Cromatografia com Fase Gasosa com Detecção por Ionização de Chamas (CG-

a) Desenvolvimento Analítico

Com base na estrutura predominantemente apolar do ácido betulínico, durante o desenvolvimento dos métodos foram utilizadas colunas cromatográficas apolares de diferentes composições (DB-1 e DB-5). Outros parâmetros experimentais que influenciam na análise da substância estudada, como programação de temperatura do forno, temperatura do injetor e fluxo de gás de make up foram otimizados para a análise.

a.1. Coluna

Inicialmente, utilizou-se uma coluna do tipo “DB-1, 30 metros” (Figura 25). A coluna DB-1 (100 % dimetilpolissiloxano) tem aplicações típicas, entre outras, para hidrocarbonetos e álcoois, e foi selecionada em função do ácido betulínico ter uma porção polar e apolar, além de suportar temperaturas acima de 300 °C, numa programação exploratória, sendo a temperatura inicial de 100 ºC, rampa de 10 ºC/min até 300 ºC, fluxo constante de 1,00 mL/min, temperatura do injetor e detector em 250 ºC; tendo como amostra, uma solução a 1mg/mL de acido betulínico padrão metilado. Na Figura 29 pode-se observar a influência desta coluna na análise.

Si O

100%

Figura 29 Unidade Polimérica da Coluna DB-1.

Figura 30 Cromatograma gasoso do ácido betulínico derivatizado por diazometano em

Coluna DB-1 por CG-DIC.

Com resultados insatisfatórios, utilizou-se uma coluna do tipo DB-5 (Poli 5 % fenil – 95 % metilsiloxano) (Figura 31), amplamente utilizada na análise de hidrocarbonetos, alcaloides aromáticos, anabolizantes, flavorizantes e fragrâncias, sendo mantida as mesmas condições cromatográficas utilizadas anteriormente.

Si O 95% Si O 5%

Figura 31 Unidade Polimérica da Coluna DB-5.

Após a mudança da fase estacionária, notou-se uma melhor resposta nos cromatogramas (um ganho em resolução e tempo de análise). A Figura 32 apresenta o cromatograma obtido com a coluna DB-5.

Figura 32 Cromatograma gasoso do ácido betulínico derivatizado por diazometano em

Coluna DB-5 por CG-DIC.

A partir destes resultados, alguns parâmetros cromatográficos foram ajustados para melhorar a resolução das amostras de extrato derivatizados. Sendo assim a DB-5 foi a coluna cromatográfica que permitiu a melhor separação de todos os componentes em um menor tempo de análise.

a.2. Gás Make-up

Inicialmente foram feitos testes para verificar a influência do gás de make up (N2), gás responsável por atingir o fluxo ideal para o detector, empregando-se para isto um fluxo menor 10 mL min-1, em relação ao inicialmente testado (30 mL min-1).

A condição de 10 mL min-1 foi considerada a mais apropriada devido à obtenção das melhores intensidades do sinal para o ácido betulínico em estudo e, por esta razão, nos experimentos posteriores essa condição foi mantida. A diminuição de fluxo de gás de make up faz com que o efeito de diluição da substância no detector seja minimizado, com conseqüente diminuição na largura da base dos sinais, apresentando melhor desempenho no processo cromatográfico, por proporcionar uma melhora na eficiência da coluna, assim como permite a redução da pressão e dos tempos de separação. Na Figura 33 pode-se avaliar a influência do gás make-up.

Figura 33 Avaliação da influência no gás make-up na resolução do ácido betulínico

derivatizado por diazometano: (a) Makeup maior; (b) Makeup menor.

a.3. Pulso de pressão

Foi avaliada a influência da variação de fluxo e pulso de pressão em diferentes períodos de duração. Na transferência mais rápida para o interior da coluna, em pressão constante a 9,38 psi, a eluição do ácido betulínico metilado aumentou a intensidade do sinal, bem como, o estreitamento da mesma. O que é explicado pelo aumento da velocidade de transferência do analito com elevado ponto de ebulição das substâncias que possam ser adsorvidas no injetor, redução do tempo de residência da amostra no injetor e aumento da capacidade do mesmo, em função do volume de vapor ser inversamente proporcional. Desta forma, a pressão resulta em um gerenciamento adequado destes fenômenos, proporcionando uma condição cromatográfica satisfatória. Na Figura 34 pode-se avaliar a influência no pulso da pressão na análise do ácido betulínico

(b) (a)

Figura 34 Avaliação do pulso de pressão no desempenho cromatográfico do ácido betulínico

metilado.

a.4. Temperatura

As injeções foram realizadas com volume de 1 µL, com divisão de fluxo e fluxo de coluna constante. Com base no ponto de fusão do betulinato de metila (PF: 225 °C), durante todas as análises, a temperatura do detector foi mantida entre 55-100 °C acima da temperatura mais alta do forno, a fim de evitar e/ou diminuir o efeito de cauda nos sinais e manter a célula do detector limpa.

De acordo com a Figura 35, os dados indicaram que, de forma geral, não há diferença significativa nas alturas relativas dos picos nas temperaturas do injetor entre 280 e 350 °C. Contudo, a temperatura de 350 °C foi escolhida por ter propiciado maior intensidade do sinal cromatográfico.

Figura 35 Cromatograma obtido com o ácido betulínco metilado e com variações de

Desta forma, a metodologia definida foi: Cromatógrafo AGILENT modelo 6890N, com injetor do tipo Split/Splitless, Coluna Cromatográfica DB-5 (30 m X 320 µm X 1.5 µm); detector de ionização de chamas. Injetor em taxa de split de 5:1; 300 ºC. Programação da coluna: Isoterma inicial de 200 ºC por 2 minutos; rampa de 15 ºC/min até 350 ºC; isoterma final de 13 minutos; fluxo constante de 1.0 mL/min; detector a 350 ºC; fluxo de Hidrogênio e Ar sintético de 35 e 350 ml/min respectivamente e Hélio como gás de arraste.

a.5. Validação da Metodologia Analítica por CG-DIC

O relatório com os resultados de validação da metodologia analítica desenvolvida por CG-DIC está descrito no Apêndice D - Relatório de Validação de Metodologia Analítica para o Teor de Ácido Betulínico (AB) em Extratos Sazonais de Eugenia florida DC por CG-DIC.

1.3.3 Cromatografia em Camada Fina acoplada a Densitometria Ótica