UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS PARA A SAÚDE
ANDRÉA BEZERRA DA NÓBREGA
PADRONIZAÇÃO DE EXTRATOS DE Eugenia florida DC. E SEU ESTUDO TOXICOLÓGICO PARA O DESENVOLVIMENTO DE UM FITOTERÁPICO OU
FITOFÁRMACO
NITERÓI 2012
ANDRÉA BEZERRA DA NÓBREGA
PADRONIZAÇÃO DE EXTRATOS DE Eugenia florida DC. E SEU ESTUDO TOXICOLÓGICO PARA O DESENVOLVIMENTO DE UM FITOTERÁPICO OU
FITOFÁRMACO
Dissertação submetida como requisito para obtenção do grau de Mestre em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal Fluminense.
Orientadora: Profa. Dra. SELMA RIBEIRO DE PAIVA Co-orientadora: Profa. Dra. GLAUCIA B. C. ALVES SLANA
NITERÓI 2012
ANDRÉA BEZERRA DA NÓBREGA
PADRONIZAÇÃO DE EXTRATOS DE Eugenia florida DC. E SEU ESTUDO TOXICOLÓGICO PARA O DESENVOLVIMENTO DE UM FITOTERÁPICO OU
FITOFÁRMACO
Dissertação submetida como requisito para obtenção do grau de Mestre em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal Fluminense.
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Selma Ribeiro de Paiva – Orientadora Universidade Federal Fluminense – UFF
Profa. Dra. Magdalena do Nascimento Rennö Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ
Prof. Dr. José Luiz Pinto Ferreira Universidade Federal Fluminense - UFF
Dra. Glaucia B. C. Alves Slana (Co-orientadora e suplente) Instituto Nacional de Propriedade Industrial – INPI
Profa. Dra. Luciana Moreira Chedier (suplente e revisora) Universidade Federal de Juiz de Fora - UFJF
NITERÓI 2012
Dedico esta dissertação:
A minha avó (in memorian), mãe e irmãs que sempre me deram muito amor, carinho, educação, força, incentivo, companheirismo e amizade. Sem elas nada disso seria possível.
AGRADECIMENTOS
À Deus por proporcionar a oportunidade de chegar até aqui e conquistar mais este título em minha vida.
À minha mãe, exemplo de força e dedicação, e irmãs por tudo que sempre fizeram por mim e por terem acreditado que conseguiria qualquer coisa que eu quisesse.
Às orientadoras Dra. Glaucia Slana e Dra. Selma Paiva, por acreditarem na minha capacidade, pelo incentivo de sempre e grande aprendizado.
Ao Glauco Villas Boas pela compreensão e liberação para capacitação
Aos colegas da Plataforma Agroecológica de Fitomedicamentos, em especial Eliete, Marcio, Cristiane, Sandra e Valério por compreenderem muitas vezes a minha ausência durante este período de capacitação.
Ao Eloizio pela ajuda no processamento primário de algumas espécies.
Ao Sergio Monteiro por viabilizar coletas de plantas e depósitos de vouchers no Jardim Botânico do Rio de Janeiro.
Aos colegas da Plataforma de Metodologia Analítica por me receberem tão bem e ajudarem na realização deste trabalho.
Ao Bruno Lessa pelo apoio técnico excepcional e uma incansável disposição em ajudar nos experimentos.
Aos estagiários Riethe, Juliana, Tamires, Flávio e Elaine, pelo auxílio em vários dos trabalhos desenvolvidos durante o mestrado.
À Dra. Isabel Paixão e Levino Menezes do Laboratório de Virologia Molecular do Departamento de Biologia Celular e Molecular do Instituto de Biologia da Universidade Federal Fluminense pelos ensaios citotóxicos.
Ao Dr. João Ernesto Carvalho e Ana Lúcia Ruis do Laboratório de Farmacologia e Toxicologia do Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas da Universidade Estadual de Campinas pelos ensaios toxicológicos.
Aos amigos por compreenderem os momentos de estresse e de isolamento para estudar.
À grande amiga Ana Claudia pelo carinho, paciência, compreensão e incentivo de sempre.
SUMÁRIO
SUMÁRIO... ... I LISTA DE ABREVIATURAS... ... II LISTA DE TABELAS ... III LISTA DE FIGURAS ... IV RESUMO ... V ABSTRACT ... VI
1 INTRODUÇÃO 1
1.1 Uso de Plantas Medicinais no Brasil ... 2
1.2 Plantas Medicinais X Indústria... 2
1.3 Aspectos Legais... 4
1.4 Família Myrtaceae ... 5
1.5 Gênero Eugenia L. ... 5
1.6 Eugenia florida DC ... 6
1.7 Triterpenos... 9
1.7.1 Atividades Farmacológicas do Ácido Betulínico ... 12
1.7.1.1 Atividade Anti-inflamatória ... 12
1.7.1.2 Atividade Antimalárica... 12
1.7.1.3 Atividade Antitumoral... 13
1.7.1.4 Atividades Antibacteriana e Antiviral ... 14
1.7.2 Citotoxidez e Mecanismo de Ação do Ácido Betulínico ... 15
1.7.3 Obtenção do Ácido Betulínico ... 15
1.7.3.1 Obtenção por Fonte Natural ... 16
1.7.3.2 Obtenção por Síntese ... 16
1.8 Estudo Químico de Plantas... 17
1.8.1 Escolha da Planta... 17
1.8.2 Levantamento das Referências Bibliográficas ... 18
1.8.3 Coleta... 19
1.8.4 Identificação Botânica ... 21
1.8.6 Extração ... 22 1.8.6.1 Métodos de Extração ... 23 1.8.6.1.1 Maceração... 25 1.8.6.1.2 Percolação... 25 1.8.6.1.3 Soxhlet ... 26 1.8.6.1.4 Ultrassom... 26 1.8.7 Determinação Estrutural ... 27
1.8.8 Ensaios Biológicos e Farmacológicos ... 27
1.2 Metodologias Analíticas ... 28
1.2.1.Cromatografia... 28
1.2.1.1 Cromatografia em Coluna ... 29
1.2.1.2 Cromatografia Gasosa (CG) ... 30
1.2.1.3 Cromatografia em Camada Fina... 31
1.2.1.4 Cromatografia de Camada Fina em Alta Eficiência (CCFAE / Densitometria) ... 31
1.2.2 Validação de Metodologias Analíticas ... 32
1.2.2.1 Especificidade/Seletividade... 34 1.2.2.2 Função de Resposta ... 34 1.2.2.3 Intervalo de Trabalho... 35 1.2.2.4 Linearidade ... 35 1.2.2.5 Exatidão ... 35 1.2.2.6 Precisão... 35
1.2.2.7 Limite de Detecção (Sensibilidade)... 36
1.2.2.8 Limite de Quantificação ... 36 1.2.2.9 Robustez ... 36 2 OBJETIVOS 37 2.1 Objetivos Gerais ... 37 2.2 Objetivos Específicos ... 37 3 JUSTIFICATIVA 37 4 MATERIAIS E MÉTODOS 38 4.1 Solventes e reagentes... 38 4.2 Equipamentos ... 38 4.3 Vidrarias ... 39
4.5 Identificação Botânica ... 42
4.6 Estudo Comparativo dos Métodos de Extração... 43
4.6.1 Escolha do(s) Solvente(s) ... 44
4.6.2 Extração por Maceração Estática ... 44
4.6.3 Extração por Maceração Dinâmica... 44
4.6.4 Extração por Percolação ... 45
4.6.5 Extração por Soxhlet ... 45
4.6.6 Extração por Ultrassom ... 45
4.7 Avaliação de diferentes Granulometrias... 46
4.8 Isolamento e Purificação do Ácido Betulínico ... 46
4.9 Caracterização do Ácido Betulínico ... 47
4.9.1 Espectrometria no Infravermelho ... 47
4.9.2 Ressonância Magnética Nuclear... 47
4.9.3 Ponto de fusão ... 47
4.9.4 Espectrometria de Massas ... 47
