UNIVERSIDADE REGIONAL DO NOROESTE DO
ESTADO DO RIO GRANDE DO SUL - UNIJUÍ
SIMONE WALBRINK FRÜHLING
MODELAGEM MATEMÁTICA DO CRESCIMENTO
BACTERIANO NO LEITE CRU
Ijuí
2013
SIMONE WALBRINK FRÜHLING
MODELAGEM MATEMÁTICA DO CRESCIMENTO
BACTERIANO NO LEITE CRU
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Modelagem Matemática da Universidade Regional do Noroeste do Estado do Rio Grande do Sul – UNIJUÍ, como requisito parcial para a obtenção de título de Mestre em Modelagem Matemática.
Orientador: Prof. Dr. Daniel Curvello de Mendonça Müller
Ijuí
2013
Aos meus pais, Bruno e Normélia, a minha irmã Solange, ao meu esposo Gelson, e em especial aos meus alunos, pelo incentivo, carinho e confiança, lhes dedico este trabalho.
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais Bruno e Normélia, pelo amor, dedicação, apoio e suporte, não medindo esforços para proporcionar minha formação moral e acadêmica, além de serem os maiores incentivadores do meu trabalho. Obrigada por tudo.
A minha irmã Solange, sem a sua ajuda e incentivo não chegaria ao final, também pelo auxílio na formatação e revisão dos trabalhos.
Ao meu esposo Gelson pela paciência, pela confiança e pelo incentivo nos momentos difíceis.
Ao professor Dr. Daniel Curvello de Mendonça Müller, pela atenção, disponibilidade e orientação, aceitando o tema proposto, sendo fundamental para realização de um sonho.
Ao professor Dr. José Antonio Gonzalez da Silva pela co-orientação, pelo suporte na análise estatística.
Ao laboratório SARLE pelas análises feitas, e ideias trocadas.
A Universidade Regional do Noroeste do Estado do Rio Grande do Sul, ao IRDeR pela infraestrutura oferecida.
Ao agrônomo Cesar Oneide Sartori, diretor do IRDER, que permitiu e propiciou a estrutura para a pesquisa.
Professores do Mestrado em Modelagem Matemática da Unijuí pelos ensinamentos e amizades.
Aos colegas e amigos, em especial a colega Juliana, agradecimento pelo companheirismo, pelas ideias trocadas e amizade.
A Geni pela amizade e disposição a nos atender prontamente.
A professora Ms. Magda Inês Luz Moreira, pelo incentivo a seguir a formação acadêmica, e prosseguir o estudo iniciado na especialização.
Ao Colégio Sinodal Ibirubá pelo incentivo, apoio e compreensão. A Capes pelo apoio financeiro recebido.
A todas as pessoas que direta e indiretamente apoiaram a realização deste trabalho. Meus sinceros e eternos agradecimentos.
“Somos o que repetidamente fazemos. A excelência, portanto, não é um feito, mas um hábito”. (Aristóteles)
RESUMO
O leite é um alimento amplamente consumido pelo homem e pelo alto valor nutritivo é alvo de grandes contaminações. São necessários rigorosos cuidados de higiene na obtenção, armazenamento, transporte e industrialização desse produto, garantindo sua qualidade, segurança e a satisfação do consumidor. A publicação da Instrução Normativa número 51 (IN 51) foi um marco para o setor leiteiro, pois previa a redução da Contagem Bacteriana Total (CBT) de um milhão para 100 mil UFC/ml. Após revisão dessa normativa, foi publicada a Instrução Normativa número 62 (IN 62) que passou a escalonar os prazos e estendeu o limite da adequação até o ano de 2016. Neste trabalho, objetivou-se modelar matematicamente o crescimento de bactérias no leite cru com a influência da temperatura e mistura das ordenhas determinando assim sua dinâmica populacional, e estimar o melhor período para a remoção do leite do tanque de expansão. A variável resposta de interesse foi a Contagem Bacteriana Total (em UFC/mL) e a temperatura (em ºC), considerando as possíveis interações com o momento de ordenha e o período de coleta (em horas). Esperava-se que o crescimento bacteriano no leite cru seguisse uma linha exponencial, segundo o modelo de Malthus, pois a mistura de ordenhas, além de elevar a temperatura, adiciona nutrientes ao meio, contribuindo para a multiplicação bacteriana. Considerando a natureza das variáveis resposta, a equação polinomial de grau dois se foi a que melhor se ajustou aos dados reais. Para modelar a temperatura, a equação logarítmica apresentou melhor ajuste aos dados reais, sendo a temperatura, a variável que mais se correlacionou com o número de bactérias. Os resultados mostraram que para o leite de baixa contagem bacteriana inicial, a mistura dos momentos de ordenha e o tempo de coleta do leite não interferem na contagem bacteriana, mantendo a qualidade do leite e o limite legal de UFC/mL prevista na IN-62.
Palavras chave: Contagem Bacteriana Total; Temperatura; Tempo; Mistura de ordenhas;
ABSTRACT
Milk is a food widely consumed by humans and due to its high nutritional value is susceptible to large contamination. It takes rigorous hygiene care in obtaining, storage, transportation and industrialization of the product, ensuring its quality, safety and customer satisfaction. The publication of Normative Instruction number 51 (NI 51) was a milestone for the dairy sector, as it provided for the reduction of total bacteria count (TBC) from one million to 100.000 CFU/ml. After reviewing the rules, Normative Instruction number 62 (NI 62) was published and it now staggers the deadlines and extended the limits of appropriateness until the year 2016. This study aims to mathematically model the growth of bacteria in raw milk with the influence of temperature and mixing milking thus determining their population dynamics, and to estimate the best time to remove the milk from the bulk tank. The response variable of interest was the Total Bacteria Count (CFU/ml) or temperature (in oC), which are altered by the effects of time of milking and the collection period (in hours). It was expected that bacterial growth in raw milk followed an exponentially line, according to the Malthus model, as the mixing milking that besides increasing the temperature, add nutrients to the environment, contributing to bacterial multiplication. Considering the nature of the variable responses, a polynomial equation of degree two was the model that best fits the actual data. To model the temperature, the logarithmic equation showed a better fit to the actual data, being temperature the variable most correlated with the number of bacteria. The results showed that milk of initial low bacterial count, mixing moments of milking and the time of milk collection does not interfere with bacterial count, maintaining milk quality and legal limit of UFC/ml provided in NI 62.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Fases da curva de crescimento microbiano... 28 Figura 2- Fatores que contribuem para obtenção de leite higiênico. ... 36 Figura 3- Gráfico demonstrando o coeficientes de proporcionalidade considerando natalidade
() e mortalidade (). ... 46 Figura 4- Gráfico demonstrando a taxa de variação da população em função da população
atingindo seu limite máximo. ... 48 Figura 5- População que tende a superpopulação em determinado tempo... 49 Figura 6- Imagem da estrutura física do IRDeR. Observa-se à direita, os locais relacionados à
coleta do leite: sala de ordenha e canzil. ... 57 Figura 7- Coleta das amostras diretamente no tanque de expansão. Observa-se a utilização de
avental, luvas, gorro e máscara, evitando-se a contaminação da amostra... 58 Figura 8- Conjunto sala de ordenha e galpão de alimentação (acima). Animais aguardando
início da ordenha em ambiente de fácil limpeza (à esquerda). Canzil para alimentação após a ordenha (à direita). ... 59 Figura 9- Imagem dos animais dentro da sala de ordenha durante o procedimento de coleta do
leite. ... 59 Figura 10- Tanque de expansão a granel (resfriador) recebendo o leite diretamente pela
tubulação interligada à sala de ordenha. ... 60 Figura 11- Representação dos períodos de coleta. Amostras C1, C7 e C13 (leite na
temperatura fisiológica do animal), representam a população de bactérias novas que serão adicionadas ao resfriador, representando o momento t0. Amostras C2, C8 e C14, ocorreram uma hora após começo da ordenha. As amostras C3, C9 e C15 representam a população de bactérias três horas após o início das ordenhas, as amostras C4, C10 e C16, cinco horas após, as C5, C11 e C17, sete horas após e C6, C12 e C18 nove horas após início das ordenhas. ... 62 Figura 12- Comparativo entre o modelo polinomial de grau dois (número de bactérias
