espectroscopia de cavidade ressonante do tipo ring-down (CRDS), que é uma técnica baseada em absorção ótica linear a laser, e que vem crescendo bastante atualmente. Uma das principais vantagens dessa técnica sobre as demais técnicas tradicionais de espectroscopia é o seu extenso caminho ótico, fazendo com que a técnica se torne muito eficaz, tornando sua sensibilidade extremamente alta [4]. Já em comparação com técnicas onde se usa espectrômetros de massa, a CRDS exige pouco ou nenhum tratamento da amostra e desta forma o tempo de análise é menor.
O equipamento usado foi o analisador isotópico i TOC-CRDS, que combina um analisador de carbono orgânico total (TOC) da OI Analytical com um espectrômetro de cavidade ressonante do tipo ring-down (CRDS) G1111-i da Picarro. Foram realizadas diversas análises de padrões sólidos e líquidos como, a sucrose, a celulose, o ácido glutâmico, a cafeína, dentre outros, e a partir dessas análises foi possível verificar o desempenho do método através dos parâmetros de linearidade, da exatidão, da precisão e da reprodutibilidade.
Objetivo
O objetivo principal desse projeto foi avaliar o potencial da técnica de análise isotópica com analisadores isotópicos a laser a partir de diversas análises de padrões sólidos e líquidos. E, além disso, aprender e conhecer mais sobre a análise isotópica e com isso capacitar-me na técnica analítica.
Materiais e Métodos Experimentais A. Materiais - Cadinhos de quartzo de 1mL; - Lã de quartzo; - Pinça; - Espátula; - Balão volumétrico de 1L; - Béquer de 50mL;
- Vials de 40 mL;
- Pipeta volumétrica de 50 L; - Pipeta volumétrica de 500 L; - Pipeta volumétrica de 1000 L.
B. Reagentes
- Água ultra pura, tipo Milli-Q; - Ácido fosfórico (Vetec); - Persulfato de sódio (Vetec); - Biftalato de potássio. C. Padrões - Sucrose; - Cafeína; - Ácido Glutâmico; - Óleo; - Celulose. D. Equipamentos
- Analisador de carbono orgânico total (TOC), OI Analytical Aurora modelo 1030, acoplado a um espectrômetro de cavidade ressonante do tipo ring-down (CRDS), Picarro G1111-i;
- Amostrador automático, OI Analytical modelo 1088; - Balança analítica Shimadzu, modelo AY220.
E. Metodologia - Preparo dos reagentes
Persulfato de Sódio 10%
Pesou-se 100g de Na2S2O8, diluiu-se com água Milli-Q e avolumou-se para 1L.
Ácido Fosfórico 5%
Foram medidos 59,0 mL de H3PO4 85% e avolumou-se para 1L com água Milli-Q. - Análise de padrões/amostras sólidas
Antes de realizar as análises no módulo sólido é necessário condicionar os cadinhos que serão utilizados, com isso coloca-se um pouco de lã de quartzo em cada cadinho criando uma “cama” para as amostras (ver figura 1). Em seguida, colocou-se cada cadinho no módulo sólido e no software do próprio equipamento clicou-se em Maint, depois na opção Solids, com isso aparecerá uma janela e na opção Run Macro, selecionou-se Codition Cup e clicou-se em Go. Feito isso o cadinho foi elevado a temperaturas altas para ser retirado o carbono residual que possa existir nele.
Figura 1. Cadinho com lã de quartzo.
Após isto, é necessário fazer uma calibração do TOC (carbono orgânico total) para calibrar o equipamento que será usado e para isto usou-se o biftalato de potássio. As contas realizadas para fazer as soluções foram feitas em função da massa de carbono. Com isso, a partir dos cálculos feitos para preparar 50 mL de uma solução estoque de Carbono de 10000 mg L-1 C, pesou-se 1,0635 g de biftalato de potássio e avolumou-se com água ultra pura tipo Milli-Q. Com a solução já preparada e os cadinhos já condicionados, preparou-se uma curva de calibração, para isto foi pipetado no 1º cadinho 50L, no 2º 100 L e no último 150L, todos da solução de 10000 mg L-1 C e esses pontos foram analisados em duplicata. O método e a sequência foram editados no próprio software do Aurora 1030. Com o TOC já calibrado, pode-se calibrar o equipamento, assim os seguintes padrões foram usados: ácido glutâmico, sucrose, celulose e óleo, e as massas pesadas dos padrões foram: 0,0034 g, 0,0043 g, 0,0033 g e 0,0044g respectivamente. Para a calibração do CRDS, utilizou-se o programa IsoDeltaRecal e usou-se os valores de delta apresentados na tabela 1 abaixo:
Padrões 13 C) Obtido Ácido Glutâmico 37,506 Sucrose -13,681 Celulose -23,349 Óleo -30,681
Tabela 1. Delta de padrões obtidos.
