Campinas 2016
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
Sandra Yamashiro
Remoção de Giardia e Cryptosporidium, ocorrência de
microsporídios e caracterização da microfauna de um sistema
Campinas 2016
Sandra Yamashiro
Remoção de Giardia e Cryptosporidium, ocorrência de microsporídios e
caracterização da microfauna de um sistema combinado de tratamento
de esgoto.
Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Doutora em Biologia Animal. Área de concentração Relações Antrópicas, Meio Ambiente e Parasitologia
ESTE ARQUIVO DIGITAL
CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA SANDRA YAMASHIRO E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. REGINA MAURA BUENO FRANCO.
Orientadora: Profa. Dra. Regina Maura Bueno Franco Co-orientadora: Dr. Isabel Cristina Vidal Siqueira de Castro
Campinas, 13 de dezembro de 2016.
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Regina Maura Bueno Franco (Orientadora)
Prof. Dr. Luiz Antônio Daniel
Profa. Dra. Maria Inês Zanoli Sato
Profa. Dra. Silmara Marques Allegretti
Profa. Dra. Luana Mattos de Oliveira Cruz
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
Agradecimentos
A Deus por me dar paciência, dedicação, perseverança e determinação durante o período difícil de coletas, realização das análises e escrita da tese de doutorado;
Aos meus pais Tadashi e Amélia, sempre preocupados com minha vida profissional, me apoiaram com mensagens de otimismo e esperança ao longo dos meus anos de estudo;
À minha irmã Miriam que sempre esteve no meu lado, com paciência e me aconselhando nos momentos difíceis;
Ao meu namorado Rodrigo, meu esposo, meu companheiro, amigo nos momentos alegres e difíceis, me ouvindo e ajudando com seus conselhos;
À minha sogra Elisabeth, sempre paciente e companheira para todas as horas; Aos meus amigos que colaboraram para o meu crescimento pessoal e profissional: Taís (pela amizade, incentivo e pela ajuda na quantificação de ciliados); Isabel (pela orientação, incentivo, amizade, auxílio na identificação e montagem das pranchas dos protozoários de vida livre); Meylin (pelo exemplo de superação, pela amizade); Carolina (pela amizade, compreensão e paciência na análise estatística); Diego (pela amizade e por ter tornado possível a publicação do artigo do meu mestrado), Guilherme e Jaqueline (pela amizade, ajuda nas coletas e no processamento das amostras).
À professora e orientadora Regina Maura Bueno Franco a quem eu respeito, pela enorme dedicação, paciência e por me ensinar a agir e me posicionar com dignidade, confiança e também não ter medo de encarar desafios.
Ao Mário, pela paciência na operação do sistema, pela dedicação para manter o sistema em funcionamento para que se tornasse possível as coletas e também ao Guilherme, no auxílio das análises das amostras e nas coletas; ao Maurício Durigan, pela ajuda nas análises filogenéticas; aos amigos de Juiz de Fora: Prof. Roberto, Franciane, Marcus, que me receberam de braços abertos no laboratório ajudando com seus conhecimentos e experiência; ao Prof. Dr. Arício Xavier Linhares pelo auxílio na análise estatística.
Aos professores membros da pré-banca Jaime Lopes da Mota Oliveira, Luciana Urbano dos Santos e Luiz Antônio Daniel pelas críticas e sugestões para o aperfeiçoamento e enriquecimento deste trabalho.
À CAPES, pela concessão de bolsa de estudo; à FAPESP (Processo n° 2011/21878-9) e ao Fundo de Apoio ao Ensino, à Pesquisa e Extensão/UNICAMP (Edital de Extensão/2013) pelo auxílio financeiro para realização deste trabalho.
Resumo
Os protozoários patogênicos Giardia spp. e Cryptosporidium spp. têm causado inúmeros surtos epidêmicos devido ao consumo de água contaminada com esgoto contendo cistos e oocistos. A microfauna presente no líquido intersticial do reator aeróbio é capaz de fornecer informações sobre o desempenho do sistema de tratamento e da qualidade do efluente tratado. No Brasil, há poucos estudos que avaliam a remoção desses parasitos pelos sistemas combinados de tratamento e caracterizam a microfauna presente no Biofiltro Aerado Submerso. Tendo em vista essa situação, foram avaliadas amostras de esgoto, efluentes, biofilme e lodo provenientes de um sistema compreendendo Filtro Anaeróbio seguido de Biofiltro Aerado Submerso que trata esgoto sanitário que recebe efluente hospitalar oriundo da área da saúde da Universidade Estadual de Campinas. Cistos e oocistos foram recuperados dessas amostras pelo método de centrífugo-concentração e filtração em membranas. A caracterização da microfauna do líquido intersticial de quatro pontos do BAS foi realizada pelos métodos quantitativos, morfológicos e molecular. Das 144 amostras analisadas de esgoto bruto e efluentes, 22,2% foram positivas para Giardia spp., enquanto que Cryptosporidium apresentou positividade de 6,2%. Nas amostras de diferentes pontos colhidos da biomassa imobilizada, o número total por litro de
Giardia spp. foi de 98.000 e somente um ponto apresentou positividade para Cryptosporidium spp. sendo registrados 30.000 oocistos/L. Já nas amostras de lodo,
foi encontrado um número médio de 7.800 cistos/L. Quanto à remoção de Giardia spp. pelo sistema, obteve-se valor médio de 92,9%. Os grupos genéticos de Giardia spp. detectados foram C e BIV oriundos do esgoto bruto e AII oriundo do efluente tratado. Não foi possível calcular o valor de remoção de Cryptosporidium pelo sistema. Nas amostras de líquido intersticial do BAS foram registrados um total de 20 espécies de protozoários ciliados, flagelados, amebas e micrometazoários. Dentre os protozoários ciliados foram encontradas 13 espécies: Metopus laminarius, Cyclidium glaucoma,
Tetrahymena pyriformis complexo, Paramecium aurelia, Aspidisca cicada, Acineria uncinata, Sterkiella tetracirrata, Trochilliopsis australis, Vorticella convalaria, Vorticella infusionum, Opercularia coarctata, Spathidium seppelti foissneri e Podophrya fixa. As
abundâncias de bacterívoros rastejantes, bacterívoros sésseis, carnívoros livre-natantes, carnívoros sésseis, amebas entre os pontos amostrados foram
significativamente diferentes. A maioria das espécies apresentou correlação com as variáveis envolvidas no processo de remoção de nitrogênio. Na análise filogenética,
S.tetracirrata obteve alinhamento 100% semelhante com a espécie descrita na Índia, S. seppelti foissneri agrupou-se com a espécie descrita originalmente com alto valor
de suporte de 91%, M. laminarius apresentou alto valor de suporte (100%) com a espécie descrita por Kahl (1927). Os ciliados Sterkiella tetracirrata e Vorticella spp. apresentaram potencial de predação sobre cistos de Giardia spp. O presente estudo ressalta a importância do tratamento de esgotos sanitários para a saúde pública, pois albergam uma grande diversidade de organismos patogênicos, reduzindo o impacto dos efluentes gerados no meio ambiente. Além disso, a microfauna se mostrou uma importante ferramenta de avaliação do desempenho do sistema de tratamento.
Palavras-chave: Giardia, Cryptosporidium, microfauna, ciliados, sistema combinado, esgoto
Abstract
The pathogenic protozoa Giardia spp. and Cryptosporidium spp. have caused various epidemic outbreaks due to consumption of contaminated water with sewage containing cysts and oocysts. The presence of microfauna in sewage is able to provide information about the performance of the treatment system and the quality of treated effluent. In Brazil, there are few studies about the evaluation of parasites removal by combined system of treatment and characterization of microfauna in Submerged Aerated Biofilter. In view of this, were analyzed sewage, effluents, biomass and sludge samples from Anaerobic Filter and Submerged Aerated Biofilter system that treats raw sewage that receives hospital effluent from health area at University of Campinas. Cysts and oocysts were recovered from these samples by centrifuge-concentration and membrane filter techniques. The characterization of microfauna from interstitial liquid of four different sites of SAB was performed by quantitative, morphological and molecular methods. Of the 144 analyzed samples of raw sewage and effluents, 22.2% were positive for Giardia spp., while Cryptosporidium was positive in 6.2%. In samples collected from different sites of immobilized biomass, the total number of Giardia cysts per liter was 98,000 and only one site was positive for Cryptosporidium spp. being recorded 30,000 oocysts / L. In the sludge samples cysts averaged 7,800 / L. In relation to removal of Giardia spp. by the system, a mean value of 92.9% was obtained. Genetic groups of Giardia spp. C and BIV were detected in raw sewage and AII from treated effluent. It was not possible to calculate the removal value of Cryptosporidium by the system. In interstitial liquid samples of SAB, a total of 20 species of ciliated protozoa, flagellates, amoebas and micrometazoa were recorded. Among the ciliated protozoa, 13 species were found: Metopus laminarius, Cyclidium glaucoma,
Tetrahymena pyriformis complex, Paramecium aurelia complex, Aspidisca cicada, Acineria uncinata, Sterkiella tetracirrata, Trochilliopsis australis, Vorticella convalaria, Vorticella infusionum, Opercularia coarctata, Spathidium seppelti foissneri e Podophrya fixa. The abundances of crawling bacterivorous, sessile bacterivorous, free
swimming carnivorous, sessile carnivorous and amoebas among the sampled sites were significantly different. Most species correlated with the variables involved in nitrogen removal process. In phylogenetic analysis, S. tetracirrata matched 100% of similarity to specie described in India, S. seppelti foissneri grouped with the specie originally described with high support value of 91% and M. laminarius showed high
support (100%) with the specie described previously. The ciliates Sterkiella and
Vorticella spp. showed potential predation on Giardia spp and Cryptosporidium spp.,
respectively. This study highlights the importance of sewage treatment for public health, as harbor a great variety of pathogenic organisms reducing the impact of effluents generated into the environment. Moreover, microfauna showed an important assessment tool of performance of the treatment system.
