UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE QUÍMICA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÂNICA
Tese de Doutorado
Topologia de Complexos Formados entre Drogas/
β
-Ciclodextrinas/Lipossomas/Células, Aplicando Técnicas de
Ressonância Magnética Nuclear - RMN
Aluno: Luís Fernando Cabeça
Orientadora: Prof
a. Dr
a. Anita Jocelyne Marsaioli
Trabalho em col. com a Prof
a. Dr
a. Eneida de Paula do Departamento de
Bioquímica – Instituto de Biologia – UNICAMP
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho a minha
família, principalmente aos meus
pais Valdir e Teresa que são a base
AGRADECIMENTOS
AGRADECIMENTOS
Agradeço em primeiro lugar a Deus; minha força, meu refúgio, meu protetor, minha vida. A Profa. Dra. Anita J. Marsaioli, pela oportunidade de trabalhar no seu grupo de pesquisa, pela orientação não só no campo profissional mas da vida, com certeza desempenhou além do papel de orientadora, uma conselheira, uma amiga, sempre disposta a me auxiliar nas interrogações deste trabalho e da vida. Meu muito obrigado Anita.
Agradeço à Profa. Dra. Eneida de Paula do Instituto de Biologia da Unicamp, por participar ativamente deste trabalho, pelas discussões, uso do seu laboratório no preparo dos lipossomas. Agradeço pela paciência, coolaboração e amizade. Obrigado Eneida.
Ao Prof. Dr. Fred Y. Fujiwara, pelas discussões, pelo aprendizado relacionado à utilização do espectrômetro de RMN, paciência e disponibilidade. Obrigado Fred.
Ao pessoal da sala de RMN Sonia (Soninha), Tiago, Paula e Anderson pelo auxílio, paciência no auxilio junto aos equipamentos e principalmente pela amizade.
Ao Instituto de Química da UNICAMP pela infra-estrutura para realização deste trabalho. Existem pessoas que aparecem em nossa vida quando menos esperamos, são pessoas colocadas no nosso caminho que deixam nossos dias mais bonitos, nossa vida mais feliz. Agradeço minha namorada Eliane por ser uma dessas pessoas e fazer parte da minha vida.
Agradeço as meninas que moraram comigo Isis (Iji), Gabriela, Stella, Mary e Dani, que sem dúvida vivenciaram comigo os bons e maus momentos, amizade e pelo sentimento de conviver como uma família de verdade.
Aos amigos do grupo de pesquisa: Suzan, Lucimar, Lu Chen, Luciana, Simone, Diego, Adriana (Dri), Georgiana (Ge), Diana, Cíntia Milagre, Cíntia Maruiama, Giedri, Carlinha, Marcela, Armando, Célio, Lucas, Pedro (Matão), Pedro Cruz, pela amizade e companheirismo.
Aos meus amigos ressonantes, Serginho e Isis pelo “treinamento” no equipamento de RMN, pelas discussões, incentivo e amizade.
Agradeço à Dona Maria uma pessoa muito especial, pela dedicação, carinho e pelo amor com que sempre nos tratou.
Aos funcionários do IQ da UNICAMP que, de alguma forma, contribuíram para o desenvolvimento deste trabalho.
Aos demais professores do IQ-UNICAMP pelo aprendizado e colaboração.
Aos meus amigos de longas épocas como Shiga, Valério, Tânia e Mayra, pela amizade e carinho.
A minha família de Campinas (tias, tios e primos) que sempre me ajudaram quando precisei.
CURRICULUM VITAE
CURRICULUM VITAE
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Dados Pessoais
Nome: Luís Fernando Cabeça Nacionalidade: Brasileira Data de Nascimento: 22/11/1978 Local: Adamantina/SP – Brasil e-mail: lfcabeca@yahoo.com.br
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Formação Acadêmica/Titulação 2002 - 2004 Mestrado em Química.
Universidade Estadual de Campinas, UNICAMP, Campinas, Brasil. Título: Estudo e Caracterização de Novas Quinazolinas Polissubstituidas. Orientador: Roberto Rittner Neto
Bolsista : Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo
1997 - 2000 Graduação em Química.
Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil. Bolsista : Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
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Produção Bibliográfica
Artigos completos publicados em periódicos
1. Cabeça, Luís Fernando, Pickholz, Mônica, de Paula, Eneida, Marsaioli, Anita Jocelyne.
Liposome/Prilocaine Interaction Mapping Evaluated through STD NMR and Molecular Dynamics Simulations. Journal of Physical Chemistry B, 2009, 113, 2365–
2370
2. Cabeça, Luís Fernando, Rocco, Silvana Aparecida, Oliveira, Paulo Roberto de, Rittner, Roberto. Synthesis of some 4-N-(phenylamino)-6,7-methylenedioxiyquinazoline
derivatives. Trends in organic chemistry, 2008, 12, 47-52.
3. Cabeça, Luís Fernando, Fernandes, Sergio Antonio, de Paula, Eneida, Marsaioli, Anita Jocelyne. Topology of a ternary complex (proparacaine-beta-cyclodextrin-liposome)
by STD NMR. Magnetic Resonance in Chemistry, 2008, 46, 832-837.
4. Fernandes, Sergio Antonio, Cabeça, Luis Fernando, Marsaioli, Anita Jocelyne, de Paula, Eneida. Investigation of tetracaine complexation with beta-cyclodextrins and
p-sulphonic acid calix[6]arenes by nOe and PGSE NMR. Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry, 2007, 57, 395-401.
CURRICULUM VITAE_______________________________
____________________________________________________________Apresentação de Trabalho
1. Cabeça, L. F., Paula, de E., Marsaioli, A. J.
Topologia de complexos formados entre AL/beta-Ciclodextrina/Lipossomas aplicando técnicas de Ressonância Magnética Nuclar. 2009.
(Simpósio, Apresentação Oral do Trabalho no I Workshop Temático - Novas Formulações Farmacêuticas de Anestésicos Locais de Ação Prolongada, Campinas, Brasil).
2. Cabeça, L. F., Pomini, A. M., Marsaioli, A. J.
Probing Bacterial Quorum-sensing Phenomenom by Saturation Transfer Difference NMR, 2008.
(Simpósio, Apresentação de Trabalho no II Workshop Cooperação Interinstitucional de Apoio a Pesquisa sobre o Cérebro – CINAPCE, Campinas, Brasil).
3. Cabeça, L. F., Milagre, C. D. F., Martins, L. G., Almeida, W. P., Marsaioli, A. J.
Drug-Protein-Liposome-Cyclodextin Complexes: 1H NMR, Topology and Drug
Delivery, 2008.
(Congresso, Apresentação de Trabalho no Encontro de Ressonância Magnética da Europa – EUROMAR, St. Petersburg, Rússia).
4. Cabeça, L. F., de Paula, E., Marsaioli, A. J.
Efeito da Variação do pH na Encapsulação entre Prilocaína, Cyclodextrina e Lipossoma aplicando 1H NMR, 2008.
(Congresso, Apresentação de Trabalho na 31ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química – SBQ, Águas de Lindóia, SP).
5. Cabeça, L. F., Fernandes, S. A., de Paula, E., Marsaioli, A. J.
Assessing the Proparacaine Transport from Cyclodextrin into Liposome, by Appling
1
H (DOSY, ROESY 1D, STD), 2007.
(Congresso, Apresentação de Trabalho no 11th Nuclear Magnetic Resonance Users Meeting – AUREMN, Angra dos Reis, RJ.).
6. Cabeça, L. F., de Paula, E., Marsaioli, A. J.
Estudo do Complexo de Inclusão Prilocaína, Ciclodextrina, Lipossoma, Aplicando Técnicas de Ressonância Magnética Nuclear - RMN, 2007.
(Congresso, Apresentação de Trabalho na 30ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química – SBQ, Águas de Lindóia, SP).
CURRICULUM VITAE
7. Cabeça, L. F., de Paula, E., Marsaioli, A. J.Topology of a Ternary Complex (Proparacaine-Cyclodextrin-Liposome) by 1H NMR (STD), 2007.
(Congresso, Apresentação de Trabalho no Encontro de Ressonância Magnética da Europa – EUROMAR, Tarragona, Espanha).
