FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
ROBERTO SALVADOR MARTINS
ESTUDO DE BIODISPONIBILIDADE COMPARATIVA ENTRE UMA FORMULAÇÃO TESTE DE ACETATO DE MEDROXIPROGESTERONA E CIPIONATO ESTRADIOL E UMA FORMULAÇÃO REFERÊNCIA EM SUSPENSÃO
INJETÁVEL INTRAMUSCULAR
CAMPINAS 2017
ESTUDO DE BIODISPONIBILIDADE COMPARATIVA ENTRE UMA FORMULAÇÃO TESTE DE ACETATO DE MEDROXIPROGESTERONA E CIPIONATO ESTRADIOL E UMA FORMULAÇÃO REFERÊNCIA EM SUSPENSÃO
INJETÁVEL INTRAMUSCULAR
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Farmacologia.
ORIENTADOR: PROF. DR. GILBERTO DE NUCCI
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO
ALUNO ROBERTO SALVADOR MARTINS E ORIENTADO PELO PROF. DR. GILBERTO DE NUCCI.
CAMPINAS 2017
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO
ROBERTO SALVADOR MARTINS
ORIENTADOR:
PROF. DR. GILBERTO DE NUCCI
MEMBROS: 1. PROF. DR. GILBERTO DE NUCCI ________________________________________ 2. PROFA. DRA. FABÍOLA TAUFIC MÓNICA IGLESIAS _________________________________ 3. PROF. DR. KÁTIA PITON SERRA _______________________________________ Programa de Pós-Graduação em FARMACOLOGIA da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas. A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno. Data: DATA DA DEFESA 21/08/2017
Agradeço a minha esposa, Alessandra, pelo incansável apoio e ajuda para que mais esta etapa de nossas vidas fosse concretizada.
Aos meus filhos, Victor e Marina, pelo apoio e sacrifício, através da abdicação do convívio diário, que minha dedicação a atividades de ciência e pesquisa acaba por lhes impor.
À minha mãe, Norina, e ao meu tio, José, pelo contínuo apoio e exemplo que sempre foram e serão para mim.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Gilberto De Nucci, pelo apoio durante estes anos de atividades em conjunto.
Ao Dr. Ronilson Agnaldo Moreno, pelo grande apoio e contribuições, fundamentais para a conclusão deste trabalho.
Ao Sr. Mauro pela paciência, apoio e colaboração no presente trabalho.
A todos que integraram ou integram o “grupo Cartesius/Galeno”, os quais colaboraram para que tanto este como os outros inúmeros trabalhos acadêmicos fossem viabilizados.
A todos que de forma direta e indireta contribuíram para a realização deste trabalho,
Estudos de biodisponibilidade são úteis para definir como a formulação de um medicamento afeta a farmacocinética do seu princípio ativo e também para determinar bioequivalência entre formulações distintas de um mesmo princípio ativo.
O acetato de medroxiprogesterona (AMP) em associação com o cipionato de estradiol (E2C) são contraceptivos de uso injetável em dose mensal.
O presente estudo tem por objetivo avaliar comparativamente a biodisponibilidade de duas formulações diferentes, disponíveis no mercado brasileiro: a formulação teste, sob a forma de suspensão injetável de AMP (25mg/mL) e E2C (5mg/mL), e a formulação de referência, com 25mg/0,5mL e 5mg/0,5mL, respectivamente, quando administradas por via intramuscular, sob condição de jejum.
O desenho foi monocêntrico, aberto, e aleatorizado sem procedimentos de codificação cega, paralelo, com dois tratamentos e período único.
Na Etapa Clínica foram selecionadas 110 voluntárias, sendo que 100 compareceram para a fase de internação, onde foram feitas as administrações das diferentes soluções de forma aleatória e início das coletas das amostras. Ao final de 84 dias, 96 voluntárias encerraram o levantamento e foram encaminhadas 4380 amostras para a Etapa Analítica.
Na Etapa Analítica o método de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência, com Electrospray, associada à Espectrometria de Massas (LC-MS/MS) para a determinação quantitativa dos fármacos AMP e C2E em matrizes biológicas foi validado, e foram obtidos os parâmetros farmacocinéticos correspondentes.
A análise estatística foi realizada com base em modelo mutiplicativo para valores da área sob a curva até o último valor obtido em todas as amostras (ASC0-t último) e para a concentração máxima (Cmáx). Estese a área extrapolada ao infinito (ASC 0-inf) foram transformados em logaritmo natural (Ln) e submetidos a análise de variância (ANOVA). Também foi calculada a constante de eliminação (Ke) e a meia-vida de eliminação (T1/2) das formulações.
Os valores de Cmáx para a AMP foram estatisticamente diferentes (p<0,05), porém os
no referência (R), de ASC0-t último foi de 0,50 e 0,67 (respectivamente) e o CV de ASC 0-inf 0,69 e 2,68. E a raiz quadrada do erro quadrático médio inter-sujeito (REQM) para o AMP foi de 0,36 para Cmáx , 0,43 para ASC0-t último e 0,58 para ASC 0-inf .
Para E2C, o CV T de Cmáx foi de 0,6 e CV R 0,69; de ASC0-t último foi de 1,18 para T e 1,17 para R e na ASC 0-inf para T foi de 1,69 e para R 3,47. A REQM foi de 0,7 para Cmáx , 1,31 para ASC0-t último e 1,49 para ASC 0-inf .
Concluiu-se que estas formulações apresentam biodisponibilidades altamente variáveis, com CV > 0,3 e REQM > 0,3 em quase todos os parâmetros estudados, exceto para o Cmáx do AMP.
O intervalo de confiança (IC) de 90% para a razão das médias geométricas dos dados transformados dos medicamentos T e R, para os parâmetros ASC0-t último, Cmáx e ASC 0-inf, apresentaram-se além do clássico 80-125%. Consequentemente, não foi comprovada a bioequivalência entre eles.
Palavras-chave: biodisponibilidade, acetato de medroxiprogesterona, estradiol, cromatografia, espectrometria de massas, intercambialidade de drogas.
Bioavailability studies are useful in defining how the formulation of a drug affects the pharmacokinetics of its active principle and also to determine bioequivalence between distinct formulations of the same active principle.
Medroxyprogesterone acetate (MPA) in combination with estradiol cypionate (E2C) are contraceptives for monthly injectable use.
The objective of the present study was to evaluate the bioavailability of two different formulations, available in the brazilian market: the test formulation, in the form of an injectable suspension of MPA (25mg/mL) and E2C (5mg/mL), and the reference formulation, with 25mg/0.5mL and 5mg/0.5mL, respectively, when given intramuscularly, under fasting conditions.
The design was monocentric, open, and randomized without blind, parallel coding procedures, with two treatments and a single period.
In the Clinical Phase, 110 volunteers were selected, of whom 100 were submitted to the hospitalization phase, where the administrations of the different solutions were randomly collected and samples were taken. At the end of 84 days, 96 volunteers closed the survey and 4380 samples were sent to Analytical.
In the Analytical Phase the High Efficiency Liquid Chromatography method with Electrospray, associated with Mass Spectrometry (HPLC-MS/MS) for the quantitative determination of MPA and C2E drugs in biological matrices was validated, and the corresponding pharmacokinetic parameters were obtained.
Statistical analysis was performed based on a multivariate model for values of the area under the curve to the last value obtained in all samples (AUC 0 - t last) and for the maximum concentration (Cmax). These, and the extrapolated area at infinity (AUC 0-inf) were transformed into natural logarithm (Ln) and subjected to analysis of variance (ANOVA). The elimination constant (Ke) and elimination half-life (T1/2) of the formulations were also calculated.
Cmax values for MPA were statistically different (p<0.05), but the other parameters for both MPA and E2C presented p>0.05.
the reference (R), AUC0-t last was 0.50 and 0.67 (respectively) and VC of AUC 0-inf 0.69
and 2.68. And the root mean square error (RMSE) inter-subject for the AMP was 0.36 for Cmax, 0.43 for AUC0-t last and 0.58 for AUC 0-inf.
For E2C, the VC T of Cmax was 0.6 and VC R 0.69; of the AUC0-t last was 1.18 for T and
1.17 for R and in AUC 0-inf for T was 1.69 and for R 3.47. The REQM was 0.7 for Cmax,
1.31 for AUC0-t last and 1.49 for AUC 0-inf.
It was concluded that these formulations presented highly variable bioavailabilities, with VC > 0.3 and REQM > 0.3 in almost all parameters studied, except for AMP Cmax.
