Extração

Antes de iniciar o processo de isolamento e purificação dos constituintes químicos das plantas deve-se preparar um extrato bruto. Para isso é necessária a escolha adequada do solvente e método de extração. Com uma extração que utilize solventes de baixa polaridade obtêm-se substâncias mais lipofílicas e com solventes alcoólicos obtêm-se um amplo espectro de material polar e apolar. Se for utilizado um solvente mais polar para o primeiro passo da extração, os fracionamentos posteriores permitem uma divisão mais fina em frações de distintas polaridades (HOSTETTMANN et al., 2003).

Depois da obtenção do extrato pode-se dar início aos métodos de partição entre solventes que eliminam uma grande parte do material indesejável. Quando se utiliza esse método combinado com testes biológicos pode-se obter, frações enriquecidas com o componente desejado (HOSTETTMANN et al., 2003).

A Tabela 7 apresenta de uma forma geral processos de separação dos constituintes de um extrato, a partir dos resultados obtidos no estudo preliminar em cromatografia de camada fina (MATOS, 1997).

Tabela 7 Processo de separação dos constituintes de um extrato versus resolução obtida em

cromatografia em camada fina (MATOS, 1997).

Resolução em placa Processo de separação

Resolução regular em placa, quantidade até 0,5g. Usar cromatografia em placa preparativa Ótima resolução em placa, 2-4 constituintes,

quantidades entre 0,1 a 1,0 g.

Usar cromatografia de média pressão. Boa resolução em placa, vários constituintes,

quantidade maior que 0,5 g.

Usar cromatografia em coluna (de preferência com gradiente de eluição).

Má resolução em placa (o material não migra ou não separa).

Usar cromatografia em coluna filtrante de gel Sephadex apropriado (LH-20). Acetilar e/ou metilar o material e repetir o exame em cromatoplaca.

No isolamento de substâncias podem-se utilizar algumas técnicas cromatográficas como (HOSTETTMANN et al., 2003):

• Cromatografia em camada fina;

• Cromatografia em coluna;

• Cromatografia líquida de alta eficiência;

• Cromatografia de partição;

Substâncias isoladas devem ser purificadas, geralmente por cromatografia em coluna preenchida com gel de sílica, nos casos de difícil purificação deve-se empacotar a coluna com

partículas menor ou igual a 10 µm para a purificação final. A Figura 13 mostra as etapas para conseguir uma substância pura (HOSTETTMANN et al., 2003).

Figura 13 Esquema para purificação de substâncias isoladas de material vegetal

(HOSTETTMANN et al., 2003).

1.8.6.1 Métodos de Extração

Antes de iniciar um processo de extração deve-se definir a seletividade do solvente a ser empregado no processo. Dependendo da finalidade a que se destina, pode-se obter um extrato cuja composição contenha a maior parte das substâncias químicas da planta, ou um extrato que apresente, apenas, substâncias com características semelhantes (SHARAPIN et al., 2000).

Quando o material vegetal é colocado em contato com o solvente, ocorre a penetração do mesmo na célula vegetal, expulsando o ar contido no citoplasma, começando o processo extrativo. A penetração do solvente na célula induz um momento dipolar nas moléculas das substâncias a serem extraídas. Assim as substâncias são associadas mais ou menos fortemente às moléculas do solvente. A capacidade de associação pode ser expressa em termos de constante dielétrica, que é uma função derivada das propriedades eletrônicas do solvente (SHARAPIN et al., 2000).

A escolha do solvente para extração deve ser feita tendo-se em vista os objetivos do estudo e os resultados da prospecção preliminar. O solvente escolhido deve ser o mais seletivo possível. Por causa da seletividade podem-se extrair apenas as substâncias desejadas ou em maior quantidade. Como a seletividade depende da polaridade, é necessário o conhecimento do grau de polaridade do solvente que mais se aproxima do ótimo de seletividade para extrair a substância desejada.

Quando não se conhece previamente o conteúdo do material a ser analisado, costuma- se submeter a droga vegetal a sucessivas extrações, com solventes de polaridade crescente, conseguindo-se assim, uma extração fracionada, em que as diferentes frações contêm substâncias de polaridades também crescente. Na Tabela 8 estão descritos os solventes mais utilizados e as substâncias que são extraídas (SIMÕES et al., 2007).