Key-words: Giardia spp., Cryptosporidium spp., microfauna, ciliates, combined system, sewage.
SUMÁRIO
1. Introdução ... 13
2. Revisão de literatura ... 17
2.1. Estudo da caracterização molecular de Giardia spp. e Cryptosporidium spp. ... 31
2.2. Giardia spp. Cryptosporidim spp. e microsporídios em amostras de esgoto, efluentes e valores de remoção dos parasitos pelos sistemas de tratamento de esgoto. ... 35
2.3. Sistemas combinados de tratamento de esgoto e sua microfauna ... 38
3. Objetivos ... 47
3.1. Objetivo geral ... 47
3.2. Objetivos específicos ... 47
4. Material e Métodos ... 48
4.1. Local de estudo ... 48
4.2. Controle Operacional do Sistema ... 49
4.3. Colheita das amostras ... 51
4.3.1. Amostras de esgoto bruto e efluentes para pesquisa de Giardia spp. e Cryptosporidium spp. ... 51
4.3.2. Amostras de líquido intersticial do Biofiltro Aerado submerso para análise da microfauna. ... 51
4.3.3. Amostras para análises das variáveis físicas e químicas. ... 52
4.4. Pesquisa de Giardia spp. e Cryptosporidium spp. em amostras de esgoto, efluente, lodo e biofilme. ... 52
4.5. Estudo da remoção de cistos de Giardia spp. e oocistos de Cryptosporidium spp. pelo sistema combinado de tratamento de esgoto. ... 54
4.6. Microscopia eletrônica de varredura em amostras de biomassa imobilizada para pesquisa de cistos de Giardia spp. e formas de desenvolvimento de Cryptosporidium spp. 55 4.7. Extração do DNA genômico e caracterização molecular a partir das amostras positivas para Giardia spp. e Cryptosporidium spp. ... 55
4.7.1. Caracterização molecular de Giardia spp. baseada nos grupos genéticos através do fragmento de 530pb do gene triose fosfato isomerase (tpi), 511 pb do gene beta-giardina (bg) e 292 pb do gene 16S. ... 56
4.7.2. Estudo do posicionamento filogenético de Giardia spp. ... 57
4.7.3. Caracterização molecular de Cryptosporidium spp. baseada no gene 18S rRNA. .. 58
4.8. Quantificação e caracterização morfológica da microfauna proveniente das amostras de esgoto do Biofiltro Aerado Submerso. ... 59
4.8.2. Técnicas de identificação de protozoários ciliados: Protargol, Flutax e Microscopia
Eletrônica de Varredura. ... 60
4.8.3. Montagem das pranchas da microfauna, tabelas biométricas e descrição dos espécimes de protozoários ciliados de vida-livre. ... 61
4.9. Caracterização molecular dos protozoários ciliados Sterkiella tetracirrata, Metopus laminarius e Spathidium seppelti foissneri. ... 61
4.10. Teste do potencial de predação em condições experimentais de cistos de Giardia spp. e oocistos de Cryptosporidium spp. pelos protozoários ciliados. ... 65
4.11. Avaliação das variáveis físicas e químicas das amostras de esgoto bruto e dos efluentes de cada sistema de tratamento de esgoto. ... 66
4.12. Análise Estatística ... 67
5.0. Resultados ... 67
Capítulo 1: Remoção de protozoários patogênicos pelo sistema combinado de tratamento Filtro Anaeróbio seguido de Biofiltro Aerado Submerso: Caracterização de cistos de Giardia spp. e oocistos de Cryptosporidium em amostras de esgoto, biofilme e lodo. ... 69
Capítulo 2: Caracterização da microfauna do Biofiltro Aerado Submerso de um sistema combinado de tratamento de esgoto. ... 108
Capítulo 3: Caracterização morfológica e molecular de Sterkiella tetracirrata (Kumar et al., 2015), Spathidium seppelti foissneri (Vd’aĉný et al., 2006) e Metopus laminarius (Kahl, 1927) provenientes de um sistema combinado de tratamento de esgoto no Brasil. ... 156
Capítulo 4: Primeiro relato de predação de cistos de Giardia spp. e predação de oocistos de Cryptosporidium spp. pelos protozoários ciliados Sterkiella e Vorticella spp. oriundos do sistema combinado de tratamento de esgoto. ... 178
Capítulo 5: Detecção de Enterocytozoon bieneusi pelos métodos moleculares em amostras de esgoto bruto e efluente tratado de um sistema combinado de tratamento de esgoto no Brasil ... 186
6.0. Considerações finais ... 203
7.0. Referências bibliográficas ... 204
1. Introdução
As atividades antropogênicas e os eventos climáticos têm prejudicado a situação da disponibilidade hídrica no mundo (UN-Water, 2010). Atualmente, mais de 1 bilhão de pessoas vivem em regiões com escassez de água, sendo que em 2025, aproximadamente 3,5 bilhões de pessoas poderão sofrer com falta de água (WATER RESOURCES INSTITUTE, 2016).
No Brasil, a realidade da escassez hídrica já ocorre principalmente na região Sudeste. Por outro lado, há regiões com grande abundância de recursos hídricos, como a região Amazônica que concentra cerca de 80% da disponibilidade hídrica do país, menor contingente populacional e valores reduzidos de demanda de água (ANA, 2015).
Em nível mundial, o crescimento populacional e a industrialização acarretaram a degradação de vários ecossistemas aquáticos como oceanos e rios, devido ao despejo inadequado de esgoto industrial e doméstico não tratado (CHAN et al., 2009). Aliado a este cenário, os períodos intensos de seca que além de limitar o consumo, podem provocar um aumento da concentração de poluentes devido à diminuição do fluxo da água, reduzindo o fator de diluição dos mesmos gerando riscos à saúde (PETROVIC et al., 2011).
Cerca de 70% dos países em desenvolvimento lançam efluente industrial não tratado nos mananciais (UN-Water, 2014a) e aproximadamente dois milhões de toneladas de esgoto não tratados são dispostos nos ambientes aquáticos ao redor do mundo, por dia. A disposição de esgoto doméstico não tratado adequadamente é uma das maiores fontes de contaminação de patógenos em mananciais (OTTOSON et al., 2006).
O esgoto de origem hospitalar apresenta efluente contendo substâncias perigosas como os resíduos farmacêuticos e químicos, patógenos e radioisótopos (CARRARO et al., 2016), representando um risco à saúde pública e ambiental quando não disposto e tratado adequadamente. Carraro et al., (2016) relataram que poucos países possuem padrões de qualidade para tratamento de esgoto hospitalar, considerando-o como sendo doméstico, despejando na rede coletora sem qualquer tipo de pré-tratamento.
No Brasil, a Resolução CONAMA no 358/2005 que dispõe sobre o tratamento
e a disposição final dos resíduos dos serviços de saúde, considera que soluções consorciadas, para fins de tratamento e disposição final de resíduos de serviços de saúde, são especialmente indicadas para pequenos geradores e municípios de pequeno porte. O artigo 11 desta resolução determina que os efluentes líquidos provenientes dos estabelecimentos prestadores de serviços de saúde, para serem lançados na rede pública de esgoto ou em corpo receptor, devem atender às diretrizes estabelecidas pelos órgãos ambientais, gestores de recursos hídricos e de saneamento competentes.
