UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
CRISTIANE MARIA DE SOUZA
HÍBRIDOS DE TALIDOMIDA E NÚCLEO FUROXÂNICO: AVALIAÇÃO DAS PROPRIEDADES ANTI-INFLAMATÓRIAS E INDUTORAS DE GAMA GLOBINA IN
VITRO
CAMPINAS 2018
HÍBRIDOS DE TALIDOMIDA E NÚCLEO FUROXÂNICO: AVALIAÇÃO DAS PROPRIEDADES ANTI-INFLAMATÓRIAS E INDUTORAS DE GAMA GLOBINA IN
VITRO
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências
ORIENTADOR: FERNANDO FERREIRA COSTA
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA
ALUNA CRISTIANE MARIA DE SOUZA, E ORIENTADA PELO PROFº DR. FERNANDO FERREIRA COSTA
CAMPINAS 2018
CRISTIANE MARIA DE SOUZA
ORIENTADOR: PROF. DR. FERNANDO FERREIRA COSTA
MEMBROS:
1. PROF. DR. FERNANDO FERREIRA COSTA
2. PROF. DR. ANDRÉ FATTORI
3. PROF. DR. MÁRIO ÂNGELO CLAUDINO
Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
DAS UTOPIAS Se as coisas são inatingíveis...ora! Não é motivo para não querê-las... Que tristes os caminhos, se não fora A presença distante das estrelas!
Aos meus pais, pelo grande apoio durante a realização deste trabalho. Aos meus irmãos, Victor e Gustavo, pelo apoio, carinho e também pelas caronas rs.
Ao Jackson, pela paciência e apoio em todos os momentos.
A toda a minha família, pelos bons momentos de descontração, pelo carinho e incentivo.
Ao Prof. Dr. Fernando Ferreira Costa, pela orientação e oportunidade de desenvolver o meu projeto de mestrado em seu laboratório.
A Carol Lanaro, pela coorientação nesses quase três anos, pelos puxões de orelha e por ter me apresentado ao mundo das culturas de células.
Aos pacientes, que gentilmente aceitaram participar deste estudo. Ao Roberto e a Layde, por terem me apresentado ao mundo da pesquisa, pelos inúmeros conselhos e pela amizade. Muito obrigada!!
A Regiane, pela indicação no laboratório, pelo tempo de convívio e de risadas e pelo conhecimento compartilhado. Em qualquer canto do mundo em que esteja...Obrigada, Rê!
A Myriam, por todos os conselhos, mini-aulas sobre MTT, opiniões, pelos desabafos. Obrigada, Myriam! O mundo precisa de mais pessoas como você!
A Dani, pela amizade, companheirismo, conselhos e por ter aberto as portas para mim na Unicamp.
A Marina, por toda a ajuda com o inglês rs, pela amizade, carinho, por termos compartilhado sonhos durante essa trajetória do mestrado e por termos realizado a nossa viagem inesquecível!!
A Rafa, pela amizade, por ter me ouvido pacientemente por tantas vezes, pelos inúmeros conselhos. Obrigada, Rafa! Quero ter sempre sua amizade.
As minhas queridas amigas de anos, que mesmo não entendendo muito bem o mundo da pesquisa, sempre me apoiaram: Fernanda, Marcela, Maria,
Sabrina, Tamires e Bruna. Obrigada por todo o carinho, meninas!
Ao pessoal da UNESP-Araraquara, Prof. Dr. Jean Leandro dos Santos e Thaís Melo, pela síntese dos compostos e por toda a ajuda ao longo desses anos.
A todo o pessoal do Lab. de Hemoglobina e Genoma.
A Dri, pela grande ajuda com as culturas, opiniões, por ter compartilhado o seu extenso conhecimento.
A Lediana, por ter sido sempre muito solícita! Muito obrigada!
A Carla e a Dul, pelas sugestões e por terem compartilhado o grande conhecimento que possuem. Obrigada!!
A Thaís, pela ajuda com o Western Blot, por compartilhar o seu conhecimento e estar sempre disposta em esclarecer as minhas dúvidas. Muito obrigada!
Ao pessoal do 1° piso (Laboratórios de Inflamação Vascular e Biologia Molecular), obrigada por toda a ajuda e pelo convívio, pessoal!
Ao pessoal do 2° piso, pela ajuda com a Citometria, Western Blot... Muito obrigada!!
Agradeço a FAPESP pelo auxílio financeiro (Processo n° 2015/16188-4, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)).
globina beta. O evento fundamental na patogenia da anemia falciforme é a polimerização da desoxi-HbS. A polimerização da desoxi-HbS depende de alguns fatores, tais como: concentração de oxigênio, pH, concentração de HbS, temperatura, pressão, força iônica e presença de hemoglobinas normais. As consequências da polimerização são: deformação, enrijecimento e perda da flexibilidade das células vermelhas, o que resulta em anemia hemolítica, eventos vaso-oclusivos e asplenia funcional. Além disso, um estado de inflamação crônica também é observado na anemia falciforme, que está associado com injúria vascular, aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), hemólise, diminuição da biodisponibilidade de NO, aumento da produção de moléculas inflamatórias (TNF-alfa, GM-SCF, IL-1β, IL-3, M-CSF, IL-6, IL-8). Sólidas evidências sugerem que o aumento significativo dos níveis de hemoglobina fetal (HbF) proporciona uma melhora no quadro clínico da doença. Atualmente, a Hidroxiureia (HU) é o medicamento aprovado pelo Food and Drug Admnistration (FDA) e que é mais bem estudado para o tratamento da anemia falciforme. O seu mecanismo de ação baseia-se na capacidade desse fármaco em aumentar os níveis de HbF e dessa forma reduzir as complicações clínicas da doença. Contudo, novos fármacos têm sido estudados a fim de melhorar o prognóstico desses pacientes. Neste trabalho, estudamos três novos compostos candidatos a fármacos para o tratamento da Anemia Falciforme. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade anti-inflamatória e de indução de gama globina, constituinte da HbF, de candidatos a fármacos derivados de Talidomida e núcleo furoxânico. Os compostos SCD2013.1, SCD2013.2 e SCD2013.3 não foram capazes de induzir significativamente a produção de cadeias γA e γG; Os compostos SCD2013.1 e SCD2013.3 foram capazes de diminuir a adesão de neutrófilos controle (***p<0,0001, n=10) e de pacientes com Hemoglobinopatia SC (***p<0,0001, n=9) à FN. O composto SCD2013.1 demonstrou atividade anti-inflamatória diminuindo a produção de TNF-α em macrófagos humanos (1µM *p<0.05; 2,5µM **p<0.0033, n=5), enquanto o composto SCD2013.3 não apresentou o mesmo efeito nas concentrações testadas. O composto SCD2013.1 foi capaz de diminuir a adesão de neutrófilos à FN e
globin gene leading to the formation of HbS. The key event in the pathogenesis of sickle cell anemia is the polymerization of HbS. The rate of HbS polymerization depends on some factors such as: oxygen concentration, pH, concentration, temperature, pressure, ionic strength, and the presence of normal hemoglobin. The consequences of HbS polymerization are: deformation, stiffness and loss of flexibility of the red blood cells, resulting in hemolytic anemia, vaso-occlusive events and splenic function impairment causing an increase in susceptibility to infection. Sickle cell anemia, despite having its origin in the mutation of the beta globin gene, presents a variety of disorders such as, a state of chronic inflammation that is associated with vascular injury, increased production of reactive oxygen species (ROS), hemolysis, decreased bioavailability of NO, and increased production of inflammatory molecules (TNF-alpha, GM-SCF, IL-1², IL-3, M-CSF, IL-6, IL-8). Strong evidence suggests that the significant increase of fetal hemoglobin (HbF) levels provide an improvement in the clinical picture of the disease. Currently, Hydroxyurea (HU) is the only well tested drug approved by the Food and Drug administration (FDA) for the treatment of sickle cell anemia. The mechanism of action of this drug is based on the ability to increase HbF levels and thus reduce clinical complications of the disease. However, new drugs are being studied in order to improve the prognosis of patients with sickle cell anemia. The objective of this study was to assess the anti-inflammatory ability and induction of gamma globin, constituent of HbF of the candidates derived from Thalidomide and furoxan derivatives. The compounds SCD2013.1, SCD2013.2 and SCD2013.3 were not able to induce significantly the production of γA and γG chains; The compounds SCD2013.1 and SCD2013.3 were able to decrease the control neutrophil adhesion to FN (***p<0.0001, n=10) and of patients with SC hemoglobinopathy (***p<0.0001, n=9). SCD2013.1 demonstrated anti-inflammatory activity by decreasing TNF-α production in human macrophages (1μM *p<0.05, 2.5μM **p<0.0033, n=5), while the SCD2013.3 compound did not show the same effect at the concentrations tested. In conclusion, SCD2013.1 was able to decrease the neutrophil adhesion to FN and also showed anti-inflammatory activity, thus making it the most promising among the three compounds tested.