4.10 Estudo de Variabilidade da Produção Metabólica... 47
4.11 Extração de Outros Indivíduos de Eugenia florida DC... 48
4.12 Extração de Outras Espécies Produtoras de Ácido Betulínico ... 48
4.13 Desenvolvimento de Metodologias Analíticas ... 49
4.13.1 Metodologia Analítica Desenvolvida por Cromatografia em Fase Gasosa (CG-DIC) ... 49
4.13.2 Validação da Metodologia Analítica por CG-DIC ... 50
4.13.3 Metodologia Analítica Desenvolvida por Cromatografia de Camada Fina (CCF / Densitometria) ... 50
4.13.4 Validação da Metodologia Analítica por CCF/Densitometria ... 51
4.14 Ensaios Citotóxicos ... 51
4.15 Ensaios em Células Tumorais... 52
4.15.1 Células ... 52 4.15.1.1 Descongelamento celular... 52 4.15.1.2 Congelamento celular ... 52 4.15.2 Repiques Celulares ... 53 4.15.2.1 Células em Suspensão ... 53 4.15.2.2 Células aderidas ... 53 4.15.2.3 Contagem celular... 54
4.15.3 Ensaio para a determinação da atividade antiproliferativa das frações dos extratos
vegetais ... 54
4.15.3.1 Diluição das amostras... 54
4.15.3.2 Ensaio de SRB ... 55
4.15.3.3 Análise dos resultados ... 55
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES 56 Capítulo 1: Desenvolvimento de Metodologias Analíticas Quantificação e Identificação 57 1.1 Isolamento e Purificação do Ácido Betulínico ... 58
1.2 Caracterização do ácido betulínico... 59
1.3 Desenvolvimento e Validação de Metodologia Analítica ... 68
1.3.1 Derivatização ... 68
1.3.2 Cromatografia com Fase Gasosa com Detecção por Ionização de Chamas (CG-DIC) ... 70
1.3.3 Cromatografia em Camada Fina acoplada a Densitometria Ótica (CCF/Densitometria). ... 75
Capítulo 2: Avaliação das técnicas de extração na obtenção dos extratos 78 2.1. Processo de Extração ... 79
Capítulo 3: Obtenção dos extratos de indivíduos de E. florida e de outras espécies que contém ácido betulínico. 94 3.1. Estudo da Variação Metabólica... 96
3.1.1 Temperatura e disponibilidade hídrica ... 98
3.1.2 Desenvolvimento da planta ... 99
3.2 Outras Espécies que Contém Ácido Betulínico... 102
Capítulo 4: Avaliação in vitro dos extratos obtidos nas diversas etapas de trabalho 104 4.1. Ensaios Citotóxicos ... 105
4.2 Ensaios em Células Tumorais... 110
4.3 Índice de Seletividade... 116
6 CONCLUSÃO 121 6.1 Conclusões Gerais ... 121
6.2 Conclusões Específicas... 121
7 SUGESTÃO E PERSPECTIVAS PARA TRABALHOS FUTUROS 124 8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 125 APÊNDICE A ... 137
APÊNDICE B... 147
Protocolo de Validação de CCF/Densitometria ... 147
APÊNDICE C... 157
Relatório de Validação de CG-DIC... 157
APÊNDICE D ... 182
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AB – Ácido Betulínico
ABNT – Associação Brasileira de Normas Técnicas AcOEt – Acetato de Etila
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária ASTM – American Society for Testing and Materials AZT – Azidotimidina
BSTFA – N, O-bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida
CAPES – Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CC50 – Concentração Citotóxica Média
CCF – Cromatografia em Camada Fina
CCFAE – Cromatografia em Camada Fina de Alta Eficiência Células VERO – linhagem celular derivada do rim do macaco CG – Cromatografia Gasosa
CG-EM – Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas CG-DIC – Cromatografia Gasosa com Detector de Ionização de Chama CI50 – Concentração média necessária para inibição celular
CI50b - Concentração média que inibe crescimento das células do linfócito CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
cm - centímetro
CPQBA – Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas CPTEC – Centro de Previsão de Tempo e Estudos Climáticos
ºC – grau Celsius
COX-2 - Ciclo-oxigenase-2
DCFM – Extrato obtido da casca do fruto maduro de Dilenia indica DCFV – Extrato obtido da casca do fruto verde de Dilenia indica DEPT-135 - Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DPFM – Extrato obtido da polpa do fruto maduro de Dilenia indica DPFV – Extrato obtido da polpa do fruto verde de Dilenia indica DTC – Detetor de Condutividade Térmica
DMSO – Dimetilsulfóxido
EC50a - Concentração média que inibe a replicação viral
EFA – Extrato obtido das folhas de Eugenia florida com Acetato de Etila EFC – Extrato obtido das folhas de Eugenia florida com Clorofórmio EFE – Extrato obtido das folhas de Eugenia florida com Etanol EFH – Extrato obtido das folhas de Eugenia florida com n-Hexano EFM – Extrato obtido das folhas de Eugenia florida com Metanol
EFHM – Extrato obtido das folhas de Eugenia florida com n-Hexano /Metanol EUA – Estados Unidos da América
g – grama
HaCat – célula normal de queratinócito humano
HIV – Human Immunodeficiency Virus (Vírus da Imunodeficiência Humana)
HL-60 - Human Promyelocytic Leukemia Cells (Células Humanas de Leucemia Promielocítica)
HSV-1 – Vírus da Herpes Simples tipo 1 IS – Índice de Seletividade
JBRJ - Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro
LFOH – Extrato obtido das folhas de Licania tomentosa com n-Hexano LFOM – Extrato obtido das folhas de Licania tomentosa com Metanol LFRH – Extrato obtido dos frutos de Licania tomentosa com n-Hexano LFRM – Extrato obtido dos frutos de Licania tomentosa com Metanol m – metro
min – minuto mL – mililitro µ L - microlitro mm – milimetro
msm –metros sobre o mar
MTT - 3 - (4,5 –dimetil tiazol -2-il) -2,5-difenil brometo de tetrazólio NBR – Normas Brasileiras
NCI – National Câncer Institute of the EUA
NCSE – Extrato obtido do rizoma de Nelumbo nucifera com Etanol nm – nanômetro
OMS – Organização Mundial de Saúde p.a. – Puro para análise
PNPIC – Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares PNPMF – Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos PROPLAM - Programa Estadual de Plantas Medicinais
PUC – Pontifícia Universidade Católica r – coeficiente de correlação
RDC – Resolução de Diretoria Colegiada Rf – Fator de Retenção
RMN13C - Ressonância Magnética Nuclear de Carbono RMN1H - Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio rpm – rotações por minuto
RPMI – meio de cultura enriquecido por 18 aminoácidos, 11 vitaminas, 6 sais inorgânicos, glutation e vermelho de fenol.
