Cromatografia

A cromatografia é um método físico-químico de separação que se fundamenta na migração diferencial dos componentes de uma mistura devido a diferentes interações entre duas fases imiscíveis: fase móvel (gás, líquido ou fluído supercrítico) e a fase estacionária (fixa, colocada em uma coluna ou numa superfície sólida) (DEGANI et al., 1998).

1.2.1.1 Cromatografia em Coluna

A metodologia de cromatografia em coluna aberta é muito utilizada devido à simplicidade de operação (HOSTETTMANN et al., 2003). É uma técnica bastante utilizada para isolamento de produtos naturais e purificação de produtos de reações químicas. As fases estacionárias mais utilizadas são sílica e alumina, entretanto estes adsorventes podem servir simplesmente como suporte para uma fase estacionária liquida. Fases estacionárias sólidas levam a separação por adsorção e fases estacionárias liquidas por partição. Estes suportes são acondicionados em tubos cilíndricos geralmente de vidro, de diâmetros variados, os quais possuem uma torneira em sua extremidade inferior (DEGANI et al., 1998).

A cromatografia em coluna aberta apresenta algumas limitações como:

• Separações lentas;

• Adsorção irreversível de algumas substâncias;

• Incompatibilidade com partículas de granulometria pequena.

Surgiram algumas técnicas alternativas de cromatografia preparativa, com o objetivo de superar estas desvantagens: cromatografia “flash”, a cromatografia em coluna seca e a cromatografia líquida a vácuo (HOSTETTMANN et al., 2003).

Os adsorventes possuem partículas na faixa de 60-230 mesh, de modo a possibilitar um fluxo razoável do solvente através da coluna. O uso de sílica de partícula menor (230-400 mesh) como adsorvente para essas colunas requer a utilização de um sistema de bombeamento para o empacotamento e eluição, sendo conhecido como cromatografia “flash” (DEGANI et al., 1998).

A cromatografia “flash” é muito utilizada entre os pesquisadores para problemas de separação simples e por serem muito fáceis de realizar, utilizando-se material de laboratório barato e de fácil acesso (HOSTETTMANN et al., 2003). Na cromatografia “flash” é aplicado uma pressão de ar e as colunas são mais curtas do que a coluna aberta convencional, tornando o processo de separação mais rápido (STILL et al., 1978). Na Figura 14, pode-se observar a diferença entre a cromatografia em coluna aberta e a cromatografia em coluna “flash”. Na Tabela 9 estão descritas variações de tamanho de partícula gel de sílica, vazão do eluente e tamanho da amostra (STILL et al., 1978).

Figura 14 Representação de cromatografia: (a) em coluna aberta (DEGANI et al., 1998); (b)

cromatografia “flash” (HOSTETTMANN et al., 2003).

Tabela 9 Tamanhos e capacidades das separações das colunas “flash” (STILL et al., 1978). Diâmetro da coluna (mm) Volume de eluente (mL) Amostra: __Carregamento típico (mg)__ ∆ Rf ≥ 0,2 ∆ Rf ≥ 0,1 Tamanho típico da fração (mL) 10 100 100 40 5 20 200 400 160 10 30 400 900 360 20 40 600 1600 600 30 50 1000 2500 1000 50 1.2.1.2 Cromatografia Gasosa (CG)

A cromatografia com fase gasosa é uma das técnicas analíticas mais utilizadas. Como uma ferramenta analítica, a cromatografia gasosa pode ser usada para análise de amostras gasosas, líquidas e sólidas voláteis. Se a amostra a ser analisada não é volátil ou estável termicamente, podem-se utilizar técnicas de derivatização ou pirólise. Além de possuir alto poder de resolução, é muito atrativa devido à possibilidade de detecção em escala de nano a picogramas (10-9 a 10-12 g) (DEGANI et al., 1998; GROB & BARRY, 2004).

Os gases utilizados como fase móvel devem ter alta pureza e ser inerte em relação à fase estacionária, os mais utilizados são hidrogênio, nitrogênio e hélio. A injeção da amostra é feita através de microseringas ou válvulas. As colunas são tubos longos de metais como aço ou cobre, vidro ou teflon com diâmetro de 0,15-3 mm e comprimento em torno de 3-100 m. Os detectores de maior aplicação são o Detector por Ionização em Chama (DIC) e o Detector de Condutividade Térmica (DCT). Muito utilizado também são os Cromatógrafos acoplados a

Espectrômetros de Massa (CG-EM). Os dados podem ser obtidos através de um registrador potenciométrico, um integrador ou um microcomputador (DEGANI et al., 1998).

1.2.1.3 Cromatografia em Camada Fina

A cromatografia em camada fina é uma técnica de adsorção líquido-sólido. Neste caso, a separação dos componentes da mistura ocorre em função da migração diferencial sobre uma camada fina de adsorvente, fixo numa superfície plana, por meio de uma fase móvel (um líquido ou misturas de líquidos) (DEGANI et al., 1998).

Por ser um método simples, rápido, visual e econômico, é uma técnica bastante usada para acompanhamento de reações orgânicas, purificação de substâncias e para identificação de frações coletadas em cromatografia líquida clássica (DEGANI et al., 1998).

O parâmetro mais importante a ser considerado na cromatografia em camada fina é o fator de retenção (Rf), o qual é a razão entre a distância percorrida pela substância em questão e a distância percorrida pela fase móvel. Os valores ideais para Rf estão entre 0,4 e 0,6. As amostras a serem analisadas devem ser aplicadas a aproximadamente 1 cm da base inferior da placa, com a ajuda de um capilar. Após a aplicação da(s) amostra(s) sobre a placa, a mesma deve ser introduzida numa cuba contendo a fase móvel adequada (DEGANI et al., 1998).

A escolha da fase móvel, que geralmente é constituída por um ou mais solventes, não é tarefa simples. No entanto, uma vez que as fases estacionárias mais usadas são extremamente polares, não devem ser utilizados solventes pouco polares, que não removeriam as substâncias do ponto de aplicação, nem solventes muito polares, capazes de arrastar os componentes da amostra até o topo da placa. Em vista disso, melhores resultados são obtidos com misturas de solventes, de modo a se obter uma polaridade média em relação à polaridade dos componentes da amostra (DEGANI et al., 1998).

A revelação das placas de cromatografia em camada fina pode ser feita por meio de luz UV, vapores de iodo, soluções de cloreto férrico, tiocianoferrato de potássio, fluorescências, radioatividade, dentre outras (DEGANI et al., 1998).

1.2.1.4 Cromatografia de Camada Fina em Alta Eficiência (CCFAE / Densitometria)

Esta é uma técnica avançada da cromatografia em camada fina, onde foi feita uma série de melhorias para automatizar as diferentes etapas do processo, aumentando assim a resolução e permitindo medições quantitativas mais precisas. A automação é útil para superar

a incerteza no tamanho das gotas e a posição quando a amostra é aplicada sobre a placa com o auxílio somente de um capilar (REICH & SCHIBLI, 2006).

A cromatografia em camada fina de alta eficiência é uma técnica bastante utilizada para estabelecer a identidade, pureza, qualidade e estabilidade de matérias-primas, extratos vegetais e produtos acabados (MUKHEJEE et al., 2010).

Na identificação química de uma amostra botânica uma impressão digital pode ser gerada. O extrato é obtido e em seguida cromatografado, apresentando uma seqüência de sinais ou zonas que representam os componentes conhecidos ou desconhecidos da amostra (REICH & SCHIBLI, 2006).