Figura 1. Opções terapêuticas na Anemia Falciforme (de Melo e colaboradores40).19
Figura 2. Estrutura química da Talidomida (Adaptado: Teo et al., 2004)...22 Figura 3. Planejamento estrutural dos compostos híbridos Lapdesf SCD2013.1, SCD2013.2 e SCD2013.3...25 Figura 4. Expressão do gene de γ-globina após o tratamento de células K562 com o composto SCD2013.2 (curva dose/resposta/tempo). O eixo X representa
as amostras com as respectivas concentrações à que foram tratadas e o eixo Y o número de unidades arbitrárias (U.A.) de expressão de γ-globina...36
Figura 5 A, B, C e D. Dot plots de citometria de fluxo. O eixo X representa a
marcação anti receptor de transferrina e o eixo Y a marcação anti Glicoforina A. O quadrante superior direito indica a marcação dupla; ambos os anticorpos...37
Figura 6. % de cadeias gama A e gama G após o tratamento das células progenitoras eritroides com os compostos SCD2013.1, SCD2013.2 e SCD2013.3. A HU foi utilizada como controle positivo de indução de gama. Cada
tratamento possui o seu respectivo controle devido ao volume do veículo DMSO utilizado nos experimentos (2013.1 2,5µM n=4; 2013.2 5µM n=6; 2013.3 5µM n=8; HU 100µM n=6). O eixo X representa os tratamentos e o eixo Y a % das cadeias gama A e gama G...39
Figura 7. Expressão gênica de γ-globina após o tratamento das células progenitoras eritroides com os compostos SCD2013.2, SCD2013.3 e HU por qPCR. O eixo X representa as amostras com as respectivas concentrações das
moléculas e o eixo Y o número de unidades arbitrárias de expressão de γ-globina (n=3)...40
Figura 8. Efeito do composto GABI-1 na expressão gênica de γ-globina: O eixo
X representa as amostras com as respectivas concentrações das moléculas e o eixo Y o número de unidades arbitrárias de expressão de γ-globina (n=1). (n=1)...41
Figura 9. Efeito do composto JS-PD na expressão gênica de γ-globina: O eixo X
representa as amostras com as respectivas concentrações das moléculas e o eixo Y o número de unidades arbitrárias de expressão de γ-globina (n=1). (n=1)...42
Figura 10. Efeito dos compostos 2013.1 e 2013.3 na viabilidade de neutrófilos avaliados por MTT (n=4). O eixo X representa os tratamentos realizados nas
células e o eixo Y a porcentagem de células viáveis...43
Figura 11. Efeito dos compostos SCD2013.1, SCD2013.3 e da hidroxiureia na adesão de neutrófilos de indivíduos controle à fibronectina. O eixo X representa
os tratamentos realizados nas células e o eixo Y a porcentagem de células aderidas à FN. * p<0,05 (comparado ao veículo H2O); ***p<0,0001 (comparado ao veículo DMSO 0,32uL) determinado por ANOVA seguido de Bonferroni...44
de células aderidas à FN. ***p<0,0001 (comparado ao veículo DMSO 0,32uL) determinado por ANOVA seguido de Bonferroni...45
Figuras 13 A-Q. Ensaio de viabilidade de macrófagos com kit
live/dead...46
Figuras 14 A e 14B. Representação gráfica do ensaio de viabilidade celular de macrófagos com o Kit Live/Dead após tratamento com o composto 2013.1 nas doses de 1µM, 2,5µM, 5µM, 10µM e 20µM e com o composto 2013.3 nas doses de 1µM, 2,5µM, 5µM e 10µM . Em cada experimento foram analisadas três imagens
de campos diferentes para encontrar o percentual de células vivas (verdes) X células mortas (vermelhas). O eixo X representa os tratamentos realizados nas células e o eixo Y a porcentagem de células viáveis...50
Figura 15. Representação gráfica do ensaio de viabilidade celular de macrófagos com o Kit Live/Dead após tratamento com hidroxiureia nas doses de 10µM, 100µM e 500µM. Em cada experimento foram analisadas três imagens de
campos diferentes para encontrar o percentual de células vivas (verdes) X células mortas (vermelhas) (n=1)...51
Figura 16. Níveis de TNF-α no sobrenadante de cultura de macrófagos controle (n=5) na ausência ou presença de LPS (n=5). O eixo X representa os tratamentos
realizados e o eixo Y a concentração de TNF-α em pg/mL (1µM *p<0.05; 2,5µM **p<0.0033, n=5, comparados ao veículo DMSO, determinado por ANOVA seguido de Bonferroni)...52
AF: Anemia Falciforme
CD34+:Cluster of Differentiation 34 – Célula tronco hematopoiética cDNA: DNA complementar
DMSO: Dimetilsulfóxido FN: Fibronectina
HbF: Hemoglobina Fetal HbS: Hemoglobina S
HPLC: High performance liquid chromatography HTAB: hexadeciltrimetil de amônio bromida HU: Hidroxiureia
LPS: Lipopolissacarídeo
MSSe: Milieu Sans Sérum Érythro
MTT: 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide;Thiazolyl blue NO: Óxido Nítrico
PBS: Phosphate Buffered Saline (Solução salina tamponada com sulfato) SDS: Dodecil sulfato de sódio
1. INTRODUÇÃO ... 17
1.1 Anemia Falciforme... 17
1.2 Inflamação ... 17
1.3 Hemoglobina Fetal ... 18
1.4 Opções Terapêuticas na Anemia Falciforme ... 19
1.4.1 Talidomida ... 21
1.5 Óxido Nítrico ... 22
1.6 Derivados Furoxânicos ... 23
1.7 Desenvolvimento e Síntese dos Compostos ... 23
2. OBJETIVOS ... 26 2.1 Objetivo Geral ... 26 2.2 Objetivos Específicos ... 26 3. CASUÍSTICA E MÉTODOS ... 27 3.1 Casuística. ... 27 3.2 Aspectos Éticos ... 28 3.3 Métodos ... 28
3.3.1. Síntese dos compostos SCD2013.1, SCD2013.2 e SCD2013.3 ... 28
3.3.2 Cultura de células ... 28 3.3.2.1 Cultura de células K562 ... 28 3.3.2.2 Cultura de células CD34+ ... 29 3.3.3 Citometria de Fluxo ... 30 3.3.4 Extração de RNA ... 30 3.3.5 Síntese de cDNA ... 30
3.3.6 Padronizações necessárias para a PCR quantitativa em tempo real (qPCR) ... 31
3.3.7 PCR Quantitativa em tempo real (qPCR) ... 31
3.3.8 Análise dos dados de PCR em tempo real ... 31
3.3.9 HPLC (High performance liquid chromatography) de cadeias ... 32
3.3.10 Ensaio de viabilidade de neutrófilos (MTT) ... 32
3.3.11 Ensaio de Adesão Estática de Neutrófilos ... 33
3.3.12 Ensaio de viabilidade de macrófagos com Kit Live/Dead (Thermo Scientific) ... 34
3.3.13 Cultura de Monócitos ... 34
4.1. Cultura de Células K562 ... 36
4.2 Diferenciação Eritróide (13° dia)... 37
4.3. HPLC de cadeias de células CD34+ diferenciadas para a linhagem eritroide ... 38
4.4. Expressão gênica de γ-globina em culturas de células CD34+ tratadas com os compostos SCD2013.2 e SCD2013.3 por PCR em tempo real. ... 39
4.5 Expressão gênica de γ-globina em culturas de células CD34+ tratadas com os híbridos GABI-1 e JS-PD ... 40
4.6. Ensaio de viabilidade de neutrófilos – MTT ... 42
4.7. ENSAIO DE ADESÃO ESTÁTICA DE NEUTRÓFILOS ... 43
4.7.1 Efeito do tratamento com os compostos 2013.1 e 2013.3 e Hidroxiureia na adesão de neutrófilos de indivíduos controle à Fibronectina. ... 43
4.7.2 Efeito do tratamento com os compostos SCD2013.1 e SCD2013.3 e Hidroxiureia na adesão de neutrófilos de pacientes com Hemoglobinopatia SC. ... 44
4.8 Ensaio de viabilidade de macrófagos – Kit Live/Dead Thermo Scientific. ... 46
4.8.1 Tratamento com Dexametasona 1 µM (Controle Positivo) (figuras 13B e C). ... 46
4.8.2 Tratamentos com o composto 2013.1 nas concentrações de 1µM, 2,5µM, 5 µM, 10µM, 20 uM (figuras 13D-I). ... 47
4.8.3 Tratamentos com o composto 2013.3 nas concentrações de 1uM, 2,5uM, 5uM, 10 uM (figuras 13J-N). ... 48
4.8.4 Tratamento com Hidroxiuréia nas concentrações de 10µM, 100µM e 500µM (figuras 13O-Q). ... 49
4.8.5 Representação gráfica do ensaio de viabilidade celular de macrófagos com o kit Live/Dead. ... 50
4.9. Dosagem de TNF-α através do método de ELISA no sobrenadante de culturas de macrófagos estimuladas com LPS e tratadas com os compostos SCD2013.1 e SCD2013.3. ... 51
5. DISCUSSÃO ... 53
6. CONCLUSÕES ... 58
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 59
1. INTRODUÇÃO 1.1 Anemia Falciforme
A Anemia Falciforme é causada por uma alteração molecular no gene da globina β, onde a homozigose de uma única mutação (A->T) no sexto códon desse gene resulta na substituição de um resíduo de ácido glutâmico por um resíduo de valina e consequente produção de uma Hb anômala – HbS 1,2. Nos pacientes SS, a concentração elevada de HbS contribui para a gravidade da doença, aumentando a propensão à formação de polímeros em baixas concentrações de O2 3, 4, 5, 6, 7.