estimado) e valores reais (número de bactérias real) encontrado nas amostras. (a) Momento de Ordenha – 1ª (Tarde); (b) Momento de Ordenha – 2ª (Manhã); (c) Momento de Ordenha – 3ª (Tarde). ... 69
Figura 13- Comparativo entre o modelo polinomial de grau dois (Temperatura estimada) e valores reais (Temperatura real) encontrado nas amostras. (a) Momento de Ordenha – 1ª (Tarde); (b) Momento de Ordenha – 2ª (Manhã); (c) Momento de Ordenha – 3ª (Tarde). ... 70
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Crescimento bacteriano, Contagem Bacteriana Total (CBT) frente às diferentes temperaturas e período de armazenamento. ... 39 Tabela 2- Análise de variância ... 54 Tabela 3- Análise de variância de dois critérios (sem interação) ... 55 Tabela 4- Resumo da análise de variância considerando os efeito de tempo de coleta do leite
sobre momento de ordenha, e suas interações, em várias temperaturas e número de bactérias. ... 63 Tabela 5- Valores médios pelo modelo de Scott-Knott para os efeitos de temperatura e
número de bactérias (NBac). ... 65 Tabela 6- Resumo análise de variância de equação de regressão polinomial e seus parâmetros
para NBac no leite cru durante três ordenhas com os valores médios gerais de tempo (T) de armazenamento do leite. ... 68 Tabela 7- Equações não lineares ajustadas para estimativa da temperatura... 70
LISTA DE QUADROS
Quadro 1- Valores médios de germes contidos em salas de ordenha ... 38 Quadro 2- Efeito da temperatura na multiplicação dos microrganismos no leite em diferentes
SUMÁRIO 1 APRESENTAÇÃO DA DISSERTAÇÃO ... 14 1.1 Introdução ... 14 1.2 Motivação ... 15 1.3 Objetivos ... 17 1.3.1 Objetivo Geral ... 17 1.3.2 Objetivo Específico ... 17 1.4 Estrutura da dissertação ... 18 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 19
2.1 O Setor Lácteo no Brasil e Rio Grande do Sul ... 19
2.2 Legislação ... 20
2.3 Microbiologia ... 22
2.3.1 Mundo Microbiano ... 22
2.3.2 Classificação dos Reinos ... 23
2.3.3 Morfologia das bactérias ... 24
2.3.4 Metabolismo, Crescimento, Reprodução de Microrganismos ... 24
2.3.5 Métodos de Determinação de Microrganismos ... 27
2.3.6 Ritmo e Controle do Crescimento Bacteriano ... 28
2.3.7 Microbiologia dos alimentos ... 30
2.4 Leite ... 31
2.4.1 Caminho do leite ... 32
2.4.2 Microbiologia do Leite ... 34
2.4.3 Fatores que influenciam na Qualidade Microbiológica do Leite ... 35
2.4.4 Coleta das amostras ... 41
2.4.5 Contagem de Microrganismos no Leite ... 42
3 MODELOS MATEMÁTICOS ... 44
3.1 Modelagem Matemática ... 44
3.2 Modelo da Dinâmica Populacional... 44
3.3 Expressões matemáticas do crescimento bacteriano ... 49
3.4 Microbiologia Preditiva ... 50
4 ESTATÍSTICA ... 52
5.1 Caracterização do Local ... 57
5.2 Delineamento Experimental ... 57
5.3 Procedimento Experimental ... 60
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 63
1 APRESENTAÇÃO DA DISSERTAÇÃO
1.1 Introdução
A pecuária leiteira é uma atividade de grande importância em diversas regiões brasileiras, desempenhando papel relevante na complementação da renda para alguns produtores rurais (COSTA, 2006), e muitos tem a atividade como principal fonte de renda na propriedade.
A produção de leite no País passa por profundas transformações, em busca do aprimoramento do produto final. Recentemente, aumentaram-se as exigências qualitativas, através de novas instruções normativas. Em 2002 o governo brasileiro publicou a Instrução Normativa número 51 (IN 51), que previa a redução da contagem bacteriana total (CBT) de um milhão para 100 mil unidades formadoras de colônia por mililitro (UFC/mL). Tais mudanças deveriam estar concluídas até julho de 2011. Com essa medida, muitos produtores brasileiros não conseguiram cumprir o prazo para as adequações propostas, visto os elevados níveis da CBT (SANTOS, 2012).
Segundo JoãoWalter Dürr, presidente do Conselho Brasileiro de Qualidade do Leite (CBQL) e responsável pelo laboratório de Microbiologia da Universidade de Passo Fundo/RS, 60% das amostras analisadas em seu laboratório, no ano de 2011, estavam fora dos padrões legais quanto a CBT. Atenta-se para que o limite recomendado na IN 51 no referido ano era de 1 milhão de UFC/mL (MILK POINT, 2012).
O Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) revisou a IN 51/2002, sendo publicados novos limites para CBT e Contagem de Células Somáticas (CCS). Essa nova edição, denominada IN 62, alterou a IN 51, contudo escalonou os prazos para que produtores e indústria promovessem as devidas adequações até o ano de 2016.
A maior contaminação por bactérias ocorre durante a ordenha e armazenamento do leite (SANTOS, 2012). O resfriamento imediato após a ordenha é a maneira mais eficiente de inibir o metabolismo e a multiplicação desses microrganismos, que por sua vez, acarretam grandes prejuízos ao produtor e à indústria.
Com o aumento das exigências no controle de qualidade do leite, tanto por parte dos consumidores quanto da indústria e da legislação nacional, o produtor precisa estar ciente de
que para manter a atividade lucrativa torna primordial adequar-se às normas vigentes. A qualidade do produto que sai para comercialização está diretamente relacionada à carga microbiana nele presente, visto a influência direta dessa no sabor e aroma do leite, além de reduzir o prazo de validade do produto disponível aos consumidores.
O presente trabalho teve como objetivo investigar o crescimento bacteriano no leite cru, considerando a mistura de três ordenhas consecutivas ao longo de 42 horas. A análise foi relacionada com os modelos matemáticos da dinâmica populacional, definindo aquele que melhor se ajustasse a realidade observada. Com este trabalho é possível definir ou justificar o melhor período de recolhimento do leite, ou ainda, afirmar se há correlação da mistura de ordenhas sobre a contagem bacteriana, sendo essa uma possível justificativa para a desconformidade encontrada nos produtos atualmente. Este capítulo apresenta a motivação para a realização do trabalho e os objetivos a serem alcançados. Por fim é apresentada a estrutura desta dissertação.
1.2 Motivação
A modelagem matemática ajuda na percepção, desenvolvimento e solução de problemas aplicados, incluindo a teoria e o cálculo, pois esta envolve situações reais guiadas por hipóteses. A biologia tem utilizado a matemática como ferramenta para interpretar os eventos, compreender seus problemas e projetar soluções.
O estudo do crescimento populacional tem grande importância para a programação do futuro, sendo que o primeiro modelo matemático para previsão de populações surgiu pela preocupação com a falta de recursos para as futuras gerações. Existem diversos modelos de crescimento populacional, dentre eles o de Thomas Robert Malthus e o modelo de Verhulst, também conhecido como equação logística (ZILL, 2003).
As bactérias tem sido as maiores fontes causadoras de enfermidades em seres vivos, podendo ocasionar doenças e até levar à morte. Invisíveis a olho nu, esses microrganismos são encontrados em todas as estruturas, mas principalmente nos alimentos, já que são meios de cultura ótimos para o seu crescimento (FORSYTHE, 2002).
O fato do leite ser um alimento com alto valor nutritivo o torna extremamente atraente para o desenvolvimento de bactérias, constituindo-se alvo de grandes contaminações. São
necessários rigorosos cuidados de higiene para sua obtenção, armazenamento e industrialização, incluindo não só o produto bruto, mas de seus derivados. Dessa forma, pode ser possível garantir um produto seguro para a alimentação e adequado segundo as exigências e necessidades do consumidor (PEREDA, 2005).
O Rio Grande do Sul é um grande produtor de leite e com excelente potencial de ampliação. A inauguração de empresas nos últimos anos ampliou a capacidade de processamento no estado e consequentemente, aumentou a procura pela matéria-prima de qualidade, o que agregou renda à propriedade rural (TONDOLO; BITENCOURT, 2006; SOUZA et.al, 2010).