Após estes procedimentos o equipamento já estava em condições para poder analisar amostras e/ou padrões sólidos. Porém, é importante ressaltar que o equipamento apresentou diversos problemas e com isso não foi possível analisar muitas amostras.
- Análise de padrões/amostras líquidas
Novamente foi necessário calibrar o TOC (carbono orgânico total) para calibrar o equipamento que será usado e usou-se também o biftalato de potássio. A solução estoque 10000 mg L-1 C foi preparada igualmente, após isto preparou-se 10 mL de uma solução de 1000 mg L-1 C, para isto utilizou-se 1 mL da solução estoque já preparada e adicionou-se 9 mL de água ultra pura tipo Milli-Q. Deste modo com a solução de 1000 mg L-1 de Carbono preparou-se a curva de calibração com os seguintes pontos: 5, 25, 50 e 100 mg L-1, e eles foram analisados em triplicata. O método e a sequência foram editados no próprio software do Aurora 1030. Feito essa calibração, era preciso fazer a calibração do equipamento.
Os padrões escolhidos para a calibração do CRDS pelo módulo líquido foram: a cafeína (C8H10N4O2), a sucrose (C12H22O11) e o ácido glutâmico (C5H9NO4), como se trata de padrões
sólidos foi necessário fazer soluções para cada padrão com cálculos baseados na massa de carbono. Para preparar 10 mL de uma solução de cafeína 10000 mg L-1 C, pesou-se 0,202 g de cafeína e avolumou-se para 10 mL com água Milli-Q, depois preparou-se uma nova
solução de 1000 mg L C pipetando 1 mL da solução de 10000 mg L e adicionando 9 mL de água Milli-Q. Deste modo para analisar uma solução de cafeína 50 mg L-1, pipetou-se 2 mL da solução de 1000 mg L-1 C, com o auxílio da pipeta de 1000 L no vial e avolumou-se com água Milli-Q para 40 mL (tamanho do vial). Já para preparar 10 mL de uma solução de ácido glutâmico 10000 mg L-1 C, pesou-se 0,245 g de ácido glutâmico e avolumou-se para 10 mL com água Milli-Q, em seguida preparou-se uma solução de 1000 mg L-1 C pipetando 1 mL da solução de 10000 mg L-1 C já preparada e adicionando 9 mL de água Milli-Q. Com isso, para analisar uma solução de ácido glutâmico 50 mg L-1, foi necessário pipetar 2 mL da solução de 1000 mg L-1 C no vial e avolumar para 40 mL. E para preparar 10 mL de uma solução de sucrose 10000 mg L-1 C, pesou-se 0,237 g de sucrose e avolumou-se para 10 mL com água Milli-Q, depois preparou-se 10 mL de uma solução 1000 mg L-1 C pipetando 1 mL da solução de 10000 mg L-1 C e adicionando 9 mL de água Milli-Q. Deste modo para analisar uma solução de sucrose 50 mg L-1, pipetou-se 2 mL da solução de 1000 mg L-1 C no vial e avolumou-se para 40 mL. Com as soluções já preparadas, foi montada a seguinte sequência: cafeína 50 mg L-1, cafeina 50 mg L-1, sucrose 50 mg L-1, sucrose 50 mg L-1, ácido glutâmico 50 mg L-1 e ácido glutâmico 50 mg L-1 e ela foi analisada com o método já calibrado. Para eliminar efeitos de memória os valores de delta usados para a calibração do CRDS foram os segundos de cada padrão.
Novamente usou-se o programa IsoDeltaRecal para a calibração do CRDS e os valores de delta usados seguem na tabela 2 abaixo:
Padrões (13C) Obtido
Ácido Glutâmico 33,148 Sucrose -10,997 Cafeína -27,605
Tabela 2. Delta de padrões obtidos.
Com isto, o CRDS já estava pronto para poder analisar amostras e/ou padrões líquidos. Mas como o equipamento necessitou de algumas trocas de peças, onde foi preciso importar algumas, o que levou bastante tempo, além de diversas visitas do técnico, a estabilização de todos os equipamentos usados foi demorada, o que acabou interferindo no cronograma do projeto, pois não foi possível fazer análises de muitas amostras.
Esses valores de delta estão presentes no relatório que é gerado após cada análise. Nesse relatório, pode-se observar os valores das áreas dos picos, a média e o desvio padrão desses valores, além do valor de CO2 que deve estar entre 2000 e 4000 ppmV, e além disso é
possível ver também detalhes do método utilizado e a curva de calibração.
Resultados e Discussões
Apesar dos diversos problemas que ocorreram durante o período do projeto, foi possível obter alguns resultados bons. A curva de calibração do método pelo módulo líquido ficou ótima, como mostra o gráfico 1, e os valores dos pontos dos gráficos seguem na tabela 3 abaixo:
Área do pico Concentração (mg L-1)
59509 5
293408 25
561236 50
Gráfico 1 – Curva de calibração pelo módulo líquido.