The 90% confidence interval (CI) for a ratio of the geometric means of the transformed data of the medicines T and R, for the AUC0-t last, Cmax and AUC0-inf parameters, were
in addition to the classic 80-125%. Consequently, no bioequivalence between them has been proven.
Key words: bioavailability, medroxyprogesterone acetate, estradiol, chromatography, mass spectrometry, interchange of drugs.
FIGURAS:
Figura 1: Parâmetros farmacocinéticos para analise de biodisponibilidade. Nos dois casos, não há bioequivalência entre os fármacos.
Figura 2: Método trapezoidal, com a soma das áreas dos pequenos trapézios formados abaixo da curva.
Figura 3: A importância do LIQ no cálculo da ASC0-t último
Figura 4: Cálculo do coeficiente angular do ângulo a é igual à tg negativa do ângulo b.
Figura 5: Fase de distribuição e de eliminação do fármaco.
Figura 6: Parâmetros farmacocinéticos para analise de bioequivalência.
Figura 7: Mosaico com separações de pigmentos em papel filtro realizadas pelo cientista Friedlieb Ferdinand Runge, em 1866.
Figura 8: Representação de uma partícula superficialmente porosa, disponível comercialmente com o nome Kinetex® da fabricante Phenomenex® e detalhe microscópico de uma partícula.
Figura 9: Diagrama de dispositivo para cromatografia e primeiras técnicas de fracionamento cromatográfico de hidrolisado de albumina de soro bovino.
Figura 10: Representação da HPLC.
Figura 11: Detecção dos diferentes fragmentos de uma solução, por MRM, em água/ metanol 1:1 contendo Cu2+, N-Ac-L-Phe (referência quiral) e D-ribose (analito, A) na espectrometria de massas.
Figura 12: ionização do analito por Electrospray.
Figura 13: Quadrupolo, perspectiva e corte transversal.
Figura 14: Eixo Hipotálamo-Hipófise-Ovário (EHHO), com os mecanismos de “feedback” positivos e negativos.
Figura 15: Alterações ovarianas durante o ciclo menstrual.
Figura 16: Concentrações plasmáticas aproximadas das gonadotrofinas e hormônios ovarianos durante o ciclo sexual feminino normal. FSH, hormônio folículo estimulante;
Figura 17: Correlação entre os níveis hormonais e as respostas ovariana e uterina. Figura 18: Estrutura molecular do medroxiprogesterona e da progesterona.
Figura 19: Estrutura do estradiol e do cipionato de estradiol. Figura 20: Desenho do estudo.
Figura 21: Estrutura química da medroxiprogesterona e medroxiprogesterona-d6. Figura 22: Estrutura química de cipionato de estradiol e de estradiol–d5.
GRÁFICOS
Gráfico 1: Curva de calibração para a AMP. Gráfico 2: Curva de calibração para E2C. Gráfico 3: MRM para Cipionato de Estradiol. Gráfico 4: MRM para Cipionato de Estradiol-d6.
Gráfico 5: Médias de idade (em anos) e índice de massa corpórea (IMC) em kg/m2 com 111 voluntárias.
Gráfico 6: Médias de idade (em anos) e índice de massa corpórea (IMC) em kg/m2 com 96 voluntárias.
Gráfico 7: Incidência de eventos adversos durante o estudo. Gráfico 8: Tipos de eventos adversos durante o estudo.
Gráfico 9: Proporção de eventos adversos relacionados à terapia. Gráfico 10: Escala aritmética da farmacocinética do AMP.
Gráfico 11: Escala semi-logarítmica da farmacocinética do AMP.
Gráficos 12: Farmacocinética do diversificada do AMP dentro do grupo “Referência”. Gráficos 13: Farmacocinética do diversificada do AMP dentro do grupo “Teste”.
Cmáx e ASC0-t último para AMP.
Gráfico 15: Escala aritmética da farmacocinética do E2C.
Gráfico 16: Escala semi-logarítmica da farmacocinética do E2C.
Gráfico 17: Farmacocinética do diversificada do E2C dentro do grupo “Teste”. Gráfico 18: Farmacocinética do diversificada do E2C dentro do grupo “Referência”.
Gráfico 19: Comparação dos IC 90% para as razões das médias geométricas T/R de Cmáx e ASC0-t último para o E2C.
Tabela1: Variações dos parâmetros farmacocinéticos do AMP encontradas na literatura. Tabela 2: Variações dos parâmetros farmacocinéticos do E2C encontradas na literatura. Tabela 3: Exames subsidiários para a determinação do estado de saúde das voluntárias. Tabela 4: Períodos – data e hora – de entrada e saída da internação.
Tabela 5: Momentos das coletas de sangue para as respectivas dosagens de AMP e C2E.
Tabela 6: Componentes do HPCL utilizados no experimento. Tabela 7: Amostras de plasma normal, lipêmico e hemolisado. Tabela 8: Informações dos padrões de referência.
Tabela 9: Espécimes biológicas.
Tabela 10: Preparo das amostras de Controle de Qualidade para AMP. Tabela 11: Modo de preparo da solução de trabalho para o padrão interno. Tabela 12: Demais soluções padrão para AMP.
Tabela 13: Dados da validação da curva de calibração para o Medroxiprogesterona. Tabela 14: Parâmetros de validação do LIQ.
Tabela 15: Parâmetros de validação dos CQs.
Tabela 16: Principais parâmetros validados para o método analítico. Tabela 17: Componentes da cromatografia líquida para AMP.
Tabela 18: Parâmetros gerais da cromatografia do AMP.
Tabela 19: Parâmetros individuais da espectrometria de massas do AMP.
Tabela 20: Condições de detecção de acetato de medroxiprogesterona na etapa analítica deste experimento.
Tabela 21: Instrumentos HPLC para o E2C. Tabela 22: Componentes do HPLC para o E2C.
Tabela 23: Informações dos padrões de referência utilizados (origem e lote). Tabela 24: Espécimes biológicas para o E2C.
Tabela 26: Preparo das amostras de Controle de Qualidade. Tabela 27: Dados de validação do LIQ para o E2C.
Tabela 28: Dados da validação da curva de calibração.
Tabela 29: Definição das amostras de Controle de Qualidade para o E2C. Tabela 30: Parâmetros de validação dos CQs para o E2C.
Tabela 31: Resultados do Teste de Estabilidade Pós-processamento. Tabela 32: Condições cromatográficas para o E2C.
Tabela 33: Tempo de retenção típico para o E2C. Tabela 34: Parâmetros típicos da HPLC para o E2C.
Tabela 35: Parâmetro Geral Espectrometria de Massas para o E2C. Tabela 36: Parâmetros individuais do MRM para o E2C.
Tabela 37: Condições de detecção do Cipionato de Estradiol na etapa analítica. Tabela 38: Sumário geral das variáveis do estudo e métodos estatísticos utilizados. Tabela 39: Concentrações plasmáticas (ng/mL) de Medroxiprogesterona, ao longo do tempo, referente ao tratamento “Referência”.
Tabela 40: Concentrações plasmáticas (ng/mL) de Medroxiprogesterona, ao longo do tempo, referente ao tratamento “Teste”.
Tabela 41: Médias aritméticas dos parâmetros farmacocinéticos finais para o AMP. Tabela 42: Análise de variância de ANOVA para Cmáx para AMP.
Tabela 43: Análise de variância de ANOVA para ASC0-t último para AMP. Tabela 44: Análise de variância de ANOVA para ASC 0-inf para AMP.
Tabela 45: Razão T/R das médias geométricas do AMP, intervalos de confiança e p, obtidos na análise de variância.
Tabela 46: Médias aritméticas dos parâmetros farmacocinéticos finais para o E2C. Tabela 47: Concentrações plasmáticas (ng/mL) de Cipionato de Estradiol, ao longo do tempo, referente ao tratamento “Referência”.
tempo, referente ao tratamento “Teste”.
Tabela 49: Análise de variância de ANOVA para Cmáx para E2C. Tabela 50: Análise de variância de ANOVA para ASC0-t último para E2C. Tabela 51: Análise de variância de ANOVA para ASC 0-inf para E2C.
Tabela 52: Razão T/R das médias geométricas do E2C, intervalos de confiança e p, obtidos na análise de variância.