Para incentivar o aumento da qualidade, algumas empresas criaram programas de pagamento diferenciado, visto que o bom produto final, está diretamente relacionado a sua carga microbiana (SANTOS, 2012). A contaminação bacteriana depende de vários fatores, como saúde do animal, correta higiene das instalações e equipamentos de ordenha, qualidade da água utilizada, temperatura e tempo de armazenagem do leite (FONSECA; SANTOS, 2000).
Na propriedade, o leite é armazenado e resfriado em tanques de expansão, popularmente denominados de resfriador a granel, ou tanque de imersão, onde o leite é depositado em latões os quais permanecem imersos em água fria. Esse último é um sistema manual, no qual se deve agitar o leite periodicamente e a água ao redor deve ser trocada em períodos pré-determinados. A facilidade de limpeza, a homogeneização automática, o aumento da capacidade de armazenamento e redução da mão de obra, foram os fatores que começaram a tecnificar o processo e fizeram com que o produtor trocasse o tanque de imersão pelo de expansão.
Grande parte dos produtores promovem duas ordenhas diárias, com intervalo de 12 horas entre elas. Contudo, o primeiro leite que cai no resfriador, ou seja, a primeira ordenha, só será recolhida 48 horas depois. Isso permite que o caminhão leve mais produto a cada coleta, visto que após 48 horas, já ocorreram quatro ordenhas. Quando a produção de leite da propriedade excede a capacidade diária do resfriador, o leite pode ser recolhido a cada 24 horas.
Considerou-se como hipótese para o problema da elevada carga microbiana, o fato da adição de novas ordenhas, misturadas àquele leite já resfriado, elevaria a temperatura local, estimulando o metabolismo das bactérias antes estabilizadas. Esse trabalho poderá encontrar alternativas para melhorar a qualidade da matéria prima oferecida à indústria, mapeando
através da dinâmica do crescimento bacteriano, os possíveis pontos críticos durante o processo de estocagem do leite.
1.3 Objetivos
1.3.1 Objetivo Geral
O objetivo desse trabalho foi modelar matematicamente o crescimento de bactérias no leite cru, em razão da variação da temperatura provocada pela sucessão de ordenhas, determinando assim sua dinâmica populacional.
1.3.2 Objetivo Específico
Determinar o melhor período para o esvaziamento do resfriador, obtendo-se uma matéria prima de maior qualidade microbiológica.
Detectar efeito de interação entre o momento de ordenha e o tempo de coleta do leite, para temperatura e número de bactérias.
Testar a viabilidade de estimar o crescimento bacteriano via regressão polinomial definindo o grau do polinômio para o crescimento bacteriano no leite cru sob condições de resfriamento.
Determinar o modelo matemático que melhor defina a variação da temperatura do leite em três ordenhas sucessivas.
1.4 Estrutura da dissertação
Este trabalho estuda o crescimento de bactérias no leite cru, com a influência da temperatura, em condição real, determinando assim a sua dinâmica populacional. Dessa forma, pode-se prever o melhor período para a remoção do volume total de leite de dentro do resfriador.
Para tanto, esse trabalho esta organizado em sete capítulos.
No Capítulo 2 é exposto o embasamento sobre o tema para uma melhor compreensão do problema. Esse capítulo também apresenta uma abordagem dos aspectos e conceitos gerais sobre microbiologia, microbiologia do leite e demais contextos relevantes.
O Capítulo 3 trás alguns modelos matemáticos de dinâmica populacional. No Capítulo 4 são apresentados conceitos, procedimentos, expressões e fórmulas estatísticas, que serão utilizadas no trabalho.
O Capítulo 5 descreve a metodologia desenvolvida para a execução do trabalho, elucidando pontualidades sobre a coleta das amostras.
No Capítulo 6 são apresentados os resultados obtidos através das análises estatísticas e cálculos matemáticos, fazendo a discussão e comparação com os modelos da dinâmica populacional, apresentando a validação dos modelos matemáticos. Finalmente, no Capítulo 7, estão expostas as considerações finais e conclusões do trabalho.
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 O Setor Lácteo no Brasil e Rio Grande do Sul
A pecuária leiteira no Brasil vem sofrendo intensas transformações desde os anos noventa, quando se iniciou o processo de desregulamentação do mercado e a abertura comercial. Trata-se de uma atividade de grande relevância em diversas regiões brasileiras, principalmente no Sul e Sudeste, desempenhando um papel relevante na complementação da renda para os produtores rurais (COSTA, 2006).
A produção primária do leite no Brasil tinha como predominância marcante produtores pouco especializados, produção sazonal, pequenos volumes de leite produzido por propriedade e animais mestiços ou voltados para corte. A implementação de programas de qualificação e a instauração de instruções normativas vêm excluindo do mercado os produtores sem capacitação. Em longo prazo, a granelização e a revisão das normas de produção e qualidade final dos produtos lácteos, resultará em mais produtores especializados e, consequentemente, no desaparecimento de um terço dos atuais (COSTA, 2006, apud ALMEIDA, 2001).
No Brasil, o processo de obtenção do leite algumas vezes é realizado sob precárias condições higiênico-sanitárias, elevando as contagens de microrganismos no produto. Por tratar-se de um alimento de grande importância nutricional, econômica, social e de saúde pública, a qualidade do leite tem merecido a atenção de pesquisadores do mundo inteiro (COSTA, 2006).
A produção leiteira do Brasil vem aumentando periodicamente. Na década de 90, passou de 14,9 bilhões de litros produzidos, para 18,7 bilhões, em apenas oito anos. Esses números continuaram subindo. Em 2004, a produção leiteira foi de 23,5 bilhões de litros. Em 2007 o país produziu 26,1 bilhões de litros de leite e em 2009 o Brasil alcançou o quinto lugar dos países produtores de leite no mundo (BARROS; SIMÃO, 2009).
Em 2011, essa produção chegou a 32,1 bilhões de litros em todo Brasil isto segundo Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE), obtendo um acréscimo de 4,5% sobre o
ano anterior, sendo que o Rio Grande do Sul foi responsável por 12,1% da produção nacional (MILK POINT, 2013).
2.2 Legislação
Em 1952, foi publicado no Brasil, o Regulamento de Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal, onde foram estabelecidos parâmetros de qualidade para produtos de origem animal, entre eles o leite e seus derivados. Em 1996 o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) criou o Programa Nacional de Melhoria da Qualidade do Leite (PNMQL), este programa veio para auxiliar a cadeia produtiva do leite que sofria grandes perdas econômicas em decorrência da elevada acidez do leite e da alta incidência de mastite nos rebanhos (OLIVEIRA et al. 2000, Apud, LEITE, 2006).
Em abril de 2002, o MAPA por meio da Instrução Normativa nº37 (IN 37), instituiu a Rede Brasileira de Laboratórios de Controle da Qualidade do Leite (RBQL), com o objetivo de realizar análises laboratoriais para a fiscalização de amostras de leite cru, coletadas em propriedades rurais e em estabelecimentos de laticínios. A RBQL é composta por sete laboratórios estrategicamente localizados nos Estados do Rio Grande do Sul, Paraná, São Paulo, Goiás, Pernambuco e dois em Minas Gerais. Os laboratórios utilizam equipamentos capazes de realizar análises de composição centesimal, contagem de células somáticas (CCS) e contagem bacteriana total (CBT).
Em 18 de setembro de 2002 o MAPA, publicou a Instrução Normativa n°51 (IN 51) onde definiu novos parâmetros de qualidade e estabeleceu critérios de avaliação para o leite cru refrigerado. A IN 51 obriga a análise mensal de uma amostra de leite, proveniente de cada uma das propriedades rurais que destinam o produto para estabelecimento sob inspeção federal. Os parâmetros de qualidade vão desde a contagem de células somáticas, até a determinação dos teores de gordura, proteína, lactose, sólidos totais, sólidos não gordurosos, resíduos de antimicrobianos, crioscopia e contagem bacteriana total (BRASIL, 2002).
A IN 51 estabelece que o leite cru refrigerado precisa apresentar no mínimo 2,9% de proteína, 3,0% de gordura e 8,4 % de Extrato Seco Desengordurado (ESD). O valor máximo permitido para a contagem de células somáticas, nas Regiões Sul, Sudeste e Centro-Oeste, é
de 1.000.000 céls./mL. A partir de julho de 2008 este valor máximo foi reduzido para 750.000 céls./mL e, em julho de 2011, para 400.000 céls./mL. Na contagem bacteriana total os valores máximos permitidos, nessas regiões foram de 1.000.000 UFC/mL de julho de 2005; 750.000 UFC/mL até julho de 2008 e 100.000 UFC/mL até julho de 2011. Estes padrões visavam melhorar a qualidade do leite e derivados produzidos no Brasil, assemelhando-se com os padrões estabelecidos mundialmente (BRASIL, 2002).