A equação da reta obtida foi y= 1132x + 7874,9, com R2= 0,9995. Observa-se que a curva montada tinha 4 pontos, porém como o último ponto não ficou bom, ele foi retirado, com isso obteve-se uma curva de calibração boa. E a partir desse método com essa curva, o CRDS foi calibrado.
Mas, já a curva de calibração pelo método sólido, não ficou tão boa, como mostra o gráfico 2. Os pontos do gráfico seguem na tabela 4 abaixo:
Área do pico Massa (mg de C)
10976 0,5
24383 1,0
34945 1,5
Tabela 4. Pontos da curva de calibração pelo módulo sólido.
Gráfico 2 – Curva de calibração pelo módulo sólido.
A equação da reta obtida foi y= 23969x - 534,33, com R2= 0,9953. A partir do gráfico percebe-se que não é uma curva de calibração boa, isto pode ter ocorrido devido aos problemas existentes no equipamento. Porém para realizar análises no módulo sólido esse método com essa curva foi usado.
Já para a calibração do CRDS era necessário fazer uma comparação entre os valores esperados e os obtidos da razão isotópica de carbono. Os valores de delta obtidos pelas
0 100000 200000 300000 400000 500000 600000 0 10 20 30 40 50 60 Ár ea d o p ico Concentração (mg L-1)
Curva de Calibração (Líquido)
0 10000 20000 30000 40000 0 0,5 1 1,5 2 Ár ea d o p ico Massa (mg de C)
Curva de Calibração Sólido
análises dos materiais de referência no módulo líquido e os valores esperados estão listados na tabela 5 abaixo:
Padrões (13C) esperado (13C) obtido
Ácido Glutâmico 37,626 33,148
Cafeína -27,771 -27,605
Sucrose -10,449 -10,997
Tabela 5. Valores da razão isotópica esperados e obtidos.
A partir desses valores pode-se construir a curva analítica do CRDS, que é mostrada no gráfico 3 abaixo:
Gráfico 3 – Curva analítica do CRDS pelo módulo líquido.
A equação da reta obtida foi y= 1,079x + 1,7637, com R2= 0,9999. Observa-se que os valores da razão isotópica esperados e obtidos da cafeína e da sucrose estão bem próximos, mas já os do ácido glutâmico não estão tão bons. Essa comparação é importante, pois a partir dela sabe-se quando o equipamento está em condições de analisar amostras onde o delta não é um valor conhecido, isto é, quando o CRDS consegue chegar no valor esperado para os padrões, ele é capaz de analisar amostras como: biocombustíveis, biomassas, açúcar, dentre outras e encontrar o delta delas com confiança.
Também foi feita essa comparação usando o módulo sólido, e os valores seguem na tabela 6 abaixo:
Padrões 13C) esperado 13C) obtido
Ácido Glutâmico 37,626 37,506
Sucrose -10,449 -13,681
Celulose -24,724 -23,349
Óleo -30,031 -30,681
Tabela 6. Valores da razão isotópica esperados e obtidos.
E novamente foi possível construir a curva analítica do CRDS usando agora esse novos valores, como é mostrados no gráfico 4:
-40 -20 0 20 40 60 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 ( 13 C) e sp er ad o (13C) obtido
Gráfico 4 – Curva analítica do CRDS pelo módulo sólido.
A equação da reta obtida foi y= 0,9973x + 0,6363, com R2= 0,9961. Essa curva não é considerada boa, apesar de alguns valores de deltas terem ficados bem parecidos como é o caso do ácido glutâmico e do óleo. Nesse caso o se aconselha fazer novas medidas para obter uma curva de analítica melhor, e assim calibrar o CRDS de maneira correta.
Conclusão
Apesar dos imprevistos que ocorreram durante o período do projeto, foi possível obter alguns resultados como: uma boa curva de calibração com R2 igual a 0,9995, como é mostrado no gráfico 1, bons valores de delta para materiais de referência e baixos desvios padrão.
Com isso concluiu-se que além dessa nova técnica ser rápida e simples, pois as amostras não precisam de tratamento prévio, já que todo o tratamento necessário é realizado on-line diminuindo com isso os erros associados e os resíduos, ela também é bastante eficiente.
Referências
1 - BENSON, S. et al. Forensic applications of isotope ratio mass spectrometry – A review.
Forensic Science International, v. 157, n. 1, p. 1 – 22, 2006.
2 - PETERSON, B. J.; FRY, B. Stable isotopes in ecosystem studies. Annual Review of
Ecology and Systematics, v. 18, p. 293 – 320, 1987.
3 - KELLY, S. D. Using stable isotope ratio mass spectrometry (IRMS) in food authentication and traceability. In: LESS, M. Food authenticity and traceability. London: Woodhead, chap. 7, 2003, p. 156 – 183.
4 – CROSSON, E. R. WS-CRDS: Precision Trace Gas Analysis and Simplified Stable Isotope Measurements. American Laboratory, v. 40, n. 20, p. 37-+, 2008
-40 -20 0 20 40 60 -40 -20 0 20 40 60 (13C ) esp er ad o (13C) obtido