ANEXO 1: Registro da Comissão de Ensino e Pesquisa – CEP ANEXO 2: Lista de Aleatorização de Voluntárias no estudo
ANEXO 3: Resumo dos dados de História Clínica e Exame Físico das Voluntárias ANEXO 4: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
ANEXO 5: Cópia do Cardápio das Voluntárias
ANEXO 6: Pressão arterial, Frequência cardíaca e Temperatura das Voluntárias, após coleta de amostras
ANEXO 7: Tabela de Eventos Adversos do Estudo
ANEXO 8: Cromatogramas de Seletividade e Efeito Matriz do AMP ANEXO 9: Tabela de LIQ e CQ do AMP
ANEXO 10: Cromatogramas de Seletividade e Efeito Matriz do E2C ANEXO 11: Tabelas do LIQ e CQ do E2C
ANEXO 12: Oscilação dos Parâmetros Farmacocinéticos do AMP ao longo das coletas
ANEXO 13: Oscilação dos Parâmetros Farmacocinéticos do E2C ao longo das coletas
AOC - Anticoncepcionais orais combinados AMP - Acetato de Medroxiprogesterona ANOVA - Análise de Variância
ANVISA - Agencia acional de Vigilância Sanitária ASC - Área Sob a Curva
ASC0-t último - Área Sob a Curva até o último valor obtido em todas as amostras ASC 0-inf - Área Extrapolada ao Infinito
BE - Estudos de Bioequivalência BLIQ - valores abaixo do LIQ
CEP - Comissão de Ensino e Pesquisa °C - Graus Célsius
Cmáx - Concentração Plasmática Máxima
CQ - Controle de Qualidade
Cúlt - Última Concentração Plasmática Detectável
CV - Coeficiente de Variância E2C - Cipionato de Estradiol ECG - Eletrocardiograma
EHHO - Eixo Hipotálamo-Hipófise-Ovário EI - Electrospray
EM - Espectrometria de Massas EMA - European Medicines Agency
EQM - erro quadrático médio inter-sujeito FDA - Food and Drug Administration FRC - Formulário de Relato de Caso FSH - Hormônio folículo estimulante
Espectrometria de Massas com Ionização por Electrospray
HPLC/LC-MS - Cromatografia Líquida acoplada a Espectrometria de Massas IC - intervalo de confiança de 90%
IMC - Índice de Massa Corpórea
Ke - Constante de velocidade de eliminação do Fármaco LH - Hormônio luteinizante
LIQ - Limite Inferior de Quantificação Ln - Logaritmo Natural
MRM - Monitoramento de Reações Múltiplas MS/MS - Espectrometria de Massas em Tandem OMS - Organização Mundial de Saúde
RDC - Resolução da Diretoria Colegiada
REQM - Raiz Quadrada do Erro Quadrático Médio SHBG - Globulina ligadora de hormônio sexual T1/2 - Meia Vida de Eliminação do Fármaco
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 23
1.1. ESTUDOS DE BIODISPONIBILIDADE ... 23
1.2. ESTUDOS DE BIOEQUIVALÊNCIA ... .. 28
1.3. ETAPA CLÍNICA DOS ESTUDOS DE BIODISPONIBILIDADE ... 29
1.3.1. SELEÇÃO DOS VOLUNTÁRIOS ... 29
1.3.2. DESENHO DO ESTUDO ... 30
1.3.3. MANIPULAÇÃO, ARMAZENAGEM E TRANSPORTE DAS AMOSTRAS ... 31
1.4. ETAPA ANALÍTICA DOS ESTUDOS DE BIODISPONIBILIDADE ... 31
1.4.1. PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS ... 31
1.4.1.1. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA PRECISÃO ... 31
1.4.1.2. ESPECTROMETRIA DE MASSAS ... 34
1.4.2. A VALIDAÇÃO ... 37
1.5. ETAPA ESTATÍSTICA DOS ESTUDOS DE BIODISPONIBILIDADE ... 38
1.6. OS HORMÔNIOS FEMININOS E O CICLO MENSTRUAL ... 40
1.7. A ANTICONCEPÇÃO COM A ADMINISTRAÇÃO DE HORMONIOS ... 46
1.7.1. O ACETATO DE MEDROXIPROGESTERONA ... 48 1.7.2. O CIPIONATO DE ESTRADIOL ... 50 2. AS FORMULAÇÕES EM ESTUDO ... 52 3. OBJETIVO DO ESTUDO ... 52 4. MÉTODO ... 52 4.1. DESENHO DO ESTUDO ... 55 4.2. ETAPA CLÍNICA ... 55
4.2.3. CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO ... 57
4.2.4. RESTRIÇÕES E PROIBIÇÕES: ANTES, DURANTE E APÓS O ESTUDO ... 58
4.2.4.1. MEDICAMENTOS ... 58
4.2.4.2. DIETA ... 59
4.2.4.3. OUTRAS RESTRIÇÕES QUANTO A TERAPIAS E CONDUTAS ... 59
4.2.5. CRITÉRIOS DE DESCONTINUAÇÃO OU RETIRADA DE VOLUNTÁRIOS DO ESTUDO ... 60
4.2.6. CONFINAMENTO DAS VOLUNTÁRIAS ... 61
4.2.7. HORÁRIOS DE JEJUM E DE ALIMENTAÇÃO ... 62
4.2.8. ADMINSTRAÇÃO DOS MEDICAMENTOS ... 62
4.2.9. MONITORAMENTO DURANTE A COLETA DE AMOSTRAS ... 62
4.2.10. ESPECIFICAÇÃO DOS PARÂMETROS DE SEGURANÇA ... 63
4.2.11. COLETA, MANIPULAÇÃO, ARMAZENAGEM E TRANSPORTE DASAMOSTRAS ... 67
4.3. ETAPA ANALÍTICA ... 70
4.3.1. DETERMINAÇÃO DO ACETATO DE MEDROXIPROGESTERONA EM PLASMA HUMANO POR HPLC-MS/MS ... 71
4.3.1.1. MÉTODO ... 71
4.3.1.2. DESCRIÇÃO DOS INSTRUMENTOS, REAGENTES E PADRÕES ... 71
4.3.1.3. CALIBRAÇÃO, SOLUÇÕES MESTRE E DE CONTROLE DE QUALIDADE DAS AMOSTRAS ... 73
4.3.1.4. VALIDAÇÃO DO MÉTODO ... 79
4.3.1.5. PREPARO DAS AMOSTRAS: A EXTRAÇÃO ... 82
... 84
4.3.1.8. MANUSEIO DOS DADOS E DOCUMENTAÇÃO ... 85
4.3.2. DETERMINAÇÃO DE CIPIONATO DE ESTRADIOL EM PLASMA HUMANO POR HPLC-MS/MS ... 86
4.3.2.1. MÉTODO ... 86
4.3.2.2. DESCRIÇÃO DOS MATERIAIS, INSTRUMENTOS, REAGENTES, PADRÕES E ESPÉCIME BIOLÓGICA ... 86
4.3.2.3. SOLUÇÕES MESTRE E DE CONTROLE DE QUALIDADE DAS AMOSTRAS ... 88
4.3.2.4. PREPARO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO E DAS AMOSTRAS DE CONTROLE DE QUALIDADE ... 92
4.3.2.5. VALIDAÇÃO DO MÉTODO ... 94
4.3.2.6. PREPARO DAS AMOSTRAS: A EXTRAÇÃO DA AMOSTRA... ... 103
4.3.2.7. CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS ... 105
4.3.2.8. CONDIÇÕES ANALÍTICAS DA ESPECTROMETRIA DE MASSAS ... 106
4.3.2.9. MANUSEIO DOS DADOS E DOCUMENTAÇÃO ... 108
4.4. ETAPA ESTATÍSTICA: RESULTADOS ... 109
4.4.1. ANÁLISE ESTATÍSTICA DA AMOSTRAGEM DE VOLUNTÁRIAS ... 109
4.4.2. A TOLERÂNCIA DAS FORMULAÇÕES ... 110
4.4.3. ANÁLISE ESTATÍSTICA DO ACETATO DE MEDROXIPROGESTERONA ... 112
4.4.4. ANÁLISE ESTATÍSTICA DO CIPIONATO DE ESTRADIOL ... 121
5.2. SEGURANÇA E TOLERABILIDADE DAS FORMULAÇÕES ... 132
6. CONCLUSÃO ... 134
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 135
8. ANEXOS ... 142
ANEXO 1. REGISTRO DA COMISSÃO DE ENSINO E PESQUISA – CEP ANEXO 2. LISTA DE ALEATORIZAÇÃO DE VOLUNTÁRIAS NO ESTUDO
ANEXO 3. RESUMO DOS DADOS DE HISTÓRIA CLÍNICA E EXAME FÍSICO DAS VOLUNTÁRIAS
ANEXO 4. TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO ANEXO 5. CÓPIA DO CARDÁPIO DAS VOLUNTÁRIAS
ANEXO 6. PRESSÃO ARTERIAL, FREQUÊNCIA CARDÍACA E TEMPERATURA DAS VOLUNTÁRIAS, APÓS COLETA DE AMOSTRAS
ANEXO 7. TABELA DE EVENTOS ADVERSOS
ANEXO 8. CROMATOGRAMAS DE SELETIVIDADE DO ACETATO DE MEDROXIPROGESTERONA
ANEXO 9. TABELA DE LIQ E CQ DO AMP
ANEXO 10. CROMATOGRAMAS DE SELETIVIDADE DO CIPIONATO DE ESTRADIOL
ANEXO 11. TABELAS DO LIQ E CQ DO E2C
ANEXO 12. OSCILAÇÃO DOS PARÂMETROS FARMACOCINÉTICOS DO ACETATO DE MEDROXIPROGESTERONA, AO LONGO DAS COLETAS
ANEXO 13. OSCILAÇÃO DOS PARÂMETROS FARMACOCINÉTICOS DO CIPIONATO DE ESTRADIOL, AO LONGO DAS COLETAS
1. INTRODUÇÃO
1.1. ESTUDOS DE BIODISPONIBILIDADE
Biodisponibilidade é a característica de um medicamento que representa a velocidade e a quantidade em que o princípio ativo alcança a circulação sistêmica, após sua administração (1,2,3). Em outras palavras, corresponde à fração do princípio ativo (F) que foi absorvida e atingiu a circulação, tornando-se disponível para a ação nos órgãos efetores e é representada pela fórmula abaixo: (4)
F = Quantidade de Fármaco que alcança a circulação Quantidade de fármaco administrada
A avaliação da biodisponibilidade é realizada com base em parâmetros farmacocinéticos, calculados a partir dos perfis de concentração plasmática do fármaco ao longo do tempo, após sua administração.