O esgoto hospitalar pode ser enquadrado no grupo A1, pois são resíduos resultantes da atenção à saúde de indivíduos ou animais, com suspeita ou certeza de contaminação biológica por agentes pertencentes à classe de risco 4, “microrganismos com relevância epidemiológica e risco de disseminação ou causador de doença emergente que se torne epidemiologicamente importante ou cujo mecanismo de transmissão seja desconhecido” (BRASIL, 2005a).
As doenças de veiculação hídrica causadas por rotavírus, Vibrio cholerae,
Shigella sp., Escherichia coli O157:H7, Campylobacter sp., Giardia sp., Cryptosporidium sp., e os microsporídios tem apresentado grande relevância em
saúde pública (WHO, 2005; FLETCHER et al., 2012).
Entre os surtos de veiculação hídrica registrados ao redor do mundo no período de 1984 a 2004, 325 destes foram causados por protozoários (KARANIS et al., 2007), sendo Giardia sp., responsável por 40,6% dos surtos e Cryptosporidium sp. por 50,8%. No período de 2004 a 2010, 199 surtos de veiculação hídrica foram registrados, sendo 120 deles foram causados por Cryptosporidium sp. e 70 por Giardia spp. e 9 por outros protozoários (BALDURSSON e KARANIS, 2011). Franco et al., (2012) ressaltaram que, em nível mundial, os protozoários foram a causa de 524 surtos epidêmicos de veiculação hídrica nos últimos 28 anos.
Os protozoários patogênicos Giardia spp. e Cryptosporidium spp. têm causado inúmeros surtos de diarreia devido a ingestão de água de consumo contaminada com cistos e oocistos (BALDURSSON e KARANIS, 2011). Essas formas infectantes exibem acentuada resistência a várias condições ambientais (temperatura, umidade, pH) e à cloração (FAYER et al., 2004), o que contribui para a disseminação desses
protozoários entre os animais, sua dispersão no ambiente, favorecendo a contaminação dos alimentos (GIANGASPERO et al., 2009).
O Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (NIAID) consideraram
Giardia e Cryptosporidium como causadores de doenças infecciosas emergentes,
definidas como doenças que apareceram recentemente na população ou que já tenham existido. Assim foram incluídos como patógenos prioritários de categoria B que se caracterizam como agentes com moderada disseminação no ambiente, resultando em moderadas taxas de morbidade e baixas taxas de mortalidade e que requerem melhora no diagnóstico e na vigilância (NIAID, 2016).
Em relação aos microsporídios, esses organismos são patógenos intracelulares obrigatórios podendo afetar uma ampla gama de hospedeiros incluindo vertebrados e invertebrados (SZUMOWSKI e TROEMEL, 2015). Szumowski e Troemel (2015) relataram que existem aproximadamente 1400 espécies de microsporídios. As espécies Enterocytozoon bieneusi e Encephalitozoon intestinalis são os microsporídios mais comuns que causam infecção gastrointestinal em HUmanos ao redor do mundo, especialmente em indivíduos imunocomprometidos (FAYER e SANTIN, 2014), sendo que a transmissão desses agentes patogênicos ocorre por meio da rota fecal-oral, inalação de aerossóis e ingestão de alimentos e água contaminados.
É importante ressaltar que os microsporídios foram enquadrados na Lista de Contaminantes Prioritários (Contaminant Candidate List-2) pela Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (EPA, 2005) devido à possibilidade de ocorrerem no sistema de abastecimento de água e por não haver estratégias de controle e prevenção estabelecidas. A complexidade das técnicas de recuperação e identificação de esporos a partir das amostras ambientais, também é um dos fatores que enquadram os microsporídios nessa lista.
Diante da realidade da poluição hídrica e da escassez de água, a eficiência do tratamento de esgoto é cada vez mais requerida tanto em países em desenvolvimento como desenvolvidos (CHAN et al., 2009). Existem várias tecnologias de tratamento de esgoto, sendo os sistemas biológicos os mais adotados tanto para o tratamento de esgoto doméstico quanto o industrial (CHAN et al., 2009). Assim, os processos aeróbios e anaeróbios envolvem os microrganismos na conversão da matéria orgânica, sendo que no primeiro, utiliza-se o oxigênio dissolvido na transformação de
compostos orgânicos em gás carbônico (CO2) e água, e no segundo, com ausência
do oxigênio, a digestão ocorre pelos processos de hidrólise, acidogênese, acetogênese e metanogênese resultando em CO2 e metano (CHAN et al., 2009). Na
atualidade, há uma tendência de usar sistemas combinando-se diferentes processos de tratamento o que acarreta maior eficiência na remoção de patógenos (CHAN et al., 2009).
Nos sistemas biológicos aeróbios, uma variedade de organismos está presente, dentre eles, destacam-se bactérias, protozoários de vida livre (flagelados, ciliados e amebas), fungos e micrometazoários (CHEN et al., 2004; MADONI, 2011; CANALS et al., 2013).
A atividade trófica desses organismos caracteriza-se pela remoção de matéria orgânica dissolvida e dos organismos patogênicos, contribuindo para a clarificação dos esgotos (PÉREZ-UZ et al., 2010).
Em especial, os protozoários ciliados são organismos extremamente sensíveis às alterações do processo de tratamento, alternando-se no sistema em resposta às mudanças nas condições físico-químicas e ambientais do efluente (CANALS et al., 2013, HU et al., 2013). Logo, a avaliação da ciliatofauna é capaz de fornecer informações sobre o desempenho do sistema de tratamento de esgoto e também da qualidade do esgoto (LEE et al., 2004; SIGNORILE et al., 2010; DUBBER e GRAY, 2011a; MADONI, 2011).
Poucos são os estudos acerca da pesquisa de Giardia spp. e Cryptosporidium spp., assim como a caracterização da microfauna presente em esgoto sanitário que recebe efluente hospitalar. Considerando que hospitais produzem um grande volume de efluente líquido e que um hospital com 1000 leitos exerce um efeito de poluição comparável a uma cidade com uma população de 10.000 habitantes produzindo um grande volume de efluente líquido (VERLICCHI et al., 2010), é importante investigar a carga parasitológica desse tipo de esgoto para avaliar o impacto sanitário sobre o corpo hídrico receptor.
É importante ressaltar que sistemas de tratamento biológico de esgoto albergam uma grande diversidade de organismos patogênicos e de vida livre, sendo que no Brasil há poucas pesquisas sobre a eficiência de remoção de Giardia spp. e
como há poucos estudos sobre a detecção de microsporídios em amostras de esgoto, principalmente dados moleculares.
Dessa forma, as ferramentas moleculares associadas às técnicas convencionais de recuperação desses organismos em amostras de esgoto irão auxiliar na identificação dos principais genótipos e fontes de contaminação.
Além disso, o monitoramento da qualidade do esgoto pelos sistemas de tratamento é realizado somente pela análise das variáveis físicas e químicas do efluente não sendo utilizadas ferramentas alternativas para avaliação. Assim, a caracterização da microfauna, em especial a ciliatofauna, deve ser considerada como um importante parâmetro na avaliação do desempenho de sistemas de tratamento de esgoto (STOTT et al.,2003; MIHAYLOVA et al., 2014) e aliada aos dados moleculares, contribuirá para o conhecimento da diversidade dos protozoários ciliados nos efluentes, a qual é pouco conhecida em relação aos ambientes aquáticos e terrestres (NTOUGIAS et al., 2011).
2. Revisão de literatura
A Organização Mundial da Saúde (2015) definiu o termo “health-care waste” como a inclusão de todo resíduo gerado pelas atividades de saúde como centros de pesquisa e laboratórios, além daquelas atividades realizadas nos domicílios como diálise, administração de insulina, dentre outros. A maioria dos resíduos (85%) produzidos pelos prestadores de saúde pode ser classificada como não perigosa ou resíduo geral de saúde, pois provêm da administração, cozinha e atividades de manutenção da limpeza. O restante (15%) se caracteriza pelos resíduos de saúde que podem oferecer riscos à saúde e ao meio ambiente. Esses resíduos de saúde podem ser: materiais cortantes, líquidos biológicos contaminados com patógenos, fezes, tecidos de órgãos, fármacos, substâncias químicas, radioativas e solventes.
Dentre os resíduos de saúde mencionados, pode ser incluído o efluente hospitalar. O esgoto hospitalar tem sido muito estudado devido à presença de substâncias perigosas e principalmente de patógenos (BRASIL, 2005, CARRARO et al., 2016; VERLICCHI et al., 2015), como as bactérias, vírus e parasitos (CARRARO et al., 2016). Entretanto, há poucos dados sobre a concentração desses patógenos em esgoto hospitalar, pois inúmeros estudos enfatizam as pesquisas sobre a
resistência das bactérias e a detecção de parasitos em efluentes de sistemas de tratamento de esgoto e água (CARRARO et al.,2016).