Em decorrência da grande desconformidade a IN 51, o MAPA publicou a IN 32 em junho de 2011 a qual prorrogava por seis meses a vigência dos prazos estabelecidos para a adoção de novos limites microbiológicos e de células somáticas. Essa medida entraria em vigor a partir de 1º de julho de 2011 para as regiões Sul, Sudeste e Centro-Oeste, dispostos no Anexo IV da Instrução Normativa nº 51, de 18 de setembro de 2002. Ainda foi instituído um grupo de trabalho com objetivo de estabelecer novas diretrizes para o PNMQL.
Em dezembro de 2011 foi publicada a Instrução Normativa nº62 (IN 62), que alterou normas de produção e qualidade do leite. A IN 62 passou a escalonar os prazos e limites antes definidos na IN 51, prorrogando-os até o ano de 2016. A IN 62 mantém os parâmetros dos teores de gordura, proteína e estrato seco desengordurado. O valor máximo permitido para a contagem de células somáticas, nas Regiões Sul, Sudeste e Centro-Oeste, é de 750.000 céls./mL. A partir de janeiro de 2012 este valor máximo foi reduzido para 600.000 céls./mL e, a partir de julho de 2014, passará para 500.000 céls./mL e, a partir de julho de 2016, para 400.000 céls/mL. Na contagem bacteriana total, os valores máximos permitidos alteraram de 750.000 UFC/mL para 600.000 UFC/mL em janeiro de 2012, 300.000 UFC/mL a partir de julho de 2014 e 100.000 UFC/mL a partir de julho de 2016 (BRASIL, 2011).
2.3 Microbiologia
2.3.1 Mundo Microbiano
Com os estudos dos microrganismos se tornou insuficiente a divisão dos seres vivos em dois reinos, animais e plantas. O zoólogo Ernet Haeckel, em 1866 criou um terceiro reino, denominado Protista, englobando as bactérias, algas, fungos e protozoários (BORZANI et al, 2001).
Os microrganismos originaram-se a aproximadamente quatro bilhões de anos, e são considerados ancestrais de todas as outras formas de vida. Em meio a tentativas e descobertas é que pesquisadores reconheceram a microbiologia como ciência que estuda organismos microscópicos. Alguns deles são nocivos e podem causar doenças no homem, em animais e plantas. Outros são responsáveis pela deterioração, respondendo por importantes alterações ambientais, essenciais para a manutenção da vida no planeta (PELCZAR; CHAN; KRIEG, 1997).
Antony Van Leeuwenhoek (1683 - 1723) através de um microscópio rudimentar ficou impressionado quando viu o grande número de objetos móveis invisíveis a olho nu. Por volta de 1850, Louis Pasteur (1822-1895), provou que a fermentação era resultado de uma série de reações químicas, que ocorriam na presença de microrganismos. Examinando vinhos, Pasteur concluiu que a seleção de microrganismos de determinado tipo poderia assegurar um bom produto. Para destruir os microrganismos existentes ele primeiro aquecia o suco de uva e depois resfriava ficando isento de micróbios, esse processo hoje é denominado pasteurização. Pasteur criou uma nova teoria sobre a origem das doenças, foi desafiado e provou que um microrganismo denominado protozoário era a causa da doença do bicho-da-seda (PELCZAR; CHAN; KRIEG, 1997).
Louis Pasteur conseguiu comprovar que os microrganismos surgem a partir de outros microrganismos preexistentes, utilizando frascos do tipo “pescoço de cisne” mostrou o desenvolvimento e proliferação de micróbios presentes no ar. A partir de então a hipótese da biogênese passou a ser mais aceitam (LOPES, 2008).
Robert Koch (1843-1910) descobriu em 1876, a bactéria do carbúnculo, mais tarde ele e seus colegas descobriram as bactérias causadoras da cólera e da tuberculose. O postulado de Koch conduziu a descoberta de várias bactérias causadoras de doenças humanas. O médico utilizou-se dos métodos laboratoriais para organizar o seu postulado (PELCZAR; CHAN; KRIEG, 1997).
Os estudos de Pasteur e Koch levaram ao desenvolvimento da microbiologia médica depois foram comparadas com microrganismos presentes na agricultura e indústria, aumentando a produção e a qualidade dos produtos. No início do século XX se teve conhecimento da enorme capacidade dos microrganismos de realizarem transformações químicas, pois estes são feitos de compostos químicos e vivem por meio de reações químicas (PELCZAR; CHAN; KRIEG, 1997).
2.3.2 Classificação dos Reinos
Com os estudos mais avançados sobre a ultraestrutura celular demonstrou-se duas categorias de células: as procarióticas e eucarióticas. Os procarióticos apresentam um único cromossomo, sem membrana nuclear. Nos eucarióticos, o núcleo é limitado por uma membrana nuclear contendo vários cromossomos em seu interior (TRABULSI et al. 2008).
Em 1969, Robert Harding Wittaker propôs nova classificação dos organismos, em cinco reinos, Reino Monera, são aqueles procariontes que obtêm nutrientes somente por absorção e não podem ingerir alimentos nem realizar fotossíntese. Nesse reino incluem-se as bactérias. O Reino Protista, inclui seres vivos unicelulares, com células eucariontes como as algas microscópicas e fungos. Os seres vivos unicelulares ou pluricelulares com células eucarionte com parede celular, e que não tem pigmento fotossintético clorofila pertencem ao Reino Fungi, no qual todos são heterotróficos como fungos microscópicos, leveduras e bolores. O Reino Plantae é composto por seres com células eucariontes, pluricelulares e autotróficos como as plantas verdes fotossintéticas e algas superiores. Seres vivos pluricelulares, com células eucariontes e heterotróficos pertencem ao Reino Animalia, são todos os animais que ingerem os alimentos. Considerando a classificação os microrganismos estão em três reinos, o Monera, Protista e Fungi (PELCZAR; CHAN; KRIEG, 1997).
2.3.3 Morfologia das bactérias
As bactérias são microrganismos procarióticos, a maioria é unicelular e apresenta forma simples, invisível ao olho humano (BORZANI et al. 2001). Conforme Pelczar, Chan e Krieg (1997), existe uma grande superfície através da qual os nutrientes podem entrar em relação a um pequeno volume de substância celular a ser alimentada, isto é resultado da alta taxa de metabolismo e crescimento da bactéria.
Segundo Borzani et al. (2001), as bactérias apresentam-se em três formas, podendo ser esféricas, cilíndricas ou espiraladas. As de forma esférica denominam-se cocos, as cilíndricas, bacilos e as espiraladas, apresentam várias espirais sendo denominadas espirilos, ou na forma de vírgula ou meia espiral são designados de vibriões.
Os cocos podem se agrupar em pares dando origem aos diplococos, em cadeias, estreptococos ou se agrupar em cachos chamados estafilococos. Os cocos isolados são denominados micrococos. (BORZANI et al. 2001). Segundo Pelczar, Chan e Krieg (1997), algumas bactérias tem flagelos, que são filamentos finos e que ajudam a bactéria a se locomover. As bactérias esféricas e cilíndricas, se observadas em microscópio, estão frequentemente acopladas umas às outras.
As bactérias geralmente possuem uma única forma, sendo essa uma característica genética que em algumas condições ambientais e de cultivo podem fazer com que os organismos apresentem formas e arranjos diferentes (TRABULSI et al. 2008). A membrana citoplasmática das bactérias é composta de proteínas imersas em uma bicamada de lipídeos, sendo os fosfolipídeos os mais importantes. As proporções desses componentes, também variam conforme a espécie e as condições de cultivo (TRABULSI et al. 2008).