8. Cabeça, L. F., de Paula, E., Marsaioli, A. J.
Estudo da Topologia de Anestésicos Locais em Lipossomas de Diferentes Tamanhos, Aplicando Técnicas de Ressonância Magnética Nuclear - RMN, 2006.
(Congresso, Apresentação de Trabalho na Jornada Científica – AUREMN, Recife, PE).
9. Cabeça, L. F., Figueiredo, I. M., de Paula, E., Marsaioli, A. J.
Estudo da Topologia de Agregados Lipídicos com Anestésicos Locais: Aplicação de Técnicas de RMN. 2006.
(Congresso, Apresentação de Trabalho na 29º Reunião da Sociedade Brasileira de Química, Poços de Caldas – MG).
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Formação complementar
2000 - 2000 Extensão Universitária em Estágio no Agrupamento de Processos Químicos da
DQ. Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo, IPT, São Paulo, Brasil.
1998 - 2001 Extensão Universitária em Programa Especial de Treinamento (PET).
Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil. Bolsista do(a): Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
2005 - 2007 PED (Programa Especial de Docência): monitor do programa PED da disciplina
QO622 (Química Orgânica Experimental II - 08-12/2005) e Q0551 (Bioquímica I - 03-07/2006 e 03-07/2007) no Instituto de Química da Unicamp.
2008 - 2008 Curso de curta duração em Escuela Binacional de Nano-Ciencia. Centro
Argentino-Brasileiro de Nanociencias y Nanotecnologia. Bolsista do(a): Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
RESUMO
RESUMO
Palavras-chave: Lipossomas; β-ciclodextrina; RMN-STD; Anestésico Local.
A encapsulação de drogas, em particular anestésicos locais (ALs), em sistemas carreadores como lipossomas (EPC) ou ciclodextrinas (
β
-CD) é uma metodologiadesenvolvida para diminuição da toxicidade sistêmica, aumento da analgesia e maior absorção do que os correspondentes ativos livres. O estudo das interações dos complexos (ALs/
β
-CD, AL/EPC e ALs/β
-CD/EPC) foi realizado utilizando técnicas de RMN de 1H (ROESY 1D, DOSY e STD). Através destas, observou-se que o ALs proparacaína (PPC) interage com aβ
-CD e que na presença de vesículas de lipossomas (MLV, 400nm e 100nm) as moléculas de PPC deixam aβ
-CD para formar um novo complexo (PPC/EPC). Entretanto, espectros de RMN-STD revelaram sinais deβ-CD quando
lipossomas foram saturados em -0,5 ppm, que é consistente com a existência de um complexo ternário PPC/β-CD/EPC. Em um segundo momento do trabalho, foi avaliado a
topologia de complexos formados entre o ALs prilocaína (PLC),β-CD e vesículas de
lipossomas de EPC variando o pH (10,0, 7,0 e 5,5). Os experimentos de STD mostraram que a liberação da PLC daβ
-CD para o lipossoma e formação do complexo PLC/EPC foi maior a pH 10,0 do que a pH 5,5. Espectros de DOSY forneceram constantes de associações maiores em pH 10,0, indicando maior interação da PLC/EPC e preferência da PLC pela fase aquosa em pH 5,5.A técnica de RMN-STD também foi aplicada pioneiramente para o estudo do
Quorum Sensing usando (S)-N-(3-oxo-octanoyl)-HSL e cepas de A. tumefaciens
NTL4(pZLR4). Vesículas de lipossomas foram usadas como modelo de membrana para o estudo do mecanismo de Quorum Sensing. Concluiu-se então que a difusão da HSL através da parte lipídica da membrana celular é um importante evento para o sucesso da comunicação bacteriana.
ABSTRACT
ABSTRACT
Keywords:
Liposomes;β
-cyclodextrin; STD-NMR; Local Anesthetics.Encapsulation of local anesthetics (Als) in drug delivery systems as liposomes (EPC) or cyclodextrins (
β
-CD) is a known methodology to decrease toxicity, increase anesthetic effect duration and absorption than the free drug. Thus evaluation of the stability of supramolecular complexes is important and here several complexes (ALs/β
-CD, AL/EPC e ALs/β
-CD/EPC) were evaluated using 1H NMR techniques (ROESY 1D, DOSY e STD). We observed that proparacaine (PPC) interacts withβ
-CD and in the presence of liposomes (MLV, 400 or 100 nm) that PPC molecules migrate from theβ
-CD to the liposome producing new binary complexes (PPC/EPC). Additionally, STD 1H NMR revealedβ
-CD signals upon liposome saturation at -0.5 ppm which was consistent with the existence of a ternary complex PPC/β-CD/EPC. We have
also evaluated the topologies of PLC/β-CD/EPC complexes at different pHs (10.0, 7.0,
5.5). The STD–NMR experiments revealed that more PLC is released to liposome from the PLC/β
-CD complex at pH 10.0 than at pH 5.5. The association constants determined by diffusion experiments (DOSY) revealed that PLC/EPC interactions are larger at pH 10.0 than at pH 5.5 due to an increase in PLC/EPC interaction and the PLC preference for the aqueous phase at pH 5.5.The STD-NMR technique was also applied to a pioneer study of the
Quorum Sensing using (S)-N-(3-oxo-octanoyl)-HSL and a strain of A. tumefaciens
NTL4(pZLR4). Liposome vesicles were used as membrane model to study the Quorum
Sensing mechanism. Finally, it was concluded that of diffusion acyl-HSLs through the
lipidic part of the bacterial cell membrane is an important event for a successful bacterial communication.
ÍNDICE
ÍNDICE
LISTA DE ABREVIATURAS ... xxi
ÍNDICE DE TABELAS ... xxiii
ÍNDICE DE FIGURAS... xxiv
1 – INTRODUÇÃO ... 1
1.1 – Química Supramolecular ... 3
1.2 – Considerações sobre Lipossomas ... 4
1.3 – Classificação dos Lipossomas ... 6
1.4 – Preparação dos Lipossomas ... 9
1.5 – Estabilidade e Aplicação dos Lipossomas ... 10
1.6 – Anestésicos Locais e sua Interação em Lipossomas ... 13
1.7 – Anestésicos Locais e as Ciclodextrinas ... 16
1.8 – Ressonância Magnética Nuclear (RMN) ... 18
1.8.1 – Rotational Frame Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy (ROESY 1D). 18 1.8.2 – Diffusion-Ordered Spectroscopy (DOSY). ... 20
1.8.3 – Saturation Transfer Difference (STD). ... 24
2 – OBJETIVOS ... 29
3 – RESULTADOS E DISCUSSÕES ... 33
3.1 –Topologia do Complexo Ternário Formado entre Proparacaína (PPC), β-ciclodextrina (β-CD) e Lipossomas (EPC) por RMN ... 35
3.1.1 – Considerações Gerais ... 35
3.1.2 – Formação de Complexo entre PPC e β-CD ... 37
3.1.2.1 – Determinação da Estequiometria entre PPC e β-CD ... 38
3.1.2.2 – Experimentos de Difusão do Complexo PPC/β-CD ... 41
3.1.2.3 – Experimentos de rOes Intermoleculares do Complexo PPC/β-CD .. 44
3.1.3 – Formação de Complexo entre PPC e EPC ... 45
3.1.3.1 – Experimentos de Difusão do Complexo PPC/EPC ... 46
3.1.3.2 – Experimentos de STD do Complexo PPC/EPC ... 48
3.1.4 – Topologia da Mistura PPC/β-CD/Lipossoma de EPC ... 52