Em relação ao esgoto doméstico, Kamizoulis (2008) relatou uma variação de 101/L a 1010 organismos/L (bactérias, helmintos, protozoários e vírus) tendo como
maiores concentrações: coliformes termotolerantes (108/L a 1010/L), Vibrio cholerae
(102/L a 105/L), Ascaris lumbricoides (10/L a 103/L), Ancylostoma/Necator (10/L a
103/L), Cryptosporidium sp. (101/L 104/L), Giardia duodenalis (102/L a 105/L) e vírus
entéricos (105/L a106/L). Para Kamizoulis (2008), a ocorrência de surtos epidêmicos
resulta do aumento das concentrações dos patógenos no esgoto, evidenciando a importância da pesquisa de patógenos nesse tipo de amostra.
O artigo 11° da Resolução CONAMA no358/2005 dispõe que efluentes líquidos
provenientes dos estabelecimentos prestadores de serviços de saúde, para serem lançados na rede pública de esgoto ou em corpo receptor, devem atender às diretrizes estabelecidas pelos órgãos ambientais, gestores de recursos hídricos e de saneamento competentes. A Resolução CONAMA no 430/2011 que dispõe sobre as
condições e padrões de lançamento de efluentes prevê que efluentes oriundos de serviços de saúde devem atender aos padrões estabelecidos exigidos pela resolução para que seja possível o lançamento em rede coletora conectada à estação de tratamento de esgoto; e para serem lançados diretamente no corpo receptor, deve haver um tratamento especial.
Entretanto, há poucos países que possuem legislação específica quanto aos parâmetros de lançamento de esgoto hospitalar, já que, em geral, o mesmo é lançado na rede coletora sem qualquer pré-tratamento (CARRARO et al., 2016). Em relação ao esgoto doméstico, no Brasil, somente 40% do volume coletado é tratado (TRATA BRASIL, 2016) e na região de Campinas, o tratamento de esgoto é de 95% (SANASA, 2016).
É importante salientar que a disposição inadequada de resíduos sólidos e lançamento de efluentes sem tratamento adequado nos cursos d’água favorece a disseminação de patógenos. A contaminação dos mananciais de água pode inviabilizar ou encarecer o sistema de abastecimento de água (PHILIPPI JR, 2005).
A diarréia é o principal sintoma gastrointestinal decorrente da ingestão de água contaminada contendo patógenos como Vibrio cholerae, Shigella sp, Escherichia coli
O157:H7 Campylobacter sp, Giardia spp. Cryptosporidium spp. e os microsporídios (WHO, 2005, 2009; FLETCHER et al., 2012).
Em 2010, nos países em desenvolvimento, houve aproximadamente 2 bilhões de casos de diarreia (sendo que 36 milhões evoluíram para casos severos) cuja proporção de mortes em crianças nos primeiros dois anos de vida foi de 72% (WALKER et al., 2013). Fletcher et al., 2012 relataram que várias espécies de protozoários estão associadas com gastroenterite em humanos, principalmente em pacientes imunocomprometidos. Entamoeba histolytica Cryptosporidium spp. e
Giardia duodenalis já foram relatados em pacientes de regiões em desenvolvimento
como Ásia e Africa, enquanto que nos países desenvolvidos, Blastocystis spp. e
Dientamoeba fragilis (FLETCHER et al., 2012).
Quanto ao gênero Giardia, sete espécies são aceitas pelos pesquisadores conforme a morfologia do trofozoíto e/ou cisto e métodos moleculares (HILLMAN, et al., 2016; RYAN e CACCIÒ, 2013): Giardia agilis (anfíbios), Giardia ardeae e Giardia
psittaci (pássaros), Giardia microti e Giardia muris (roedores), sendo que Giardia duodenalis infecta mamíferos. Hillman et al. (2016) descreveram uma nova espécie
na Austrália, Giardia peramelis, isolada a partir de amostras de fezes de Isoodun
obesulus (marsupial) utilizando métodos moleculares e morfológicos.
Giardia duodenalis pertence ao Filo Metamonada, Classe Diplomonadida e
Familia Giardiinae (ADL et al., 2012), podendo ser encontrada tanto em humanos como animais, incluindo animais de estimação e de criação (FENG e XIAO, 2011). Pode ser ainda considerada como um complexo de espécies que não variam morfologicamente, porém são divididos em oito grupos genéticos distintos (A-H) conforme polimorfismo protéico e do DNA (Tabela 1).
Tabela 1. Grupos genéticos de G. duodenalis e principais hospedeiros. Grupos genéticos Hospedeiros
A Humanos e outros primatas, animais de criação, cachorros, gatos e outras espécies de mamíferos silvestres.
B Humanos e outros primatas, cachorros, gatos e outras espécies de mamíferos silvestres.
C Cachorros e outros canídeos D Cachorros e outros canídeos E Bovinos e ungulados
F Gatos
G Ratos
H Mamíferos aquáticos
Fonte: Adaptado de Ryan e Càccio (2013).
Ainda dentro dos grupos genéticos A e B, existe uma subestrutura genética que os diferencia com base nas sequencias de loci múltiplos, dividindo-os nos subgrupos AI, AII, AIII, BIII e BIV (MINETTI et al., 2015). O subgrupo AI foi encontrado em animais de criação e de companhia e o subgrupo AII, principalmente em humanos. Já para AIII, o mesmo foi primeiramente identificado em animais ungulados, sendo mais restrito aos animais. Os subgrupos BIII e BIV têm sido observados em bovinos, cavalos, macacos, cachorros e humanos (DURIGAN et al., 2014).
A giardiose é causada por G. duodenalis atingindo os humanos sendo transmitida pela rota fecal oral, mediante contato humano-humano (antroponótica), animal-humano (zoonótica) ou por meio de ingestão de água e alimentos contaminados com cistos (CAMA e MATHISON, 2015; RYAN e CACCIÒ, 2013). O ciclo de vida de Giardia compreende duas fases evolutivas: o trofozoíto (forma vegetativa) e o cisto (forma infectante) (ANKARKLEV et al., 2010).
O trofozoíto de Giardia possui formato de pêra medindo de 12 µm -15µm de comprimento x 5 µm -9 µm de largura. A parte ventral contém o disco ventral ou disco adesivo, dois núcleos, corpos medianos e quatro pares de flagelos (anterior, posterior, caudal e ventral) (MONIS et al., 2009). Quanto ao cisto, este possui forma oval medindo de 8 µm - 12 µm de comprimento e 7 µm - 10 µm de largura. A parede é composta principalmente por N-acetilgalactosamina e três diferentes proteínas de parede (CWP1, CWP2 e CWP3) sendo essas últimas constituídas por leucinas e cisteínas. A alta insolubilidade do cisto é devido à forte interação entre as cadeias de carboidratos e às interações de acúcares e proteínas presentes na parede. A
espessura da parede mais externa do cisto é de 0,3 µm – 0,5 µm, apresentando uma rede de finas fibrilas com 7 nm - 20 nm de diâmetro, sendo que a parede mais interna contém duas membranas (interna e externa). No citoplasma do cisto, constam 4 núcleos, axonema e corpos em crescente (ANKARKLEV et al., 2010).
Após a ingestão do cisto, a parede do mesmo se rompe pela ação do suco gástrico liberando o trofozoíto na região anterior do intestino delgado, iniciando a colonização no epitélio intestinal por meio da adesão pelo disco ventral (Figura 1). Por fissão binária, os trofozoítos multiplicam-se na luz do intestino e sob ação dos sais biliares, se encistam sendo imediatamente liberados junto com as fezes, podendo infectar outros hospedeiros (Figura 1) (GEURDEN e OLSON, 2011; RYAN e CACCIÒ, 2013; ANKARKLEV et al., 2010).
Entre os indivíduos infectados, as manifestações clínicas podem ser agudas ou crônicas enquanto outros não apresentam sintomatologia (COTTON et al., 2011). Os principais sinais clínicos da giardiose, quando presentes são: náuseas, perda de peso, desidratação, inchaço, dor abdominal e diarreia (COTTON et al., 2011). A infecção é geralmente auto-limitante em indivíduos imunocompetentes, entretanto, diarreia crônica pode ocorrer em crianças e em indíviduos imunocomprometidos e quando a giardiose é prolongada, pode estar associada ao mau desenvolvimento cognitivo na infância (CAMA e MATHISON, 2015). É muito comum a infecção em crianças que frequentam creches, podendo essas transmitir a infecção para familiares e cuidadores (OLIVEIRA-ARBEX et al., 2016).