2.3.4 Metabolismo, Crescimento, Reprodução de Microrganismos
Os microrganismos precisam de um meio com nutrientes e condições físicas apropriadas para seu crescimento e desenvolvimento, tendo a influência da temperatura, pH, pressão osmótica e pressão atmosférica. Os processos de crescimento de microrganismos
dependem de reações químicas, que são afetadas pela temperatura. Em temperatura favorável para o crescimento, o número de divisões celulares por hora, chamado taxa de crescimento geralmente dobra para cada aumento de temperatura de 10ºC. A temperatura na qual uma espécie de microrganismos cresce mais rapidamente é a temperatura ótima de crescimento. As temperaturas mínima, ótima e máxima são denominadas temperaturas cardinais de uma espécie de microrganismo (PELCZAR; CHAN; KRIEG, 1997).
Cada espécie de bactéria apresenta suas próprias temperaturas cardinais. A temperatura mínima é considerada a menor temperatura onde a espécie é capaz de crescer. A temperatura máxima é a temperatura mais alta onde ainda é possível o crescimento e a temperatura ótima é aquela onde a espécie apresenta o melhor crescimento (TORTORA; FUNKE; CASE, 2003). Para Pelczar, Chan e Krieg (1997), a temperatura ótima está próxima do limite superior da variação de temperatura, visto que a velocidade das reações enzimáticas aumenta com o aumento da temperatura, até as enzimas serem danificadas pelo calor e cessaram o crescimento.
Os microrganismos são classificados em três grupos, de acordo com a variação de temperatura para crescimento: psicrófilos, ou microrganismos que crescem em baixas temperaturas, crescem melhor em temperaturas de 15 a 20°C, mesófilos, ou microrganismos que crescem em temperaturas moderadas, crescem melhor entre 25 e 40°C, e os termófilos, ou microrganismos que crescem em altas temperaturas, crescendo melhor entre 50 e 60°C (TORTORA; FUNKE; CASE, 2003).
O metabolismo bacteriano é muito diversificado. Bactérias diferentes podem utilizar como fonte de carbono e de energia nutrientes distintos e viver em diferentes temperaturas. Isto explica a distribuição universal das bactérias, encontradas nos ambientes mais variados (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2000).
Segundo Junqueira e Carneiro (2000), as bactérias podem ser divididas em fototróficas, quando utilizam a luz solar como fonte de energia, e quimiotróficas, quando utilizam a energia presente em compostos químicos. Algumas bactérias contêm como componente de sua estrutura, ou liberam para o meio de cultura, substâncias tóxicas chamadas de endotoxinas e exotoxinas bacterianas, que em parte são responsáveis pelos danos causados pelas bactérias aos organismos por elas atacados.
Segundo Borzani et al. (2001), alguns compostos orgânicos são indispensáveis para o crescimento dos microrganismos, como por exemplo, vitaminas, aminoácidos, nucleotídeos e
ácidos graxos. A água é um nutriente vital, pois regula a pressão osmótica das membranas. A agitação favorece crescimento de aeróbios e facultativos, pois, promove a homogeneização dos nutrientes no meio de cultura e a dispersão dos produtos metabólicos, favorecendo crescimento de anaeróbios.
Pelczar, Chan e Krieg (1997), relatam que alguns microrganismos necessitam da presença de gases para manutenção de suas atividades. Os aeróbios, por exemplo, necessitam de oxigênio. Os anaeróbios não toleram o oxigênio, pois não utilizam o gás. Os microaerófilos toleram em pequena quantidade enquanto os facultativos não necessitam do ar atmosférico para sobreviverem. A grande parte das bactérias crescem mais dentro de variações pequenas de pH. O pH ótimo para esse crescimento, se aproxima da neutralidade, ou seja, entre 6,5 e 7,5 (TORTORA; FUNKE; CASE, 2003).
Os microrganismos se reproduzem de duas maneiras, assexuada e sexuada. A Reprodução sexuada dos microrganismos eucarióticos ocorre por fusão de duas células diferentes, gerando um único ser. O ciclo celular eucariótico é dividido em duas partes, a interfase que consiste nas fases de crescimento 1, síntese de DNA e crescimento 2, onde a fase M é mitótica. Existe também a reprodução assexuada das bactérias por fissão binária, onde uma célula se divide em duas células idênticas. Uma célula se divide em duas, as duas se dividem e se tornam quatro e assim por diante. As populações de células crescem exponencialmente, por meio de uma progressão geométrica (PELCZAR; CHAN; KRIEG, 1997). Algumas espécies bacterianas se reproduzem por brotamento, formando uma região que inicia um crescimento que quando atinge o tamanho ideal se separa. As bactérias filamentosas se reproduzem através de uma cadeia de esporos (TORTORA; FUNKE; CASE, 2003).
De acordo com Pelczar, Chan e Krieg (1997), o tempo que o microrganismo leva para se dividir e se duplicar varia pela influência da composição nutricional do meio e pelas condições físicas de incubação. O crescimento pode ser caracterizado em termos quantitativos, incluindo o número de gerações, período de incubação, tempo de geração e a taxa de crescimento (número de gerações por hora).
De acordo com os mesmos autores, quando o meio de cultura é isolado em um frasco ou tubo e nenhum novo nutriente é adicionado ao sistema, nenhum produto de excreção metabólico é removido. Os microrganismos nessa situação, estão em um sistema fechado. O
crescimento exponencial de uma cultura em sistema fechado é um crescimento balanceado, pois depois de atingir a população máxima, começam a morrer.
É possível manter um meio de cultura contínuo, ou seja, sistema de células em crescimento no qual os nutrientes são adicionados continuamente e o volume do frasco permanece constante pela retirada simultânea de meio já utilizado. Os valores médios de todas as características, calculados por bactéria, permanecem constantes em qualquer intervalo de tempo, se tornando um regime estacionário. Além do tamanho, composição química e velocidade de crescimento permanecer constante por bactéria, também permanecem constantes a composição do meio de cultura, a concentração de metabólitos e a massa de células (TRABULSI et al. 2008).
2.3.5 Métodos de Determinação de Microrganismos
Para Borzani et al. (1997), o crescimento de uma população se dá em termos da massa total em função do número de indivíduos. Pode-se calcular a massa pela dosagem de certos componentes celulares como, proteína e ácidos nucléicos. Esse método é considerado sensível, pois a composição química varia muito rapidamente de acordo com as condições de crescimento.
Para Tortora, Funke e Case (2003) o crescimento bacteriano é considerado o aumento do número de indivíduos e não o aumento de tamanho de uma determinada célula. Existem diferentes métodos para quantificar o crescimento de uma população microbiana. Alguns determinam o número de células enquanto outros analisam a massa total da população.
Em populações de bactérias se utiliza amostragem para determinação da população. Sabendo-se que essa população é grande, o método utilizado para a contagem pode ser direto ou indireto. O método de contagem em placa é a técnica mais utilizada, onde cada colônia se origina de uma bactéria, o inoculo original é sempre homogêneo e não existe agregação das células. Nessa técnica deve-se ter o cuidado de não haver crescimento de colônia exageradamente comprometendo a acurácia dos resultados gerados. Para isso se utiliza o método da diluição seriada. O aparecimento de colônias visíveis na placa ocorre em 24 horas, o que se torna desvantajoso em algumas análises (TORTORA; FUNKE; CASE, 2003).
Segundo Borzani et al. (2001), o número de organismos pode ser determinado por contagem do número total de indivíduos, vivos e mortos, com o uso do microscópio. Conta-se o número de partículas em suspensão em determinado volume de diluição. Hoje existem aparelhos eletrônicos que promovem essa leitura automaticamente. A contagem de microrganismos viáveis, aquela que calcula o número de bactérias vivas é chamada de contagem de unidade formadora de colônias (UFC).
Na natureza os microrganismos estão em culturas mistas, com várias espécies ocupando o mesmo ambiente. Para determinar as características de um microrganismo ele deve estar em cultura pura, onde todas as células possuam mesma origem. Em laboratórios os microrganismos são cultivados em meios de cultura, sendo o mais utilizado o meio ágar (PELCZAR; CHAN; KRIEG, 1997).
2.3.6 Ritmo e Controle do Crescimento Bacteriano
O crescimento bacteriano em meio líquido, gera uma curva quando se realiza sua contagem por intervalo de tempos simulado na figura 1. Esse crescimento é dividido em quatro fases: lag, log, estacionária e de declínio (TORTORA; FUNKE; CASE, 2003).
Figura 1- Fases da curva de crescimento microbiano.