3.1.4.1 – Experimentos de Difusão da Mistura PPC/β-CD/EPC ... 53
3.1.4.2 – Experimentos STD da Mistura PPC/β-CD/EPC ... 55
3.2 – Efeitos da Variação do pH na Encapsulação e Topologia do Complexo Ternário Prilocaína/ β-ciclodextrina/Lipossoma ... 60
ÍNDICE
_
3.2.1.1 – Determinação da Estequiometria entre PLC e β-CD ... 66
3.2.1.2 – Experimentos de Difusão do Complexo PLC/β-CD ... 68
3.2.1.3 – Experimentos de ROESY 1D do Complexo PLC/β-CD ... 70
3.2.2 – Formação de Complexo entre PLC e EPC ... 73
3.2.2.1 – Experimentos de DOSY do Complexo PLC/EPC ... 75
3.2.2.2 – Experimentos de STD do Complexo PLC/EPC ... 76
3.2.3 – Topologia da PLC em β-CD e Lipossoma de EPC ... 82
3.2.3.1 – Experimentos de Difusão da Mistura PLC/β-CD/EPC ... 82
3.2.3.2 – Experimentos de STD da Mistura PLC/β-CD/EPC ... 86
3.2.4 – Conclusões ... 91
3.3 – Interação Acil-Homoserina Lactona com Lipossomas e Células de Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4) ... 94
3.3.1 – Experimentos de rOes Intermoleculares entre acil-HSL/β-CD ... 98
3.3.2 – Interação entre HSL e células de Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4). ... 100
3.3.3 – Formação do Complexo entre HSL 1 e Lipossomas de EPC como Modelos de Membranas. ... 101
3.3.5 – Conclusões ... 105
4 – CONSIDERAÇÕES FINAIS... 107
5 – PARTE EXPERIMENTAL ... 111
5.1 – Instrumentação e Condições ... 113
5.1.1 – Preparação das Amostras ... 113
5.1.1.1 – Preparação dos Lipossomas ... 113
5.1.1.2 – Complexos Formados entre ALs/β-CD ... 113
5.1.1.3 – Complexos Formados entre ALs/EPC ... 114
5.1.1.4 – Complexos Formados entre ALs/β-CD/EPC ... 114
5.1.1.5 – Complexos Formados com acil-HSL ... 114
5.2 – Espectroscopia de Ressonânica Magnética Nuclear (RMN) ... 115
5.2.1 – RMN de 1H ... 116 5.2.2 – Experimentos de ROESY 1D ... 116 5.2.3 – Experimentos de Difusão ... 117 5.2.4 – Experimentos de Titulação ... 118 5.2.5 – Experimentos de STD ... 119 6 – REFERÊNCIAS ... 123 ANEXO A ... 133 ANEXO B ... 149
LISTA DE ABREVIATURAS
LISTA DE ABREVIATURAS
DOSY………..Diffusion-Ordered Spectroscopy
(Espectroscopia de Difusão Ordenada)
ROESY-1D……….…..Rotational Frame Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy
(Espectroscopia do Efeito Overhauser
Nuclear nas Coordenadas Girantes)
STD………...Saturation Transfer Difference
(Diferença de Transferência de Saturação)
GCSTESL ………….…...…Gradient-Compensated Stimulated Echo Spin Lock
(Gradiente Compensado de Trava de Eco de Spin Estimulado)
NOE...……….….Nuclear Overhauser Effect (Efeito Overhauser Nuclear)
HSQC...Heteronuclear Single Quantum Coherence
(Coerência Heteronuclear Quantum Simples)
HMBC………... Heteronuclear Multiple Bond Correlation
(Correlação Heteronuclear a Multimplas Ligações)
COSY………...…Correlation Spectroscopy (Espectroscopia de Correlação)
PPC………...……….………Proparacaína
PLC…………...………Prilocaína
EPC…………...……Egg phosphatidylcholine (Fosfatidilcolina de Ovo)
β-CD...Beta-Ciclodextrina
HSA…………...Human Serum Albumin (Albumina de Soro Humano)
K
d………...……...Constante de Dissociação
w
0...Frequência de Larmor
LISTA DE ABREVIATURAS
_
T
1...Tempo de Relaxação Longitudinal
T
1ρ...Tempo de Relaxação nas Coordenadas Girantes
at...Aquisition Time (Tempo de Aquisição)
δ
...Deslocamento Químico
B
0...Campo Magnético Estático
d
1...Tempo de Espera para Reciclagem
Hz...Hertz
lb...Line Broadening (Apodização para Aumentar a Razão Sinal/Ruído)
D...Coeficiente de Difusão
fx...Fração Molar
rf...Radiofrequência
Δ...Periodo de Difusão
K
a...Constante de Associação
I
on...Irradiação em Ressonância
I
off...Irradiação Fora de Ressonância
σ
inter...Transferência de Magnetização Intermolecular
MLV...Multilamelar Vesicles (Vesículas Multilamelares)
LUV...Large Unilamelar vesicles (Vesículas Unilamelares Grandes)
SUV...Small Unilamelar Vesicles (Vesículas Unilamelares Pequenas)
GUV...Giant Unilamellar Vesicles (Vesículas Unilamelares Gigantes)
MUV...Medium-Sized Unilamellar Vesicles (Vesículas Unilamelares Médias)
MVL...Multivesicular Liposomes (Lipossomas Multivesiculares)
OLV...Oligolamellar Vesicles (Vesículas Oligolamelares)
ÍNDICE DE TABELAS
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1 – Classificação de lipossomas quanto ao tamanho 8
Tabela 2 – Exemplo de moléculas de anestésicos locais. 14
Tabela 3 – Deslocamentos químicos de RMN de 1H da PPC, PPC/β-CD, PPC/EPC
e PPC/β-CD/EPC, com vesículas de EPC de 400 nm. 36 Tabela 4 – Coeficientes de Difusão (D) e constantes de associação (Ka) da PPC,
β-CD, EPC (400 nm), PPC/β-CD, PPC/EPC e PPC/β-CD/EPC. 37
Tabela 5 – Deslocamentos químicos da PLC, PLC/β-CD, PLC/EPC e
PLC/β-CD/EPC (500 MHz) nos pHs 10,0, 7,0 e 5,5. 62 Tabela 6 – Coeficientes de difusão (D) e constantes de ligação aparente (Ka) da
PLC, β-CD , EPC (400 nm), e dos complexos PLC/β-CD, PLC/EPC e
PLC/β-CD/EPC, em pH 10,0. 63
Tabela 7 – Coeficientes de difusão (D) e constantes de ligação aparente (Ka) da
PLC, β-CD , EPC (400 nm), e dos complexos PLC/β-CD, PLC/EPC e
PLC/β-CD/EPC, em pH 5,5. 64
Tabela 8 – Incrementos de rOe intermoleculares entre hidrogênios da PLC e
H-3 da β-CD. 71
Tabela 9 – Alargamento do sinal (em Hz) a meia altura para alguns hidrogênios da
PLC na ausência e presença de lipossomas de EPC em diferentes pHs. 74 Tabela 10 – Razão entre a transferência de saturação dos hidrogênios da PLC em
diferentes pHs. 81
Tabela 11 – Razão entre a transferência de saturação dos hidrogênios da PLC nos
diferentes pHs. 90
Tabela 12 – Condições experimentais utilizadas para o experimento de ROESY 1D. 116
Tabela 13 – Condições experimentais utilizadas para o experimento de DOSY. 118
Tabela 14 – Diluição para preparação das amostras para titulação. 119
Tabela 15 – Condições experimentais utilizadas para o experimento de STD dos
complexos EPC/ligantes. 121
Tabela 16 – Condições experimentais utilizadas para o experimento de STD dos
ÍNDICE DE FIGURAS
_
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 – Representação de um lipossoma multilamelar (MLV) encapsulando
substâncias hidrofílicas (amarelo), fidrofóbicas (azul), anfifílicas (verde), colesterol (vermelho) e proteínas (roxo). 5 Figura 2 – Moléculas de lipídios A) fosfatidilcolina, B) fosfatidilserinas e
C) fosfatidilgliceróis. 6
Figura 3 – Representação esquemática dos vários tipos de lipossomas: Vesículas