A patofisiologia da giardiose caracteriza-se por mecanismos multifatoriais que envolvem aspectos do parasito e do sistema imunológico do indivíduo (GEURDEN e OLSON, 2011). A adesão dos trofozoítos pelo disco adesivo na superfície das células intestinais é mediada por moléculas do parasito (alfa, beta, delta e gama giardinas) e por proteínas contráteis (COTTON et al., 2011).
Figura 1. Representação esquemática do ciclo de vida de Giardia duodenalis.
Fonte: Adaptado de Ankarklev et al., (2010).
Após o contato do parasito no intestino, as substâncias citopáticas produzidas pelos trofozoítos provocam apoptose dos enterócitos e a reorganização do citoesqueleto do epitélio intestinal, que por sua vez, aumentam a permeabilidade da superfície intestinal (GEURDEN e OLSON, 2011). Tal mudança na permeabilidade leva ao aumento do número de linfócitos intraepiteliais que consequentemente ativa os linfócitos T. A ativação dos linfócitos T e as substâncias citopáticas dos trofozoítos iniciam o encurtamento dos microvilos da bordadura em escova afetando a atividade das enzimas como as lípases, proteases, dissacaridases, lactase, maltase e sucrase. Outra alteração intestinal provocada pelo aumento dos linfócitos intraepiteliais e o encurtamento dos microvilos é a má absorção de água, eletrólitos e nutrientes (GEURDEN e OLSON, 2011) que aliada ao aumento da contratilidade intestinal (devido ao menor tempo e permanência do alimento) provoca a diarreia. Além disso, a dor abdominal ocorre devido ao aumento da contratilidade do intestino (GEURDEN e OLSON, 2011).
Globalmente, 280 milhões de pessoas são infectadas por Giardia e nos Estados Unidos aproximadamente 1,2 milhões de novos casos são registrados anualmente
(YODER et al., 2012; ANKARKLEV et al., 2012). A prevalência de giardiose em humanos é variável de 0,4% a 7,5% nos países desenvolvidos e nos países em desenvolvimento é de 8% a 30% (FENG e XIAO, 2011). No Brasil, na região do Amazonas, a prevalência de Giardia duodenalis em crianças de 2 a 5 anos foi de 22,2% (35/188)(CORONATO NUNES et al., 2016) e em Botucatu (estado de São Paulo), foi registrada uma prevalência de 21,9% (27/123) de Giardia duodenalis em crianças de uma creche (OLIVEIRA-ARBEX et al., 2016). Entretanto, é importante ressaltar que 37% da população mundial (2,5 bilhões de pessoas) não possui acesso às condições sanitárias adequadas (tratamento de água e esgoto) sendo que estimativas sugerem a melhora do saneamento básico poderia salvar 1,5 milhões de crianças por ano (UN-Water, 2014b).
Outro protozoário causador de diarreia é Cryptosporidium spp., parasito pertencente ao Filo Apicomplexa, Classe Gregarinomorphea e Subclasse Cryptogregaria (RYAN et al., 2016; CAVALIER-SMITH, 2014). Anteriormente,
Cryptosporidium era considerando pertencente a ordem Eucoccidiorida (juntamente
com Eimeria, Toxoplasma, Sarcocystis, Cyclospora e Isospora); entretanto, estudos moleculares e de ultraestrutura do parasito demostraram maior proximidade com as gregarinas que com os coccídios (RYAN et al., 2016; ALDEYARBI e KARANIS, 2016; RYAN e HIJAWI, 2015; CARRENO et al., 1999).
Outras características peculiares de Cryptosporidium já o diferenciavam de outros coccídios, como: desenvolvimento do protozoário na superfície apical da célula intestinal (intracelular, mas extra citoplasmático); presença de organela alimentar para adesão no hospedeiro; produção de outros dois tipos de oocistos - com parede espessa e com parede fina, respectivamente - sendo esse último responsável pela autoinfecção do hospedeiro; tamanho diminuto de oocistos (5 µm x 4,5 µm), não apresentando estruturas como micrópila, esporocistos e grânulos polares (PETRY, 2004; RYAN E HIJAWI, 2015).
Tendo em vista a mudança de classificação para Gregarinomorphea, é necessária a reconsideração do comportamento e ciclo de vida do parasito (CLODE et al., 2015).
Apesar do ciclo evolutivo ocorrer extra-citoplasmaticamente no hospedeiro, inúmeros estudos têm evidenciado a capacidade do parasito se desenvolver no meio extracelular, principalmente em culturas desprovidas de células in vitro e também em
biofilmes aquáticos (Figura 2) (EDWARDS et al., 2012; KOH et al., 2014; CLODE et al., 2015).
Koh et al (2014) identificaram vários estádios de desenvolvimento (trofozoítos, merontes e merozoítos) de Cryptosporidium em biofilmes aquáticos, utilizando microscopia confocal de varredura a laser, microscopia eletrônica de varredura e citometria de fluxo, concluindo que esses biofilmes podem servir como reservatórios ambientais para oocistos, como também fornecer condições para o desenvolvimento do ciclo do parasito (Figura 2). Os autores verificaram ainda que oocistos de
Cryptosporidium iniciaram a excistação liberando esporozoítos que depois se
transformam em trofozoítos. Os trofozoítos podem permanecer como células únicas ou associarem pelas suas extremidades ou laterais com outros trofozoítos cujo processo é chamado de sizígia, sendo que nesse momento, os trofozoítos podem se transformar em merontes ou gamontes-like (Figura 2). Esses trofozoítos desenvolvem um vacúolo (vacúolo parasitóforo na célula hospedeira) e subsequentemente iniciam a merogonia produzindo merontes tipo I. Os merontes tipo I contem inúmeros merozoítos tipo I que se transformam em merontes tipo II cujos merozoítos tipos II podem dar origem aos micros e macrogamontes. Os microgamontes sofrem fissão binaria dando origem aos microgametas que podem fecundar o macrogamonte produzindo os oocistos (KOH et al., 2014).
Os estádios “gamonte-like” e “gamonte-like gigante” foram observados unicamente no biofilme aquático, e provavelmente, surgiram do trofozoíto com a finalidade de produzir mais merozoítos e trofozoítos maximizando o potencial de reprodução do parasito, sem a necessidade de reprodução sexuada. Entretanto, a origem desses gamontes permanece desconhecida (CLODE et al., 2015).
Figura 2. Diagrama esquemático do ciclo de vida de Cryptosporidium no meio livre de célula (meio ambiente) ou sem encapsulação na célula no hospedeiro.
Fonte: Adaptado de CLODE et al., (2015).
No ciclo de vida envolvendo o hospedeiro, Clode et al., (2015) sugere um novo termo para a organela alimentar, o epimerito (Figura 3). Na célula hospedeira, os trofozoítos são circundados por uma membrana plasmática, dando início à formação de um vacúolo parasitóforo o qual funde-se posteriormente com a membrana plasmática. A membrana desse vacúolo se dobra formando o epimerito. Essa estrutura é semelhante a um botão, sendo constituído por uma região eletron-densa no ponto de adesão na célula e dobras laterais radiais, obtendo nutrientes e energia do hospedeiro. Koh et al., (2014) também observaram o epimerito em estádios “gamontes-like” no biofilme aquático.
Figura 3. Representação esquemática da formação do epimerito de Cryptosporidium em meio extracelular e epicelular.
Fonte: Adaptado de Clode et al., (2015).
O gênero Cryptosporidium compreende 29 espécies consideradas válidas tendo como principais hospedeiros aves, mamíferos, répteis, anfíbios e peixes, demonstrando potencial zoonótico do parasito (Tabela 2) (ZAHEDI et al., 2016; KVÁČ et al., 2016; LI et al., 2015; RYAN e HIJAWI, 2015). Dessas espécies, 16 e alguns genótipos já foram relatados em humanos: C. muris, C.parvum, C.felis, C.andersoni,
C. canis, C. hominis, C. suis, C. bovis, C. fayeri, C. ubiquitum, C. cuniculus, C. tyzzeri, C. viatorum, C. scrofarum, C. erinacei e C. meleagridis. Dentre essas, as espécies
mais relatadas em humanos são C. parvum e C. hominis (RYAN e HIJAWI, 2015; RYAN et al., 2014).
Ryan e Hijjawi (2015) relataram que há mais de 40 genótipos de
Cryptosporidium e que com o avanço das ferramentas de caracterização molecular e
biológica, haverá uma alta probabilidade de serem considerados como espécies. O estudo molecular baseado na pequena subunidade ribossomal RNA (SSU RNA) tem sido utiizado em inúmeros estudos para identificação das espécies e genótipos de
Cryptosporidium.