A polimerização da desoxi-HbS é um fator determinante na fisiopatologia da AF que, por sua vez, leva à hemólise crônica e processos vaso-oclusivos, que são a maior causa de morbidade nesse grupo de pacientes 2. A oclusão vascular diminui a perfusão nos órgãos, levando ao infarto tecidual e, em associação à anemia, contribui para complicações clínicas como: crises dolorosas, síndrome torácica aguda, hipertensão pulmonar, acidente vascular cerebral (AVC), danos em múltiplos órgãos e diminuição da sobrevida dos pacientes com anemia falciforme 8.
Os eventos vaso-oclusivos compreendem uma complexa interação de diferentes tipos celulares como: células falcizadas, reticulócitos, células endoteliais, leucócitos, plaquetas e proteínas do plasma 9,10. O processo recorrente de vaso-oclusão, isquemia-reperfusão, ativação da célula endotelial e injúria induz uma resposta inflamatória contínua nos pacientes com AF, a qual é propagada pelos elevados níveis de citocinas inflamatórias, diminuição da biodisponibilidade do NO e estresse oxidativo 11.
1.2 Inflamação
A anemia falciforme apresenta grande variabilidade de lesões orgânicas, dentre as quais se destaca o estado inflamatório crônico 12, 13, 14. As crises vaso-oclusivas e a anemia hemolítica observadas na anemia falciforme causam as
complicações da doença 8. As crises vaso-oclusivas envolvem interações de células vermelhas, leucócitos e plaquetas ativados, células endoteliais e proteínas do plasma e, quando recorrentes, promovem processos de isquemia-reperfusão, ativação de células do endotélio vascular e lesões, que promovem uma resposta inflamatória contínua 11. A propagação dessa resposta inflamatória ocorre também pela diminuição da biodisponibilidade de NO, decorrente da alta taxa de hemólise, que ocasiona a liberação de hemoglobina livre e esta consome quantidades micro molares de óxido nítrico, desviando-o de sua função homeostática 15,16. O estado inflamatório crônico também compreende o aumento da produção de moléculas inflamatórias (TNF-alfa, GM-SCF, IL-1β, IL-3, M-CSF, IL-6, IL-8) 17, 18, 19, 20, 21
e aumento da expressão de moléculas de adesão na superfície dos neutrófilos, hemácias e plaquetas 22. Além disso, sabe-se que neutrófilos de pacientes com AF demonstraram maior capacidade de adesão à endotelina e à fibronectina 23, 24, 25 e a sequência de estímulos inflamatórios induz a expressão de moléculas de adesão por meio das células endoteliais, que facilita adesão de outras células, como as hemácias 26.
O TNF-α é um dos principais mediadores da resposta inflamatória aguda, no qual há o recrutamento dos neutrófilos e monócitos para o sítio da inflamação 27, 28
. Lanaro e colaboradores 17 demonstraram aumento dos níveis plasmáticos e de RNAm de TNF-α e IL-8 em pacientes com anemia falciforme no estado estável. A produção de IL-8 pode ser induzida por TNF-α, IL-1 e outras moléculas inflamatórias como produtos bacterianos 29, 30.
1.3 Hemoglobina Fetal
A hemoglobina fetal (HbF) inibe a polimerização da desoxi-HbS. Os níveis de HbF nos eritrócitos de pacientes com anemia falciforme são geralmente elevados e, embora a relação entre os níveis de HbF e a evolução clínica da doença não seja absoluta, todos os dados existentes mostram que níveis significativamente elevados de HbF estão correlacionados com melhor evolução clínica da doença 31. A HbF é composta por duas cadeias globínicas alfa e duas cadeias de globinas gama, e possui maior afinidade pelo oxigênio do que a hemoglobina A 32, 33. As cadeias gama
são produzidas em altos níveis nas células da linhagem eritroide durante a fase fetal e, após o nascimento, são substituídas pelas cadeias beta, que dão origem a hemoglobina A. Essa substituição é regulada por mecanismos transcricionais, que envolvem conhecidos fatores de transcrição como BCL11A, GATA1 e KLF1 34. No recém-nascido portador da anemia falciforme, a HbF é significativamente substituída pela HbS por volta dos 6 meses de idade, período em que se observam as manifestações clínicas da doença. Em adultos normais, há resquícios da produção de HbF, correspondendo a menos de 1% do total de hemoglobina.
1.4 Opções Terapêuticas na Anemia Falciforme
Evidências experimentais e clínicas sugerem o desenvolvimento de terapias direcionadas para a reativação da produção de hemoglobina fetal em pacientes com doença falciforme e talassemia beta 32, 33, 35, 36, 37, 38. Na AF, os efeitos benéficos do aumento dos níveis de HbF ocorrem devido a diminuição da concentração de HbS, que reduz a capacidade de polimerização dessa hemoglobina anômala 39.
A hidroxiureia (HU), um inibidor da ribonucleotídeo redutase, tem sido exaustivamente investigada, pois é o único medicamento aprovado pelo Food and Drug Admnistration (FDA) para o tratamento de pacientes com anemia falciforme, cujos benefícios são o aumento da concentração de HbF, melhora dos parâmetros hematológicos e a redução das complicações clínicas 41, 42, 43. Tratamentos longos
com HU também reduzem a contagem de neutrófilos 44. Alguns estudos descrevem
os efeitos benéficos da HU na AF e a provável relação com alterações na adesão celular, nas propriedades da membrana das células, ao óxido nítrico e no sistema de transporte de cátions 45, 46, 47, 48, 49. Rodriguez e colaboradores50 relataram que a farmacodinâmica da HU possibilita que ela seja uma molécula doadora de óxido nítrico. Além disso, Gladwin e colaboradores 51 propuseram que a terapia com HU promoveria a geração intravascular e intraeritrocitária dessa substância. Indiretamente a HU possui diversos efeitos sobre a ativação endotelial, entre eles podemos citar: diminuição significativa dos níveis circulantes de moléculas de adesão endoteliais (sVCAM-1, sICAM-1, sE-selectina e sP-selectina) sugerindo diminuição da ativação endotelial. Além da redução dos níveis de algumas citocinas inflamatórias durante a terapia com HU; GM-CSF, ET-1, ET-3. Por outro lado, a HU é capaz de aumentar os níveis de IL-10, uma citocina anti-inflamatória 17, 18. Também foi descrita a capacidade da hidroxiureia de prevenir, com uma única dose, processos inflamatórios vasculares agudos 52. Além da HU, algumas outras drogas já tiveram seu efeito indutor de HbF descrito, como a Decitabina, o Butirato e outras 53, 54, 55
.