Para medicamentos administrados via intravenosa, essa propriedade não existe porque o processo de absorção não ocorre nesta via de administração. Este conceito é útil em estudos de biodisponibilidade absoluta, quando a comparação é feita entre uma preparação farmacêutica administrada por uma determinada via (não intravenosa), com o perfil farmacocinético da mesma preparação administrada por via intravenosa. (1,5)
Já a biodisponibilidade relativa se refere à comparação entre duas preparações farmacêuticas diferentes (teste e referência), em relação à velocidade da absorção e quantidade do fármaco absorvido, quando administradas pela mesma via (que não a intravenosa) e na mesma dose molar. (1,2)
O termo bioequivalência, segundo a legislação brasileira em vigor (1,2), utiliza os testes de biodisponibilidade relativa de dois ou mais medicamentos (equivalentes farmacêuticos), que, quando administrados nas mesmas condições experimentais e na mesma dose molar, não apresentem diferenças estatisticamente significativas em relação a biodisponibilidade.
Portanto, os estudos de biodisponibilidade são úteis para definir como a formulação de um medicamento afeta a farmacocinética do seu princípio ativo, requisito indispensável para avaliar a qualidade de um medicamento, (2,6) e também para determinar se um novo medicamento teste (T) e o medicamento de referência (R) correspondente são bioequivalentes (7). Isso confere maior segurança no uso dos genéricos (formulações com o mesmo princípio ativo que um medicamento de referência R) por parte da população, tendo como vantagens o menor preço e a garantia de que os medicamentos a serem lançados no mercado apresentem as mesmas características e propriedades físico-químicas que o medicamento inovador, conhecido como de referência. Para tanto, é necessário o desenvolvimento de metodologias seguras e dinâmicas de avaliação da garantia da qualidade e dos processos referentes aos estudos realizados (2).
A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) foi criada pela Lei no 9782, de 26 de janeiro de 1999, estando vinculada ao Ministério da Saúde (8). Este órgão segue os critérios das agências reguladoras internacionais, como a US Food and Drug Administration (FDA) e a European Medicines Agency (EMA), que orientam testes de bioequivalência para assegurar que os medicamentos genéricos (teste) tenham absorção que seja bioequivalente ao medicamento inovador (referência).
Para tal, são utilizadas diretrizes abrangentes, baseadas nos parâmetros obtidos na curva de concentração do fármaco versus tempo após sua administração em voluntários sadios. Os parâmetros utilizados são: área sob a curva (ASC), usada para descrever a extensão da absorção; a concentração máxima do fármaco após sua administração (Cmáx); e o tempo para atingir a concentração máxima
Figura 1: Parâmetros farmacocinéticos para analise de biodisponibilidade. Nos dois casos, não há bioequivalência entre os fármacos.
FONTE: Morais, J.A.G., 2014 (11).
A ASC representa a quantidade total de fármaco absorvido. É considerado o parâmetro mais importante na avaliação da biodisponibilidade, sendo expresso em concentração x tempo (mg/mL x h) e representa a quantidade total de fármaco absorvido após administração de uma dose do princípio ativo.
É, portanto, proporcional à quantidade de fármaco que entra na circulação sistêmica e independe da velocidade de absorção, pois na sua avaliação é computada toda a quantidade de fármaco absorvida ao longo da sua distribuição e eliminação. Assim, pode-se comparar a fração de absorção (F) entre duas formulações de um mesmo medicamento – teste (T) x referência (R) – pela fórmula abaixo:
F = ASC (T) x 100 ASC (R)
Para o cálculo da ASC de cada medicamento utiliza-se o método trapezoidal, que consiste na soma das áreas dos pequenos trapézios formados abaixo da curva (12), conforme demonstrado na figura 2.
Figura 2: Método trapezoidal, com a soma das áreas dos pequenos trapézios formados abaixo da curva.
A ASC obtida durante o experimento compreende a concentração x tempo no intervalo desde o instante inicial de administração do fármaco até o último tempo quantificável (ASC0-t último). Este parâmetro é dependente do limite inferior quantificado (LIQ) pelo método analítico adotado, pois valores abaixo do LIQ não serão mensurados e são computados como zero (figura 3).
Figura 3: A importância do LIQ no cálculo da ASC0-t último
FONTE: Jim H. Hughes, 2017(13).
Quando a ASC abrange o intervalo teórico do instante inicial até o tempo relativo à completa eliminação do fármaco é chamada de área sob a curva do tempo zero ao infinito (ASC0-inf). Esta pode ser extrapolada pela fórmula abaixo, onde Cúlt corresponde à última concentração detectada pelo método, acima do LIQ, e Ke corresponde à constante de eliminação do fármaco.
ASC0-inf = ASC0-t último + Cúlt / Ke
A Ke é calculada inicialmente com a transformação dos valores de concentração plasmática (y) versus tempo (x) em logaritmo natural (Ln) e submetidos a uma análise de regressão, sendo Ke a inclinação da reta multiplicada por -1, ou seja, corresponde ao coeficiente angular, calculado pela tangente negativa do ângulo b (figura 4).
Figura 4: Cálculo do coeficiente angular do ângulo a é igual à tg negativa do ângulo b.
O ângulo b é obtido na fase descendente da curva, que corresponde à fase eliminação do fármaco (figura 5). Portanto é fundamental que o LIQ seja pequeno o suficiente para contemplar o maior número de pontos desta trajetória, a fim de representar com maior exatidão a fase de eliminação do fármaco, como demonstrado na figura 3.
Também a relação entre a ASC0-inf / ASC0-t último assume importância nos estudos de farmacocinética, uma vez que representa a fração da ASC que foi extrapolada, ou seja, que não foi determinada pelos dados coletados, mas em sua maior parte pela inclinação dos últimos valores detectados. Esta relação deve ser menor que 20% para que a curva seja representativa (4).
Figura 5: Fase de distribuição e de eliminação do fármaco. FONTE: Golan, D.E, 2009. (4)
O tempo necessário para que a concentração plasmática ou a quantidade original de um fármaco no organismo se reduza à metade é chamado de meia-vida (T1/2). Nos estudos de biodisponibilidade a meia-vida de eliminação é calculada a partir da Ke , pela fórmula abaixo.
T1/2
= Ln 2
Ke
1.2. ESTUDOS DE BIOEQUIVALÊNCIA
Para estudos de bioequivalência há a necessidade de se estabelecer uma relação estatística direta entre os fármacos T e R nos parâmetros ASC e Cmáx .
São calculados os intervalos de confiança de 90% (IC) para a relação de T / R das médias geométricas da ASC e da Cmáx. A correlação entre as médias
geométricas é estabelecida quando este IC estiver dentro de 80-125%. Isto significa que os parâmetros farmacocinéticos ASC e Cmáx do medicamento teste
estão dentro da faixa de 80% a 125% da variabilidade do referência, portanto considerado bioequivalente (7,9,10) (Figura 6).
Figura 6: Parâmetros farmacocinéticos para analise de bioequivalência.