multilamelares (MLV), vesículas unilamelares pequenas (SUV), vesículas unilamelares grandes (LUV), vesículas unilamelares gigantes (GUV), lipossomas multivesículares (MVL), vesículas oligolamelares pequenas (SOV), vesículas oligolamelares grandes (LOV) e vesículas oligolamelares
gigantes (GOV). 8
Figura 4 – A) Imagem de um mini-extrusor e B) Componentes que compõem o
mini-extrusor. 10
Figura 5 – Representação esquemática da β-ciclodextrina. 16
Figura 6 – Dependência do NOE/ROE entre hidrogênios em relação ao produto da
frequência de ressonância (w0) e o tempo de correlação molecular (τc), levando em consideração o Bo (ν MHz). Figura modificada do artigo
[Otter et al., 1988]. 20
Figura 7 – Sequência de pulsos GCSTESL (Gradient-Compensated Stimulated
Echo Spin Lock). 23
Figura 8 – Esquema exibindo a transferência de saturação entre o receptor e as
moléculas ligantes. A ressonância do receptor é saturada através de um pulso seletivo. A ressonância das moléculas pequena não é afetada diretamente pelo pulso seletivo aplicado. As moléculas que interagem com o receptor (circulos) são saturadas por transferência de saturação intermolecular. A rápida mudança no equilíbrio entre ligantes ligados e no estado livre permite a detecção dessas moléculas na solução. 25 Figura 9 – Sequência de pulsos do experimento de STD, baseada na aplicação de
um trem de pulso seletivo (180º) na macromolécula, seguida de um pulso duro 90º (φ1) e um filtro T1ρ (φ2), onde ocorre a transferência de magnetização e eliminação dos sinais residuais da macromolécula do espectro. φ3, φ4, φ5 e φ6 forma uma sequência de WATERGATE para eliminar o sinal residual da HDO. 27
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 10 – Espectro de RMN de 1H (499,89 MHz, D2O/ referência H2O residual em 4,7 ppm) da β-CD [10 mmol L-1], PPC [10 mmol L-1] e da PPC em β-CD. Topo: molécula de proparacaína e região dos espectros da PPC e PPC/β-CD (6,50- 8,00 ppm) ampliada em destaque acima. 38 Figura 11 – Expansões dos espectros de RMN de 1H (499,89 MHz, D2O/ referência
H2O residual em 4,7 ppm) de soluções de PPC e β-CD em concentrações
diferentes. 40
Figura 12 – Gráfico representando a titulação através do método de Job para PPC e
β-CD. 41
Figura 13 – Espectro de DOSY (499,89 MHz, D2O/ referência H2O residual em
4,7 ppm) da PPC [10 mmol L-1]. 42
Figura 14 – Espectro de DOSY (499,89 MHz, D2O/ referência H2O residual em 4,7 ppm) da β-CD [10 mmol L-1]. 43 Figura 15 – Espectro de DOSY (499,89 MHz, D2O/ referência H2O residual em
4,7 ppm) do complexo PPC/β-CD. 43
Figura 16 – Espectro de RMN de 1H ROESY 1D (499,89 MHz, D2O/ referência H2O residual em 4,7 ppm) da mistura de PPC/β-CD. 45 Figura 17 – Formação do complexo PPC/β-CD e topologias alternativas. A) parte
aromática inclusa na β-CD e B) grupo N-etil incluso na cavidade da β-CD. 45 Figura 18 – Espectro de RMN de 1H (499,89 MHz, D2O/ referência H2O residual em
4,7 ppm) da PPC e do complexo PPC/EPC. 46 Figura 19 – Espectro de DOSY (499,89 MHz, D2O/ referência H2O residual em
4,7 ppm) da vesícula lipossomal de EPC 400 nm [5 mmol L-1]. 47 Figura 20 – Espectro de DOSY (499,89 MHz, D2O/ referência H2O residual em
4,7 ppm) do complexo PPC/EPC. 48
Figura 21 – A) Espectro de RMN de 1H (499,89 MHz, D2O/ referência H2O residual em 4,7 ppm) da PPC [10 mmol L-1] em EPC [5 mmol L-1], (400 nm). B) Espectro controle (irradiando em 30 ppm) C) Espectro de STD (irradiando em -0,5 ppm). Comprimento de pulso igual a 50 ms, n = 50, tempo total de saturação 2,55 s. Valor de NOE transferido para o H-1c normalizado como 100% foi de 2,36 10-3. Topo: Molécula de PPC. 50
ÍNDICE DE FIGURAS
_
Figura 22 – A) Espectro de RMN de 1H (499,89 MHz, D2O/ referência H2O residual em 4,7 ppm) da PPC [10 mmol L-1] em EPC [5 mmol L-1], (MLV). B) Espectro controle (irradiando em 30 ppm) C) Espectro de STD (irradiando em -0,5 ppm). Comprimento de pulso igual a 50 ms, n = 50, tempo total de saturação 2,55 s. Valor de NOE transferido para o H-1c normalizado como 100% foi de 2,27 10-3. Topo: Molécula de PPC. 51 Figura 23 – A) Espectro de RMN de 1H (499,89 MHz, D2O/ referência H2O residual
em 4,7 ppm) da PPC [10 mmol L-1] em EPC [5 mmol L-1], (100 nm). B) Espectro controle (irradiando em 30 ppm) C) Espectro de STD (irradiando em -0,5 ppm). Comprimento de pulso igual a 50 ms, n = 50, tempo total de saturação 2,55 s. Valor de NOE transferido para o H-1c normalizado como 100% foi de 2,87 10-3. Topo: Molécula de PPC. 52
Figura 24 – Espectro de DOSY (499,89 MHz, D2O/ referência H2O residual em
4,7 ppm) do complexo PPC/β-CD/EPC. Os sinais de 1H do EPC não
aprecem no espectro. 53
Figura 25 – A) Espectro de RMN de 1H ROESY 1D da mistura PPC/β-CD/EPC
(499,89 MHz, D2O/ referência H2O residual em 4,7 ppm). B) Espectro de RMN de 1H da mistura de PPC/β-CD/EPC. 55 Figura 26 – A) Espectro de RMN de 1H (499,89 MHz, D2O/ referência H2O residual
em 4,7 ppm) da PPC [10 mmol L-1] em β-CD [10 mmol L-1] em EPC [5 mmol L-1] (400 nm). B) Espectro controle (irradiando em 30 ppm) C) Espectro de STD (irradiando em -0,5 ppm). Comprimento de pulso igual a 50 ms, n = 50, tempo total de saturação 2,55 s. Valor de NOE transferido para o H-3 normalizado como 100% foi de 1,77 10-3. Topo: Molécula de
PPC. 56
Figura 27 – A) Espectro de RMN de 1H (499,89 MHz, D2O/ referência H2O residual em 4,7 ppm) da PPC [10 mmol L-1] em β-CD [10 mmol L-1] em EPC [5 mmol L-1] (MLV). B) Espectro controle (irradiando em 30 ppm) C) Espectro de STD (irradiando em -0,5 ppm). Comprimento de pulso igual a 50 ms, n = 50, tempo total de saturação 2,55 s. Valor de NOE transferido para o H-1c normalizado como 100% foi de 1,17 10-3. Topo: Molécula de PPC. 57
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 28 – A) Espectro de RMN de 1H (499,89 MHz, D2O/ referência H2O residual em 4,7 ppm) da PPC [10 mmol L-1] em β-CD [10 mmol L-1] em EPC [5 mmol L-1] (100 nm). B) Espectro controle (irradiando em 30 ppm) C) Espectro de STD (irradiando em -0,5 ppm). Comprimento de pulso igual a 50 ms, n = 50, tempo total de saturação 2,55 s. Valor de NOE transferido para o H-1c normalizado como 100% foi de 2,39 10-3. Topo: Molécula de
PPC. 58
Figura 29 – Espectro de RMN de 1H (499,89 MHz, D2O/ referência H2O residual em 4,7 ppm) da PLC (10 mmol L-1) A) em pH 10,0, B) em pH 7, C) em pH 5,5. Topo: Molécula de prilocaína e expansão do espetro. 61 Figura 30 – Espectro de RMN de 1H (499,89 MHz, D2O/ referência H2O residual em
4,7 ppm) da PLC [10 mmol L-1], β-CD [10 mmol L-1] e da PLC em β-CD,
em pH 10. 65