Quando as bactérias são colocadas em um novo meio de cultura, o número de células sofre pequenas variações. Esse período é denominado fase de lag. Durante esse período as células não se reproduzem imediatamente pois se encontram em estado de latência, onde ocorre intensa atividade metabólica, síntese de DNA e de enzimas. Dependendo de certos fatores a fase de lag não existe ou pode ser longa. Isso depende principalmente do estágio de crescimento em que se encontra o inóculo. Fatores como inóculo pequeno ou que provenha de uma cultura velha ou ainda quando o meio e a temperatura de incubação se alteram, alteram também o período dessa fase (TRABULSI et al., 2008)
A fase log inicia assim que as células começam seu processo de divisão, entrando no período de crescimento, onde o tempo de geração atinge um valor constante. A fase de logaritmo é o período de maior atividade metabólica da célula, onde os microrganismos são sensíveis às mudanças ambientais (TORTORA; FUNKE; CASE, 2003), e o crescimento é exponencial. A velocidade de crescimento dx/dt em função da massa x e a velocidade específica é constante, sendo considerada a fase mais importante, onde é grande a quantidade de nutriente (BORZANI et al. 2001).
A fase estacionária ocorre quando a velocidade de crescimento diminui e o número de células mortas é equivalente ao número de células novas. A atividade metabólica de cada célula diminui nesta fase, ocorrendo um período de equilíbrio (TORTORA; FUNKE; CASE, 2003). Nessa fase há o acúmulo de metabólitos tóxicos, esgotamento de nutrientes e oxigênio (BORZANI et al. 2001).
A fase de declínio ocorre quando o número de células mortas é maior que o número de células novas (TORTORA; FUNKE; CASE, 2003). A causa da morte das células, depois do período de crescimento de uma cultura, pode estar relacionada com a natureza e a concentração do fator limitante do crescimento. Um dos fatores limitantes é a falta de nutrientes, pois os organismos que param de crescer continuam com atividade metabólica, utilizando as reservas nutritivas como fonte de energia. Outro fator limitante é o acúmulo de produtos metabólitos tóxicos, podendo haver a queda de pH, que resulta em redução exponencial (TRABULSI et al. 2008).
Para Forsythe (2002), a duração de cada fase depende do organismo e do ambiente. A taxa de morte aumenta com a presença de ácidos e diminui com a presença de gordura.
Pode-se fazer controle de microrganismos pela ação de agentes físicos, ocorrendo a morte exponencial. Para matar microrganismos o agente físico mais eficiente e econômico é o
calor (BORZANI et al. 2001). Os microrganismos são considerados mortos quando perdem a capacidade de se multiplicar. A morte ocorre pela desnaturação de proteínas e fluidificação dos lipídeos na presença de calor úmido e por oxidação (TRABULSI et al. 2008).
A Pasteurização consiste no aquecimento a 62°C por 30 minutos, seguido de resfriamento brusco. É um método muito utilizado para destruir microrganismos causadores de doenças. Dependendo do produto a ser esterilizado, é realizado o congelamento a baixas temperaturas, sendo por vezes utilizada a radiação ultravioleta ou ionizante e filtração para destruição dos microrganismos (BORZANI et al. 2001)
O controle de microrganismos pode ser feito pela ação de agentes químicos, como desinfetantes, que matam agindo diretamente na estrutura microbiana. Os agentes quimioterápicos são substâncias que interferem nas vias metabólicas, podendo ser microbicida, que ocasiona a morte do microrganismo, ou microbiostático, que apenas impede sua proliferação. Os compostos podem ser esterilizantes, desinfetantes, antissépticos e conservantes, dependendo da concentração e tempo de contato (BORZANI et al. 2001).
2.3.7 Microbiologia dos alimentos
Os fatores que afetam o crescimento microbiano são utilizados para controlar a deteriorização de alimentos. A uma temperatura de -10°C, ocorre o congelamento, que previne o crescimento de todos os microrganismos. A mesma ação, é obtida com o branqueamento, onde a temperatura vai de 95 a 110°C, matando microrganismos superficiais (FORSYTHE, 2002).
A maioria dos microrganismos cresce melhor com valores de pH em torno de 7,0 apesar de alguns ainda crescerem com pH abaixo de 4,0. Alguns alimentos têm acidez inerente, outros são ácidos devido à ação de certos microrganismos, como a acidez biológica que ocorre em leites fermentados. Os alimentos que resistem à variação de pH são denominados tamponados, entretanto, os microrganismos que crescem em ambientes ácidos tornam o substrato menos ácido. O pH influencia no funcionamento das enzimas e nos transportes de determinados nutrientes, podendo, inclusive, afetar a morfologia de alguns microrganismos (JAY, 2005).
As bactérias necessitam valores altos de aw, ou seja, a atividade da água deve ser maior que 0,91. Quando se diminui aw, se aumenta à fase lag de crescimento e diminui a velocidade e o tamanho da população final. O potencial de oxidação-redução de um substrato depende da perda ou ganho de elétrons. Quando ocorre à perda, o substrato é oxidado e quando há ganho, o substrato é reduzido (JAY, 2005).
Para o bom crescimento, os organismos necessitam de água, fonte de nitrogênio, vitaminas e minerais aliadas a fatores de crescimento (JAY, 2005). O leite de vaca contêm diversas substâncias que inibem o crescimento de microrganismos, como a lactoferrina, conglutinina e o sistema lactoperiodase. O leite possui ainda, o inibidor do retrovírus, a caseína e alguns ácidos graxos, que possuem atividade antimicrobiana. Os parâmetros intrínsecos (do próprio alimento) e extrínsecos (do ambiente, como a temperatura) formam obstáculos simultâneos, que quando combinadas, podem formam barreiras a serem ultrapassadas pelos microrganismos, antes de destruir os alimentos. (JAY, 2005).
2.4 Leite
Denomina-se leite, o produto normal, fresco e integral oriundo da ordenha completa e ininterrupta de vacas sadias (KIRCHOF, 1994). É um alimento de alto valor nutritivo, indispensável aos mamíferos, principalmente nos primeiros meses de vida. Quando obtido em circunstâncias naturais, é ligeiramente amarelado, possui odor suave e gosto adocicado (BEHMER, 1999).
O leite bovino é secretado diretamente do úbere, ou seja, na glândula mamária, a qual é constituída de tecido glandular. O úbere é composto por alvéolos, lóbulos, cisternas e tetos, sendo envolvido por tecido muscular responsável pela proteção da glândula. O produto da sua secreção é o leite, cuja função natural é a alimentação dos bezerros (PEREDA, 2005). O leite é esbranquiçado pela refração à luz, que produz uma emulsão formada de gotas muito pequenas de gordura, envolvidas por lecitina, dispersas em água e contendo sais em solução, e um colóide protéico, estabilizando os microglóbulos de gordura (SALINAS, 2002).
O leite constitui um dos alimentos mais completos, que possibilita o processamento industrial obtendo-se diversos produtos para a alimentação humana (FONSECA; SANTOS,
2000). Behmer (1999), afirma que a quantidade e qualidade do leite produzido pelo animal sofre influência da raça, alimentação, idade, número de parições, tempo de lactação e as variações climáticas. O leite é uma mistura de glóbulos graxos, estabilizada por substâncias albuminóides, num soro que contém em solução a lactose, proteínas, sais minerais e orgânicos, lecitina, uréia, aminoácidos, ácido láctico, ácido acético, álcool, lactocromo, vitaminas e enzimas.
Conforme Fonseca e Santos (2000), a média da densidade do leite é de 1,032 g/mL. O teste da densidade pode ser útil na detecção de adição de água. O ponto crioscópico indica a temperatura de congelamento do leite, que é de - 0,531ºC, e é determinado pelos elementos solúveis. A adição de água causa a alteração no ponto ocorrendo aumento da temperatura necessária para atingir o congelamento.
O leite recém-ordenhado apresenta acidez natural variando o pH de 6,6 a 6,8. A acidez pode ser medida em pH ou pelo método de Dornic, que considera a massa de ácido lático, sendo a variação de 16 a 18 ºD. A presença de glóbulos de gordura e micelas de caseína faz com que a viscosidade do leite seja maior que da água (FONSECA; SANTOS, 2000).
A densidade do leite a 15°C é de aproximadamente 1.030 gramas por litro, ácido em estado natural, com pH aproximado a 6,57 (KIRCHOF, 1994). O único glicídeo livre é a lactose, o componente mais abundante, mais simples e o mais constante, podendo ser um fator limitante da produção do leite. A lactose é considerada o componente mais lábil diante da ação microbiana, sendo um bom substrato para as bactérias, que a transformam em ácido láctico (PEREDA, 2005).