FONTE: Wang Y., Hsu L., 2017. (5)
Além destes, o tempo necessário para atingir o Cmáx , chamado Tmáx, médio do
medicamento teste e sua variabilidade não devem ter diferença aparente para o inovador.
Operacionalmente, os ensaios de biodisponibilidade e bioequivalência se desenvolvem em três etapas: Clínica, Analítica e Estatística.
1.3. ETAPA CLÍNICA DOS ESTUDOS DE BIODISPONIBILIDADE
E BIOEQUIVALENCIA
A etapa clínica compreende o recrutamento e a seleção de voluntários, a administração dos medicamentos e a coleta de amostras para análises referentes ao estudo e de monitoramento clínico dos voluntários durante as etapas pré e pós-estudo. (2)
1.3.1. SELEÇÃO DOS VOLUNTÁRIOS
Os voluntários devem ser adultos e sadios. Os critérios de seleção devem ter como base o exame médico satisfatório (incluindo interrogatório minucioso e exame físico), e os exames laboratoriais (como enzimas hepáticas e função renal), hematológicos, sorologias, parasitológicos, exame simples de urina e eletrocardiografia. (2)
O voluntário deve ser capaz de compreender a natureza e objetivo do estudo, inclusive os riscos e efeitos adversos. Deve estar com intenção de cooperar, cumprindo os requerimentos de todo o ensaio, o que vem a ser confirmado
mediante a assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.
O peso dos voluntários deverá estar em um limite de ± 10% do peso considerado normal para homens e mulheres levando-se em consideração a altura e a estrutura física. Não fumantes são preferidos e a ingestão de álcool deve ser proibida durante o estudo.
1.3.2. DESENHO DO ESTUDO
O estudo de bioequivalência é do tipo aberto, aleatório, cruzado, sendo que os voluntários recebem os medicamentos teste e referência em ocasiões diferentes, chamadas períodos. Na maioria dos estudos é administrada apenas uma dose do produto, em jejum de 10 a 12 horas. (14)
O período de coletas deve compreender pelo menos cinco meias-vidas de eliminação do fármaco e o intervalo entre os períodos deve ser de, no mínimo, sete meias-vida de eliminação do fármaco ou seu metabólito, quando o mesmo for ativo.
O desenho experimental mais comumente utilizado e citado como apropriado para avaliação de bioequivalência entre formulações é o tipo "cross-over", onde todos os sujeitos recebem cada medicamento do estudo em tempos diferentes. Desta forma, cada indivíduo funciona como seu próprio controle, com base no fato de que a variação intra-sujeitos é bem menor que a inter-sujeitos. (2,14,15) Fármacos que não fazem parte do estudo não devem ser administrados em paralelo e, preferencialmente, o voluntário não deve ter tomado outra medicação no período de uma semana antes da realização do experimento, evitando, assim, alguma interação do tipo indução enzimática, competição por proteínas plasmáticas, etc.
Em estudos de doses simples, um número suficiente de amostras deve ser coletado para descrever, adequadamente, as três fases críticas da curva de concentração x tempo, a seguir: absorção, permitindo, assim, comparação qualitativa da velocidade da disponibilidade; tempo em que ocorre o pico de concentração máxima; declínio da concentração na fase de eliminação.
1.3.3. MANIPULAÇÃO, ARMAZENAGEM E TRANSPORTE DAS
AMOSTRAS
Após as coletas, as amostras de sangue devem ser armazenadas em condições adequadas para preservar as características originais dos produtos até o vencimento de sua validade (15).
Assim, são encaminhadas à sala de processamento e armazenamento, onde são centrifugadas para a separação do plasma. Após a centrifugação, são transferidas para tubos criogênicos identificados por meio de códigos-de-barra, e mantidos em freezer específico para amostras biológicas, monitorados através de termômetro calibrado.
O transporte das amostras para a unidade analítica deve ser feito em caixas térmicas contendo gelo seco, com controle da temperatura monitorado por termômetro de máxima e mínima calibrado durante todo o trajeto (15).
1.4. ETAPA ANALÍTICA DOS ESTUDOS DE BIODISPONIBILIDADE
A etapa analítica compreende a análise das amostras coletadas na etapa clínica, com a quantificação do fármaco inalterado ou seu metabólito ativo, obtendo-se a curva de concentração versus tempo, bem como a validação do método cromatográfico utilizado para esse fim. (1)
1.4.1. PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS
1.4.1.1. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA PRECISÃO
A cromatografia é o processo físico-químico atualmente mais utilizado para a separação do analito (substância ou componente químico, em uma amostra, cuja detecção é alvo da análise em um ensaio) desejado, presente na maioria das vezes no plasma.
Os primeiros métodos cromatográficos, em 1866, receberam este nome por identificarem os diferentes pigmentos de compostos químicos através da variação de cores detectadas em papel de filtro ao final do processo de separação. O médico e cientista alemão Friedlieb Ferdinand Runge (1795-1867)
ficou fascinado com a capacidade do papel de filtro em separar os pigmentos de tintas, em especial as de cor escura, que eram difíceis de identificar em solução (figura 7). (16)
Figura 7: Mosaico com separações de pigmentos em papel filtro realizadas pelo cientista Friedlieb Ferdinand Runge, em 1866.
FONTE: Pacheco, S. e colaboradores, 2015.(16)
Atualmente, cromatografia evoluiu muito e se fundamenta nas diferentes propriedades de cada substância, promovendo a interação destas com duas fases imiscíveis, chamadas de fase móvel e fase estacionária. (16)
A fase móvel contém um solvente fluido – líquido ou gasoso – que tem características específicas para carrear o analito. Ela é introduzida no equipamento e misturada ao plasma (sangue, ou outro material biológico). Essa mistura passa pela fase estacionária, que pode ser plana ou presente em uma coluna do equipamento. (17)
A fase estacionária é fixa e refere-se à coluna cromatográfica, ou seja, um cilindro rígido (normalmente de aço ou vidro) no interior do qual se encontra um material de enchimento, formado por pequenas partículas porosas adsorventes (figura 8). (18)
Figura 8: A - Representação de uma partícula superficialmente porosa, disponível comercialmente com o nome Kinetex® da fabricante Phenomenex®. B - Detalhe microscópico de uma partícula.
FONTE: Pacheco, S. e colaboradores, 2015.(16)
É na fase fixa que a separação dos componentes da substância se dá por adsorção, partição, troca iônica ou por afinidade e solubilidade físico-químicas(18).Pode servir para fixar o analito ou as demais substâncias presentes na fase móvel, de acordo com as caraterísticas da formulação estudada. Dessa forma os componentes da solução (fase móvel) interagem com a coluna, são liberados do sistema em diferentes tempos e identificados por um equipamento específico – o detector. A figura 9 mostra uma técnica de fracionamento cromatográfico de hidrolisado de albumina de soro bovino da década de 70, com fase móvel: 1:2:1 álcool butílico, álcool propílico e HCl 0,1 N e 2:1 álcool n-propílico e HCl 0,5 N. A coluna de 0,9 x 30 cm e aplicação de equivalente a 2,5 mg de proteína hidrolisada.
(A) (B)
Figura 9: Diagrama de dispositivo para cromatografia (A). Primeiras técnicas de fracionamento cromatográfico de hidrolisado de albumina de soro bovino.
O detector faz o registro de características das diferentes substâncias que deixam o sistema, como por exemplo, por absorbância. (16,17,18,20)
Atualmente, os materiais mais utilizados na fase fixa são a sílica ou um polímero de 2 a 50 micrômetros de diâmetro, por apresentarem ótimas características para a separação dos componentes. Ao longo da coluna, há uma série de estágios independentes onde acontece o equilíbrio entre o analito dissolvido (sorvido) na fase estacionária e na fase móvel. Cada estágio de equilíbrio é chamado de prato teórico. Surgiram, então, as partículas esféricas porosas de 1,7μm, que permitem melhores resoluções e alta eficiência, a chamada cromatografia liquida de alta eficiência (HPLC – do inglês High Performance Liquid Chromatography). Com 30000 pratos/15cm, necessitam de uma instrumentação mais sofisticada para serem empregadas com o máximo de desempenho cromatográfico (figura 10).
Figura 10: Representação da HPLC: 1) Reservatório de solventes; 2) Degaseificador; 3) Válvula; 4) Reservatório da fase móvel; 5) Bomba pressórica; 6) Válvula comutadora; 7) Loop de injeção da amostra; 8) Pré-coluna; 9) Coluna Analítica; 10) Detector infravermelho; 11) Aquisição de dados; 12) Coletor de frações.