Além de realizar a diferenciação de genótipos e espécies de Cryptosporidium, foi possível determinar os subtipos existentes de C.parvum e C.hominis pela análise
do gene GP60. O estudo desse gene revelou que C.hominis parece ser altamente específico a humanos, enquanto que para C. parvum subtipo IIc é transmitido antroponoticamente e outros subtipos são zoonóticos (XIAO, 2010; RYAN et al., 2014; RYAN e HIJAWI, 2015).
Tabela 2. Principais hospedeiros e espécies de Cryptosporidium spp. Hospedeiros Espécies
Mamíferos C. muris; C. parvum; C. wrairi; C. felis; C. andersoni; C. canis; C. hominis; C. suis; C. bovis; C. fayeri; C. macropodum; C. ryanae; C. xiaoi; C. ubiquitum; C. cuniculus; C. tyzzeri; C. viatorum; C. scrofarum; C. erinacei; C. proliferans; C.rubeyi
Aves C. meleagris; C. baileyi; C. galli Répteis C. serpentis; C. varanii
Anfíbios C.fragile
Peixes C.molnari; C. huwi
A criptosporidiose é transmitida pela rota fecal-oral, por meio da ingestão de alimentos e água contaminados com oocistos, sendo que inúmeros surtos de gastroenterite provocadas por Cryptosporidium mediante ingestão de água de consumo contaminada com oocistos têm sido registrados nos Estados Unidos (PAINTER et al., 2015; MIYAMOTO e ECKMANN, 2015). Nos Estados Unidos (2000 a 2008) já foram registrados 74800 casos de criptosporidiose devido a ingestão de alimentos contaminados (SCALLAN et al., 2011) enquanto que no período de 2011 a 2012 já foram relatados 17.321 casos da parasitose, sendo que a maioria delas foram associadas com águas de recreação (PAINTER et al., 2015)
O ciclo de vida de Cryptosporidium spp. envolve a reprodução assexuada e sexuada do parasito no intestino do hospedeiro (MIYAMOTO e ECKMANN, 2015; SMITH et al., 2005). Após a ingestão dos oocistos, sob ação da acidez seguida de neutralização e exposição às enzimas pancreáticas e da bile, os esporozoítos emergem do oocisto e acabam se aderindo na região extracitoplasmática (região apical) das células epiteliais do intestino (MIYAMOTO e ECKMANN, 2015; SMITH et al., 2005).
O período de incubação da criptosporidiose é de 2-14 dias e as manifestações clinicas incluem diarreia, dores abdominais, náuseas, vômito, perda de peso e febre baixa (MIYAMOTO e ECKMANN, 2015; CHEN et al., 2002). A severidade da doença dependerá da imunidade do indivíduo, sendo auto-limitante em imunocompetentes,
geralmente no período de 1 a 3 semanas e, em imunocomprometidos, a infecção é prolongada, podendo ser devastador para pacientes com SIDA, devido à má absorção de nutrientes pelo intestino, sendo que a diarreia pode levar o paciente ao óbito.
A patogênese do protozoário Cryptosporidium possui vários fatores incluindo o efeito das substâncias produzidas pelo parasito no epitélio intestinal e a resposta inflamatória do hospedeiro os quais afetam a capacidade de absorção e aumento da secreção do intestino. A severidade da doença caracteriza-se pelo deslocamento da borda de microvilos, perda do epitélio causando atrofia das microvilosidades, hiperplasia das células da cripta e infiltração de células inflamatórias. Os processos inflamatórios, osmóticos e secretórios são apontados como as principais causas da diarreia.
Na maioria dos países, a diarreia é uma das causas de morte em crianças abaixo de 5 anos de idade, sendo que a taxa de mortalidade em crianças com o vírus HIV é muito maior (CDC, 2015). Em países em desenvolvimento, Cryptosporidium spp. tem sido a segunda maior causa de mortalidade (após rotavírus) (LIU et al., 2014a). Kotloff et al., (2013) relataram que o parasito foi responsável pela diarreia em aproximadamente 22.000 crianças residentes na Ásia e África. Nos Estados Unidos, no período de 2000 a 2008, foram registrados 74.800 casos de criptosporidiose devido a ingestão de alimentos contaminados (SCALLAN et al., 2011). Enquanto que no período de 2011 a 2012, foram relatados 17.321 casos da parasitose, sendo que a maioria deles foi associado com águas de recreação (PAINTER et al., 2015).
Tanto Cryptosporidium como Giardia apresentam aspectos epidemiológicos em comum os quais favorecem a disseminação desses parasitos mediante consumo de água e alimentos contaminados (TRAVAILLÉ et al., 2016; PRYSTAJECKY et al., 2015; KITAJIMA et al., 2014; RYAN et al., 2014; BETANCOURT et al., 2014; RYAN e CACCIÒ, 2013; FENG e XIAO, 2011), a saber:
Ubiquidade de oocistos e cistos no ambiente aquático;
Oocistos e cistos são eliminados em grandes quantidades nas fezes (108–
109/ gr de fezes) e são imediatamente infectantes;
A transmissão pode ocorrer por contato direto e indireto;
Baixa dose infectante (10 cistos de Giardia e 9 oocistos de
Persistência de cistos e oocistos no ambiente e resistência aos desinfetantes comumente utilizados para tratamento de água para abastecimento público e/ou para recreação.
Em relação aos microsporídios, esses organismos são parasitos intracelulares obrigatórios sendo atualmente classificados como pertencentes ao Reino Fungi (VÁVRA E LUKES, 2013; SZUMOWSKI e TROEMEL, 2015), podendo afetar uma ampla gama de hospedeiros incluindo vertebrados e invertebrados (SZUMOWSKI e TROEMEL, 2015). Szumowski e Troemel (2015) relataram que existem aproximadamente 1.400 espécies de microsporídios dentro do Filo Microspora, sendo que 17 delas são conhecidas por infectar humanos. Enterocytozoon bieneusi e
Encephalitozoon intestinalis são os microsporídios mais comuns que causam infecção
gastrointestinal em humanos ao redor do mundo (FAYER e SANTÍN, 2014).
Existem mais de 200 genótipos de E. bieneusi descritos atualmente, dos quais 52 são exclusivos de humanos e 34 já observados em homens e animais (SANTÍN e FAYER, 2015). Fiuza et al., (2015) verificaram em amostras fecais de suínos do Rio de Janeiro uma grande variedade genética de E.bieneusi, identificando 21 genótipos dos quais 4 já foram relatados (O, EbpA, CS-1, and H) e 17 novos genótipos, não relatados (PigEb1-PigEb17). Outros dados sobre genótipos de E. bieneusi em animais no Brasil são escassos. Além desta pesquisa em suínos, o outro único estudo de genótipos de E. bieneusi em animais foi realizado em pássaros do Estado de São Paulo, no qual foi relatado o genótipo zoonótico EbpA (LALLO et al., 2012).
Os microsporídios produzem esporos que contém uma estrutura de invasão altamente especializada denominada filamento polar (FRANZEN, 2004; WEISS et al., 2014) que pode apresentar um comprimento de 50 µm a 500 µm e cerca de 4 a 30 espirais dentro do esporo (FRANZEN, 2004). Há dois mecanismos de invasão na célula hospedeira: invasão ativa e endocitose (FRANZEN, 2004). Quando ocorre a extrusão do filamento polar sob estimulação do aumento da pressão osmótica dentro do esporo, o túbulo entra em contato com a célula hospedeira penetrando com auxílio do disco de ancoragem e em seguida, transferindo o conteúdo do esporo (esporoplasma) para o citoplasma da célula hospedeira.
O esporoplasma se transforma em meronte que é circundado por um vacúolo parasitóforo, sofrendo várias merogonias (reprodução assexuada) produzindo centenas de merontes em uma única célula infectada. Posteriormente, os merontes
se transformam em esporontes que possuem uma superfície espessa e depois em esporoblastos que darão origem aos esporos que serão liberados após o rompimento da célula hospedeira. A endocitose ocorre quando a célula hospedeira engloba o esporo com a formação de fagossomo o qual é atacado pelas enzimas dos lisossomos. Para escapar da ação dessas enzimas digestivas, o esporo libera o túbulo polar e assim transfere o esporoplasma para dentro da célula hospedeira, dando início a reprodução assexuada.
Didier et al., (2004) sugerem vários modos de transmissão dos microsporídios devido à ubiquidade dos esporos no ambiente. A transmissão vertical (congênita) tem sido descrita em roedores, coelhos, carnívoros e primatas não humanos, entretanto, não há descrição em humanos. Assim, a transmissão horizontal é mais comum envolvendo rota fecal-oral, inalação de aerossóis contaminados e ingestão de alimentos e água contaminados devido à presença de microsporídios nos tratos intestinal e respiratório de indivíduos infectados.