2.4.1 Caminho do leite
Dentro das propriedades rurais, o leite é obtido através da ordenha e, imediatamente após, deve ser resfriado. O leite sai do úbere da vaca a temperatura muito favorável ao crescimento bacteriano, por isso é necessário resfria-lo rapidamente a 4°C e mantê-lo nessa temperatura até sua remoção. As baixas temperaturas inibem o crescimento de bactérias lácticas e coliformes, mais ainda ocorre a proliferação das bactérias psicrotróficas (PEREDA, 2005).
A temperatura de armazenamento recomendada é de no máximo 4ºC dentro de 2 horas após o término da ordenha. Durante a mistura de uma nova ordenha consecutiva, a temperatura deve permanecer menor que 10ºC e voltar à 4ºC após o término da ordenha (FONSECA; SANTOS, 2000).
Segundo as normas vigentes, o leite deve ser transportado por veículos adequados, diariamente ou em dias alternados. É imperativo que esse transporte seja executado em caminhões equipados com cisterna isotérmica. O leite é transportado aos centros de coleta ou diretamente para a indústria, onde é conservado novamente em silos isotérmicos para então ser processado e destinado ao consumo. Para obter-se qualidade do produto final que chega aos consumidores, é necessário que a matéria-prima seja de alta qualidade. Assim, uma vez que o leite cru seja de boa qualidade, é possível destiná-lo a industrialização de qualquer derivado (KIRCHOF, 1994).
Ao chegar à indústria o leite é resfriado a temperaturas de até 5ºC permanecendo armazenado até o processamento, não devendo permanecer armazenado mais que 48 horas (PEREDA, 2005). Nessa fase, é submetido a vários testes de qualidade, identificando-se parâmetros que determinem até mesmo o seu descarte (KIRCHOF, 1994).
O Ministério da Agricultura recomenda a realização da prova do álcool, que deve ser feita pelo transportador antes de fazer o carregamento do leite. Esse método estima a estabilidade das proteínas do leite durante o processamento térmico, pois o álcool atua como desidratante e simula as condições do aquecimento. O leite que não passa nesta prova certamente apresentará problemas de estabilidade durante o processamento na indústria (FONSECA; SANTOS, 2000).
O teste da densidade, chamado teste de crioscopia, é a prova realizada para verificar a quantidade de água no produto. Em caso de excesso o leite congela, sendo normal admitir-se percentual máximo de água de 87,5%. O teste do antibiótico, ou seja, resíduo alcalino misturado indevidamente no leite agindo como conservante, altera a qualidade do produto final, podendo causar danos aos consumidores (KIRCHOF, 1994).
2.4.2 Microbiologia do Leite
As bactérias que contaminam o leite podem ser classificadas de acordo com a faixa ótima de crescimento e multiplicação. As psicrófilas crescem melhor de 0 a 15ºC; as mesófilas entre 20 e 40ºC e as termófilas entre 44 e 55 ºC. Ainda temos as psicrotróficas que crescem a baixas temperaturas menos que 7 ºC e as termodúricas que resistem a pasteurização (FONSECA; SANTOS, 2000).
Conforme Cassoli (2005), o leite com alta contagem bacteriana pode acarretar na sua acidificação, coagulação, aumento de viscosidade, produção de gás alterando a cor, sabor e odor, diminuição da vida de prateleira e diminuição do rendimento. Nos anos noventa foi implantado o processo de coleta a granel e melhores condições de transporte e refrigeração, pois se pensou que teria diminuição de microrganismos. O processo minimizou as bactérias mesófilas que crescem na temperatura ambiente, porém aumenta o número de bactérias psicrotróficas que crescem em baixas temperaturas.
Segundo Cassoli (2005) há grande importância do conhecimento da carga microbiana e qualidade do leite produzido. Para tanto se tem testes qualitativos, como o teste da redutase fermentação e acidez, oferecem diagnóstico da qualidade, quanto aos quantitativos, a CBT, faz-se contagem bacteriana em placa (CBP) que é o método de referência para estimar o número de unidades formadoras de colônia (UFC) por mililitro de leite.
A qualidade microbiológica se destaca, pois pode ser um bom indicativo da saúde da glândula mamária do rebanho e das condições de higiene adotadas na fazenda (FONSECA; SANTOS, 2000).
Alguns microrganismos que contaminam o leite beneficiam o homem, pois causam mudanças físicas, químicas e organolépticas que ocorrem no leite ao preparar diversos produtos lácteos. Quando essa atividade não é controlada, há deterioração do produto, não sendo possível o consumo, ainda que podem estar presentes microrganismos patogênicos podendo causar diversas doenças em humanos (PEREDA, 2005).
O tipo de microbiota inicial, a taxa, a temperatura e o tempo de armazenamento são parâmetros que influem na proliferação das bactérias durante o armazenamento em estado cru, sendo possível fazer generalizações das mudanças na microbiota durante o transporte e o armazenamento (PEREDA, 2005).
Analisando os modelos matemáticos que se relacionam com microrganismos constata-se que, quando as bactérias estão em meio de cultura apropriado, sob condições ótimas para o crescimento, há grande proliferação em espaço de tempo reduzido. Nesse sentido, quando há disponibilidade de nutrientes e poucas substâncias tóxicas, o crescimento bacteriano é exponencial, uma vez que sofre divisão binária (PELCZAR, CHAN E KRIEG, 1997).
De acordo com Pelczar, Chan e Krieg (1997), o crescimento exponencial de uma cultura em um sistema fechado é um crescimento balanceado, pois após atingir a população máxima, os microrganismos começam a morrer. Considera-se que em sistemas fechados não há renovação de nutrientes, havendo a saturação do meio. No leite, essa saturação acontece somente quando esse é mantido em altas temperaturas, ou seja, a temperatura natural de ordenha (35 a 37°C). Essa temperatura é considerada ótima para proliferação bacteriana, aumentando consideravelmente a atividade metabólica dos microrganismos, o que gera maior consumo de nutrientes e consequentemente mais metabólicos tóxicos, ocasionando assim a saturação (PEREDA, 2005).
2.4.3 Fatores que influenciam na Qualidade Microbiológica do Leite
Para se ter um leite de qualidade, devem ser tomados alguns cuidados básicos de higiene e manejo nas etapas do processo, visto que de nada adianta a melhor tecnologia se forem negligenciadas medidas simples de manuseio de equipamentos ou sanidade animal (Figura 2) (KIRCHOF, 1994).
Figura 2- Fatores que contribuem para obtenção de leite higiênico.
Fonte: KIRCHOF, Breno. Exploração leiteira para produtores. Guaíba: Agropecuária, p.27, 1994.
A higiene da ordenha, a limpeza dos utensílios e o resfriamento do leite estão diretamente ligados à contagem bacteriana total (CBT). O excesso de bactérias no leite acarreta alterações do produto final, prejudicando seu aspecto nutricional, sabor, aroma, textura e prazo validade. As vias de contaminação que aumentam os valores da CBT são os tetos das vacas, utensílios, equipamentos de ordenha, mãos do ordenhador, a limpeza do tanque de refrigeração e a velocidade de resfriamento (MENDONÇA, 2009).
Segundo Behmer (1999), a ordenha deve ser efetuada em local próprio com piso de cimento paredes revestidas de azulejos ou material que propicie a fácil limpeza. Os estábulos devem ser amplos, arejados, e iluminados. Deve-se evitar maus-cheiros, pois o leite absorve os odores do ar. A limpeza não deve ocorrer em horários próximos à ordenha, pois provocam elevação da poeira, aumentando o risco de contaminações.
O produtor é quem tem maior controle sobre a atividade, e é ele quem vai determinar a qualidade do seu produto. O ordenhador é quem vai intermediar a ligação entre a vaca e a ordenhadeira. Para que a vaca produza leite de qualidade deve ser tratada com tranquilidade, receber rigoroso controle de sanidade, recebendo alimentação adequada e água à vontade. O ordenhador deve ser uma pessoa saudável que preze pela limpeza. Deve vestir roupas limpas, utilizar avental, não fumar e dar especial atenção às mãos e unhas. A vaca pode ser ordenhada até três vezes ao dia, com intervalos iguais entre ordenhas Para melhor manejo o correto é seguir sempre a mesma rotina, iniciando pela preparação da sala e seus equipamentos, onde tudo deve ficar ao alcance do ordenhador. Quando muito sujos os tetos podem ser lavados
água morna e enxugados com um papel toalha. Do contrário, pode-se utilizar toalhas úmidas, individuais e esterilizadas após o uso. Logo que concluída a ordenha, mergulham-se os tetos em solução desinfetante a base de iodo, gerando uma proteção química antes de liberar o animal. Essa manobra denomina-se pós-dipping (BEHMER, 1999).