FONTE: Yassine W., 2004.(20)
1.4.1.2. ESPECTROMETRIA DE MASSAS
A Espectrometria de Massas (EM ou MS – do inglês Mass Spectrometry) é definida como o estudo da matéria pela formação de íons em fase gasosa, que posteriormente são detectados e caracterizados por um Espectrômetro de
Massas de acordo com suas relações massa/carga (m/z), estrutura ou propriedades fisico-químicas, podendo medir quantitativamente as massas de uma amostra (21). O resultado é a detecção de uma curva do sinal do íon como uma função da sua razão massa/carga, fornecendo a estrutura da amostra pela identificação e fragmentações diferentes (figura 11).
Figura 11: Detecção dos diferentes fragmentos de uma solução, por MRM, em água/ metanol 1:1 contendo Cu2+, N-Ac-L-Phe (referência quiral) e D-ribose (analito, A) na espectrometria de massas.
FONTE: Augusti, D.A, 2006. (22)
A ionização do analito atualmente é feita por electrospray (ESI – do inglês: Electrospray Ionization), utilizado em métodos analíticos de moléculas polares que apresentam íons em solução aquosa, transformando-os em íons em fase gasosa.
Esta ionização ocorre na etapa em que a solução, advinda da coluna cromatográfica, é pulverizada através de uma agulha (cone de Taylor), onde é aplicada uma corrente elétrica de alta voltagem (potencial elétrico de em média 5kV), criando um aerossol carregando os íons. As gotículas formadas evaporam-se devido ao calor aplicado em um capilar que recebem as gotículas em partículas cada vez menores. À medida que o solvente evapora na região de alto vácuo, o tamanho da gotícula diminui gradativamente até que sobrem somente os íons livres do solvente (figura 11). Os íons se desprendem das gotículas dirigindo-se para o analisador de massas através da manutenção de um campo elétrico.
Figura 12: ionização do analito por Electrospray.
FONTE: Magnet Fild Laboratory. Disponível em: http://www.magnet.fsu.edu .
O analisador de massas é a parte de um espectrômetro responsável por separar os íons de acordo com sua massa/carga. Esta separação se dá através do método de Monitorização de Reações Múltiplas (MRM), visto na figura 11, que é resultado da disposição de quatro hastes metálicas em um formato quadrangular, o quadrupolo, formando uma câmara por onde passam os íons carregados (figura 13). O íon que vem da câmara de ESI é separado dos demais por radiofrequência (através de sua relação massa/carga). Na câmara seguinte (câmara de fragmentação) este íon é fragmentado pela colisão com gás argônio. Através desta colisão são formados íons menores, que são encaminhados para a terceira câmara, onde existe um detector eletrônico de pequenos fragmentos. Somente os fragmentos selecionados, quanto à sua relação massa/carga, são analisados e quantificados, enquanto os íons restantes são refletidos. (23)
Figura 13: Quadrupolo, perspectiva e corte transversal.
O desenvolvimento da interface entre a HPLC e a EM com a ionização química por fonte de ionização à electrospray (LC-MS/MS), tornou possível a análise de compostos não voláteis e termolábeis, presentes em matrizes biológicas
complexas e a identificação da massa molecular dos compostos presentes na amostra. O sistema LC-MS/MS é uma combinação poderosa em que é possível obter o padrão de fragmentação característico de um composto e obter informação sobre sua estrutura química. (24)
1.4.2. A VALIDAÇÃO
A validação deve garantir, por meio de estudos experimentais, que o método atenda às exigências das aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos resultados. Para tanto, deve apresentar especificidade, linearidade, intervalo, precisão, sensibilidade, limite de quantificação e exatidão, adequados à análise (15).
No Brasil, a ANVISA determina que o método analítico deve descrever a metodologia detalhadamente, abordando os reagentes, materiais, equipamentos, instrumentação cromatográfica e tratamento das amostras (inclui todos os procedimentos aos quais as amostras são submetidas). (1)
As condições cromatográficas também devem ser detalhadas. Neste caso, a HPLC permite a separação do(s) composto(s) de interesse dos demais compostos eventualmente presentes na matriz biológica, como é o caso do plasma humano, evitando que um número elevado de interferentes prejudique a detecção do fármaco, auxiliando, assim, na seletividade do método de quantificação. (25)
Já a EM permite que sejam atingidos padrões elevados de especificidade, necessários à adequada identificação das estruturas moleculares dos fármacos, em meio a outros componentes da matriz biológica ou metabólitos da droga que não foram afastados através da HPLC.
São descritos vários parâmetros (fase móvel, coluna, velocidade do fluxo, temperatura da coluna, temperatura do auto injetor, volume de injeção, tempos de retenção do analito e padrão interno). No caso de espectrometria de massas, especificam-se os íons monitorados, detector, entre outros parâmetros de detecção; parâmetros de integração e parâmetros de construção da curva de calibração. (2)
1.5. ETAPA ESTATÍSTICA DOS ESTUDOS DE BIODISPONIBILIDADE
A etapa estatística compreende a análise dos dados obtidos na etapa analítica com o cálculo e comparação dos parâmetros farmacocinéticos através de intervalos de confiança e testes de hipóteses, utilizando-se para isso ferramentas como planilhas e softwares devidamente validados. (2)
O poder do teste de um estudo de biodisponibilidade relativa/bioequivalência é definido como a probabilidade de aceitar a bioequivalência entre produto teste e referência corretamente. (2)
Durante a etapa de planejamento, a definição do número de voluntários necessários para obter um poder estatístico desejado (por exemplo, 80%) estabelecendo bioequivalência entre duas formulações dentro dos limites clinicamente importantes (por exemplo, 20% da média do referência) é um desafio. A metodologia comumente utilizada para este fim é definir o tamanho de amostra adequado através do cálculo da função do poder do teste, baseado numa estimativa de coeficiente de variação intra-individual obtida através da literatura. Também pode ser obtida através de um estudo piloto, com menor número de voluntários. (2)
Com os resultados da etapa analítica, deve-se apresentar tabela contendo valores individuais, médias (aritmética e geométrica), desvio padrão e coeficiente de variação de todos os parâmetros farmacocinéticos relacionados à administração dos medicamentos teste e referência.
Também é recomendado que os parâmetros ASC0-t último e Cmáx sejam
transformados em logaritmo natural (Ln), uma vez que, em geral, a distribuição dos dados transformados se aproxima mais a uma distribuição normal em relação aos dados originais. Os casos em que se optar por realizar a análise estatística nos dados em escala original devem ser apresentadas justificativas. Deve-se realizar a análise de variância (ANOVA) dos parâmetros farmacocinéticos ASC0-t último e Cmáx transformados, para avaliar os efeitos de
fonte, grau de liberdade, soma dos quadrados, erro quadrático médio, estatística F, valor de p e os coeficientes de variação intra e inter-individuais. (2)
Também deve ser construído um intervalo de confiança (IC) de 90% para a diferença das médias geométricas dos dados transformados dos medicamentos teste e referência, para os parâmetros ASC0-t último e Cmáx.
O Tmáx será analisado como diferença individual (teste – referência),
construindo-se IC de 90%, através de teste não-paramétrico.
Dois medicamentos serão considerados bioequivalentes se os valores extremos do intervalo de confiança de 90% da razão das médias geométricas (ASC0-t último teste / ASC0-t último referência e Cmáx teste / Cmáx referência) forem maiores que
0,8 e menores que 1,25. Outros limites de IC de 90% para Cmáx, previamente
estabelecidos no protocolo, poderão ser aceitos mediante justificativas científicas (2). Os programas (softwares) utilizados para a análise estatística dos dados devem ser validados e devem ser informados no estudo.
O coeficiente de variação (CV) é a razão do desvio padrão pela média. Portanto quantifica o peso do desvio padrão sobre a distribuição. Tem a capacidade de comparar diferentes distribuições do mesmo parâmetro, cujas médias sejam diferentes. O CV pode ser aplicado para avaliar resultados de trabalhos que envolvem a mesma variável-resposta, permitindo quantificar a precisão das pesquisas. Pode ser expresso em decimal, ou porcentagem. Para estudos de biodisponibilidade relativa, valores maiores que 30% são considerados altos (5,6). Outra variação muito importante na avaliação da precisão do estudo é o erro quadrático médio (EQM), também chamado de risco quadrático, de um estimador de um parâmetro escalar. O EQM é muito útil para a comparação de estimadores, principalmente se um deles for viciado. Para o EQM, os valores considerados altos e que representam grande variabilidade da droga, são aqueles maiores ou iguais a 0,3 (30%). (6)
No caso de voluntários que apresentem comportamento discrepante nos parâmetros farmacocinéticos, em relação aos demais voluntários, sua exclusão
do estudo deverá ser justificada. Deverão ser apresentados os resultados do estudo com e sem a inclusão de seus dados. (2)
1.6. OS HORMÔNIOS FEMININOS E O CICLO MENSTRUAL
Os estrogênios e os progestagênios (atualmente chamados de progestinas) são hormônios endógenos que desempenham várias funções no organismo, sendo que na mulher estas funções vão desde promover o desenvolvimento de caracteres sexuais secundários na puberdade até o controle da ovulação e preparo cíclico do aparelho reprodutor para a fecundação. (26-31)
Ciclo menstrual é o termo utilizado para definir o conjunto de complexas alterações fisiológicas, envolvendo síntese, secreção e retroalimentação negativa (do inglês, negative feedback) de hormônios. Ocorre nas mulheres em idade fértil e que têm como finalidade propiciar condições favoráveis à fecundação, permitindo a reprodução.