Figura 31 – Espectro de RMN de 1H (499,89 MHz, D2O/ referência H2O residual em 4,7 ppm) da PLC [10 mmol L-1], β-CD [10 mmol L-1] e da PLC em β-CD,
pH 7. 66
Figura 32 – Expansões dos espectros de RMN de 1H (499,89 MHz, D2O/ referência H2O residual em 4,7 ppm) de soluções de PLC e β-CD em diferentes
concentrações. 67
Figura 33 – Moléculas de lidocaína (a) e prilocaína (b). 68
Figura 34 – Espectro de DOSY (499,89 MHz, D2O/ referência H2O residual em 4,7 ppm) da PLC [10 mmol L-1], pH 10,0. 69 Figura 35 – Espectro de DOSY (499,89 MHz, D2O/ referência H2O residual em
4,7 ppm) da PLC/β-CD [10 mmol L-1], pH 10,0. 70 Figura 36 – Espectro de RMN de 1H ROESY 1D (499,89 MHz, D2O/ referência H2O
residual em 4,7 ppm) da mistura de PLC/β-CD em pH 10,0. 71 Figura 37 – Formação do complexo PLC/β-CD e topologia alternativa em pH 10,0. 71 Figura 38 – Espectro de RMN de 1H ROESY 1D (499,89 MHz, D2O/ referência H2O
residual em 4,7 ppm) da mistura de PLC/β-CD em pH 7,0. 72 Figura 39 – Espectro de RMN de 1H ROESY 1D (499,89 MHz, D2O/ referência H2O
residual em 4,7 ppm) da mistura de PLC/β-CD em pH 5,5. 72 Figura 40 – Formação do complexo PLC/β-CD e topologias alternativas a partir dos
dados de ROE, A) parte aromática inclusa em β-CD, B) parte N-propil inclusa em β-CD em pH 7,0 e 5,5. 73
ÍNDICE DE FIGURAS
_
Figura 41 – Espectro de RMN de 1H (499,89 MHz, D2O/ referência H2O residual em 4,7 ppm): A) PLC [10 mmol L-1] pH 10; B) PLC/EPC pH 10,0; C) PLC/EPC pH 7,0 e PLC/EPC pH 5,5. 75 Figura 42 – Espectro de DOSY (499,89 MHz, D2O/ referência H2O residual em
4,7 ppm) do complexo PLC/EPC em pH 10,0. 76 Figura 43 – A) Espectro de RMN de 1H (499,89 MHz, D2O/ referência H2O residual
em 4,7 ppm) da PLC em lipossomas de EPC (400 nm). B) Espectro controle (irradiando em 30 ppm). C) Espectro de STD (irradiando em -0,5 ppm), em 298 K e pH 10,0. Comprimento de pulso igual a 50 ms, n = 50, tempo total de saturação 2,55 s. Valor de NOE transferido para o H-14 normalizado como 100% foi de 57,0 10-3.Topo: molécula de PLC. 77 Figura 44 – A) Espectro de RMN de 1H (499,89 MHz, D2O/ referência H2O residual
em 4,7 ppm) da mistura PLC em lipossomas de EPC (400 nm). B) Espectro controle (irradiando em 30 ppm). C) Espectro de STD (irradiando em -0,5 ppm), em 298 K e pH 7,0. Comprimento de pulso igual a 50 ms, n = 50, tempo total de saturação 2,55 s. Valor de NOE transferido para os H-aromáticos normalizados como 100% foi de 7,2 10-3. Topo: molécula de PLC. A sobreposição dos sinais H-10 e H-13 impede encontrar um valor preciso de transferência de saturação para cada sinal. 78 Figura 45 – A) Espectro de RMN de 1H (499,89 MHz, D2O/ referência H2O residual
em 4,7 ppm) da PLC em lipossomas de EPC (400 nm). B) Espectro controle (irradiando em 30 ppm). C) Espectro de STD (irradiando em -0,5 ppm), em ressonância, em 298 K e pH 5,5. Comprimento de pulso igual a 50 ms, n = 50, tempo total de saturação 2,55 s. Valor de NOE transferido para o H-14 normalizado como 100% foi de 19,5 10-3. Topo: molécula de PLC. A sobreposição dos sinais H-10 e H-13 impede encontrar um valor preciso de transferência de saturação para cada sinal. 79 Figura 46 – Transferência de saturação para os hidrogênios da PLC na mistura PLC e
lipossoma. A) em pH 10,0, B) pH 7,0, C) pH 5,5. Topo: Molécula de prilocaína forma protonada e não protonada. 80 Figura 47 – Espectro de DOSY (499,89 MHz, D2O/ referência H2O residual em
4,7 ppm) do complexo PLC/β-CD /EPC em pH 10,0. 84 Figura 48 – Espectro de RMN de 1H ROESY 1D (499,89 MHz, D2O/ referência H2O
residual em 4,7 ppm) da mistura de PLC/β-CD/EPC em pH 10,0. 85 Figura 49 – Espectro de RMN de 1H ROESY 1D (499,89 MHz, D2O/ referência H2O
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 50 – Espectro de RMN de 1H (499,89 MHz, D2O/ referência H2O residual em 4,7 ppm): A) PLC [10 mmol L-1] pH 10,0; B) PLC/β-CD/EPC pH 10,0; C) PLC/β-CD/EPC pH 7,0 e PLC/β-CD/EPC pH 5,5. 86 Figura 51 – A) Espectro de RMN de 1H (499,89 MHz, D2O/ referência H2O residual
em 4,7 ppm) da PLC [10 mmol L-1] em β-CD [10 mmol L-1] e lipossomas de EPC [5 mmol L-1] (400 nm). B) Espectro controle (irradiando em 30 ppm). C) Espectro de STD (irradiando em -0,5 ppm), em 298 K e pH 10,0. Comprimento de pulso igual a 50 ms, n = 50, tempo total de saturação 2,55 s. Valor de NOE transferido para os H-aromáticos normalizados como 100% foi de 2,15 10-3. Topo: molécula de PLC. 87
Figura 52 – A) Espectro de RMN de 1H (499,89 MHz, D2O/ referência H2O residual
em 4,7 ppm) da PLC [10 mmol L-1] em β-CD [10 mmol L-1] e lipossomas de EPC [5 mmol L-1] (400 nm). B) Espectro controle (irradiando em 30 ppm). C) Espectro de STD (irradiando em -0,5 ppm), em 298 K e pH 7,0. Comprimento de pulso igual a 50 ms, n = 50, tempo total de saturação 2,55 s. Valor de NOE transferido para o H-14 normalizado como 100% foi de 1,60 10-3. Topo: molécula de PLC. 88 Figura 53 – A) Espectro de RMN de 1H (499,89 MHz, D2O/ referência H2O residual
em 4,7 ppm) da PLC [10 mmol L-1] em β-CD [10 mmol L-1] e lipossomas de EPC [5 mmol L-1] (400 nm). B) Espectro controle (irradiando em 30 ppm). C) Espectro de STD (irradiando em -0,5 ppm), em 298 K e pH 5,5. Comprimento de pulso igual a 50 ms, n = 50, tempo total de saturação 2,55 s. Valor de NOE transferido para o H-14 normalizado como 100% foi de 1,67 10-3. Topo: molécula de PLC. 89 Figura 54 – Transferência de saturação para os hidrogênios da PLC na mistura PLC e
lipossoma. A) em pH 10,0, B) pH 7,0, C) pH 5,5. 90 Figura 55 – Mecanismo de Quorum Sensing usando as proteínas Lux e acil-HSLs. 95
Figura 56 – Molécula de (S)-N-(3-oxo-octanoil)-HSL 1. 96
Figura 57 – A) Espectro de RMN de 1H (499,89 MHz, D2O/DMSOd6 20%/
referência H2O residual em 4,7 ppm) da (S)-N-(3-oxo-octanoil)-HSL [10 mmol L-1], B) da β-CD [10 mmol L-1] e C) da mistura HSL/β-CD
(D2O), 298 K e pH 7,0. 99
Figura 58 – A) Espectro de RMN de 1H ROESY 1D da mistura HSL/β-CD
(499,89 MHz, D2O/ referência H2O residual em 4,7 ppm). B) Espectro de RMN de 1H da mistura de HSL/β-CD. 99
ÍNDICE DE FIGURAS
_
Figura 60 – A) Espectro RMN (499,89 MHz, D2O/ referência H2O residual em 4,7 ppm) da mistura HSL [10 mmol L-1], β-CD [10 mmol L-1] e células de
Agrobacterium tumefaciens [16 mg]. B) Espectro controle (irradiando
em 30 ppm). C) Espectro de STD (irradiando em -0,5 ppm). Comprimento de pulso igual a 50 ms, n = 50, tempo total de saturação 2,55 s. Valor de NOE transferido para o H-6’,7’ normalizado como 100% foi de 4,8 10-3.