S – Coordenada Sul SFB – Soro Bovino Fetal
SIMERJ – Sistema de Meteorologia do Estado do Rio de Janeiro SRB – sulforrodamina B
SUS – Sistema Único de Saúde TCA – Ácido tricloroacético T.Ic - Índice terapêutico TMCS – trimetilclorosilano
UFF – Universidade Federal Fluminense
UFSC – Universidade Federal de Santa Catarina UNICAMP – Universidade Estadual de Campinas UNIFESP – Universidade Federal de São Paulo UV – Ultravioleta
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Extratos de plantas mais prescritos na Alemanha (HOSTETTMANN et al., 2003). .... 3
Tabela 2 Estudos realizados com o ácido betulínico e/ou seus derivados frente à linhagem de células tumorais (SAMI et al., 2006). ... 13
Tabela 3 Ácido betulínico (I) e seus derivados (II a VIII). Efeito inibitório sobre HIV (µM) das substâncias I a VIII em comparação com o AZT (JUNGES, 1997). ... 15
Tabela 4 Algumas fontes naturais de obtenção do ácido betulínico descritas na literatura. ... 16
Tabela 5 Recomendações gerais de coleta para plantas expontâneas e plantas cultivadas (MARTINS et al., 2000). ... 20
Tabela 6 Uma forma geral de redução do peso em plantas medicinais submetidas à secagem (MARTINS et al., 2000). ... 20
Tabela 7 Processo de separação dos constituintes de um extrato versus resolução obtida em cromatografia em camada fina (MATOS, 1997)... 22
Tabela 8 Solventes usados para extração X substâncias extraídas (SIMÕES et al., 2007)... 24
Tabela 9 Tamanhos e capacidades das separações das colunas “flash” (STILL et al., 1978).... 30
Tabela 10 Classificação dos testes para validação de métodos analíticos, segundo sua finalidade (BRASIL, 2003a). ... 33
Tabela 11 Ensaios necessários para validação do método analítico, segundo sua finalidade (BRASIL, 2003a). ... 33
Tabela 12 Coleta de Eugenia florida DC para o estudo de variação Sazonal. ... 40
Tabela 13 Dados referentes à coleta de outros indivíduos de Eugenia florida DC para estudo comparativo. ... 41
Tabela 14 Dados referentes à coleta de outras espécies que contém ácido betulínico para estudo comparativo... 41
Tabela 15 Espécies utilizadas na pesquisa desta dissertação, registros e localização. ... 43
Tabela 16 Material usado para obter diferentes granulometrias das folhas de E. florida. ... 46
Tabela 17 Linhagens celulares empregadas na avaliação de atividade antiproliferativa. ... 53
Tabela 19 Solventes selecionados para os estudos dos métodos de extração (SMITH, 1994). . 80 Tabela 20 Efeito citotóxico (CC50) de extratos do estudo Sazonal das folhas de Eugenia florida DC e substâncias puras em células VERO. ... 106
Tabela 21 Efeito citotóxico (CC50) de extratos de outras espécies que contém ácido betulínico e substâncias padrões em células VERO. ... 109
Tabela 22 Efeito citotóxico de extratos do estudo Sazonal de folhas de Eugenia florida DC e
substâncias padrões em células neoplásicas. ... 111
Tabela 23 Efeito citotóxico de extratos de outras espécies que contém ácido betulínico e
substâncias padrões em células neoplásicas. ... 115
Tabela 24 Resultados de CI50 obtidos por Kumar et al. (2010) para linhagens leucêmicas, utilizando Dillenia indica. ... 116
Tabela 25 Índice de Seletividade nas linhagens testadas nos extratos de Eugenia florida. ... 117 Tabela 26 Índice de Seletividade (IS) nas linhagens testadas nas outras espécies que contém
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Diferentes fontes de agentes terapêuticos (HOSTETTMANN et al., 2003). ... 1
Figura 2 Exemplo fotográfico de Eugenia florida DC. (a) Hábito arbóreo; (b) Detalhe da inflorescência, (c) Detalhe dos frutos, (d) Detalhe das sementes (LORENZI, 2000). ... 7
Figura 3 Detalhes da morfologia de Eugenia florida DC. 01. Ramo com inflorescência. 02. Folha. 03 Inflorescência. 04. Botão Floral. 05. Disco estaminal. 06. Fruto (ROMAGNOLO & SOUZA, 2006). ... 8
Figura 4 Estruturas básicas dos triterpenos isolados das folhas de Eugenia florida (JUNGES, 1997)... 9
Figura 5 Isopreno: unidade básica formadora dos terpenos. ... 9
Figura 6 Formação de terpenóides a partir do ácido mevalônico (ALVES, 2001). ... 10
Figura 7 Estrutura química do ácido ursólico (MAURYA & SRIVASTAVA, 2012)... 11
Figura 8 Estrutura química do ácido boswélico (CSUK et al., 2010)... 11
Figura 9 Estrutura química do ácido betulínico (PATOCKA, 2003). ... 12
Figura 10 Estrutura base do ácido betulínico (I) e seus derivados produzidos a partir da inserção de substituintes em R1 e R2 (JUNGES, 1997). ... 14
Figura 11 Síntese do ácido betulínico proposta por Csuk et al, 2006. ... 17
Figura 12 Fatores que podem influenciar a produção de metabólitos secundários (GOBBO-NETO & LOPES, 2007)... 19
Figura 13 Esquema para purificação de substâncias isoladas de material vegetal (HOSTETTMANN et al., 2003)... 23
Figura 14 Representação de cromatografia: (a) em coluna aberta (DEGANI et al., 1998); (b) cromatografia “flash” (HOSTETTMANN et al., 2003)... 30
Figura 15 Proposta do mecanismo de fragmentação molecular do Betulinato. ... 59
Figura 16 Espectro de CG-EM do extrato metanólico de folhas de E. florida. ... 60
Figura 17 Espectro de CG-EM do padrão de ácido betulínico Sigma Aldrich. ... 61
Figura 19 Assinalamento no RMN de 1H do ácido betulínico. ... 63
Figura 20 Assinalamento no RMN de 13C do ácido betulínico. ... 63
Figura 21 Espectro de RMN1H do ácido betulínico... 64
Figura 22 Espectro de RMN13C do ácido betulínico... 65
Figura 23 Espectro de DEPT-135 do ácido betulínico ... 66
Figura 24 Espectro de infravermelho do ácido betulínico... 67
Figura 25 Mecanismo da derivatização do ácido betulínico por diazomentano. ... 69
Figura 26 Cromatograma gasoso do padrão do ácido betulínico derivatizado por diazometano.69 Figura 27 Mecanismo da derivatização de um ácido por BSTFA... 69
Figura 28 Cromatograma gasoso do acido betulínico após derivatização com BSTFA + TMCS. ... 70
Figura 29 Unidade Polimérica da Coluna DB-1. ... 71
Figura 30 Cromatograma gasoso do ácido betulínico derivatizado por diazometano em Coluna DB-1 por CG-DIC... 71
Figura 31 Unidade Polimérica da Coluna DB-5. ... 71
Figura 32 Cromatograma gasoso do ácido betulínico derivatizado por diazometano em Coluna DB-5 por CG-DIC... 72
Figura 33 Avaliação da influência no gás make-up na resolução do ácido betulínico derivatizado por diazometano: (a) Makeup maior; (b) Makeup menor. ... 73
Figura 34 Avaliação do pulso de pressão no desempenho cromatográfico do ácido betulínico metilado. ... 74
Figura 35 Cromatograma obtido com o ácido betulínco metilado e com variações de temperaturas... 74
Figura 36 Densitograma do ácido betulínico com a fase móvel MeOH:CHCl3 (1:9)... 76
Figura 37 Densitograma do ácido betulínico com fase móvel Hexano:AcOEt (4:6)... 77
Figura 38 Estrutura do ácido betulínico, com a porção polar destacada em vermelho. ... 80
Figura 39 Resultados da extração por soxhlet das folhas de Eugenia florida (a) Teor de ácido betulínico analisado por CG-DIC; (b) Rendimento extrativo. ... 81
Figura 40 Resultados da extração por Maceração Estática das folhas de Eugenia florida (a)
Teor de ácido betulínico analisado por CG-DIC; (b) Rendimento extrativo. ... 84
Figura 41 Resultados da extração por Maceração Dinâmica das folhas de Eugenia florida (a)
Teor de ácido betulínico analisado por CG-DIC; (b) Rendimento extrativo. ... 85
Figura 42 Resultados da extração por Percolação das folhas de Eugenia florida (a) Teor de
ácido betulínico analisado por CG-DIC; (b) Rendimento extrativo... 87
Figura 43 Resultados da extração por Ultrassom das folhas de Eugenia florida (a) Teor de
ácido betulínico analisado por CG-DIC; (b) Rendimento extrativo... 89
Figura 44 Comparação dos percentuais de ácido betulínico obtidos no estudo dos métodos de
extração e solventes. ... 90
Figura 45 Resultados da extração por ultrassom com diferentes granulometrias das folhas de
Eugenia florida (a) teor de ácido betulínico analisado por CG-DIC; (b) Rendimento extrativo. 92
Figura 46 Comparação dos rendimentos extrativos de folhas de E. florida obtidos nos
diferentes solventes e técnicas estudadas. ... 95
Figura 47 Resultado do estudo de variação sazonal das folhas de E. florida extraídas com
n-Hexano /Metanol por soxhlet (a) Teor de ácido betulínico analisado por CG-DIC; (b) Rendimento extrativo. AB (ácido betulínico). ... 97
Figura 48 Parâmetros observados durante o estudo de variação metabólica das folhas de E.