Além da reativação da síntese de HbF, outros medicamentos que poderiam minimizar as complicações clínicas da anemia falciforme, como o Prasugrel, capaz de diminuir a atividade plaquetária e o Regadenoson, estão sendo estudados 56, 57. Alguns outros, como os inibidores de fosfodiesterase 5 e 9 (PDE5 e PDE9), tem sido propostos para o tratamento da AF. Dentre os inibidores de PDE5, o sildenafil é o medicamento com maior número de aplicações em várias alterações clínicas, cujo mecanismo de ação é amplificar a resposta do NO na musculatura vascular por inibição da hidrólise do segundo mensageiro; guanosina monofosfato cíclica (GMPc). O inibidor de PDE9, BAY73-6691, foi capaz de alterar significativamente o recrutamento de leucócitos na microvasculatura de
camundongos com anemia falciforme durante a vaso-oclusão e, quando a administração é concomitante a hidroxiurea, há um sinergismo e uma melhora significativa no rolamento dos leucócitos e na adesão, diminuição da interação hemacia-leucócito, ocasionando melhora na sobrevida do animal 58.
Além disso, tem sido sugerida a utilização das estatinas (medicamento utilizado no tratamento das hiperlipidemias por reduzirem os níveis de colesterol através da inibição da enzima hidroximetilglutaril-CoA redutase), uma vez que foi demonstrado que este medicamento melhora o fluxo sanguíneo dependente de NO e diminui a expressão de moléculas de adesão 59. Esses efeitos são conhecidos como pleiotrópicos e incluem: ação reguladora na função endotelial, aumento da estabilidade de placas ateroscleróticas, diminuição do estresse oxidativo, inflamação e resposta trombogênica, sugerindo benefício no tratamento da anemia falciforme.
1.4.1 Talidomida
A Talidomida foi desenvolvida na década de 50, na Alemanha, inicialmente como um sedativo, e logo passou a ser utilizada por mulheres em período gestacional a fim de amenizar enjoos matinais. No entanto, apresentou um terrível efeito não previsto que gerou milhares de casos de malformações fetais. Em razão desse efeito colateral, o fármaco for retirado do mercado 60. Embora a Talidomida possua graves efeitos colaterais, é também conhecida por seu potente efeito anti-inflamatório, principalmente pela inibição de TNF-α, uma importante citocina inflamatória 61.
Análogos da Talidomida, como a Pomalidomida e a Lenalidomida, os quais pertencem à classe de drogas imunomoduladoras, têm sido utilizados em ensaios terapêuticos diversos, com resultados promissores para o tratamento de doenças neoplásicas hematológicas e condições inflamatórias 60, 62, 63. De fato, muitas dessas drogas participam hoje da terapêutica de primeira linha para algumas neoplasias como o mieloma múltiplo. Um estudo atual ex-vivo demonstrou que tanto a Pomalidomida quanto a Lenalidomida foram capazes de estimular a proliferação de células CD34+ e a produção de hemoglobina total, bem como, aumentar a produção
de hemoglobina fetal através de um mecanismo transcricional 64. Meiler e colaboradores 65, evidenciaram após tratamento de 8 semanas com pomalidomida em animais transgênicos para anemia falciforme, um aumento moderado nos níveis de HbF com eficácia similar a da Hidroxiurea, além de ausência de mielosupressão, aumento da eritropoese e preservação da função da medula óssea, sugerindo que esse fármaco possa ser empregado como terapia na AF.
Figura 2: Estrutura química da Talidomida (Adaptado: Teo et al., 2004).
1.5 Óxido Nítrico
O Óxido Nítrico é um gás solúvel sintetizado por uma família de enzimas denominadas óxido nítrico sintases (NOS) a partir do aminoácido L-arginina e que possui ação vasodilatadora 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73. A hemólise crônica observada na doença falciforme pode diminuir a biodisponilidade de NO 15 devido à liberação de hemoglobina livre. O incremento na produção de NO pode agregar alguns efeitos benéficos aos pacientes falciformes 74, pois além de regular o tônus vascular por ser uma substância vasodilatadora 75, reduz a adesão de hemácias, leucócitos e plaquetas em ensaios in vitro 76, 77, 78.
Sabe-se que o NO participa da ativação da via de Guanilato Ciclase Solúvel (GCs), que converte Guanosina Trifosfato (GTP) em Guanosina Monofosfato cíclica (GMPc). O GMPc age como segundo mensageiro intracelular, ativando a proteína quinase dependente de GMPc (PKG), permitindo que vários processos fisiológicos ocorram79. Ikuta e colaboradores 80 demonstraram que a ativação da via de Guanilato Ciclase Solúvel (GCs) induz a expressão gênica de γ-globina em células K562. Posteriormente, Cokic e colaboradores 48 sugeriram que a indução de HbF por meio da HU é mediada pela ativação da via de GCs dependente de NO,
sugerindo que outras drogas com o mesmo potencial doador de NO possam também ter efeito indutor de HbF.
1.6 Derivados Furoxânicos
Os doadores de NO e seus efeitos são amplamente estudados em diversas doenças. As propriedades doadoras de óxido nítrico dos derivados do núcleo furoxânico (1,2,5-oxadiazol-2-óxido) tem sido exploradas para obtenção de uma série de compostos híbridos com diferentes atividades farmacológicas, como por exemplo, atividade antiagregante plaquetária 81, 82, 83. As altas taxas de liberação de NO por meio dos derivados furoxânicos mostraram-se promissoras em doenças como a Leishmaniose e a Tuberculose 84, 85. Híbridos de Resveratrol, uma substância antioxidante, e derivados furoxânicos demonstraram atividade anti-plaquetária e anti-trombóticas 86. Além disso, essa estrutura mostrou-se importante na ativação da Guanilato Ciclase Solúvel, uma das vias de ativação da síntese de HbF 87. Outra vantagem dessa estrutura é o seu efeito tóxico diminuído em relação a outros doadores de NO, uma vez que a exposição ao NO foi reportada como capaz de causar efeitos carcinogênicos e mutagênicos.
Sabe-se que a capacidade de doação de NO por parte dos derivados furoxânicos ocorre de maneira cisteína-dependente 88, no entanto, os mecanismos para essa doação permanecem obscuros.
1.7 Desenvolvimento e Síntese dos Compostos
Além dos medicamentos disponíveis no mercado, novos compostos têm sido desenvolvidos para o tratamento da anemia falciforme. Esses compostos agregam várias funções: agem como analgésicos, apresentam atividades farmacológicas múltiplas e doam óxido nítrico. Lanaro e colaboradores89 demonstraram que híbridos de talidomida e HU foram capazes de aumentar a produção de HbF in vivo e diminuir a produção de citocinas pró-inflamatórias em culturas de monócitos de camundongos falciformes. Dos Santos e colaboradores 90 demonstraram que híbridos de hidroxiureia e talidomida, obtidos através de
hibridação molecular, apresentaram efeitos analgésicos e anti-inflamatórios em camundongos transgênicos para anemia falciforme. Estes pesquisadores também demonstraram que híbridos de talidomida e derivados furoxânicos aumentaram em três vezes a expressão do gene de gama globina em cultura de células K562 após 96h de tratamento 91.
Assim, sob a coordenação do Prof. Dr Jean Leandro dos Santos na Universidade Estadual Paulista – “Júlio de Mesquita Filho” – Faculdade de Ciências Farmacêuticas - Campus de Araraquara, visando o potencial efeito anti-inflamatório da Talidomida e as propriedades doadoras de NO por meio do núcleo furoxânico, que poderiam modular a síntese de HbF, três novos compostos híbridos foram sintetizados: 4-(3-((4-(1,3-dioxoisoindolin-2-il)benzoil)oxi)propoxi)-3-(fenilsulfonil)-1,2,5-oxadiazol- 2N-óxido (SCD2013.1); (E)-4-(4-((2-(4-(1,3-dioxoisoindolin-2-il)benzoil)hidrazino)metil)fenoxi)-3-(fenilsulfonil)-1,2,5 oxadiazol-2-N-óxido (SCD2013.2); (E)-4-(3-((2-(4-(1,3-dioxoisoindolin-2-il)benzoil)hidrazino)metil)fenoxi)-3-(fenilsulfonil)-1,2,5-oxadiazole 2-N-óxido (SCD2013.3).