Topo: Estrutura da (S)-N-(3-oxo-octanoil)-HSL. 101 Figura 61 – A) Espectro RMN de 1H (499,89 MHz, D2O/ referência H2O residual em
4,7 ppm) da mistura HSL [10 mmol L-1], β-CD [10 mmol L-1] e EPC lipossomas [5 mmol L-1], 400 nm. B) Espectro controle (irradiando em 30 ppm). C) Espectro de STD (irradiando em -0,5 ppm). Comprimento de pulso igual a 50 ms, n = 50, tempo total de saturação 2,55 s. Valor de NOE transferido para o H-6’,7’ normalizado como 100% foi de 89,0 10-3. Topo:
Estrutura da (S)-N-(3-oxo-octanoil)-HSL. 103 Figura 62 – Espectro RMN de 1H (499,89 MHz, D2O/ referência H2O residual em
4,7 ppm) da mistura HSL [10 mmol L-1], β-CD [10 mmol L-1] e HSA [0,07 mmol L-1], 400 nm. A) Espectro controle (irradiando em 30 ppm). B) Espectro de STD (irradiando em -0,5 ppm). Comprimento de pulso igual a 50 ms, n = 50, tempo total de saturação 2,55 s. Valor de NOE transferido para o H-8’ normalizado como 100% foi de 125 10-3. Topo: Estrutura da
(S)-N-(3-oxo-octanoil)-HSL. 104
Figura 63 – Gráfico do fator STD (%) versus tempo de saturação para o complexo
INTRODUÇÃO
1 – INTRODUÇÃO
1.1 – Química Supramolecular
A química molecular desenvolveu procedimentos poderosos para construir
as mais sofisticadas moléculas com átomos conectados por ligações covalentes. Ao
lado da química molecular encontra-se a química supramolecular, termo
introduzido pela primeira vez em 1988 por Jean-Marie Lehn [Lehn, 1988], que
definiu a química supramolecular como a “química além das moléculas”, entidades
organizadas de alta complexidade que resulta da associação de duas ou mais
espécies químicas unidas por forças intermoleculares [Diederich, 2007]. Através da
manipulação apropriada destas interações de natureza não covalente (ligações de
van der Waals, ligação de hidrogênio, interações iônicas e coordenação de metal),
a química supramolecular tem sido um dos campos mais interessantes da química
moderna e transformou-se progressivamente na química da informação molecular,
envolvendo estudos das características estruturais como os processos moleculares
de auto-reconhecimento e auto-organização que representam a concepção básica da
química molecular [Lehn, 2002; Banerjee et al., 2004; MacDonald et al., 2004].
O conhecimento da auto-organização das estruturas dá acesso a materiais
supramoleculares avançados, tais como polímeros e cristais líquidos, e fornecem
uma aproximação original à nanociência e à nanotecnologia. Hoje são conhecidos
muitos sistemas supramoleculares como os criptofanos, as ciclodextrinas e os
calixarenos, e assim, o estudo de complexos formados por esses sistemas com
drogas revela novas propriedades químicas, físicas e biológicas [Liu et al., 2004].
O nosso grupo desenvolve uma linha de pesquisa fundamentada na química
supramolecular. Essa linha de pesquisa foi iniciada no final da década de 90 com
complexos de ciclodextrinas [Borges, 2001; Laverde et al., 2002], utilizando a
INTRODUÇÃO
_
Ressonância Magnética Nuclear (RMN) como ferramenta analítica principal e
implementando metodologias apropriadas como medidas de difusão (DOSY) e
efeito Overhauser nuclear nas coordenadas girantes (ROE). Nos anos subseqüentes
foram avaliados outros sistemas supramoleculares como calixarenos [Fernandes
et al., 2005] e mais recentemente foram implantadas novas técnicas (NMR-STD,
WaterLogsy, NOE-pumping e DOSY-NOESY) visando o estudo do sítio ativo de
proteínas [Figueiredo et al., 2007].
Entre as moléculas e sistemas estudados na química supramolecular
encontram-se os lipossomas, os quais são sistemas transportadores eficientes de
biomoléculas [Lasic et al., 1995; Lasic et al., 1996; Nunez, 2000; de Mareuil et al.,
2002]. A liberação controlada de drogas encapsuladas em lipossomas leva a uma
melhor resposta farmacológica e com maior absorção do que os mesmos ativos
livres [DiSapio, 1999], abrindo as perspectivas da aplicação dos lipossomas para a
liberação controlada de drogas. Neste aspecto, o estudo das interações de
princípios ativos, como anestésicos locais com lipossomas utilizando técnicas de
ressonância magnética nuclear como RMN-STD, podem levar à melhor
compreensão destas interações e eventual desenvolvimento de fármacos e
princípios ativos mais eficientes, aumentando, dessa forma, a eficiência da ação
terapêutica e retenção da sua estrutura e atividade por mais tempo [Moraes, 1996;
Zalloum, 2001; Fraceto et al., 2002].
1.2 – Considerações sobre Lipossomas
Os Lipossomas são vesículas constituídas de uma ou mais camadas de
lipídios separados por compartimentos aquosos e são usados no campo
farmacêutico como agentes carreadores e liberadores de drogas devido sua
INTRODUÇÃO
encapsular substâncias hidrofílicas em seu cerne aquoso e as hidrofóbicas e
anfifílicas em suas bicamadas (Figura 1).
Figura 1 – Representação de um lipossoma multilamelar (MLV) encapsulando substâncias
hidrofílicas (amarelo), fidrofóbicas (azul), anfifílicas (verde), colesterol (vermelho) e proteínas (roxo).
Os liposomas apresentam baixa toxicidade, são biodegradáveis e capazes de
proteger os compostos encapsulados da diluição e degradação, de forma que,
quando alcançam os tecidos alvos podem liberar doses concentradas do
medicamento, aumentando a eficácia do tratamento. Os lipossomas modificam as
propriedades farmacocinéticas, o tempo de trânsito na circulação sanguínea e o
metabolismo da droga encapsulada [Santos et al., 2002; Goniotaki et al., 2004;
Puglia et al., 2004]. A liberação controlada de drogas encapsuladas em lipossomas
apresenta menores efeitos colaterais, logo menor toxicidade [Moraes, 1996;
DiSapio, 1999; Zalloum, 2001].
As vesículas lipossomais são constituídas basicamente por fosfolipídeos. Os
lipídeos mais utilizados nas formulações de lipossomas são os que se aproximam
de uma forma cilíndrica como as fosfatidilcolinas, fosfatidilserinas e
INTRODUÇÃO
_
fosfatidilgliceróis, que tendem a formar uma bicamada estável em solução aquosa
(Figura 3). As fosfatidilcolinas são as mais empregadas em estudos de formulação
de lipossomas, pois apresentam grande estabilidade frente a variações de pH ou da
concentração de sal no meio [Batista et al., 2007].
Figura 2 – Moléculas de lipídios A) fosfatidilcolina, B) fosfatidilserinas e C) fosfatidilgliceróis.
1.3 – Classificação dos Lipossomas
Os lipossomas podem ser classificados com relação ao seu tamanho e ao
número de lamelas existentes, podendo ser divididos em três categorias princípais
INTRODUÇÃO
• Vesículas Multilamelares (MLV – Multilamelar Vesicles):
formas lipossomais formadas por bicamadas fosfolipídicas
concêntricas intercaladas por compartimentos aquosos, cujo
diâmetro varia de 400 a 3500 nm.
• Vesículas unilamelares grandes (LUV – Large Unilamelar vesicles):
formas lipossomais constituídas por apenas uma bicamada
fosfolipídica, mas com uma grande cavidade aquosa. Diâmetro
varia de 200 a 1000 nm.
• Vesículas unilamelares pequenas (SUV – Small Unilamelar Vesicles):
formas lipossomais constituídas por apenas uma bicamada
fosfolipídica e um pequeno compartimento aquoso. Diâmetro
varia de 20 a 50 nm.
Além dessas categorias existem ainda as vesículas unilamelares gigantes ou
GUV (Giant Unilamellar Vesicles), com dimensões superiores a 1 µm, podendo
chegar a dezenas de µm, tamanho comparável ao de uma célula eucariótica.