Outro modo de transmissão é a zoonótica, já que muitas espécies de microsporídios que infectam humanos também infectam animais, como
Encephalitozoon cuniculi. Nos humanos, os microsporídios podem infectar qualquer
órgão, mas predominantemente acometem o trato intestinal podendo causar diarreia fatal em pacientes com SIDA e óbito dos indivíduos transplantados.
O tamanho dos esporos de microsporídios que acometem os humanos pode variar de 1µm a 5µm (CALI et al., 2011). No caso dos principais microsporídios que causam infecção gastrointestinal no ser humano, E. bieneusi e E. intestinalis, os esporos medem aproximadamente 1,3 µm x 0,8 µm e 2,0 µm x 1,2 µm, respectivamente (CALI et al., 2011; FAYER e SANTÍN, 2014).
A parede do esporo é espessa sendo composta por três camadas: exósporo, endósporo e membrana plasmática. O exósporo (mais externo) é composto por glicoproteínas e endósporo (mais interno) por quitina conferindo ao esporo resistência às condições ambientais desfavoráveis como longos períodos de tempo na água e também desidratação favorecendo a disseminação pelo ambiente (DIDIER et al., 2004; WEISS et al., 2014). Devido ao pequeno tamanho, os esporos podem não ser removidos pelos processos convencionais de tratamento de água (filtração) e de esgoto juntamente com outros parasitos como oocistos de Cryptosporidium e cistos de Giardia (DOWD et al.,1998; GRACZYK et al., 2007; CHENG et al., 2011).
Assim, a detecção juntamente com as ferramentas moleculares como FISH (hibridização in situ) e PCR têm fornecido dados simultâneos de quantidade e viabilidade desses esporos (GRACZYK et al., 2007), como também permitem o rastreamento da origem desses patógenos humanos (GRACZYK e LUCY, 2007).
2.1. Estudo da caracterização molecular de Giardia spp. e Cryptosporidium spp.
O desenvolvimento e avanço de ferramentas moleculares para o estudo da diversidade genética de Giardia spp. e Cryptosporidium spp. vem permitindo conhecer a ampla gama de hospedeiros desses protozoários, além de possibilitar a compreensão da dinâmica e padrões de transmissão desses parasitos contribuindo para o melhor entendimento da epidemiologia desses patógenos (THOMPSON e ASH, 2016).
Para a caracterização genética de Giardia spp. há inúmeros genes alvo que podem ser estudados como a pequena unidade ribossomal (SSU-rDNA), espaçador transcrito interno (ITS1-2), beta-giardina (β-giardin), triose fosfato isomerase (TPI) e glutamato desidrogenase (GDH) (CACCIÒ et al., 2002; HOPKINS et al., 1997; LALLE et al., 2005; READ et al., 2004; SULAIMAN et al., 2003).
Ressalte-se ainda que para Giardia duodenalis, esses marcadores genéticos diferem quanto à identificação de grupos e subgrupos genéticos e quanto às relações filogenéticas sugeridas (WIELINGA E THOMPSON, 2007). Os genes TPI, GDH e beta-giardina são os marcadores mais comuns para a determinação de grupos genéticos e subtipos enquanto que o gene SSU rDNA é mais indicado para a determinação de espécies e grupos genéticos (WIELINGA E THOMPSON, 2007). Por outro lado, o estudo de um único locus não fornece informações suficientes para compreender um possível elo zoonótico. Assim, a maioria dos estudos epidemiológicos de Giardia duodenalis emprega a genotipagem multilocus para uma melhor caracterização de isolados de Giardia oriundos de diversos hospedeiros (LIU et al., 2014b) cujos resultados podem contribuir para um melhor entendimento da relação entre humanos e animais como hospedeiros e reservatórios, como também a elucidação das rotas de transmissão da giardiose (LIU et al., 2014b).
Hopkins et al., (1997) avaliando o gene SSU-rDNA de Giardia, proveniente de amostras clínicas de humanos e de cães, verificaram que as sequencias de DNA de 4 grupos de Giardia eram distintos, sendo que os grupos 1 e 2 eram de cistos recuperados de humanos enquanto 3 e 4 foram oriundos exclusivamente de cães, sugerindo novos grupos genéticos de G. duodenalis, já que não havia relatos sobre as sequências obtidas desses isolados de cães. A partir desse estudo com o gene SSU rDNA, foi possível vislumbrar a existência de grupos genéticos (A-H) de Giardia
duodenalis confirmando o potencial zoonótico do parasito (THOMPSON E ASH, 2016;
RYAN e CACCIÒ, 2013).
Em relação ao potencial zoonótico de Giardia, THOMPSON E ASH (2016) relataram que o protozoário é mantido por uma série de ciclos entre hospedeiros independentes, bem como ciclos provenientes de duas espécies zoonóticas. Entretanto, a frequência dessas transmissões é desconhecida fazendo com que a epidemiologia dessas infecções permaneça controversa, mesmo que o emprego da biologia molecular tenha confirmado a natureza zoonótica de Giardia spp (FLETCHER et al., 2011; THOMPSON e SMITH, 2011). Diante do fato de que animais podem abrigar Giardia duodenalis zoonóticas e específicas, FENG e XIAO (2011) afirmam que a biologia molecular é requerida para o rastreamento da origem desse parasito.
Quanto ao protozoário Cryptosporidium spp. a aplicação das ferramentas moleculares tem sido importante para a determinação da diversidade genética do parasito, contribuindo também para o rastreamento da origem de contaminação do protozoário, já que oocistos de diferentes espécies são morfologicamente semelhantes (THOMPSON E ASH, 2016). Diversas espécies e genótipos do parasito podem estar envolvidos na ocorrência de surtos de criptosporidiose por veiculação hídrica já que a contaminação da água com oocistos pode ser proveniente de diversas fontes (ROCHELLE e DI GIOVANI, 2014; XIAO et al., 2006).
O termo genótipo refere-se a um nível taxonômico inferior ao de espécie, sendo constituído por um conjunto de marcadores genéticos cujas sequências são diferentes do gene SSU rRNA, apresentando assim características que não o elevam para o
status de espécie.
O gene SSU rDNA é amplamente difundido na identificação de espécies do parasito devido à presença de regiões semi-conservadas e variáveis do DNA as quais facilitam a criação de primers específicos ao gênero-espécie. Outra característica
desse gene é a natureza multi-cópia permitindo gerar vários templates na PCR (RYAN et al., 2014; THOMPSON E ASH, 2016).
Outro gene que também tem sido empregado como alvo na identificação de subtipos de Cryptosporidium é o gene 60 kDA glicoproteína (gp60), um marcador molecular cuja heterogeneidade reside na variação no número dos nucleotídeos TCA, TCG ou TCT na extremidade 5’ (gp40), embora o polimorfismo também esteja presente no restante do gene (RYAN et al., 2014).
O termo subtipo inclui a variação dentro das espécies de Cryptosporidium a partir da investigação de vários locus (gene gp60) de uma população específica do parasito proveniente tanto de humanos como animais (RYAN et al., 2014). A nomenclatura desses subtipos foi baseada conforme SULAIMAN et al., (2005); XIAO,2010; Feng et al. 2011 (Tabela 4), no qual o nome do subtipo se inicia com a espécie e a designação de família sendo seguida pelo número repetido de TCA (representado pela letra A), número de TCG (pela letra G) ou TCT (letra T). No caso do nome IeA11G3T3 esse indica que C. hominis pertence à família subtipo Ie, possuindo 11 cópias de TCA repetidos, 3 cópias repetidas de TCG e 3 cópias repetidas de TCT.
Tabela 3. Subtipos de Cryptosporidium spp.