É através do Eixo Hipotálamo-Hipófise-Ovário (EHHO) que o sistema nervoso central exerce o controle das funções reprodutoras, por meio da interação de peptídeos hipotalâmicos, gonadotrofinas glicoproteicas hipofisárias e esteroides sexuais ovarianos (30), como visto na figura 14.
Figura 14: Eixo Hipotálamo-Hipófise-Ovário (EHHO), com os mecanismos de “feedback” positivos e negativos.
FONTE: Guyton, A.C.; HALL, J.E., 2011.
As alterações histológicas e funcionais que ocorrem nos ovários e no útero ao longo do ciclo menstrual são resultado da secreção alternada dos hormônios hipofisários – o Hormônio Folículo-estimulante (FSH, follicle-stimulating hormone) e o Hormônio Luteinizante (LH, luteinising hormone). Durante cada mês do ciclo ocorrem aumento e diminuição cíclicos de FSH e LH, que acarretam alterações ovarianas.
O início do ciclo menstrual se dá na liberação do Hormônio Liberador de Gonadotrofina (GnRH, do inglês, gonadotrophin-releasing hormone), um decapeptídeo, que é sintetizado e liberado por neurônios peptidérgicos do hipotálamo, que o libera de forma pulsátil – cerca de uma descarga por hora. Clinicamente este período é identificado pelo primeiro dia de menstruação. (26-31)
Tanto o FSH quanto o LH estimulam suas células alvo ovarianas ao se combinarem com receptores na membrana. Eles aumentam a secreção, o crescimento e a proliferação das células através da ativação da adenosina 3',5'-monofosfato cíclico (AMPc) que provoca a formação de proteína quinase e fosforilações múltiplas de enzimas chave, que estimulam a síntese de hormônios sexuais. (29,30,31)
Assim, ocorrerá a formação do ovócito e a estimulação para a produção dos hormônios ovarianos, estrógeno e progesterona, que preparam o útero e trompas para uma possível gravidez.
O GnRH estimula a adeno-hipófise a liberar hormônios gonadotróficos, o FSH em maiores quantidades, e LH em pequenas quantidades. O resultado é o crescimento de folículos ovarianos e o estímulo à produção ovariana de estrogênio, marcando a fase ovariana do ciclo chamada folicular, que começa no primeiro dia de menstruação até a liberação do óvulo – ovulação – que ocorre imediatamente antes da rápida elevação da concentração do LH (Figura 15).
Figura 15: Alterações ovarianas durante o ciclo menstrual.
FONTE: Guyton, A.C.; HALL, J.E., 2011. (29)
O chamado folículo primordial corresponde a cada óvulo circundado por camada única de células da granulosa. Com a estimulação ovariana do FSH e do LH, alguns folículos apresentam o aumento dos respectivos óvulos e crescimento de outras camadas de células da granulosa, passando para folículos primários(29,30,31).
Esse crescimento acelerado é causado pelo estrógeno secretado para o folículo e faz com que as células da granulosa aumentem o número receptores de FSH, com a formação de folículos ainda maiores, chamados folículos vesiculares. Tanto o FSH quanto os estrogênios combinam-se para promover receptores LH nas células originais da granulosa. Após aproximadamente uma semana de crescimento, um dos folículos passa a crescer mais do que os outros, até atingir o diâmetro aproximado de 1,5cm. Este passa a ser denominado folículo maduro, ou Folículo de Graaf, que consiste em células da teca e granulosas dispostas ao redor de um centro preenchido pelo óvulo e por líquido, e que secreta grande quantidade de estrogênio. (26,29)
O estrogênio irá agir no hipotálamo, diminuindo a produção de FSH hipofisário e bloqueando o estímulo aos demais folículos, que passam a involuir. O contínuo crescimento do Folículo de Graaf é garantido por um mecanismo de feedback intrínseco. (26,29)
Ocorre, então, a ovulação, que corresponde à liberação do óvulo do Folículo de Graaf para fora do ovário, permitindo que este atinja a Trompa de Falópio e assim migrar para o encontro com do espermatozoide e realizar a fecundação. A ovulação somente ocorrerá com o pico de secreção de LH pelo hipotálamo, necessário também para o crescimento folicular final. O LH tem ainda o efeito específico nas células da granulosa e tecais, convertendo-as em células secretoras de progesterona. (26,29)
Por isso, cerca de dois dias antes da ovulação, há aumento importante da secreção de LH (cerca de 6 a 10 vezes) e do FSH (duas a 3 vezes), como demonstrado na figura 16.
Figura 16: Concentrações plasmáticas aproximadas das gonadotrofinas e hormônios ovarianos durante o ciclo sexual feminino normal. FSH,
hormônio folículo estimulante; LH, hormônio luteinizante.
FONTE: Guyton, A.C.; HALL, J.E., 2011. (29)
Aproximadamente um dia antes da ovulação a secreção de estrogênio começa a cair e o nível de progesterona segue aumentando.
Após a ovulação, as células da granulosa e tecais internas, remanescentes do folículo roto, se transformam em células luteínicas. Aumentam seu diâmetro e ficam repletas de inclusões lipídicas, que lhes dão aparência amarelada, dando origem ao chamado corpo lúteo. As células da granulosa no corpo lúteo formam grandes quantidades de progesterona e estrogênio, mantendo elevado o nível de progesterona nesse momento. Todas essas alterações nas funções das células dependem da ação do LH. (26,29,32)
O corpo lúteo cresce durante 7 a 8 dias após a ovulação, produzindo e secretando progesterona e estrogênio. Estes têm potentes efeitos de “feedback” na adeno-hipófise, mantendo baixos níveis de FSH e LH.
As células luteínicas também secretam pequenas quantidades do hormônio inibina, que inibe a secreção pela adenohipofise, especialmente do FSH. O resultado são concentrações sanguíneas menores de FSH e LH e faz com que o corpo lúteo degenere e involua, geralmente ao final de 12 dias após a ovulação(26,27). Nessa época, a parada súbita de secreção de estrogênio, progesterona e inibina pelo corpo lúteo remove a inibição por “feedback”,
permitindo que a hipófise retome a secreção de quantidades cada vez maiores de FSH e LH. Estes dão início ao crescimento de novos folículos, começando novo ciclo ovariano. (29)
Associado à produção cíclica mensal de estrogênios e progesterona pelos ovários há um ciclo uterino, que responde diretamente às ações destes hormônios e apresenta as seguintes fases: (1) proliferação do endométrio uterino; (2) desenvolvimento de alterações secretoras no endométrio; e (3) descamação do endométrio, que é conhecido como menstruação. As várias fases deste ciclo endometrial são mostrados na figura 17 e são chamadas respectivamente de proliferativa, secretora e menstruação. (26,29)
Figura 17: Correlação entre os níveis hormonais e as respostas ovariana e uterina.
A menstruação é a fase do ciclo menstrual caracterizada pelo sangramento através do canal vaginal. Este sangramento é resultado da descamação e eliminação da camada superficial do endométrio uterino, quando não ocorre a fecundação, que irá se regenerar durante a fase folicular ovariana, após o término do fluxo menstrual. E a partir daí todo o processo se reinicia. (26,27,29) Em resumo, há uma hierarquia de hormônios durante o ciclo menstrual: 1. O hormônio de liberação hipotalâmica, o GnRH;
2. Os hormônios sexuais hipofisários anteriores, FSH e o LH, ambos secretados em resposta ao GnRH;
3. Os hormônios ovarianos, estrogênio e progesterona que são secretados pelos ovários em resposta ao FSH e LH.
O que determina o perfeito funcionamento do sistema reprodutor feminino é, portanto, a oscilação dos níveis séricos destes hormônios e o revezamento sequencial destes, sendo que, em cada momento do ciclo, um hormônio especifico assume o “comando” das alterações.