A partir da hibridação molecular, a subunidade Ftalimídica da molécula de Talidomida, que é anti-TNF-α, foi associada a uma molécula doadora de NO (núcleo furoxânico) (Figura 2). Os híbridos foram nomeados como SCD (Sickle Cell Disease) 2013.1, 2013.2 e 2013.3. Os três compostos são capazes de doar NO em níveis semelhantes. Através da detecção quantitativa de nitrito pela técnica de Griess, dados já publicados92 mostraram que o composto SCD2013.2 produziu 12,1+-0,3% de nitrito (mol/mol) e o composto SCD2013.3 produziu 11,9+0,6% (mol/mol).
Figura 3.: Planejamento estrutural dos compostos híbridos Lapdesf SCD2013.1, SCD2013.2 e SCD2013.3
Uma vez que nem todos os pacientes em terapia com HU respondem significativamente ao tratamento, a investigação de novos compostos com atividade anti-inflamatória e indutora de HbF pode ser uma estratégia promissora. Neste trabalho, investigamos as duas atividades biológicas citadas.
2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo Geral
Avaliar a capacidade de indução de hemoglobina fetal e a atividade anti-inflamatória dos compostos derivados da talidomida + núcleo furoxânico in vitro.
2.2 Objetivos Específicos
Avaliar o padrão de expressão do gene da γ-globina em cultura de células da linhagem K562 após tratamento com o composto SCD2013.2;
Avaliar a produção de hemoglobina fetal por HPLC em cultura de células eritroide a partir CD34+ de indivíduos controle após o tratamento com os compostos SCD2013.1, SCD2013.2 e SCD2013.3;
Avaliar a expressão gênica de γ-globina em culturas CD34+
tratadas com os compostos SCD2013.2 e SCD2013.3.
Avaliar a viabilidade de neutrófilos tratados com os compostos SCD2013.1 e SCD2013.3 pelo método MTT.
Comparar a adesão in vitro basal e estimulada de neutrófilos de indivíduos controle e pacientes com Hemoglobinopatia SC tratados com os compostos SCD2013.1 e SCD2013.3 à fibronectina.
Avaliar a viabilidade de macrófagos tratados com os compostos SCD2013.1 e SCD2013.3 através do Kit Live/Dead.
Avaliar a produção de TNF-α no sobrenadante de culturas de macrófagos estimuladas com LPS e tratadas com os compostos SCD2013.1 e SCD2013.3.
3. CASUÍSTICA E MÉTODOS
3.1 Casuística.
Para o estudo foram selecionados pacientes com Hemoglobinopatia SC diagnosticados no Hemocentro da UNICAMP, através de eletroforese de hemoglobina e cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Estes pacientes apresentavam idade entre 18-60 anos, encontravam-se em fase estável, na ausência de infecção ou processos inflamatórios, sem transfusão sanguínea por pelo menos três meses e sem crises de dor por este mesmo período e sem terapia com hidroxiuréia.
O grupo controle foi constituído por 10 indivíduos saudáveis, com idade entre 18-55 anos e que possuem normalidade no perfil eletroforético para as hemoglobinas confirmados por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
Foram selecionados indivíduos com Hemoglobinopatia SC que não estavam em tratamento com HU, para que fosse possível determinar com maior eficácia o efeito dos compostos testados.
Tabela 1. Dados hematológicos dos pacientes com hemoglobinopatia SC
e indivíduos controle que participaram do estudo. Os valores estão expressos como média, menor e maior valor.
Indivíduos Pacientes com Hemoglobinopatia SC Controle (n= 10) (n=9) Sexo (M/F) 5/5 3/6 Idade (anos) 36,3 (23 – 55) 47,4 (33 – 60) Hemácias (x106/µL) 5,02 (4,50 – 5,52) 4,16 (4,33-5,06) Hematócrito (%) 45,81 (40,1 – 52,3) 35,38 (30,1- 47,1) Hemoglobina (g/dL) 14,72 (13 – 16,2) 11,26 (15,2-9,6) Leucócitos (x103/µL) 6,49 (5,29 – 8,61) 9,87 (5,59-13,14) Hb Fetal (%) 0,2% (0,1 – 0,4) 0,57% (0,40 – 1,20)
3.2 Aspectos Éticos
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP, sob parecer n° 1.169.997 e CAAE n°: 45878215.8.0000.5404. Todos os participantes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE), previamente avaliado e aprovado pelo CEP.
3.3 Métodos
3.3.1. Síntese dos compostos SCD2013.1, SCD2013.2 e SCD2013.3
Os compostos SCD2013.1, SCD2013.2 e SCD2013.3 foram sintetizados, isolados, purificados e caracterizados pelo Laboratório de Pesquisa e
Desenvolvimento de Fármacos da Faculdade de Ciências Farmacêuticas – UNESP
Araraquara sob supervisão do Prof. Dr. Jean Leandro dos Santos. O composto SCD2013.2 demonstrou problemas de solubilidade a decorrer do projeto e, portanto, os experimentos de adesão estática de neutrófilos e cultura de monócitos não foram realizados com este composto.
3.3.2 Cultura de células
3.3.2.1 Cultura de células K562
Células K562 foram cultivadas em meio DMEM, 10% SFB, 5% CO2 – 37°C e, após confluência, foram tratadas com o composto SCD2013.2. Uma curva dose resposta (5, 30, 60µM) e tempo (24-96h) foi feita para determinar a melhor concentração do composto. O composto foi diluído em DMSO e a garrafa controle recebeu o maior volume de DMSO usado no experimento. Cada ponto da cultura coleado teve a viabilidade avaliada por azul de trypan e as células foram colocadas em Trizol e armazenadas a -80°C para posterior extração do RNA total.
3.3.2.2 Cultura de células CD34+
Amostras de sangue periférico de indivíduos controle foram coletadas em tubo contendo heparina lítica e processadas imediatamente após a coleta. As amostras foram diluídas 1:2 em solução de PBS+ACD+BSA e em seguida colocadas em gradiente de Ficoll-Paque (Amersham Biosciences, Uppala Sweden) por 30 minutos à 317g em temperatura ambiente. A camada formada na interface (buffy coat) foi coletada e as células lavadas em PBS+ACD+BSA. Em seguida, as células foram lisadas em tampão de lise para hemácias por 15 minutos em gelo e centrifugadas por 5 minutos a 361g. Novamente as células foram lavadas em PBS e ressuspendidas para contagem em câmara de neubauer.
Após a contagem das células, estas foram incubadas com FcR Blocking Reagent e Hapten-Antibody por 15 minutos e após lavagem, incubadas com Anti-Hapten MicroBeads, segundo as orientações do fabricante (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany). Após o tempo de incubação, as células foram lavadas, ressuspendidas em PBS e passadas por uma coluna magnética LS (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany) fixada em um suporte magnético. As células de interesse ficaram presas à coluna enquanto as contaminantes (monócitos e linfócitos) foram coletadas em tubo falcon. Em seguida, a coluna foi retirada do suporte magnético e uma leve pressão foi realizada através de um êmbolo para fazer com que as células CD34+ se soltassem da coluna e pudessem ser coletadas em um novo tubo. As células CD34+ foram então lavadas com PBS+ACD+BSA por 10 minutos a 1500rpm e ressuspendidas em 1mL de PBS+ACD+BSA para contagem em câmara de Neubauer.
As células CD34+ foram cultivadas em meio MSSe (meio IMDM
suplementado com lipídeo, transferrina, BSA e bicarbonato 7,5%). Para cada 1ml de meio MSSe foram adicionados 50ng de Stem cell fator (SCF; R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN), 2 unidades de Eritropoetina (Eprex; Janssen, Canadá) e 5ng de interleucina 3 (SCF; R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN). Essas células foram incubadas por 7 dias em estufa de CO2 - 5%, a 37°C, com 10% SFB em meio MSSe (Fase I). Na fase II utilizamos 30% de SFB e meio MSSe com todos os fatores de
crescimento descritos na fase I e 2 unidades de EPO. As células foram cultivadas novamente em 5% de CO2 a 37°C93. No dia 9, as células precursoras eritroides foram coletadas, centrifugadas, ressuspendidas e contadas novamente. As células foram adicionadas na concentração de 1.105 cels/mL de meio MSSe para início do tratamento com os compostos SCD2013.1, SCD2013.2 e SCD2013.3 (2,5 e 5µM). No dia 13 de cultivo celular as células foram coletadas e contadas. Foram separadas células para citometria de fluxo, extração de RNA e HPLC. A diferenciação eritoide foi acompanhada por citometria de fluxo. A viabilidade células das fases I e II foi analisada por meio da técnica de azul de trypan.