Espécies Subtipos Nucleotídeos
C. hominis Ia Ib Id Ie If Ig Ih Ii Ij TCA TCA, TCG, TCT TCA, TCG TCA, TCG, TCT TCA, TCG TCA TCA, TCG TCA TCA
C. parvum IIa TCA, TCG
IIb TCA IIc TCA, TCG IId TCA, TCG IIe TCA, TCG IIf TCA IIg TCA
(Continuação da tabela 3)
Espécies Subtipos Nucleotídeos
C.parvum IIh IIi IIk IIl IIm IIn IIo TCA, TCG TCA TCA TCA TCA, TCG TCA TCA, TCG C. meleagridis IIIa IIIb IIIc IIId IIIe IIIf IIIg TCA TCG TCA TCG TCA TCA TCA TCG TCA TCG TCA TCG C. fayeri IVa IVb IVc IVd IVe IVf TCA, TCG, TCT TCA, TCG, TCT TCA, TCG, TCT TCA, TCG, TCT TCA, TCG, TCT TCA, TCG, TCT
Genótipo de gambá XIa TCA, TCG, TCT
C. cuniculus Va
Vb
TCA TCA Genótipo de cavalo VIa
VIb
TCA, TCG
C. wrairi VIIa TCA, TCT
Genótipo de ferret VIIIa TCA, TCG
C. tyzzeri IXa
IXb
TCA TCA
Genótipo de visom Xa TCA, TCG
Genótipo I de gambá XIa TCA, TCG, TCT
C. ubiquitum* XIIa XIIb XIIc XIId XIIe XIIf
(Continuação da tabela 3)
Espécies Subtipos Nucleotídeos
C. erinacei XIIIa TCA
Fonte: Adaptado de Ryan et al., (2014).
* C. ubiquitum não apresentam tri nucleotídeos repetidos, não podendo ser considerado como subtipo conforme nomenclatura.
Na América do Norte, Europa e Austrália, os subtipos IIa de C. parvum encontrados em bovinos também foram relatados em humanos nesses continentes (XIAO, 2010). O subtipo IIaA15g2r1 de C. parvum que foi encontrado em bovinos em Portugal, é também o subtipo mais relatado em humanos no mesmo país.
Na República da Irlanda e Nordeste da Irlanda, indivíduos foram infectados com os mesmos subtipos (IIaA18g3r1) encontrados em bovinos. Em Portugal, o potencial de transmissão zoonótica foi observada no subtipo IId de C. parvum, já que quatro subtipos foram encontrados em indivíduos com HIV, sendo que dois desses subtipos já foram registrados em bovinos e caprinos (XIAO, 2010).
Alves et al., (2006) e Soba e Logar (2008) relataram que a diversidade genética de C. parvum foi mais alta em humanos do que em bovinos, sendo que dos três subtipos de C. parvum, relato do subtipo IIc em animais não foi registrado. Além desses estudos, a natureza antroponótica do subtipo IIC tem sido demonstrada em várias pesquisas que compararam os subtipos do parasito em criptosporidiose humana e bovina ocorrente nos EUA, Canadá, Portugal, Eslovênia, Reino Unido e Irlanda (XIAO, 2010).
2.2. Giardia spp. Cryptosporidim spp. e microsporídios em amostras de
esgoto, efluentes e valores de remoção dos parasitos pelos sistemas de tratamento de esgoto.
Sistemas de tratamento biológico de esgoto albergam uma grande diversidade de organismos patogênicos e diante desse cenário, há inúmeras pesquisas envolvendo a detecção e a remoção de patógenos como Giardia spp. Cryptosporidium spp. e microsporídios provenientes desses sistemas (KITAJIMA et al., 2014; HACHICH et al., 2013; IZQUIERDO et al., 2011).
Kitajima et al., (2014) avaliaram amostras de esgoto provenientes de duas estações de tratamento por Lodos Ativados e Filtros Biológicos em Arizona (EUA), utilizando como método de concentração das amostras, a filtração em filtro eletronegativo seguida de imunofluorescência direta (FA) e nested-PCR dos genes
GDH (Giardia) e 18S rDNA (Cryptosporidium). As concentrações de Giardia encontradas nessas amostras foram de 4,8 - 6,4 x 103 de cistos/L, sendo também
positivas para PCR, enquanto que para Cryptosporidium, foram detectados 7,4 x 101
- 1 x 102 oocistos/L. Entretanto, pela PCR, não houve positividade para
Cryptosporidium. O estudo do posicionamento filogenético da Giardia encontrada
nessas amostras de esgoto, resultou em grupos genéticos AII (humano-especifico) e B (zoonótico). Quanto aos valores de remoção, o processo de Lodos Ativados obteve o maior valor de remoção de Giardia (2,08 log10) em relação ao Filtro Biológico (1,52
log10). Já para Cryptosporidium, o processo de Filtro Biológico removeu 0,81 log10
enquanto que o processo de Lodos Ativados reduziu o número de oocistos em 0,71 log10.
Concentrações de cistos de Giardia e oocistos de Cryptosporidium também foram detectados em amostras de esgoto concentradas por centrífugo-concentração e PCR provenientes de duas estações de tratamento na China por Liu et al., (2011). Das 48 amostras de esgoto examinadas, por PCR, 15 foram positivas para
Cryptosporidium das quais 14 amostras foram atribuídas C.andersoni e 1 C. ubiquitum. Para Giardia, 24 foram positivas na PCR sendo caracterizadas como
grupos genéticos AII e B.
No caso de sistemas de tratamento que combinam reatores anaeróbios e aeróbios, Tawfik et al., (2015) pesquisaram Giardia e Cryptosporidium em amostras de efluente provenientes de um sistema combinado constituído por Reator anaeróbio híbrido seguido de biofiltro aeróbio com biomassa hídrida, utilizando a filtração em membranas, centrifugo-concentração e ressupensão em Percoll-sacarose com gravidade específica de 1,15 g/L. Para visualização das formas parasitárias, o sedimento obtido foi corado pelo método de ácido tricromático. Foi encontrada uma positividade para cistos de Giardia em 72% das amostras de esgoto e efluentes, sendo atingida uma remoção de 100% do parasito pelo sistema. Quanto a Cryptosporidium, houve uma positividade do parasito em 81,8% das amostras de efluente. Os autores não relataram valor de remoção para Cryptosporidium
Samie e Ntekele (2014) analisaram 79 amostras de efluentes oriundas de sistemas combinados (reatores anaeróbios e aeróbios) e de lodos ativados na África do Sul, concentrando-as pelas técnicas de centrifugo-concentração, floculação com sulfato férrico e cloreto de césio, e pesquisa de Giardia nos sedimentos pela PCR
usando o gene TPI. A positividade do parasito foi de 31,65%, sendo detectados os grupos genéticos A e B. Em relação aos valores de remoção do parasito foram de 40% (sistemas combinados) e 20% (Lodos ativados).
No Brasil, em Ribeirão Preto-SP, Tonani et al., (2013) pesquisaram ambos os protozoários em amostras de Estação de Tratamento Biológico (Lodos Ativados) utilizando o método 1623 USEPA (IDEXX Filta-Max®, separação imunomagnética e
IFA), sendo então encontradas concentrações de 120 a 2.200 cistos/L e de 0,45 a 3,5 cistos/L de Giardia em amostras de esgoto e de efluente tratado, respectivamente. Já para Cryptosporidium, foram registrados 28,9 oocistos/L em esgoto e 1,05 oocistos/L no efluente tratado. Tonani et al., (2011) encontraram valor de remoção de 67,8% de
Giardia pelo sistema de Lodos Ativados em Ribeirão Preto, concentrando as amostras
pela sedimentação e centrífugo-concentração do sedimento obtido.
No período de Fevereiro e Dezembro de 2009, Hachich et al., (2013) pesquisaram Giardia e Cryptosporidium em 48 amostras de esgoto bruto e de efluente tratado provenientes de 4 estações de tratamento da região metropolitana de São Paulo. Utilizando o método 1623 (USEPA, 2005) e empregados o sistema Filta-Max®
(IDDEX), a separação imunomagnética, e IFA, os autores relataram que 100% e 58,3% das amostras de esgoto foram positivas para Giardia e Cryptosporidium, respectivamente. Das amostras de efluente tratado, 79,2% foram positivas para cistos de Giardia e 25,03% para oocistos de Cryptosporidium spp. A remoção de cistos de
Giardia pelos sistemas alcançou valores de 2 log10 a 5 log10. Os autores não relataram
valor de remoção para Cryptosporidium.
Quanto à ocorrência de microsporídios em amostras de água e de esgoto, Izquierdo et al., (2011) registraram 21,0% de positividade para microsporídios (2 amostras de água de consumo, 5 amostras de efluentes e 1 amostra de água de recreação) de um total de 38 amostras coletadas na Galícia, utilizando técnica de coloração de Weber e PCR, sendo que essa última, registrou positividade para
Encephalitozoon intestinalis nas amostras de água de recreação. Guo et al., (2014)
encontraram E. bieneusi em 58,2% das amostras de águas pluviais nos Estados Unidos utilizando filtração e PCR. Em outro estudo, Hu et al (2014) verificaram positividade de 31,5% para E. bieneusi em amostras de água de consumo na China, após contaminação com carcaças de porcos domésticos. Galvan et al., (2013) verificaram que 61,0% das amostras de efluentes domésticos de Madri continham os