florida. ... 98
Figura 49 Comparação entre diferentes indivíduos de E. florida (a) Teor de ácido betulínico
analisado por CG-DIC; (b) Rendimento extrativo. ... 100
Figura 50 Diferentes indivíduos de Eugenia florida que foram usados neste estudo (a)
Indivíduo usado para o estudo Sazonal; (b) 2º Indivíduo do campus da Fiocruz; (c) Indivíduo do Jardim Botânico... 101
Figura 51 Rendimento de ácido betulínico em outras espécies e órgãos, analisados por
CG-DIC. ... 102
Figura 52 Avaliação do efeito citotóxico em relação ao percentual de ácido betulínico e
rendimento extrativo dos ensaios de sazonalidade das folhas de E. florida... 107
Figura 53 Avaliação do efeito citotóxico com o percentual de ácido betulínico e rendimento
extrativo dos ensaios de variação metabólica das folhas de E. florida... 108
Figura 54 Avaliação da atividade citotóxica do ácido betulínico em extratos obtidos de outras
espécies ... 110
Figura 55 Avaliação da concentração média de inibição celular (CI50) do extrato do estudo Sazonal de folhas de Eugenia florida DC em linhagens tumorais. ... 112
Figura 56 Avaliação da concentração média de inibição celular (CI50) do extrato de outras espécies em linhagens tumorais... 114
Figura 57 Índice de Seletividade dos extratos de folhas de Eugenia florida usados estudo de
sazonalidade e dos outros indivíduos (a) avaliação do IS das linhagens U251, MCF-7, NCI-ADR/RES, 786-0, NCI-H460, HT29; (b) avaliação da linhagem OVOCAR-3... 118
Figura 58 Índice de Seletividade (IS) dos extratos de outras espécies (a) avaliação do IS das
linhagens U251, MCF-7, NCI-ADR/RES, 786-0, NCI-H460, HT29; (b) avaliação da linhagem OVOCAR-3. ... 120
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi padronizar os extratos de Eugenia florida DC. e estudar suas atividades farmacológicas visando o desenvolvimento de um quimioterápico de origem vegetal. Para tanto, foram realizados estudos com diferentes métodos de extração, estudo de variação metabólica da planta, desenvolvimento e validação de metodologias analíticas, ensaios citotóxicos e ensaios em células tumorais. Os dados obtidos no trabalho apontaram a percolação no tempo de 2 horas como o método que apresentou o melhor percentual de extração de ácido betulínico a partir das folhas de E. florida. Apesar de saber que a granulometria influencia diretamente na eficiência da extração, não foram observadas grandes diferenças percentuais nos teores de ácido betulínico para os diferentes tamanhos de partículas utilizados na extração por ultrassom, porém constatou-se que a homogeneidade dos tamanhos de partículas aumenta a eficiência da extração. No estudo de variação metabólica observaram-se variações durante o ano que devem observaram-ser consideradas na qualidade da matéria-prima vegetal. Os extratos de E. florida apresentaram baixa citotoxidez em células VERO e apresentaram índice de seletividade alto o que representa uma maior afinidade pelas células tumorais do que pelas células sadias (VERO). Nos ensaios com células tumorais os extratos apresentaram atividade mais potente contra a linhagem de ovário (OVOCAR-3), muito mais que os padrões de ácido betulínico (comercial e isolado), o que confirma a presença de outra(s) substância(s) com atividade antitumoral presente(s) no extrato o que corrobora para a pesquisa e o desenvolvimento de um fitoterápico ao invés de um fitofármaco para ser utilizado no tratamento do câncer de ovário.
ABSTRACT
The objective of this study was the standardize of Eugenia florida DC. leaves extracts and study their pharmacological activities aiming the development of a chemoterapic. To achieve this goal, studies were performed using different particle sizes, metabolic profile, as well as development and validation of analytical methodologies, cytotoxic assays and assays on tumor cells. The data obtained on this study showed that the percolation extraction method in the time of 2 hours showed the better rate of betulinic acid extraction from E. florida leaves. Despite the knowledge that the particle size directly affects the efficiency of ultrasound extraction, major differences were not observed in the percentage of betulinic acid for the different particle sizes used, however the uniformity of the particle size increases the efficiency of extraction. In the metabolic profile study, variations were observed during the year which should be considered in the quality of the vegetable raw material. E. florida extracts showed lower citotoxicity in VERO cells, and showed high selectivity index which represents a greater affinity for tumor cells than for healthy cells. In tumoral cells assays, the extracts showed stronger activity against the ovarian line (OVOCAR-3), much more than the standards of betulinic acid (commercial and isolated), which confirms the influence of (an) other substance (s) presented in the extract with antitumoral activity in the extract which defines the development of a herbal medicine instead of a herbal drug to be used for the treatment of ovarian cancer.
1 INTRODUÇÃO
As plantas medicinais representam um recurso terapêutico há muito tempo utilizado pela população mundial e em vários casos é o único meio disposto para o tratamento de algumas doenças em diferentes comunidades (MACIEL et al., 2002).
Com o crescimento da química farmacêutica, no início do século XIX, as plantas passaram a representar a primeira fonte de substâncias para o desenvolvimento de medicamentos. A Figura 1 mostra que apesar da síntese orgânica representar um maior percentual de fonte de agentes terapêuticos, uma boa parte dos medicamentos industrializados é de origem vegetal (HOSTETTMANN et al., 2003).
Figura 1 Diferentes fontes de agentes terapêuticos (HOSTETTMANN et al., 2003).
Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), 60% da população mundial fazem uso de medicamentos tradicionais, sendo que a maioria é à base de plantas medicinais (OMS, 2002a). Em muitos países a utilização de plantas medicinais é bastante comum, sendo a OMS uma grande incentivadora desta prática. Países membros da OMS têm desenvolvido políticas referentes à medicina tradicional e/ou complementar e alternativa (OMS, 2002b).
Um terço da população mundial não tem acesso a medicamentos essenciais, sendo necessário que se invista na medicina tradicional como forma de ajudar a melhorar a saúde pública. Estas diretrizes apontam para uma necessidade de se identificar práticas seguras e eficazes, a fim de proporcionar uma base sólida que fomente e promova a medicina tradicional (OMS, 2002b). Produtos sintéticos 56% Biológicos 5% Produtos naturais 6% Derivados de produtos naturais 24% Produtos sintéticos modelados a partir de produtos naturais9%
1.1 Uso de Plantas Medicinais no Brasil
No Brasil, a utilização de plantas medicinais teve sua origem relacionada com a cultura dos índios que habitavam o país. Depois, sofreu influência dos colonizadores e de outros povos que vieram mais tarde (BALUNAS & KINGHORN, 2005). Segundo Bertoni, um botânico do século XIX, a tribo Guarani teve o melhor conhecimento sobre as plantas medicinais, mais do que os europeus no século XVI (MELLO, 1980) e que foi significativo para o uso de plantas com a finalidade terapêutica por brasileiros e europeus. A partir do século XVII, as culturas africana e européia foram introduzidas no Brasil, sobrepondo-se à indígena. Entre 1823 a 1831, von Martius e outros botânicos coletaram várias plantas brasileiras, e posteriormente publicaram o “Systema Materiae Medicae Vegetabilis Brasilienses” que descreve 470 plantas (MELLO, 1980).
Levantamentos entre 1949 a 1992, mostram que a submissão de resumos em encontros científicos no Brasil, abordando o tema plantas medicinais, ocorreu regularmente neste período, porém menos de 10% das substâncias bioativas de extratos vegetais foram quimicamente investigadas (SOUZA BRITO & SOUZA BRITO,1993).
Mais de 20% da flora mundial está representada no Brasil, entretanto poucos estudos foram feitos para investigar o potencial de novas drogas ou matéria-prima para as preparações farmacêuticas (PETROVICK et al., 1999).
Várias iniciativas têm sido empenhadas no intuito de viabilizar o uso de fitoterápicos na saúde pública. Em 1983, foi criado o Projeto Farmácias Vivas pelo professor Dr. Francisco José de Abreu Matos da Universidade Federal do Ceará, com o objetivo de estimular o uso racional de plantas medicinais com finalidade terapêutica, principalmente na saúde pública. (BALUNAS & KINGHORN, 2005). No Rio de Janeiro, existe um Programa Estadual de Plantas Medicinais (PROPLAM) que vigora desde 1996 pela Lei Estadual n° 2.537 que tem como objetivo estabelecer políticas públicas nas áreas de preservação, pesquisa e utilização terapêutica das plantas medicinais (VICTÓRIO & LAGE, 2008).
1.2 Plantas Medicinais X Indústria
O uso de plantas medicinais é uma alternativa para o tratamento de muitas doenças em vários países em desenvolvimento. Entre as vantagens no uso de plantas medicinais tem-se a redução nas taxas de importação de medicamentos (GARLET & IRGANG, 2001).
Pequenas e grandes empresas têm incluído fitoterápicos na linha de produção, em vista disto, parcerias entre instituições de ensino e empresas são bem vindas na busca de novos
fitoterápicos (LIMA et al., 2001). Um bom exemplo destas parcerias é o Acheflan® do Laboratório Aché, primeiro antiinflamatório feito com base no extrato de uma planta nativa brasileira, Cordia verbenacea DC. Os estudos para o desenvolvimento do medicamento levaram sete anos e foram conduzidos com parcerias entre a UFSC, UNIFESP, PUC-Campinas e UNICAMP (http://www.redetec.org.br/inventabrasil/acheflan.htm, 2011).