3.3.3 Citometria de Fluxo
A diferenciação eritroide foi acompanhada através dos anticorpos anti-CD71 e anti-Glicoforina A. As amostras foram ensaiadas no equipamento FaCSCalibur (BD).
3.3.4 Extração de RNA
As amostras de RNA foram extraídas com Kit comercial – Rneasy Mini e Kit (Qiagen GmbH, Hilden) segundo as instruções do fabricante.
3.3.5 Síntese de cDNA
A leitura do RNA total foi realizada em espectrofotômetro (DeNovix Inc., Wilmington, DE, USA). As amostras de RNA obtidas foram submetidas à síntese de DNA complementar (cDNA) utilizando-se o kit com enzima Fermentas (Molecular Biology, Thermo Fisher Scientific Inc., Massachusetts, USA).
3.3.6 Padronizações necessárias para a PCR quantitativa em tempo real (qPCR)
Todas as amostras foram primeiramente ensaiadas para amplificação dos controles endógenos, βActina e GAPDH, para avaliação do Ct de amplicação de cada amostra antes do ensaio com os primers do gene de γ-globina.
3.3.7 PCR Quantitativa em tempo real (qPCR)
As amostras de cDNAs utilizadas na reação de qPCR foram quantificadas em espectrofotômetro (Denovix) e utilizadas como molde em reações de PCR quantitativa em tempo real.
As reações para PCR quantitativa em tempo real foram feitas em duplicata, utilizando o sistema de detecção SYBRTM Green (Life Technologies) para avaliação da expressão gênica de globina gama nas células K562 tratadas com o
composto SCD2013.2 e em células CD34+ tratadas com os compostos SCD2013.2 e
SCD2013.3. A detecção de amplificação em tempo real foi feita no equipamento StepOne Plus.
3.3.8 Análise dos dados de PCR em tempo real
A expressão dos genes de interesse foi determinada de forma relativa, onde os valores de expressão são normalizados em relação a genes conhecidos como “controles endógenos”. Nos ensaios realizados, foram utilizados como controles endógenos os genes Beta actina (β-actina) e GAPDH (gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase).
Os valores de Ct de cada gene foram obtidos em duplicata. Para análise, foram calculadas as médias aritméticas dessas duplicatas para cada amostra. Em seguida foi obtido o valor de delta Ct (ΔCt), que consistiu na subtração do menor Ct de um gene de uma determinada amostra com os demais Cts desse mesmo gene de outras amostras estudadas. Após, foi realizado o cálculo de “Q” valor, correspondente a 2ΔCt. Os valores de Q dos genes βactina e GAPDH de cada
amostra analisada foram submetidos ao software geNorm, que calculou a média geométrica entre eles, valor este denominado de Fator de Normalização da amostra. A expressão normalizada de um dado gene de interesse em uma determinada amostra foi dada pela razão entre o valor de Q do gene de interesse da amostra pelo fator de normalização da amostra. O valor obtido foi expresso em unidades arbitrárias (UA) ou valor absoluto de expressão.
3.3.9 HPLC (High performance liquid chromatography) de cadeias
As células progenitoras eritroides coletadas foram lisadas para que pudesse ser feita a análise por HPLC. 1x107 células foram lavadas com PBS em duas centrifugações de 1500 rpm por 5 minutos à 4°C para completa remoção . Em seguida, o sobrenadante foi retirado e as células foram eluídas em 80 ul de H2O de injeção e mantidas em freezer -20°C por 2 horas. Após esse período, as células foram centrifugadas a 11.000 rpm por 15 minutos à 4°C e o sobrenadante vermelho contendo hemoglobina foi coletado para análise por HPLC. A corrida foi realizada no equipamento HPLC Alliance 2695 – Waters. As frações Gama G e Gama A possuem tempo de retenção em 59 e 65 minutos, respectivamente.
3.3.10 Ensaio de viabilidade de neutrófilos (MTT)
Neutrófilos de indivíduos controle (2x106 células/mL) foram incubados com os compostos SCD2013.1 e SCD2013.3 (5, 50 e 100µM) por 1 hora à 37°C e 5% CO2 (mesmo período de incubação realizado no ensaio de adesão estática de neutrófilos). Após esse período as amostras foram pipetadas em triplicatas de 100µL/poço e foi adicionado 10µL de MTT (5mg/mL em PBS) em cada poço. Posteriormente a placa foi incubada por 3h à 37°C e 5% CO2. Em seguida 100µL de SDS 10% foram adicionados aos poços a fim de lisar as células. A placa foi novamente incubada por 18h, à 37°C e 5%CO2. Ao final do período de incubação, a leitura da absorbância foi realizada em espectrofotômetro em comprimento de onda de 540 nm. Os resultados foram obtidos comparando a absorbância dos poços onde
foram realizados os tratamentos com os compostos com o controle DMSO, que foi considerado com 100% de viabilidade.
3.3.11 Ensaio de Adesão Estática de Neutrófilos
Foram coletadas amostras de sangue periférico (16mL) em tubos contendo heparina lítica. O sangue coletado foi submetido a gradiente de Ficoll com densidades iguais a 1.119g/L e 1.077g/L, respectivamente. O gradiente foi centrifugado a 700g por 30 minutos à temperatura ambiente para obtenção da camada de células granulocíticas, a qual foi coletada e lavada com PBS 1X (pH=7,4). Após a lavagem, a camada de granulócitos coletada foi submetida à lise hipotônica (solução de amônia -155mM NH4CL, 10mM KHCO3) com o intuito de romper as hemácias contaminantes. As células foram novamente lavadas com PBS 1X e a concentração desejada foi ajustada com a adição de meio RPMI 1640 (pH=7,2).
Placas com 96 poços foram recobertas com 60μL do ligante fibronectina (20μg/mL de FN em PBS) por 16-20 horas a 4°C. Os poços da placa foram lavados duas vezes com PBS antes do bloqueio dos sítios de ligação inespecíficos com PBS/BSA 0,5% por 90 minutos a 37°C. As células previamente separadas foram tratadas com os compostos por 30min e em seguida foram plaqueadas. Na placa, foram estimuladas com TNF-α por mais 30 minutos. Foi realizada uma lavagem com PBS 1X para remoção das células não aderentes e em cada poço foi adicionado 50μL de meio de cultura RPMI. Para mensurar os neutrófilos que aderiram à FN foi realizada uma curva padrão, construída em concentrações que variavam de 0-100% a partir da suspensão original de células (2x106 células/mL) em 50μL de RPMI. As placas foram congeladas por pelo menos 12 horas antes de medir o conteúdo de Mieloperoxidase (MPO), enzima presente nos grânulos dos neutrófilos. Após as 12h, a placa foi descongelada e foi adicionado a cada poço 100μL de HTAB seguido de homogeneização. Em seguida, 20μL da solução foram transferidos para uma nova
placa para adição de 200μL de solução de o-dianisidina (o-dianisidine
dihidrocholorido 0,167mg/ml, peroxidase de hidrogênio 0,0005% em tampão de fosfato de potássio, 50 mM, pH 6.0), e após cinco minutos foi mensurada a absorbância utilizando o leitor de ELISA (Versa Max tunable microplatereader, EUA)
em comprimento de onda igual a 492nm, que quantifica reação do substrato de o-dianisidina na presença de peróxido de hidrogênio com o conteúdo da MPO.
3.3.12 Ensaio de viabilidade de macrófagos com Kit Live/Dead (Thermo Scientific)
Células mononucleares de indivíduos controle foram separadas através de gradiente de Ficoll e, posteriormente, Percoll 45%, a fim de obter apenas os monócitos. 5.105 células foram adicionados à uma placa de 24 poços e incubados overnight com 450µL de meio RPMI e 10% de soro fetal bovino, tempo necessário para diferenciação e adesão dessas células à placa. Após esse período, o sobrenadante foi retirado e foram adicionados meio+soro novos à placa, bem como o volume de droga (SCD2013.1 e SCD2013.3) correspondente à concentração desejada (1, 2,5, 5, 10 e 20µM). Os compostos foram diluídos em DMSO. Foi realizada novamente uma incubação de 24h. Após esse período, o sobrenadante foi removido e as células aderidas foram lavadas por 3x com PBS 1X. Foram adicionados sob as células 500µL de PBS 1X, 2µL de calceína (marcador de células vivas) 10µM e 2 µL de Brometo de Etídeo (marcador de células mortas) 10µM. A placa foi incubada por 20min e a emissão de fluorescência foi avaliada em microscópio de fluorescência com os filtros Alexa488 e Alexa555. A contagem do percentual de células vivas e células mortas foi realizada através do software ImageJ.
