Capítulo 4: Avaliação in vitro dos extratos obtidos nas diversas etapas de trabalho
6.2 Conclusões Específicas
Desenvolvimento de Metodologias Analíticas
As duas metodologias analíticas desenvolvidas por CG-DIC e CCF/Densitometria, atenderam os parâmetros de validação descritos na RE (Resolução da ANVISA) nº 899/2003, o que sugere a confiabilidade dos resultados de identificação e quantificação do ácido betulínico, independente do método de extração e a espécie utilizada.
O resultado de caracterização por CG-EM confirmou a presença do ácido betulínico na matriz. O resultado de RMN comprovou a eficiência da metodologia desenvolvida por
cromatografia tipo “flash” para o isolamento e a recristalização para purificação do ácido betulínico a 98,5%, mais puro do que o padrão Sigma Aldrich de 90%.
Avaliação das Técnicas de Extração
A matriz de E. florida apresenta uma característica polar, por isso o rendimento de extração é maior com solventes polares como o metanol, mas o ácido betulínico por ser uma substância com características polares e apolares e apresentou uma melhor extração com os solventes de constante dielétricas menores como o acetato de etila e o clorofórmio.
As técnicas que apresentaram um maior teor de ácido betulínico extraído foram: percolação e maceração.
As técnicas de ultrassom e soxhlet apresentaram menor teor de ácido betulínico provavelmente pela degradação do mesmo pelas ondas ultrassônicas e uso de temperaturas.
No estudo de diferentes tamanhos de partículas para as folhas de E. florida, observou-se que para extração do ácido betulínico, o melhor tamanho foi de 0,85 mm, apresentando um maior percentual de ácido betulínico. Como os resultados com as linhagens de células tumorais demonstraram que existem outras substâncias presentes nas folhas de E. florida que também possuem atividade antitumoral, se faz necessário testar os extratos obtidos das diferentes granulometrias de folhas de E. florida nas linhagens celulares para verificar se realmente o melhor tamanho seria 0,85 mm com solvente acetato de etila (que apresentou um maior percentual de AB) ou se a forma pulverizada (que apresentou um menor percentual de AB, mas com um alto rendimento extrativo e consequentemente um maior número de substâncias extraídas). Com este estudo pode-se concluir que é importante diminuir o tamanho da partícula e obter uma amostra com granulometria homogênea, o que facilita muito a solubilização das substâncias.
Obtenção dos Extratos
No estudo de variação metabólica os meses de junho e julho apresentaram um maior percentual de teor de ácido betulínico. Mas para afirmar que um determinado fator está correlacionado a produção de AB, estudos mais específicos devem ser realizados correlacionando conhecimentos ambientais, agronômicos e biológicos de diversos indivíduos.
Os estudos realizados com as outras espécies que contém ácido betulínico em sua composição apresentaram resultados de teor de AB abaixo de 4%, o que foi considerado muito baixo em relação à média de 10,25% dos resultados obtidos com E. florida.
Avaliação in vitro dos extratos obtidos nas diversas etapas do trabalho
Os extratos de Eugenia florida apresentaram citotoxidade menor do que o padrão de ácido betulínico e a maioria apresentou o Índice de Seletividade maior que dois, significando que o extrato apresenta mais afinidade para linhagens neoplásicas do que para as linhagens sadias. A atividade antitumoral continua independente da variação de teor do ácido betulínico no extrato o que sugere a existência de outras substâncias no extrato que apresentam atividade antitumoral e/ou um efeito sinérgico com o ácido betulínico. Esses resultados definem que, neste caso, seria melhor desenvolver um medicamento fitoterápico do que um fitofármaco.
Ressalta-se a afinidade pela linhagem OVOCAR-3, onde os resultados foram bastante interessantes principalmente para o mês de Maio/2011 com CI50= 1,6 µg/mL, que foi melhor do que o padrão do ácido betulínico com CI50= 2,5 µg/mL. Esse fato sinaliza a novas pesquisas para o desenvolvimento de um antitumoral para câncer de ovário, no entanto outros estudos devem ser desenvolvidos.
Os extratos de E. florida apresentaram menor atividade em comparação aos fármacos doxorrubicina e vincristina, mas é importante considerar que tratam-se de extratos brutos e que são necessários mais estudos para obter frações purificadas que atendam a atividade desejada.
Para as outras espécies estudadas foram observados bons resultados de citotoxidade para os extratos das cascas dos frutos verdes de D. indica; dos frutos extraídos com metanol e das folhas extraídas com n-hexano e metanol de L. tomentosa e do rizomade N. nucifera, que apresentaram valores de CC50>1.000 µg/ml. As espécies estudadas também apresentam uma seletividade pela linhagem OVOCAR-3, a espécie/órgão mais ativa contra esta linhagem foi a raiz de Nelumbo nucifera com CI50= 0,54 µg/mL. Como se trata da raiz de uma planta torna-se menos vulnerável à variações sazonais, o que viabiliza o desenvolvimento de um fitoterápico, sendo necessário uma programação anula de cultivo.
7 SUGESTÃO E PERSPECTIVAS PARA TRABALHOS FUTUROS
O uso de folhas de E. florida como um fitoterápico associado à terapia para tratamento de câncer, pode ser uma grande descoberta para a fitoterapia no Brasil e podendo apresentar um custo muito menor do que os fármacos usados hoje para tratamento, no entanto mais estudos devem ser realizados.
A partir dos resultados aqui apresentados e discutidos têm-se como metas para futuros trabalhos:
1 - Continuidade do estudo de sazonalidade por mais um ou dois anos;
2 – Obtenção de frações purificadas do extrato das folhas de E. florida e avaliação da atividade antitumoral destas in vitro, em linhagens tumorais e com linhagens celulares normais;
3 – Avaliação da atividade in vitro dos extratos obtidos com diferentes tamanhos de partículas;
4 – Estudo de estabilidade dos extratos; 5 – Estudos de pré-formulação;
6 – Ensaios de toxicidade in vivo dos extratos, frações e pré-formulações que apresentarem atividade frente aos ensaios preliminares in vitro;
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APÊNDICE A
Protocolo de validação de metodologia analítica para determinação do teor de Ácido Betulínico (AB) em extratos Eugenia florida DC (EF) por CG-DIC
1 – ABRANGÊNCIA
Este protocolo descreve o procedimento utilizado para validar um método por cromatografia gasosa (CG) / detector de ionização de chama (DIC) para identificar e quantificar o ácido betulínico em extratos de Eugenia florida DC, oriundos de diversas técnicas extrativas e solventes.
2 – NORMAS E DOCUMENTOS A CONSULTAR
Normas de Validação - Re 899/03.
3 – DEFINIÇÕES
Extrato – Extratos obtidos de folhas de Eugenia florida DC contendo ácido betulínico.
Teste de Grubbs (G) – É realizado para um valor suspeito, podendo este ser o maior ou o menor valor. Valores aberrantes são valores diferentes, não necessariamente errados, são