1.7. A ANTICONCEPÇÃO COM A ADMINISTRAÇÃO DE HORMÔNIOS
Anticoncepção corresponde ao uso de métodos e técnicas com a finalidade de impedir que o relacionamento sexual resulte em gravidez. Entre outros benefícios, previne gravidez indesejada, facilita o planejamento familiar, previne complicações do aborto provocado e diminui mortalidade materna em mulheres com comorbidades que impeçam uma gestação. (33)
Os estrogênios e as progestinas estão entre os fármacos mais amplamente prescritos para este fim. O principal mecanismo de ação dos componentes combinados é a suspensão da ovulação, através da inibição do fator de liberação hipotalâmico. O aumento dos níveis sanguíneos do componente estrogênico inibe a secreção hipofisária de FSH, com consequente atraso na maturação folicular, enquanto que os níveis sanguíneos do componente progestacional são suficientes para inibir o pico de liberação de LH, que aparece no meio do ciclo e induz a ovulação.
Assim, tanto por inibirem o EHHO, como por agirem diretamente no aparelho reprodutor feminino, como aumentar a viscosidade do muco cervical e reduzir a sua produção, esta associação cria condições que impeçam a fecundação. (31,34) Assim como outros esteroides, tanto estrógenos como progesterona ligam-se aos receptores tipo 4, como os nucleares. Existem pelo menos dois receptores para estrógenos conhecidos, que são ERa e ERb, e dois para progestinas, EPa e EPb (30). Após a ligação, ativam-se complexos com sítios nucleares, ativando genes e promovendo a síntese proteica, com as consequentes ações farmacológicas. Entre outras ações, estão o aumento da síntese de receptores para progesterona em órgãos como útero, vagina, adeno-hipófise e hipotálamo, desencadeado pelo estímulo estrogênico. (30,31,34)
O princípio do uso combinado estáno sinergismo das ações dos dois hormônios, onde a progestina age em nível central (hipotálamo e hipófise) inibindo a produção e liberação do LH (bloqueio gonadotrófico), o que impede a ovulação. Perifericamente, interfere na motilidade tubária, causa atrofia endometrial por impedir a ação isolada do estrogênio e torna o muco cervical espesso, dificultado a passagem do espermatozoide (30,31,34,35). Já o estrogênio possui ação central negativa sobre a produção e liberação do FSH, impedindo consequentemente o crescimento folicular, além de ajudar a estabilizar o endométrio, gerando sua transformação inadequada tanto para a migração do espermatozoide, como para uma possível nidação do blastocisto no endométrio (30,31,34). Os anticoncepcionais orais combinados (AOCs) representam o método anticoncepcional mais utilizado em todo o mundo. Estima-se que 100 milhões de mulheres são usuárias desse método, que se caracteriza por sua elevada eficácia (falha é de menos de um a cada 100 mulheres/ano com o uso perfeito, aumentando para 5 a cada 100 mulheres ano, com sua utilização típica. Em nosso país estima-se aproximadamente 27% das mulheres em idade fértil utilizem os AOCs. (35)
Atualmente, quase 12 milhões de mulheres em todo o mundo usam formulação de esteroides injetáveis somente com progestágeno ou com contraceptivos mensais combinados (esteroides e progestágenos). (36)
A grande vantagem dos injetáveis, quando comparados a contracepção oral combinada, está na facilidade de uso, como dose única mensal se opondo ao uso diário oral e menor incidência de efeitos colaterais indesejados (como hipertensão arterial sistêmica, alterações na hemostasia e coagulação, no metabolismo lipídico e na função hepática). (37)
Outras vantagens estão no uso do estrogênio natural (o estradiol), mais fisiológicos do que os utilizados nas pílulas anticoncepcionais combinadas, e na possibilidade de administrar doses menores de hormônios, por não haver efeito de metabolismo de primeira passagem hepática, por sua administração parenteral.
1.7.1. O ACETATO DE MEDROXIPROGESTERONA
Os progestágenos podem ser sintéticos ou naturais. A progesterona é o único progestágeno natural, produzido pelo corpo lúteo ovariano após a ovulação, pela placenta durante a gestação, pelas adrenais e pelo sistema nervoso. Os sintéticos tentam mimetizar o efeito da progesterona e são chamados de progestinas (38,39,40)
O acetato de medroxiprogesterona (AMP) – acetato de 17a-hidroxi-6a-metilprogesterona – é um progestágeno eficaz e altamente seletivo, tendo características farmacológicas semelhantes às da progesterona natural (figura 18). É cerca de 10 vezes mais potente que a progesterona, e não é transportada pela globulina fixadora de hormônios sexuais (SHBG) (31). Liga-se com baixa afinidade à albumina e passou por um processo de esterificação da molécula, que objetivou retardar sua absorção e aumentar sua biodisponibilidade. (31) O AMP demonstrou possuir várias ações farmacológicas sobre o sistema endocrinológico, como a inibição das gonadotrofinas pituitárias (FSH e LH), a diminuição dos níveis sanguíneos de ACTH e de hidrocortisona, e a diminuição da testosterona circulante, o que explica sua eficácia contraceptiva com uma só injeção mensal (41,42).Também demonstrou diminuição dos níveis de estrogênio circulante, como resultado da inibição de FSH e indução enzimática de redutase hepática, resultando em aumento do clearance de testosterona, com
consequente redução de conversão de androgênios para estrogênios. (41)
(A) (B)
Figura 18: Estrutura molecular do AMP (A) e da progesterona (B).
FONTE: Schumacher et al, 2007. (28)
Segundo Rahimy, 1999, (41) a atividade da fase lútea foi suprimida por pelo menos 63 dias após a última injeção intramuscular e a ovulação foi completamente inibida durante todo o intervalo de dosagem de AMP,conforme foi determinado pela concentração sérica de progesterona, perfis de tempo 4,7ng/mL, consistente com a supressão da função ovariana. A supressão prolongada da função ovariana relaciona-se temporariamente com os perfis de concentração-tempo séricos sustentados de AMP, ou seja, quanto maior a exposição sistêmica ao AMP (quanto maior a ASC e maiores níveis de concentração mínima), maior a duração da supressão ovulatória. (41)
Após administração intramuscular, o AMP é lentamente liberado, resultando em um nível baixo, mas persistente na circulação. Imediatamente após uma injeção intramuscular de 150mg/mL de acetato de medroxiprogesterona, as concentrações séricas são de 1,7 ± 0,3nmol/L. Duas semanas mais tarde, os níveis são de 6,8 ± 0,8nmol/L. O tempo médio para o pico é de aproximadamente 4 a 20 dias após uma dose intramuscular. Os níveis séricos de acetato de medroxiprogesterona são reduzidos gradualmente e permanecem relativamente constantes, por volta de 1 a 4,7ng/mL por 2 a 3 meses. (36,42)
A literatura tem demonstrado que há uma ampla variação inter-individual nos parâmetros farmacocinéticos da medroxiprogesterona após sua administração intramuscular (43). A tabela 1 mostra a diversidade de valores de C
T1/2 para acetato de medroxiprogesterona em aplicação intramuscular mensal, encontrados em algumas publicações. (43-45)
Acetato de Medroxiprogesterona N (ng/mL) Cmáx Tmáx (dias) (dias) T ½ Rahimy et al., 1998 (41) 14 1,25 + 0,33 3,5 + 2,9 14,7 + 7,8 Zhou et al., 1998 (43) 9 1,18 + 0,4 3,4 + 0,9 x Sierra-Ramirez et al., 2011(44) 14 1,47 + 0,48 4,75 + 2,09 24,03 + 21,7 Thurman A. et al, 2013 (45) 15 1,31 + 0,44 4,1 + 5,0 17,1 + 7,5 Tabela1: Variações dos parâmetros farmacocinéticos do AMP encontradas na literatura.
Aproximadamente 90 a 95% do AMP estão ligados às proteínas. O volume de distribuição relatado é de 20 ± 3 litros. O AMP atravessa as barreiras hematoencefálica e placentária.
Sua metabolização é hepática e sua meia-vida de eliminação, após uma injeção intramuscular única, é de cerca de 6 semanas. É excretado principalmente nas fezes, via secreção biliar. Aproximadamente 30% de uma dose intramuscular é excretada na urina após 4 dias.
1.7.2. O CIPIONATO DE ESTRADIOL
O estradiol é o principal estrogênio secretado pelo ovário e também o mais potente (figura 19). O cipionato de estradiol (C2E), assim como o AMP, passou por processo de esterificação para retardar sua absorção e aumentar sua biodisponibilidade.