3.3.13 Cultura de Monócitos
Células mononucleares de indivíduos controle foram separadas através de gradiente de Ficoll (1500rpm, 30m) e, posteriormente, Percoll 45% (1800rpm, 30m), a fim de obter apenas os monócitos. As células foram lavadas (1500rpm, 10m) adicionadas a uma placa de 24 poços com 450µl/poço de meio RPMI e 50µL de soro fetal bovino (10%) e incubadas overnight a 37°C e 5%CO2. Os compostos SCD2013.1 e SCD2013.3 (1 e 2,5µM) foram adicionados aos poços e a placa foi novamente incubada por 30 minutos à 37°C e 5%CO2. Em seguida, as células
foram estimuladas com LPS (2µg/mL) e a placa foi incubada por 24 horas. Após o período, os sobrenadantes foram coletados em eppendorfs, centrifugados a 15.000rpm, 4°C 15min e estocados a -80°C.
3.3.14 Quantificação de Citocinas
A quantificação de TNF-α foi realizada através de Kit de ELISA seguindo o protocolo fornecido pelo fabricante (R&D Systems). A técnica consiste em uma placa pré-preparada com o anticorpo de captura. A amostra é adicionada sobre essa placa e indubada. Após a lavagem da placa, o anticorpo de detecção conjugado com um marcador é adicionado. Para revelação, adicionou-se o substrato capaz de reagir com o marcador. A absorbância das amostras foi avaliada e espectrofotômetro a 450nm.
3.3.15 Análise estatística
Os dados foram analisados através do software GraphPad Prism versão 5. Para as análises estatísticas, foram feitos testes paramétricos quando a distribuição foi normal (ANOVA seguido pelo pós-teste de Bonferroni). Os resultados foram expressos como média ± erro da média. Valores de P<0,05 foram considerados estatisticamente significativos.
4. RESULTADOS
4.1. Cultura de Células K562
Uma única cultura de células K562 tratada com o compostos SCD2013.2
foi realizada com o objetivo de avaliar a melhor concentração e o tempo de
tratamento capaz de induzir a expressão gênica de globina. A expressão de
γ-globina foi maior na concentração de 5µM após 96h de tratamento (figura 4).
COMPOSTO SCD2013.2
Figura 4. Expressão do gene de γ-globina após o tratamento de células K562 com o composto SCD2013.2 (curva dose/resposta/tempo). O eixo X representa as concentrações e o
eixo Y o número de unidades arbitrárias (U.A.) de expressão de γ-globina.
γ-glo b in a (UA) γ-glo b in a (UA) γ-glo b in a (UA) γ-glo b in a (UA)
4.2 Diferenciação Eritróide (13° dia)
Células CD34+ de indivíduos controle foram submetidas à diferenciação eritroide por um período de 13 dias, onde, no 9° dia, os compostos foram
adicionados. A diferenciação eritroide foi avaliada no 13° dia através de citometria de
fluxo utilizando os anticorpos anti receptor de transferrina e anti-Glicoforina A.
Observa-se que nenhum dos três compostos foi capaz de interferir na maturação
celular nas concentrações testadas, avaliada pela marcação duplo positivo das
células (figuras 5 A, B, C, D).
CONTROLE 2013.1 2,5µM
SCD2013.2 5µM SCD2013.3 5µM
Figura 5 A, B, C e D. Dot plots de citometria de fluxo. O eixo X representa a
marcação anti receptor de transferrina e o eixo Y a marcação anti Glicoforina A. O quadrante superior
direito indica a marcação dupla; ambos os anticorpos.
4.3. HPLC de cadeias de células CD34+ diferenciadas para a linhagem eritroide
Células CD34+ de indivíduos controle foram submetidas à diferenciação eritroide por um período de 13 dias. No 9° dia, os compostos SCD2013.1 2,5µM,
SCD2013.2 5µM, SCD2013.3 5µM e a Hidroxiureia 100µM foram adicionados e no
13° dia as células foram coletadas para prosseguir com os protocolos de Citometria
de Fluxo, HPLC e RNA. Os três compostos testados demonstraram tendência para o
aumento da síntese de gama A e gama G, porém, o resultado não foi
estatisticamente significativo (figura 6).
Ctr ll D MS O 2013 .1 2 ,5uM Ctr ll D MS O 2013 .2 5 uM Ctr ll D MS O 2013 .3 5 uM Ctr l HU HU 100 uM 0 2 4 6 8 10 % g a ma A + g a ma G
Figura 6. Porcentagem de cadeias gama A e gama G após o tratamento das células progenitoras eritroides com os compostos SCD2013.1, SCD2013.2 e SCD2013.3. A HU foi
utilizada como controle positivo de indução de gama. Cada tratamento possui o seu respectivo
controle devido ao volume do veículo DMSO utilizado nos experimentos (2013.1 2,5µM n=4; 2013.2
5µM n=6; 2013.3 5µM n=8; HU 100µM n=6). O eixo X representa os tratamentos e o eixo Y a % das
cadeias gama A e gama G.
4.4. Expressão gênica de γ-globina em culturas de células CD34+
tratadas com os compostos SCD2013.2 e SCD2013.3 por PCR em tempo real.
As amostras de culturas CD34+ foram ensaiadas para avaliação da expressão gênica de γ-globina após tratamento com os compostos SCD2013.2 5µM
e SCD2013.3 5µM, no entanto, a expressão de γ-globina não apresentou aumento
estatisticamente significativo quando comparado à amostra controle. A HU foi utilizada como controle positivo de indução de γ-globina (figura 7).
Figura 7. Expressão gênica de γ-globina após o tratamento das células progenitoras eritroides com os compostos SCD2013.2, SCD2013.3 e HU por qPCR. O eixo X
representa as amostras com as respectivas concentrações das moléculas e o eixo Y o número de
unidades arbitrárias de expressão de γ-globina (CTRL HU + HU100uM n=3; DMSO + 2013.2 5uM n=3; 2013.3 5uM n=4).
4.5 Expressão gênica de γ-globina em culturas de células CD34+
tratadas com os híbridos GABI-1 e JS-PD
Uma vez que os compostos que são objetivos de estudo deste projeto
(SCD2013.1, SCD2013.2, SCD2013.3) não apresentaram potencial efeito indutor de
HbF, optamos por testar dois novos compostos sintetizados no LAPDESF/UNESP,
utilizando o mesmo protocolo. O primeiro, denominado GABI-1, é híbrido de
Pomalidomida+HU. O segundo, denominado JS-PD, é um inibidor de
Bromodomínio-3, molécula responsável pelo recrutamento de GATA-1 durante o
silenciamento de cadeias gama, no entanto, os resultados de qPCR expressos em
γ-gl ob in a (U .A .)
unidades arbitrárias mostraram que não houve aumento significativo da expressão gênica de γ-globina em nenhuma das concentrações testadas (figuras 8 e 9).
Composto GABI-1
DMS O GA BI-1 1uM GA BI-1 2,5 uM GA BI-1 5uM GA BI-1 10u M 0.0 0.5 1.0 1.5 -g lo b in a ( U A )Figura 8. Efeito do composto GABI-1 na expressão gênica de γ-globina em células
CD34+: O eixo X representa as amostras com as respectivas concentrações das moléculas e o eixo Y
JS-PD
DMS O JS-P D 1 uM JS-P D 2 ,5uM JS-P D 5 uM JS-P D 1 0uM 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 -g lo b in a ( U A )Figura 9. Efeito do composto JS-PD na expressão gênica de γ-globina em células
CD34+: O eixo X representa as amostras com as respectivas concentrações das moléculas e o eixo Y
o número de unidades arbitrárias de expressão de γ-globina (n=1).