Alguns autores definem ainda uma classe de vesículas unilamelares médias ou
MUV (Medium-Sized Unilamellar Vesicles), com dimensões compreendidas entre
as SUV e as LUV. De menor importância, mas também caracterizados,
encontram-se os lipossomas multivesiculares ou MVL (Multivesicular Liposomes) e as
vesículas oligolamelares ou OLV (Oligolamellar Vesicles) que, à semelhança das
unilamelares, podem ser subdivididas em pequenas, grandes e gigantes
(SOV, LOV e GOV). Observa-se na Tabela 1 e Figura 3 um resumo da
classificação destes lipossomas quanto ao tamanho [Santos et al., 2002].
INTRODUÇÃO
_
Tabela 1 – Classificação de lipossomas quanto ao tamanho
Classificação Diâmetro
das
vesículas
Vesícula Multilamelar (MLV)
400 a 3500 nm
Vesícula Unilamelar Grande (LUV)
200 a 1000 nm
Vesícula Unilamelar Pequena (SUV)
20 a 50 nm
Vesícula Unilamelar Gigante (GUV)
> 1000 nm
Vesícula Multivisicular (MUV)
50 a 100 nm
Vesícula Oligolamelar (OLV)
0,1 a 1 µm
Figura 3 – Representação esquemática dos vários tipos de lipossomas: Vesículas multilamelares
(MLV), vesículas unilamelares pequenas (SUV), vesículas unilamelares grandes (LUV), vesículas unilamelares gigantes (GUV), lipossomas multivesículares (MVL), vesículas
INTRODUÇÃO
1.4 – Preparação dos Lipossomas
A maioria dos métodos de preparação de vesículas lipídicas inclui a
hidratação de um filme lipídico, onde os lipídios são primeiramente dissolvidos em
solvente orgânico, seguido da evaporação do solvente com consequente formação
do filme. A hidratação deste filme pode ser efetuada com água ou solução tampão,
sob agitação magnética vigorosa, promovendo a formação da dispersão de
lipossomas multilamelares (MLV). O fármaco a ser encapsulado pode ser
incorporado na solução tampão ou dissolvido na mistura lipídica (lipofílicos).
A obtenção de vesículas unilamelares grandes e pequenas (LUV e SUV) tem
como base a utilização de uma suspensão de vesículas multilamelares. A partir da
dispersão de MLV, utilizam-se vários métodos para produzir dispersões
homogêneas de SUV e LUV: como processos mecânicos, eletrostáticos ou
químicos. Os processos mais frequentes são os mecânicos, que podem incluir a
sonicação ou a extrusão dos lipídios através de membranas de policarbonato com
diferentes porosidades [Santos et al., 2002].
O processo de extrusão geralmente é realizado utilizando-se um extrusor
com pressão a base de nitrogênio. A pressão é aplicada sobre os lipossomas MLV
forçando-os através de filtros (normalmente de policarbonato) com tamanhos de
poros adequados para o tamanho de lipossoma desejado. O processo de extrusão
também pode ser realizado utilizando um mini-extrusor (Figura 4). Neste caso, a
pressão exercida pelo usuário força a passagem das vesículas lipossomais MLV de
uma seringa para outra através de filtros com diâmetro desejado. As vesículas
preparadas no mini-extrusor apresentam distribuição de tamanho da partícula da
vesícula unilamelar em função do poro e do número de passadas pela membrana do
extrusor. Um mínimo de onze passadas através da membrana é recomentado.
INTRODUÇÃO
_
A
B
Figura 4 – A) Imagem de um mini-extrusor e B) Componentes que compõem o mini-extrusor.
1.5 – Estabilidade e Aplicação dos Lipossomas
A estabilidade dos lipossomas pode ser afetada por fatores químicos, físicos
e biológicos. Dependendo da sua composição, as formulações finais dos
lipossomas podem apresentar um curto tempo de meia-vida, em parte devido à
instabilidade física e química [Sharma et al., 1997; Batista et al., 2007].
INTRODUÇÃO
a hidrólise do éster e a oxidação da insaturação localizada na cadeia lipídica
[Saetern et al., 2005]. Esse problema pode ser superado pela conservação dos
lipossomas em atmosfera de nitrogênio e argônio, pelo uso de antioxidantes como
alfa-tocoferol na preparação, como também a liofilização da formulação final
[Sharma et al., 1997; Cacela et al., 2006].
A instabilidade física dos lipossomas pode ser causada por processos de
agregação e fusão das vesículas e o extravasamento do fármaco encapsulado. A
adição de uma pequena quantidade de lipídios carregados (estearilamina ou
dicetilfosfato) na preparação de lipossomas produz repulsão eletrostática entre as
vesículas, reduzindo a agregação e a fusão das vesículas [Sharma et al., 1997].
No caso da instabilidade biológica, um dos maiores pré-requisitos para o uso
de lipossomas como carreadores de fármacos in vivo é que eles devem circular e
reter o fármaco por tempo suficiente para alcançar o sítio efetivo. Assim, a grande
desvantagem dos lipossomas convencionais é a sua eliminação da circulação pelo
sistema retículo-endotelial [Sapra et al., 2003]. A solução deste problema pode ser
alcançada através do desenvolvimento de sistemas lipídicos modificados
(essencialmente pela inserção de certas moléculas na sua camada externa), com
novas possibilidades de transporte ativo, evitando a sua eliminação pelo sistema
retículo-endotelial [Gregoriadis et al., 1975; Sunamoto et al., 1986;
Cohen et al., 1995; Lasic et al., 1995; Santos et al., 2002].
Apesar das limitações práticas da utilização de lipossomas como sistemas
transportadores de fármacos, a utilização de vesículas lipídicas continua a ter
grandes vantagens relativamente a outras famílias de transportadores. Sendo que,
uma das principais vantagens da utilização de lipossomas como transportadores é a
facilidade de incorporação de um fármaco, independentemente da sua carga ou
massa molecular. Além disso, os sistemas de vesículas lipídicas encontram-se
caracterizados em termos de estrutura, estabilidade, físico-química, toxicidade,
INTRODUÇÃO
_
imunogenicidade e formas de administração in vivo (intravenosa, intramuscular,
subcutânea, dérmica, ocular, pulmonar, nasal ou oral), dispondo-se de um vasto
leque de possibilidades na escolha do sistema mais adequado para cada fim
[Santos et al., 2002].
Atualmente, já são disponíveis diversas formulações farmacológicas
comerciais utilizando lipossomas como carreadores, como por exemplo no
tratamento de câncer. Embora a indústria farmacêutica seja bem sucedida no
desenvolvimento de fármacos antineoplásicos, sua administração causa toxicidade
sistêmica. Uma estratégia alternativa para este problema é o uso de lipossomas
como carreadores de fármacos antineoplásicos para alcançar a acumulação seletiva
do fármaco no tecido tumoral com toxicidade mínima para as células saudáveis,
alterando a farmacocinética e biodistribuição dos fármacos antineoplásicos
[Mamot et al., 2003].
Na fabricação de vacinas os lipossomas são aplicados como veículos de
liberação de antígenos como adjuvante imunológico, apresentando vantagens como
a fácil preparação, baixa toxicidade, biocompatibilidade e biodegradabilidade,
assim como a liberação lenta de antígenos encapsulados [Ben-Yehuda et al., 2003;
Mazumdar et al., 2004]. Também pode ser encontrado na terapia de doenças
infecciosas e parasitárias. Pesquisas realizadas em camundongos [Labana et al.,
2002; Frezard et al., 2005] exibiram liberação controlada dos fármacos
encapsulados em lipossomas para doenças como tuberculose e leishmaniose.
Outra aplicação das vesículas lipossomais é no ecapsulamento de anestésicos
locais (ALs) [de Paula et al., 1996; Pinto et al., 2000; Fraceto et al., 2002; Cereda
et al., 2004; Uhrikova et al., 2004], aumentando o tempo de meia-vida dos ALs
in vivo [Grant et al., 2001; Grant, 2002], prolongando o efeito da anestesia e
diminuindo os efeitos colaterais.
INTRODUÇÃO
1.6 – Anestésicos Locais e sua Interação em Lipossomas
Os anestésicos locais (ALs) são compostos químicos que promovem o
bloqueio reversível da condução nervosa. O primeiro composto a ser utilizado
como anestésico local foi a cocaína, um alcalóide isolado das folhas de
Erithroxylon coca, que teve sua ação demonstrada por Köller (1884)
[Grzybowski, 2008] ao utilizá-la como anestésico oftálmico. Foi empregada
clinicamente durante muito tempo e foi substituída por outras substâncias devido
aos seus efeitos colaterais como dependência química e psíquica.