Separação preparativa Separação Semi- preparativa Separação analítica Substância Pura

Tabela 8 Solventes usados para extração X substâncias extraídas (SIMÕES et al., 2007). Solvente Tipos de substâncias preferencialmente extraídas

Éter de petróleo, n-Hexano Lipídios, ceras, pigmentos, furanocumarinas

Tolueno, Diclorometano, Clorofórmio Bases livres de alcalóides, antraquinonas livres, óleos voláteis.

Acetato de etila, n-butanol Flavonóides, cumarinas simples

Etanol, Metanol Heterosídeos em geral

Misturas hidroalcoólicas, água Saponinas, taninos

Água acidificada Sais de Alcalóides

Água alcalinizada Saponinas

Além da seletividade do solvente, existem outros fatores que podem influenciar na extração das substâncias desejáveis do material vegetal: características do material vegetal, o seu grau de divisão e a metodologia de extração (SHARAPIN et al., 2000; SIMÕES et al., 2007).

• Características do material vegetal: A estrutura histológica das diversas partes componentes de uma planta é bastante heterogênea; existem órgãos, como algumas raízes e caules, cujos tecidos estão extraordinariamente compactados, ao passo que em folhas e flores os tecidos podem apresentar estruturas e tecidos mais delicados. O poder de penetração dos solventes depende, entre outros fatores, da consistência dos tecidos que formam o material a extrair (SIMÕES et al., 2007).

• Grau de divisão: O grau de divisão do material pode influenciar diretamente na eficiência da extração. As características do material vegetal descritas anteriormente apresentam influência direta. Para que ocorra a penetração adequada dos solventes em cada tipo de órgão utilizado na extração é necessário considerar que quanto mais rígido for o material menor deve ser a sua granulometria (SIMÕES et al., 2007).

• Tempo de extração: o tempo de extração varia em função: da rigidez dos tecidos do material vegetal, do seu grau de divisão, da natureza da substância a extrair, do solvente, e da utilização ou não de temperatura e/ou agitação (SIMÕES et al., 2007).

• Temperatura: o aumento de temperatura na extração aumenta a solubilidade das substâncias, mas o calor nem sempre pode ser empregado já que muitas substâncias são instáveis em altas temperaturas (SIMÕES et al., 2007).

• Agitação: a agitação pode abreviar consideravelmente a duração do processo extrativo (SIMÕES et al., 2007).

Na escolha do método de extração deve-se avaliar alguns fatores importantes: a eficiência do método, a estabilidade das substâncias extraídas e a disponibilidade dos solventes e equipamentos a serem utilizados (SIMÕES et al., 2007).

1.8.6.1.1 Maceração

A maceração é um método de extração muito utilizado que consiste em colocar em contato o material a ser extraído e o líquido extrator, em quantidades preestabelecidas, por um período prolongado de horas ou dias consecutivo, em recipiente fechado, âmbar ou que não permita contato com a luz, à temperatura ambiente (SHARAPIN et al., 2000)

Pela sua natureza, não conduz ao esgotamento da matéria-prima vegetal, seja devido à saturação do líquido extrator ou ao estabelecimento de um equilíbrio difusional entre o meio extrator e o interior da célula. Quando houver necessidade pode-se realizar a re-maceração, que consiste na repetição da maceração utilizando o mesmo material vegetal, renovando-se apenas o líquido extrator (SIMÕES et al., 2007).

Existem dois tipos de maceração: maceração estática e maceração dinâmica. A diferença entre as duas é a agitação, na maceração estática é realizada somente uma vez ao dia ou a cada troca de solvente, e na maceração dinâmica a agitação é constante durante todo o processo de extração.

• Maceração Estática - consiste na operação na qual a extração da matéria-prima

vegetal é realizada em recipiente fechado, em temperatura ambiente, durante um período prolongado (horas ou dias), com ou sem renovação do líquido extrator (SIMÕES et al., 2007).

• Maceração Dinâmica – neste tipo de extração a planta deve ficar em contato

com o solvente em mesa agitadora (shaker) ou algum tipo de agitador mecânico. Dessa forma, o solvente permanece em agitação durante o período de extração (SIMÕES et al., 2007).