4.6. Ensaio de viabilidade de neutrófilos – MTT
A absorbância de cada tratamento foi medida após 3 horas de incubação
com MTT. As leituras dos veículos DMSO 0,60µl e DMSO 1,2µl foram consideradas
com 100% de viabilidade celular e a porcentagem de células viáveis de cada
tratamento foi determinada baseada na leitura do veículo correspondente. A dose de
5µM do composto SCD2013.1 e do composto SCD2013.3 foi considerada adequada
quanto à sua citotoxicidade para realização do ensaio de adesão estática de
n=4
DMS O 0 ,60u L 2013 .1 5 uM 2013 .3 5 uM DMS O 1 ,2uL 2013 .1 5 0uM 2013 .1 1 00uM 2013 .3 5 0uM 2013 .3 1 00uM 0 50 100 150 Tratamentos % d e c é lu la s v iá v e isFigura 10. Efeito dos compostos SCD2013.1 e SCD2013.3 na viabilidade de neutrófilos avaliados por MTT (n=4). O eixo X representa os tratamentos realizados nas células e o
eixo Y a porcentagem de células viáveis.
4.7. ENSAIO DE ADESÃO ESTÁTICA DE NEUTRÓFILOS
4.7.1 Efeito do tratamento com os compostos 2013.1 e 2013.3 e Hidroxiureia na adesão de neutrófilos de indivíduos controle à Fibronectina.
A dose de 5µM dos compostos SCD2013.1 e SCD2013.3 foi capaz de
diminuir significativamente a adesão de neutrófilos à Fibronectina quando
comparado às células tratadas com TNF e DMSO. A HU foi testada em 100µM,
500µM e 1000µM, sendo a dose de 500µM eficaz na diminuição da adesão de
n=10
BA SA L TNF DMS O 0 ,32 2013 .1 5 uM 2013 .3 5 uM H2O HU 100 uM HU 500 uM HU 100 0uM H2O 1 5 HU 100 uM 1 5 HU 500 uM 1 5 HU 100 0uM 1 5 0 10 20 30 40***
*
***
Tratamentos % n e u tr ó fi lo s a d e ri d o s à F NFigura 11. Efeito dos compostos SCD2013.1, SCD2013.3 e da hidroxiureia na adesão de neutrófilos de indivíduos controle à fibronectina. O eixo X representa os tratamentos realizados
nas células e o eixo Y a porcentagem de células aderidas à FN. * p<0,05 (comparado ao veículo
H2O); ***p<0,0001 (comparado ao veículo DMSO 0,32uL) determinado por ANOVA seguido de
Bonferroni.
4.7.2 Efeito do tratamento com os compostos SCD2013.1 e SCD2013.3 e Hidroxiureia na adesão de neutrófilos de pacientes com Hemoglobinopatia SC.
Reproduzindo o perfil apresentado em células de indivíduos controle, a
dose de 5µM dos compostos SCD2013.1 e SCD2013.3 foi capaz de diminuir
significativamente a adesão de neutrófilos de pacientes com Hemoglobinopatia SC à
dos testes em indivíduos controle, nenhuma das doses diminuiu significativamente a
adesão dessas células à FN (figura 12).
n=9 BA SA L S C TNF SC SC DMS O 0 ,32 SC 201 3.1 5uM SC 201 3.3 5uM H2O SC HU 100 uM HU 500 uM HU 100 0uM 0 5 10 15 20 25 *** *** Tratamentos % n e u tr ó fi lo s a d e ri d o s à F N
Figura 12. Efeito dos compostos SCD2013.1 e 2013.3 e da hidroxiureia na adesão de neutrófilos de pacientes com Hemoglobinopatia SC à Fibronectina. O eixo X representa os
tratamentos realizados nas células e o eixo Y a porcentagem de células aderidas à FN. ***p<0,0001
4.8 Ensaio de viabilidade de macrófagos – Kit Live/Dead Thermo Scientific.
A viabilidade celular de macrófagos foi avaliada através do percentual de
células vivas X células mortas de três campos diferentes para cada tratamento. As
doses ideais encontradas para ambos os compostos testados (SCD2013.1 e
SCD2013.3) foram 1µM e 2,5µM.
4.8.1 Tratamento com Dexametasona 1 µM (Controle Positivo) (figuras 13B e C).
Figura 13A: Controle Basal – Aumento 20x
– 83,89% de células viáveis
Figura 13B: Tratamento com o veículo
Etanol absoluto 0,5uL)
Figura 13C: Tratamento com Dexametasona
4.8.2 Tratamentos com o composto 2013.1 nas concentrações de 1µM, 2,5µM, 5 µM, 10µM, 20 uM (figuras 13D-I).
Figura 13D: Veículo DMSO –
Aumento 20x – 83,66% de células
viáveis
Figura 13E: SCD2013.1 1uM
– Aumento 20x –93,41% de células viáveis Figura 13G: SCD2013.1 5 uM – Aumento 20x – 36,87% de células viáveis. Figura 13F: SCD2013.1 2,5uM – Aumento 20x – 75,64% de células viáveis Figura 13H: SCD2013.1 10 uM – Aumento 20x – 3,12% de células viáveis Figura 13I: SCD2013.1 20 uM – Aumento 20x – 6,66% de células viáveis
4.8.3 Tratamentos com o composto 2013.3 nas concentrações de 1uM, 2,5uM, 5uM, 10 uM (figuras 13J-N).
.
Figura 13J: Veículo DMSO – Aumento
20x – 83,66% de células viáveis Figura 13K: SCD2013.3 1uM – Aumento 20x – 97,2% de células viáveis Figura 13L: SCD2013.3 2,5 uM – Aumento 20x – 71,22% de células viáveis Figura 13M: SCD2013.3 5uM – Aumento 20x – 44,65% de células viáveis. Figura 13N: SCD2013.3 10 uM – Aumento 20x – 9,85% de células viáveis.
4.8.4 Tratamento com Hidroxiuréia nas concentrações de 10µM, 100µM e 500µM (figuras 13O-Q).
Figura 13O: HU 10uM – 93,51% de
células viáveis
Figura 13P: HU 100uM – 96,80% de
células viáveis
Figura 13Q: HU 500uM – 96,69% de
4.8.5 Representação gráfica do ensaio de viabilidade celular de macrófagos com o kit Live/Dead.
A viabilidade celular foi avaliada através do percentual de células vivas X
células mortas de três campos diferentes para cada tratamento. As doses ideais
encontradas para ambos os compostos testados (SCD2013.1 e SCD2013.3) foram
1µM e 2,5µM (figuras 14A-B).
Figuras 14A e 14B. Representação gráfica do ensaio de viabilidade celular de
macrófagos com o Kit Live/Dead após tratamento com o composto 2013.1 nas doses de 1µM, 2,5µM, 5µM, 10µM e 20µM e com o composto 2013.3 nas doses de 1µM, 2,5µM, 5µM e 10µM . Em
cada experimento foram analisadas três imagens de campos diferentes para encontrar o percentual
de células vivas (verdes) X células mortas (vermelhas). O eixo X representa os tratamentos
realizados nas células e o eixo Y a porcentagem de células viáveis (n=2; 2013.1 5uM e 2013.3 2,5uM
e 5uM n=3).
n=3
HU
BA SA L HU 10u M HU 100 uM HU 500 uM 0 50 100 150 Tratamentos % d e c é lu la s v iá v e isFigura 15. Representação gráfica do ensaio de viabilidade celular de macrófagos com o Kit Live/Dead após tratamento com hidroxiureia nas doses de 10µM, 100µM e 500µM. Em
cada experimento foram analisadas três imagens de campos diferentes para encontrar o percentual
de células vivas (verdes) X células mortas (vermelhas) (n=1).
4.9. Dosagem de TNF-α através do método de ELISA no sobrenadante de culturas de macrófagos estimuladas com LPS e tratadas com os compostos SCD2013.1 e SCD2013.3.
Macrófagos de indivíduos controles foram estimulados com LPS e
tratados com os compostos SCD2013.1 e SCD2013.3 nas doses de 1µM e 2,5µM por 24h. Os sobrenadantes foram coletados e a produção de TNF-α foi avaliada por
kit de ELISA (R&D SYSTEMS). O composto SCD2013.1 foi capaz de diminuir significativamente a produção de TNF-α nas doses de 1µM e 2,5µM, por outro lado,
A dexametasona foi utilizada como controle positivo por sua conhecida atividade
anti-inflamatória (o etanol foi o veículo de diluição do fármaco) (figura 16).
Figura 16. Níveis de TNF-α no sobrenadante de cultura de macrófagos controle (n=5) na ausência ou presença de LPS (n=5). O eixo X representa os tratamentos realizados e o eixo Y a
concentração de TNF-α em pg/mL (1µM *p<0.05; 2,5µM **p<0.0033, n=5, comparados ao veículo DMSO, determinado por ANOVA seguido de Bonferroni).
* * **