O ginkgo (Ginkgo biloba L.) é utilizado na medicina chinesa desde 2.800 a.C. e atualmente é o fitoterápico mais vendido no mundo, sendo indicado para o tratamento dos problemas ligados à insuficiência de circulação cerebral e periférica (HOBBS, 1991). A eficácia do ginkgo é atribuída aos gincolídeos, diterpenos que inibem a agregação plaquetária (BRAQUET, 1987).
A Tabela 1 mostra alguns extratos vegetais que são prescritos na Alemanha, evidenciando o mercado de fitoterápicos.
Tabela 1 Extratos de plantas mais prescritos na Alemanha (HOSTETTMANN et al., 2003).
. Plantas Indicação Vendas
(milhões em $ DM*)
Ginkgo biloba L. Insuficiência vascular cerebral
periférica
461
Aesculus hippocastanum L. Insuficiência venosa 114
Crataegus spp. Cardiotônico 65
Hypericum perforatum L. Depressão 59
Urtica dioica L. Problemas urológicos 35
Echinacea sp. Imunoestimulante 34
* marco alemão
Em meados do século XX, a química de produtos naturais passou a ser a principal fonte de pesquisa para novos agentes anticancerígenos. Nos Estados Unidos da América 60% dos medicamentos anticancerígenos aprovados eram de origem natural (CRAGG et al., 1997). No final dos anos 60 os alcalóides bisindólicos vimblastina e vincristina foram isolados de Catharanthus roseus G. Don e foram considerados como medicamentos indispensáveis para o tratamento da leucemia (HOSTETTMANN et al., 2003). Outra substância isolada no final dos anos 60 foi o diterpeno paclitaxel, inicialmente chamado como taxol, extraído das cascas do Taxus brevifolia Nutt. Foi descoberto pelo National Cancer Institute (NCI), tendo sido caracterizado também em outras espécies do gênero Taxus (HOSTETTMANN et al., 2003).
Várias substâncias obtidas de plantas estão em fase de estudo para tratamento do câncer. Um exemplo de substância que se mostrou ativa contra vários tipos de leucemia é a homoarringtonina, uma substância isolada de Cephalotaxus harringtonia Var. Nana (ZHOU et al., 1995).
Não só as substâncias novas (inéditas) são promissoras, algumas substâncias conhecidas vêm mostrando grande potencial terapêutico. O ácido betulínico é um constituinte comumente encontrado em algumas espécies de Betula spp. Este triterpeno mostrou uma potente atividade antitumoral principalmente para tratamento de melanomas (ZUCO et al., 2002).
É importante salientar que o mecanismo de ação dos componentes ativos presentes em muitas plantas ainda são desconhecidos. Até hoje muitas espécies e preparados vegetais medicinais são estudados na busca de entendimento do seu mecanismo de ação e do isolamento dos princípios ativos (BARREIRO et al., 2006). Muitas vezes os próprios constituintes são conhecidos, mas não desempenham o efeito isoladamente. Esta situação se deve aos fitocomplexos presentes na planta, em muitos casos com mais de 50 substâncias.
1.3 Aspectos Legais
Fitoterápico, segundo a ANVISA é: “Todo medicamento tecnicamente obtido e elaborado, empregando-se, exclusivamente, matérias primas ativas vegetais com a finalidade profilática, curativa ou para fins de diagnóstico, com benefício para o usuário. É caracterizado pelo conhecimento da eficácia e dos riscos de seu uso, assim como pela reprodutibilidade e constância de sua qualidade; é o produto final acabado, embalado e rotulado. Na sua preparação podem ser utilizados adjuvantes farmacêuticos permitidos pela legislação vigente. Não podem estar incluídas substâncias ativas de outras origens, não sendo considerado produto fitoterápico quaisquer substâncias ativas, ainda que de origem vegetal, isoladas ou mesmo suas misturas.” (BRASIL, 1995).
O Brasil possui um arcabouço legal para plantas medicinais e fitoterápicos, bem como programas de incentivo à pesquisa desses. Até 2004, as espécies vegetais medicinais podiam ser regulamentadas como medicamentos, seguindo as instruções normativas para registro de medicamentos fitoterápicos, o que deixou de ser permitido com a publicação da RDC 48/2004 (BRASIL, 2004). Políticas governamentais voltadas para o setor, foram publicadas em 2006: a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos (PNPMF) e a Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares (PNPIC) no Sistema Único de Saúde (SUS) (BRASIL, 2006a; BRASIL, 2006b).
Em 2010 a ANVISA publicou uma norma para melhor regulamentar a produção e o uso de espécies vegetais medicinais, a RDC (Resolução de Diretoria Colegiada) 10/2010. Para cada espécie, foram padronizadas indicações terapêuticas, forma de uso, quantidade a ser
ingerida e os cuidados e restrições a serem observados no seu uso, conforme o uso tradicional (BRASIL, 2010a), além da RDC 14/ 2010 que atualiza os procedimentos de registro de fitoterápicos no país (BRASIL, 2010b).
1.4 Família Myrtaceae
Myrtaceae pertence à ordem Myrtales e compreende cerca de 131 gêneros com aproximadamente 4620 espécies. Os gêneros de Myrtaceae mais representativos são Eugenia (cerca de 1115 espécies), Syzygium (1045 espécies), Eucalyptus (680 espécies), Myrcia (cerca de 400 espécies), Malaleuca (220 espécies) e Psidium (100 espécies) (STEVENS, 2001).
Myrtaceae é formada por um grande número de plantas que incluem desde representantes de matas rasteiras a grandes árvores. Esta família é uma das mais importantes da Mata Atlântica brasileira. O uso medicinal de muitas de suas espécies tem sido comprovado, como a atividade antimicrobiana de óleos essenciais e atividades antiviral, hipoglicemiante, antioxidante e anticancerígena (BOLZANI et al., 2002).
1.5 Gênero Eugenia L.
Este gênero se distribui em áreas que vão do México a Argentina. Na América tropical e subtropical são referidas mais de 500 espécies (BACCHI et al., 2003). O gênero Eugenia apresenta-se bem representado nas diversas formações vegetais do Brasil, com ocorrência abundante e freqüente. Além disso, muitas espécies produzem frutos comestíveis muito apreciados, não só por animais, mas também pelo homem, como por exemplo, a pitanga (Eugenia uniflora L.). Do ponto de vista químico, vale ressaltar a produção de ácido betulínico e derivados, que atraem muita atenção por apresentarem atividades biológicas, anti-HIV, antitumoral, antimalárica e anti-inflamatória (LUNARDI et al., 2001).
As folhas de algumas espécies de Eugenia são usadas na medicina popular para diversas finalidades terapêuticas. O uso da infusão de folhas de Eugenia uniflora L. em água, por exemplo, pode servir para controle da hipertensão, diminuição do colesterol e ácido úrico, emagrecimento e também como adstringente e digestivo (SCHMEDA-HIRSCHMANN et al. 1987), outro exemplo é o uso das folhas da Eugenia dysenterica DC., planta característica do Cerrado, que são muito usadas na medicina popular como antidiarréico (LIMA et al., 2007).
Óleos essenciais e substâncias como flavonóides e taninos, especialmente constituídos de mono- e sesquiterpenos, já foram isolados do gênero Eugenia e estão descritos na literatura (FRIGHETTO et al., 2005a; FRIGHETTO et al., 2005b).
1.6 Eugenia florida DC
Eugenia florida DC., conhecida popularmente pelo nome de guamirim-cereja ou pitanga preta, é comumente encontrada em quase todo território brasileiro, na maioria das formações vegetais arbóreas, sendo recomendada para paisagismo e para a composição de reflorestamento. Os frutos são muito apreciados por várias espécies de pássaros o que ajuda na dispersão das sementes (LORENZI, 2000).
Eugenia florida é uma árvore, com 5-9 m de altura, dotada de copa arrendondada e pouco densa, com folhagem avermelhada após a brotação (Figura 2a). Inflorescências em rácemos axilares de 1-2 cm de comprimento, com pilosidade hirta e flores perfumadas de cor branca. Floresce em mais de uma época do ano, predominando, o período compreendido entre os meses de agosto e setembro (Figura 2b). O fruto é constituído por uma baga globosa, glabra, brilhante, com cálice persistente, de cor vermelha ou preta quando madura, com polpa carnosa, adocicada, contendo uma única semente, com amadurecimento principalmente em dezembro e janeiro (Figuras 2c e 2d) (LORENZI, 2000).