Analisando as informações anteriores, pode-se resumir em seis as principais medidas de obtenção do leite de qualidade: a higiene do ambiente de permanência das vacas, a realização do pós-dipping, o tratamento imediato dos casos clínicos de mastite e acompanhamento dos casos subclínicos, a limpeza e manutenção dos equipamentos de ordenha, a terapia de vaca seca e a segregação e descarte das vacas cronicamente infectadas (MENDONÇA, 2009).
Segundo Behmer (1999), os primeiros jatos do leite devem ser sempre desprezados, pois estes estão retidos no canal galactófero, ficando em longo período em contato com o ambiente. Devem-se evitar retenções de leite no úbere, promovendo diariamente o esgotamento completo de todo o leite. A ordenha deve ser feita em lugar separado de onde se alimentam as vacas. Quando ocorre a parição o ordenhador deve identificar o animal e somente após 10 dias de nascimento do bezerro, a vaca retorna à ordenha com as demais, nesse período o leite (colostro) será descartado ou oferecido ao bezerro. Essa medida é preconizada, pois esse leite pós-parto contém excesso de caseína e albumina, sendo impróprio ao consumo humano.
Segundo Kirchof (1994), as principais fontes de contaminação são as fezes do animal, ar viciado, sujidades oriundas dos animais mal cuidados, ordenha feita sem a devida higiene, falta de higiene corporal dos ordenhadores e tratadores, ambiente impróprio, demora no transporte do leite, longa exposição do leite ao sol, elevando a temperatura. Sua pesquisa comparou ordenhas sem que fossem tomadas quaisquer medidas recomendadas (cuidados com a vaca, ordenhador e balde e sem desprezar os primeiros jatos) com ordenhas corretas (sob abrigo, após limpeza do úbere e mãos do ordenhador com água e sabão, desprezando os três primeiros jatos, com balde esterilizado). A diferença da quantidade de bactérias entre elas foi de 321.700 bactérias por mL. Abaixo no quadro 1, é possível visualizar os valores médios de bactérias dissipados na sala de ordenha.
Quadro 1- Valores médios de bactérias contidos em salas de ordenha
Existência no: Número médio de bactérias:
Ar da sala de ordenha 70 por L
Água potável 10 a 250 por mL
Água não-potável 6.000 a 250.000 por mL
Areia 225.000 por g
Pó 78.000.000 por g
Capim 2.000.000 a 200.000.000 por g
Fenos e palhas 7.000.000 a 10.000.000 por g
Esterco de vaca 40.000.000 por g
Leite recém-ordenhdo 300.000 por mL
Leite na recepção da indústria 500.000 a vários milhões por mL Fonte: KIRCHOF, Breno. Exploração leiteira para produtores. Guaíba: Agropecuária, p.29, 1994.
Conforme Kirchof (1994), o leite após ordenha deve ser filtrado para eliminar detritos que possam ter caído durante a ordenha, evitando que arrastem grande quantidade de microrganismos. O leite deve ser refrigerado o mais rápido possível, pois a temperatura que sai da vaca é a temperatura ótima para multiplicação de microrganismos, considerando sempre que essa medida apenas retarda o crescimento bacteriano.
O leite é resfriado na propriedade para conservá-lo durante o transporte até a indústria. Quando chega à indústria é filtrado e novamente resfriado (BEHMER, 1999). No quadro 2 pode-se observar a interação da temperatura com a carga de microrganismos inicial em três situações distintas.
Quadro 2- Efeito da temperatura na multiplicação dos microrganismos no leite em diferentes condições de higiene. Condições de produção Temperatura em °C
Contagem total de germes por mL
Fresco 24 horas 48 horas 72horas Vacas, meio ambiente e utensílios limpos 4,4 4.295 4.138 4.566 8.427 10,0 4.295 13.961 127.727 5.725.277 15,5 4.295 1.587.333 33.011.111 326500000 Vacas limpas, meio ambiente e utensílios sujos 4,4 39.082 88.028 121.864 186.245 10,0 39.082 177.437 831.615 1.761.458 15,5 39.082 4.461.111 99.120.000 633375000 Vacas, meio ambiente e utensílios sujos 4,4 136.533 281.546 538.775 749.030 10,0 136.533 1.170.546 13.662.115 25.687.541 15,5 136.533 24.673.571 639.884.615 2.047.083.330 Fonte: KIRCHOF, Breno. Exploração leiteira para produtores. Guaíba: Agropecuária, p.30, 1994.
Segundo Fonseca e Santos (2004) a taxa de multiplicação bacteriana está intimamente relacionada com a temperatura de armazenamento do leite. Recomenda-se não permitir que a temperatura após a mistura de ordenhas, ultrapasse 10°C, e, que essa, deve retornar para 4°C dentro de 1h após o término da ordenha. Esses autores estudaram a projeção de bactérias nas diferentes temperaturas e períodos de armazenamento, conforme demonstrado na tabela 1.
Tabela 1- Crescimento bacteriano, Contagem Bacteriana Total (CBT) frente às diferentes temperaturas e período de armazenamento.
Contagem bacteriana inicial Temperatura de armazenamento CBT 3h CBT 9h CBT 24h 9000 col/ml 4º 9.000 9.000 10.000 9000 col/ml 15º 10.000 46.000 5.000.000 9000 col/ml 25º 18.000 1.000.000 57.000.000 9000 col/ml 35º 30.000 35.000.000 800.000.000
Fonte: Fonseca e Santos, 2004.
A limpeza ou a sanitização inadequadas permite que uma grande quantidade de bactérias que se encontram no equipamento de ordenha contamine o leite. A remoção dos componentes orgânicos e minerais do leite que se encontram no equipamento e a sanitização antes da ordenha, elimina os microrganismos que sobreviveram e cresceram durante os intervalos das ordenhas. Os produtos para a limpeza adequada são soluções com detergentes
alcalinos clorados e detergentes ácidos, eliminando a grande maioria das bactérias (FONSECA; SANTOS, 2004).
Segundo Fonseca e Santos (2000), as etapas da limpeza do tanque de expansão e dos equipamentos de ordenha devem ser seguidas juntamente com o tempo adequado, temperatura das soluções e a concentração dos detergentes deve ser rigorosamente seguidas para a produção de leite de alta qualidade. Durante a pré-lavagem, há passagem de água morna de 35 a 45ºC, o detergente alcalino clorado contem 130 ppm de cloro e pH mínimo de 11 a temperatura de 50ºC, já o detergente ácido que é utilizado após o detergente alcalino, deve apresentar pH máximo de 3 e temperatura de 35 a 45ºC. O sanitizante utilizado antes da ordenha contém 25 ppm de Iodo ou 130 ppm de Cloro a temperatura de 35 a 45ºC, sem enxágue.
Conforme Kirchof (1994), o resfriamento é realizado por resfriadores de imersão e a granel. Para o resfriador de imersão são necessários taros ou latões, pois estes ficam imersos em água fria contida no tanque de resfriamento.
Os tanques a granel normalmente são encontrados com sistema de resfriamento a gás, que pode resfriar diretamente o leite, ou resfriar a água, que circula nas grossas paredes do tanque. Isso diminui a temperatura até chegar ao recomendado, ou seja, a temperatura programada pelo produtor. É muito importante que ocorra o igual resfriamento do leite, e para tanto, faz-se necessária a homogeneização. No tanque a granel é instalada uma pá que agita o leite, este agitador pode ser programado. Quando em taros o leite deve ser agitado manualmente por um homogeneizador especial (KIRCHOF, 1994).
O resfriamento em tanques de expansão é mais eficiente, pois apresenta grande superfície de contato com o leite e possui um agitador automático, que auxilia na rápida redução da temperatura. A utilização de resfriadores de imersão, nos quais os latões são imersos na água gelada, as trocas de calor são muito lentas e a agitação deve ser feita manualmente (FONSECA; SANTOS, 2004).