1.8.6.1.2 Percolação

Denomina-se percolação o processo de passar o solvente através de uma camada do material a ser extraído, até o seu completo esgotamento. A percolação simples consiste no processo em que ocorre uma extração exaustiva da droga sempre com o solvente renovado. O material deve ser umedecido previamente com o liquido extrator por duas horas em recipiente fechado (SHARAPIN et al., 2000).

Em escala de bancada, a percolação é conduzida em extratores, denominados percoladores, de corpo cilíndrico ou cônico, providos de torneira na parte inferior, para regular o fluxo do solvente. A camada do material a ser extraído deve ser igual a cinco vezes o diâmetro médio do equipamento (SHARAPIN et al., 2000).

1.8.6.1.3 Soxhlet

A extração em soxhlet é um método contínuo muito utilizado na extração de substâncias orgânicas. As vantagens deste processo de extração são: uma extração contínua e um volume reduzido de solvente e as desvantagens são: o solvente deve ser volátil, a substância de interesse a ser extraída não pode ser volátil ou termolábil, pois o material extraído permanece em contato com o solvente em ebulição durante todo o processo e, em alguns casos, isto pode provocar degradações nos componentes extraídos (MELECCHI, 2005).

1.8.6.1.4 Ultrassom

A extração por ultrassom é um processo que utiliza a energia de ondas sonoras. Estas ondas criam uma variação na pressão do líquido empregado no processo, gerando cavitações. Cavitações consistem na formação espontânea de bolhas num líquido abaixo do seu ponto de ebulição, resultante do esforço dinâmico (LIST & SCHMIDT, 1989).

A utilização de ondas ultra-sônicas de alta freqüência (20 a 100 kHz) causa mudanças físicas e químicas permanentes por produzirem cavitações e microfluxos nos líquidos, aquecimento e ruptura nos sólidos e instabilidade na interface de sistemas líquido-líquido e líquido-gás (BARBOZA & SERRA, 1992; BERLAN & TIMOTHY, 1992).

A utilização do ultrassom pode ser dividida em duas principais áreas: alta potência e baixa potência. Elevada freqüência, pequenas translocações, moderada velocidade e alta aceleração são algumas características do ultrassom de alta potência. Na biologia a técnica de ultrassom de alta potência é utilizada na homogeneização de células, esterilização, extração de componentes em tecidos de plantas ou animais (BARBOZA & SERRA, 1992).

As ondas ultra-sônicas de baixa freqüência e baixa amplitude de propagação são usadas em muitos campos da ciência, engenharia e medicina, para ensaios e diagnósticos técnicos.

Esta técnica é citada como sendo igual, ou melhor, do que a técnica de extração por soxhlet, apresentando vantagens de alta reprodutibilidade, possibilitando a utilização em uma ampla gama de tamanhos de amostra, rapidez de processamento e baixo custo (KOH, 1983; SARGENI & VICHNEWSI, 2000).

Os principais efeitos do ultrassom, empregado como técnicas de extração são: aumento da permeabilidade da parede celular; produção de cavitação; e aumento da tensão mecânica das células (LIST & SCHMIDT, 1989).

Os efeitos do ultrassom no processo de extração dependem da freqüência e capacidade do equipamento e do tempo empregado na extração. Alguns autores informam a ocorrência de transformações químicas nos extratos, resultante da utilização de longos tempos de extração (VINATORU, 2001; SCHINOR et al., 2004).

1.8.7 Determinação Estrutural

A determinação estrutural de uma substância pode ser feita através da interpretação de vários espectros obtidos em aparelhagem específica, dentre estes se citam: espectrofotômetros de absorção das radiações ultravioleta, visível e infravermelho, espectrômetro de ressonância magnética protônica e de carbono 13 e espectrômetro de massas. As amostras destinadas à obtenção de espectros devem atender, principalmente, a duas condições rotineiras (MATOS, 1997):

Pureza – o material deve ser o mais puro possível, avaliado através de ponto de fusão,

ressonância magnética nuclear, infravermelho, espectrometria de massas e avaliado o comportamento por cromatografia em camada fina;

Umidade – a presença de água no material pode provocar alterações desvantajosas nos

espectros, por isso, é necessária a sua retirada por completo da amostra sempre que possível. O aquecimento do material em estufa com temperatura de 5-10 ºC abaixo do ponto de fusão da substância e depois deixar o material esfriar em dessecador a vácuo, pode ser uma maneira de se conseguir retirar a água do material.