Figura 2 Exemplo fotográfico de Eugenia florida DC. (a) Hábito arbóreo; (b) Detalhe da
inflorescência, (c) Detalhe dos frutos, (d) Detalhe das sementes (LORENZI, 2000).
Os dados morfológicos e anatômicos da folha de E. florida reúnem características comuns à família Myrtaceae, podendo-se destacar algumas de importância diagnóstica para a espécie como, por exemplo, árvores ou arbustos, as folhas simples, geralmente opostas e com margens inteiras. Como características da família, citam-se: a ocorrência de cavidades secretoras, a presença de floema interno ao xilema e alto teor de tanino (DONATO & MORRETES, 2009).
A Figura 3 mostra alguns detalhes morfológicos de Eugenia florida DC.
(a) (b)
Figura 3 Detalhes da morfologia de Eugenia florida DC. 01. Ramo com inflorescência. 02.
Folha. 03 Inflorescência. 04. Botão Floral. 05. Disco estaminal. 06. Fruto (ROMAGNOLO & SOUZA, 2006).
O perfil químico das folhas de Eugenia florida DC. apresenta especialmente triterpenos dos esqueletos lupânico, nor-lupânico, ursânico e oleanânico. A Figura 4 mostra os esqueletos dos triterpenos encontrados em E. florida (JUNGES, 1997).
LUPÂNICO NOR-LUPÂNICO
URSÂNICO OLEANÂNICO
Figura 4 Estruturas básicas dos triterpenos isolados das folhas de Eugenia florida (JUNGES,
1997).
1.7 Triterpenos
Os triterpenos pertencem à larga e estruturalmente diversa classe química conhecida como terpenos, que são substâncias constituídas basicamente por átomos de hidrogênio e carbono, com uma unidade formadora de 5 carbonos, chamada de isopreno C5 (Figura 5) (FREIRE, 2009).
Figura 5 Isopreno: unidade básica formadora dos terpenos.
A biossíntese dos terpenos é oriunda da via do ácido mevalônico, através da união de unidades isoprênicas ligadas de uma maneira específica conhecida como “cabeça-cauda”. A
Figura 6 mostra que duas unidades isoprênicas (C5) unidas cabeça-cauda produzem os vários esqueletos monoterpênicos (C10), enquanto o encandeamento de três unidades resulta na classe dos sesquiterpenos (C15) (ALVES, 2001). Os triterpenos apresentam como precursor o esqualeno, um hidrocarboneto com 30 átomos de carbono que é formado a partir da união cauda-cauda de dois grupos trans-farnesila (FREIRE, 2009).
Figura 6 Formação de terpenóides a partir do ácido mevalônico (ALVES, 2001).
Os triterpenos apresentam diversas propriedades medicinais descritas, principalmente anti-inflamatórias e cardiovasculares, além das atividades antibacteriana, antiviral e analgésica. Devido à sua grande aplicabilidade e a variedade de espécies que contém triterpenos em sua composição, o seu estudo tem sido de grande interesse na tentativa de novas e reais aplicações (PATOCKA, 2003).
Existe cerca de 4000 triterpenos conhecidos distribuídos na natureza, a maioria deles na forma livre, mas outros ocorrem como glicosídeos (saponinas) ou em especial como formas combinadas (PATOCKA, 2003).
Os triterpenos de estrutura pentacíclica possuem grande atividade anticancerígena, o que pode ser avaliado observando alguns triterpenos pentacíclicos bastante estudados como o ácido ursólico, ácido boswélico e ácido betulínico (FREIRE, 2009).
O ácido ursólico (Figura 7) é um triterpeno pentacíclico presente em diversas plantas e apresenta importantes atividades farmacológicas como: analgésico, antitumoral,
Ácido Mevalônico
antibacteriano, diurético, antidiabético, inibidor da COX-2, anti-inflamatório, hepatoprotetor e anti-HIV para vários tipos de linhagens (MAURYA & SRIVASTAVA, 2012).
Figura 7 Estrutura química do ácido ursólico (MAURYA & SRIVASTAVA, 2012).
O ácido boswélico (Figura 8) é encontrado, sobretudo na resina de Boswellia serrata Triana & Planch, usado na medicina tradicional como analgésico e para tratamento de inchaço. Estudos recentes mostram atividade antitumoral (CSUK et al., 2010). Estudos in vitro comprovaram que o ácido boswélico induz apoptose em células leucêmicas humanas (HL-60) e inibe a topoisomerase I (SHAO et al., 1998; HOERNLEIN et al., 1999).
Figura 8 Estrutura química do ácido boswélico (CSUK et al., 2010).
O ácido betulínico (Figura 9) é um triterpeno pentacíclico pertencente ao grupo dos lupanos. Possui diversas atividades biológicas, tais como, anti-inflamatório e antimalárico testadas in vitro (SIMÕES et al., 2007). Entretanto, a atividade que mais tem sido estudada é a
ação anticancerígena (SAMI et al., 2006). Estudos demonstraram o potencial citotóxico do ácido betulínico para as células de melanoma, não só em ratos, mas também em células humanas (PISHA et al., 1995). O crescimento de tumores foi observado por 40 dias e o ácido betulínico mostrou-se responsável por uma redução acentuada da massa tumoral e não induziu quaisquer efeitos secundários, tais como perda de peso (PATOCKA, 2003).
Figura 9 Estrutura química do ácido betulínico (PATOCKA, 2003).
1.7.1 Atividades Farmacológicas do Ácido Betulínico
1.7.1.1 Atividade Anti-inflamatória
O ácido betulínico apresenta atividade anti-inflamatória contra edema induzido em patas de ratos por carragenina e serotonina, foram testados doses de 50 e 100 mg/kg de ácido betulínico, apresentando atividade anti-inflamatória significativa, comparável a agentes como fenilbutazona e dexametasona, conhecidos fármacos anti-inflamatórios (MUKHERJEE et al., 1997).
Também foi encontrada atividade inibidora para a fosfolipase A2, que desempenha um papel crucial no processo inflamatório (SAMI et al., 2006).
1.7.1.2 Atividade Antimalárica
O ácido betulínico foi testado in vitro contra cepas de Plasmodium falciparum sensíveis a cloroquina, e se mostrou ativo com valores de CI50 entre 19,6 µg/mL e 25,9 µg/mL. (SAMI et al., 2006).
1.7.1.3 Atividade Antitumoral
Segundo Pisha et al. (1995), o ácido betulínico é um inibidor que apresenta afinidade por melanoma humano, através da indução da apoptose. Ratos tratados com ácido betulínico (doses de 50, 250 e 500 mg/kg) parecem ser resistentes a melanomas humanos transplantados e apresentam regressão do tumor de 0,2 a 0,6 cm3, enquanto as células saudáveis foram resistentes aos efeitos do ácido betulínico.
Posteriormente foi descoberto que o ácido betulínico atua também em outras células tumorais como neuroblastoma, tumores cerebrais e leucemia (SCHMIDT et al., 1997; FULDA et al., 1999; EHRHARDT et al.,2004). Sua atividade tumoral tem sido o alvo de muitos estudos. A Tabela 2 mostra algumas destas atividades em linhagens de células tumorais.
Tabela 2 Estudos realizados com o ácido betulínico e/ou seus derivados frente à linhagem de
células tumorais (SAMI et al., 2006).
Patologia Referências
Melanoma Pisha et al. (1995), Fulda et al. (1997), Kim et al. (1998),
Jeong et al. (1999), Selzer et al. (2000), Kim et al. (2001), Hata et al. (2002, 2003), Zuco et al. (2002), Symon et al. (2003), Sarek et al. (2003), Tan et al. (2003), You et al. (2003), Sawada et al. (2004), Urban et al. (2004), Liu et al. (2004), Zanon et al. (2004), Fulda et al. (2004), Fulda & Debatin (2005), Kasperczyk et al. (2005).
Carcinoma pulmonar Fulda et al. (1997), Zuco et al. (2002), Sarek et al. (2003), Urban et al. (2004), You et al. (2003), Mukherjee et al. (2004b).
Câncer de cólon Fulda et al. (1997), Kim et al. (2001), Baglin et al. (2003b), Sarek et al. (2003), Mukherjee et al. (2004b), Urban et al. (2004).
Carcinoma de próstata Kim et al. (2001), Sarek et al. (2003), Mukherjee et al. (2004b), Urban et al. (2004).
Leucemia Fulda et al. (1997), Noda et al. (1997), Deng and Snyder (2002), Hata et al. (2003), Ehrhardt et al. (2004), Urban et
al. (2004).
Carcinoma de ovário Deng & Snyder (2002), Zuco et al. (2002), Sarek et al. (2003), Mukherjee et al. (2004b).
Carcinoma endotelial Mukherjee et al. (2004a,b).
Carcinoma de epiderme oral Kim et al. (1998), Jeong et al. (1999).
Glioblastoma Fulda et al. (1999), Sarek et al. (2003), Jeremias et al. (2004), Fulda et al. (2004), Fulda & Debatin (2005), Kasperczyk et al. (2005).
Câncer de mama Fulda et al. (1997), Sarek et al. (2003), Urban et al. (2004). Neuroblastoma Fulda et al. (1997), Schmidt et al. (1997), Fulda et al. (1998a), Hata et al. (2003), Fulda et al. (2004), Fulda & Debatin (2005), Kasperczyk et al. (2005).
Câncer de coluna vertebral Fulda et al. (1997, 1999, 2004), Fulda & Debatin (2005).
Carcinoma de cérvix Zuco et al., 2002
Carcinoma hepatocelular Sarek et al., 2003
Osteosarcoma Sarek et al., 2003
1.7.1.4 Atividades Antibacteriana e Antiviral
A atividade antiviral do ácido betulínico e seus derivados foram também estudados contra a gripe, herpes simples tipo 1 (HSV-1), gripe FPV/Rostock e ECHO-6 enterovírus (PAVLOVA et al., 2003). Foi observado que na molécula do ácido betulínico quando o grupo carboxílico do C28 foi substituído por um grupo amida primário, houve um aumento na atividade antiviral. (BALTINA et al., 2003). O ácido betulínico apresentou atividade antiviral contra o vírus ECHO-6, porém foi inativo contra as bactérias Staphylococcus aureus, Escherichia coli (HESS et al., 1995), Bacillus subtilis e Micrococcus luteus (SAMI et al., 2006).
Vários autores descrevem a capacidade de triterpenos pentacíclicos em inibir a replicação do HIV in vitro. O ácido betulínico apresentou CI50 de 1,4 µM (CICHEWICZ & KOUZI, 2004).
Um estudo comparativo entre o efeito da Azidotimidina (AZT) e o ácido betulínico e seus derivados demonstrou uma maior ação dos triterpenos contra o vírus HIV. A atividade relativa ao ácido betulínico (I) e seus derivados (II-VIII) (Figura 10 e Tabela 3) comparada com o AZT, expressa na concentração de cada substância, é mostrada na Tabela 3 (JUNGES, 1997).
Figura 10 Estrutura base do ácido betulínico (I) e seus derivados produzidos a partir da
inserção de substituintes em R1 e R2 (JUNGES, 1997).
R2
Tabela 3 Ácido betulínico (I) e seus derivados (II a VIII). Efeito inibitório sobre HIV (µM)
das substâncias I a VIII em comparação com o AZT (JUNGES, 1997).
Substância R1 R2 EC50a IC50b T.Ic I H COOH 1,4 13 9,3 II H CH2OH 23 45 1,9 III H COOCH2COOCH3 17 26 1,5 IV Ac COOH 25 20 0,8 V COC6H5 COOH 15 15 1,0 VI COCH=CHCH3 COOH 19 48 2,5 VII SO3K COOH 20 35 1,7
VIII CO(CH2)2COOH COOH 4 16 4,0
AZT - - 0,04 2000 50000
R1 – derivados do ácido betulínico com substituição do radical na posição R1. R2 – derivados do ácido betulínico com substituição do radical na posição R2. EC50a – Concentração média que inibe a replicação viral
IC50b – Concentração média que inibe crescimento das células do linfócito T.Ic – Índice terapêutico
1.7.2 Citotoxidez e Mecanismo de Ação do Ácido Betulínico
Em princípio pensou-se que o ácido betulínico apresentava uma afinidade citotóxica somente por linhagens de melanoma (linhagem MEL-1-4) com a indução da apoptose de células cancerosas, por ter sido inativo contra várias outras linhagens celulares de câncer, tais como: mama (linhagem BC-1), cólon (linhagem COL-2), carcinoma epidermóide, próstata (linhagem LNCaP), pulmão (linhagem LU - 1) e cancro (PISHA et al., 1995). Porém, estudos posteriores confirmaram sua ampla citotoxidez contra várias outras linhagens de células cancerígenas. Verificou-se ser citotóxico contra outras linhagens celulares de neuroblastomas (SCHMIDT et al., 1997).
O ácido betulínico apresenta efeito direto sobre mitocôndrias com a indução da permeabilidade mitocondrial (FULDA et al., 1999) e despolarização do potencial de membrana mitocondrial (LIU et al., 2004). Também induz a liberação de citocromo C (FULDA et al., 1999) e a formação de espécies reativas de oxigênio, além do aumento da fosforilação padrão e, portanto, ativação da proteína p38 por estresse (LIU et al., 2004).
1.7.3 Obtenção do Ácido Betulínico
O ácido betulínico pode ser obtido por duas maneiras, por extração a partir de diferentes espécies vegetais, como pode ser observado na Tabela 4, ou por síntese orgânica.
1.7.3.1 Obtenção por Fonte Natural
São observadas na literatura diversas citações relativas à obtenção deste produto natural, utilizando-se variadas espécies vegetais para a extração, bem como metodologias diferentes para este fim, como podem ser observadas na Tabela 4.
Tabela 4 Algumas fontes naturais de obtenção do ácido betulínico descritas na literatura.
Droga Solvente de
extração
Método de extração Referência Cascas da raiz de Morus alba L. Etanol (70%) Maceração estática Signab et al , 2005 Frutos de Dillenia indica L. Metanol Maceração estática Kumar et al , 2010 Frutos e folhas de Licania
tomentosa (Benth.) Fritsch
n-Hexano
Metanol
Maceração estática Castilho & Kaplan, 2008a Rizoma de Nelumbo nucifera
Gaertn.
Etanol (70%) Maceração estática Mukherjee et al , 2010 Folhas de Ugni molinae Turcz n-Hexano
Diclorometano Acetato de etila Metanol.
Maceração estática Aguirre et al., 2006
Casca de Platanus occidentalis L. Metanol
n-Hexano
Diclorometano
Maceração estática Partição
Jayasuriya et al., 2005
Folhas de Eugenia florida DC. Etanol Maceração estática Frighetto, et al., 2005b Caules de Doliocarpus dentatus
(Aubl.) Standl.
Éter de Petróleo Soxhlet Sauvain et al., 1996
Caule de Davilla rugosa Poir. Metanol Maceração estática David et al., 2006
1.7.3.2 Obtenção por Síntese
Existem diversas rotas sintéticas propostas na literatura, porém em rotas longas com rendimento global baixo. Uma rota sintética proposta é a partir da betulina, um triterpeno de ocorrência natural que parece ser matéria-prima ideal para a síntese (FREIRE, 2009).
A betulina pode ser encontrada em altas quantidades em algumas espécies, chegando a constituir, por exemplo, cerca de 22% da casca de Betula alba (KESSLER et al., 2006) . Essa substância tem sido convertida no ácido por duas diferentes rotas sintéticas (FREIRE, 2009)
A primeira abordagem utiliza uma oxidação da betulina, seguida por uma redução. Embora estas duas reações forneçam boas a moderados rendimentos, a redução resultou na formação de uma mistura de epímeros, de difícil separação (FREIRE, 2009). Assim, em uma segunda via sintética, o uso de proteção de grupos funcionais tem sido sugerido, levando ao material puro, embora toda seqüência agora envolva cinco reações químicas (FREIRE, 2009).
Uma rota utilizando permanganato de potássio e óxido de cromo foi sugerido, e ainda mais recentemente, uma abordagem eletroquímica foi concebida. Ambas as abordagens, no
entanto, são de pequena escala e a preparação obteve rendimento apenas moderado (FREIRE, 2009).
Csuk et al (2006) sugerem nova forma de obtenção do ácido betulínico com rendimento de 86% a partir da betulina, conforme a reação apresentada na Figura 11:
Figura 11 Síntese do ácido betulínico proposta por Csuk et al, 2006.
1.8 Estudo Químico de Plantas
O estudo químico das plantas geralmente compreende algumas etapas principais e complementares (MATOS, 1997 e LOCK de UGAZ, 1994):
• Escolha da planta a ser estudada;
• Levantamento bibliográfico;
• Coleta da planta escolhida;
• Identificação botânica da planta;
• Prospecção preliminar da sua composição química;
• Isolamento e a purificação dos constituintes principais;
• Determinação estrutural;
• Ensaios biológicos e farmacológicos.
1.8.1 Escolha da Planta
Sem dúvida, existe uma dificuldade muito grande em escolher uma planta para estudo dentro de um universo de cerca de oitocentos e cinqüenta mil (número de espécies vegetais estimadas a mais de duas décadas por Farnsworth em 1987), considerando que cada espécie é formada por um conjunto de milhões de indivíduos com variações biológicas, morfológicas e na composição química o que torna difícil a escolha (MATOS, 1997).
Existem vários processos de seleção que foram desenvolvidos ao longo da história da fitoquímica, entretanto os aspectos de maior importância para a seleção de plantas para estudo químico são: o conhecimento da flora da região a ser pesquisada; o conhecimento popular sobre o uso das plantas e a quimiossistemática (MATOS, 1997; SIMÕES et al., 2007).
A quimiossistemática se baseia no levantamento de dados da literatura que permitem a avaliação da produção metabólica do táxon estudado, seja este o gênero, a família, ordem, entre outros. A partir destes dados é possível eleger marcadores quimiossistemáticos, devido, não somente ao seu grande número de ocorrências, mas também pela sua elevada diversidade estrutural (CASTILHO & KAPLAN, 2008b).
A escolha da planta a partir de informações do conhecimento popular pode conduzir a descoberta de substâncias promissoras, principalmente quando se trabalha nas regiões tropicais e subtropicais do planeta, que são ricas em diversidade botânica e química (HOSTETTMANN et al., 2003).
Outro aspecto importante na escolha da planta é o conhecimento da flora da região a ser pesquisada, ou seja, um levantamento prévio da vegetação existente na região. Assim é possível descobrir quais espécies são predominantes e concentrar a escolha nos constituintes químicos presentes nas mesmas (MATOS, 1997).
1.8.2 Levantamento das Referências Bibliográficas
O levantamento das referências bibliográficas é o ponto de partida de qualquer estudo, por isso, é de extrema importância uma busca de informações que tenham sido publicadas sobre o tema do trabalho a ser executado. No caso do estudo químico de plantas, a pesquisa bibliográfica sobre seus constituintes é iniciada em geral pela consulta ao Chemical Abstracts ou outras coletâneas de sumários de trabalhos publicados (MATOS, 1997).
Realizar uma pesquisa bibliográfica faz parte do cotidiano de todos os estudantes e pesquisadores. É uma das tarefas que mais impulsionam o trabalho de aprendizado e amadurecimento na área de estudo. Atualmente, as bibliotecas digitais têm facilitado e simplificado muito essa tarefa, pois trazem recursos de busca e cruzamento de informações que facilita a vida de todos. Uma iniciativa de extrema importância para a pesquisa no Brasil é o Portal de Periódicos da CAPES que disponibiliza para membros de 268 instituições de ensino superior e de pesquisa brasileiros o acesso a mais de treze mil revistas (nacionais e internacionais) com resumos de documentos em todas as áreas do conhecimento. As bases de
dados mais utilizadas são: Web of science, Scopus, Scifinder scholar, Medline/Pubmed, Google acadêmico, Lilacs e Scielo (TRAINA & TRAINA Jr., 2009).
1.8.3 Coleta
As espécies vegetais apresentam alta variabilidade no que se refere à produção de substâncias com atividade terapêutica. A produção metabólica pode variar dependendo do órgão da planta, estágio de desenvolvimento, a época do ano e hora do dia e muitos outros fatores que estão descritos na Figura 12 (MARTINS et al., 2000).
Figura 12 Fatores que podem influenciar a produção de metabólitos secundários
(GOBBO-NETO & LOPES, 2007).
A distribuição das substâncias numa planta pode ser bem irregular, pois alguns grupos podem se localizar preferencialmente em partes específicas da planta. Portanto, há a necessidade de se conhecer que parte deve ser coletada para estudo. Outro fator importante na coleta é o estágio de desenvolvimento da planta, isso se deve à concentração máxima da substância desejada ser atingida a partir de determinada idade ou fase de desenvolvimento. As concentrações das substâncias podem variar durante o dia e/ou durante o ano. A Tabela 5 apresenta algumas recomendações de coleta, de forma a garantir uma melhor qualidade (MARTINS et al., 2000), entretanto não representa uma regra a ser seguida.
Tabela 5 Recomendações gerais de coleta para plantas expontâneas e plantas cultivadas
(MARTINS et al., 2000).
Parte a ser coletada Ponto de Coleta
Casca e entrecasca Quando a planta estiver florida
Flores No início da floração
Frutos e sementes Quando maduros
Raízes Quando a planta estiver adulta
Talos e folhas Antes do florescimento
A coleta deve ser realizada com o tempo seco. A coleta de plantas doentes, manchadas, fora do padrão, com terra, poeira, órgãos deformados ou outros defeitos devem ser evitados (MARTINS et al., 2000).
O material coletado pode ser utilizado fresco ou seco. O consumo de plantas medicinais frescas nem sempre é possível, por isso, utiliza-se o processo de secagem do material vegetal como um método de conservação. A secagem do material vegetal visa impedir a ação enzimática e consequentemente deterioração. Após a secagem, geralmente, ocorre a redução do peso do material coletado conforme descrito na Tabela 6 (MARTINS et al., 2000).
Tabela 6 Uma forma geral de redução do peso em plantas medicinais submetidas à secagem
(MARTINS et al., 2000).
Órgão Vegetal Redução do Peso (%)
Folhas 20 - 75 Cascas 40 – 65 Lenho de árvores 30 – 70 Raízes 25 – 80 Flores em geral 15 – 80 Flor de camomila 66 Flor de borragem 90
A secagem pode ocorrer de forma lenta ao natural à sombra, em local ventilado, protegido de poeira e do ataque de insetos e/ou outros animais, mas deve-se ter cuidado para que o material vegetal não apresente fungos devido a secagem lenta. Outro método de secagem é o artificial com o auxilio de estufas ou secadores, este método é mais rápido podendo-se controlar a temperatura e umidade durante o processo, nesse caso deve-se controlar adequadamente a temperatura para que as substâncias de interesse não degradem (MARTINS et al., 2000).
1.8.4 Identificação Botânica
A planta escolhida para estudo deve ser seguramente identificada antes mesmo de iniciar o estudo químico. Segundo Matos (1997), o processo de identificar uma planta significa reconhecer um determinado espécime integrante de um conjunto como sendo semelhante a uma descrição existente, ou a outra planta já identificada em publicações e coleções especializadas em taxonomia botânica. Assim sendo, o pesquisador depende de um especialista para identificar a planta a ser estudada. Uma identificação errada ou a falta da mesma pode anular todo o trabalho do pesquisador.
Antes da coleta, no entanto, faz-se necessário a obtenção das autorizações e licenças, que podem variar dependendo do local onde se deseja coletar. Estas podem ser solicitadas junto ao Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA), Instituto Estadual do Meio Ambiente (INEA), Prefeituras, detre outros.
Para que ocorra a identificação é necessário coletar pequenos ramos de 20 a 30 cm com folhas, flores e frutos. Esse material deve ser preparado adequadamente em forma de exsicatas e depositados em herbário. Assim não se poderá por em dúvida a origem das substâncias isoladas e identificadas pelo pesquisador (MATOS, 1997).
1.8.5 Prospecção Preliminar da Composição Química
Uma espécie vegetal apresenta múltiplos constituintes químicos, muitas vezes os constituintes de interesse se apresentam em pequenas quantidades o que dificulta o seu isolamento e purificação. Essas dificuldades podem ser minimizadas definindo objetivos específicos para o estudo químico e aplicando-se técnicas de prospecção preliminar (MATOS, 1997).
O planejamento da prospecção preliminar deve atender a três princípios: a rapidez de execução; a precisão dos resultados; e a amplitude de informações. O pesquisador vai avaliar os seus objetivos e as condições de trabalho para definir os limites da influência destes princípios. A cromatografia em camada fina (CCF) é uma técnica bastante utilizada para estudo de espécies vegetais. O cromatógrafo com fase gasosa acoplado ao espectrofotômetro de massa, por exemplo, é um equipamento que geralmente atende de forma satisfatória aos princípios do planejamento da prospecção preliminar (MATOS, 1997). Outros equipamentos também podem ser utilizados dependendo da natureza dos extratos que estão sendo avaliados.