Anestésicos locais compreendem um grande número de moléculas com
diferentes funções químicas: amino-ésteres, amino-amidas, amino-cetonas, amidas,
poliesteres, etc (Tabela 2) [Gupta, 1991], capazes de bloquear a condução do
estímulo nervoso. ALs diferem dos anestésicos gerais por sua ação regional e pelo
modo de aplicação, sendo os últimos aplicados via sistêmica direta (sangue) ou
indireta (pulmões). Além disso, ALs agem sobre os axônios, enquanto os
anestésicos gerais atuam nas transições sinápticas [de Jong, 1994].
O mecanismo de ação dos anestésicos locais está relacionado com o
desequilíbrio iônico interno e externo da membrana, os ALs bloqueiam os canais
do Na
+, impedindo o fluxo de íons necessários à despolarização da membrana do
axônio [Covino et al., 1985; de Jong, 1994; de Araujo et al., 2008]. Além disso, os
ALs agem sobre as membranas expandindo a bicamada, diminuindo a temperatura
de transição de fases, diminuindo a organização e aumentando a dinâmica [Fraceto
et al., 2002; Fraceto et al., 2004; Fraceto et al., 2005]. Acredita-se que a
diminuição da permeabilidade da membrana aos íons de sódio ocorra por dois
mecanismos: i) interação específica do anestésico local com o canal de sódio, ii)
por alterações gerais na fluidez da membrana (levando a modificações
INTRODUÇÃO
_
ação dos ALs é modulado pelas interações com os lipídios da membrana e também
com a proteína do canal de sódio.
Tabela 2 – Exemplo de moléculas de anestésicos locais.
Anestésico Abrev. R
1R
2X
Procaína
Benzocaína
Tetracaína
PRC
BZC
TTC
- H
- H
- C
4H
9- CH
2-N(C
2H
5)
2- CH
3- CH
2-N(CH
3)
2- H
- H
- H
C O O NH R1 X CH2Proparacaína
PPC
-OC
3H
7- CH
2-N(C
2H
5)
2-
NH2 R1 C O O CH2 R2Lidocaína
LDC
- CH
3 CH2 N C2H5 C2H5Prilocaína
PLC
- H
CH CH3 N H C3H7 R1 NH CH3 C R2 OMepivacaína
MVC
- CH
3 N CH3INTRODUÇÃO
Os anestésicos locais do tipo amino-amida são os mais empregados na
clínica médica e odontológica nos dias de hoje, devido a suas vantagens
farmacológicas em relação aos amino-ésteres, como: menor velocidade de
hidrólise, maior estabilidade e tempo de ação, além de menor toxicidade
[de Araujo et al., 2008]. Dentre as amino-amidas a prilocaína destaca-se por ter
atividade farmacológica similar à lidocaína (o AL de maior utilização em anestesia
regional no mundo inteiro) porém com menor toxicidade e com larga utilização em
odontologia [Cereda et al., 2004; Cereda et al., 2006]. Efeitos adversos do uso da
prilocaína estão associados ao aparecimento de meta-hemoglobinemia quando
usada em altas doses. Isto se dá pela ação da ortotoluidina, que é um produto da
hidrólise da prilocaína por amidases hepáticas [Malamed, 2001] e que é capaz de
oxidar a hemoglobina.
A proparacaína, um AL do tipo amina-éster, apresenta propriedades
farmacológicas similares a lidocaína, tetracaína e bupivacaína. É normalmente
usada como anestésico local em consultórios oftalmológicos e clínicas veterinárias
[Stiles et al., 2001; Dincel et al., 2007]. Deve ser armazenada em temperaturas
amenas (4-8 ºC) e protegida da luz, com o intuito de evitar sua degradação
química.
A proposta do uso de AL encapsulada em lipossomas tem como vantagens a
liberação lenta da droga, prolongando a duração da anestesia e a redução da
toxicidade [Langerman et al., 1992; Mowat et al., 1996]. Logo, o conhecimento
preciso da interação entre o AL e lipossomas (mimetizando uma membrana), bem
como topologia do complexo formado é fundamental para desenvolvimento de
anestésicos mais eficazes e potentes.
INTRODUÇÃO
_
1.7 – Anestésicos Locais e as Ciclodextrinas
Em solução aquosa quase todas as drogas estão sujeitas a alguma degradação
e, frequentemente, a atividade terapêutica é prejudicada pela instabilidade da droga
[Loftsson et al., 1996]. A consequência mais comum da degradação da droga é a
perda da sua eficiência e em alguns casos os produtos de degradação são tóxicos.
Para aumentar a estabilidade e solubilidade de drogas em solventes aquosos
utilizam-se diversas técnicas tais como ajuste do pH das soluções aquosas,
suspensões lipossomais tamponadas e formação de géis e emulsões
[Ennis et al., 1986; McCormack et al., 1998]. Outra alternativa é o uso de
complexos de ciclodextrinas que diminui a toxicidade local e/ou sistêmica, protege
contra degradação e favorece o prolongamento da anestesia [de Araujo et al.,
2003].
Ciclodextrinas (Figura 5) [Loukas et al., 1998] são oligossacarídeos cíclicos
compostos por 6-8 unidades de glicoses (
α
-CD,
β
-CD,
γ
-CD, respectivamente),
unidas através de ligações α-1,4.
INTRODUÇÃO
Estes compostos possuem exterior hidrofílico e uma cavidade interna
hidrofóbica [Al-nouti et al., 2002; Fraceto et al., 2007]. Complexos formados por
β
-ciclodextrinas (
β
-CD) são particularmente interessantes como sistemas
liberadores de drogas devido à melhora na solubilidade aquosa, estabilidade
química e biodisponibilidade [Uekama, 2004]. Entretanto estes complexos são
rapidamente removidos da circulação sanguínea quando passam pelo sistema renal,
podendo moléculas de
β
-ciclodextrinas induzirem toxicidade nos rins,
especialmente depois de uso crônico [Frank et al., 1976; McCormack et al., 1996;
Fatouros et al., 2001]. Quando complexos de inclusão droga/CD são injetados
intravenosamente uma rápida dissociação ocorre, quer por diluição ou por
deslocamento da droga por outros componentes do sangue. A droga liberada é
então metabolizada como uma droga livre e uma quantidade da ciclodextrina é
excretada através dos rins [Valentino et al., 2008]. Portanto, ciclodextrinas
aumentam a disponibilidade, sem alterar a farmacocinética das drogas
[McCormack et al., 1998].
Para amenizar a toxicidade das ciclodextrinas utiliza-se o encapsulamento de
agentes terapêuticos em sistemas multicomponentes como drogaciclodextrina
-lipossoma [McCormack et al., 1996; Loukas et al., 1998; McCormack et al., 1998;
Fatouros et al., 2001; Hagiwara et al., 2006; Maestrelli et al., 2006; Piel et al.,
2006]. A topologia dos sistemas multicomponentes é normalmente sugerida com
base em estudo de difração de raio X e RMN.
INTRODUÇÃO
_
1.8 – Ressonância Magnética Nuclear
(RMN)
O estudo das interações moleculares é importante para entender e explicar as
topologias dos complexos em solução. Neste sentido, as ligações de hidrogênio não
só desempenham um papel importante para a estabilidade dessas estruturas, mas
também são importantes em todos os processos bioquímicos. No campo da
química supramolecular, a RMN tem sido utilizada como uma técnica
experimental poderosa para a investigação de interações intermoleculares,
promovendo evidencias sobre a topologia e formação de complexos através do
núcleo do hidrogênio [Kapur et al., 2000] o qual tem alta sensibilidade e permite
extrair um grande volume de informações a partir da análise de seus espectros.
Com isso, muitos métodos de RMN de
1H foram desenvolvidos e aplicados na
triagem e caracterização de complexos supramoleculares tais como: rotational
frame nuclear Overhauser effect spectroscopy (ROESY1D) [Mo et al., 1997],
diffusion-ordered spectroscopy (DOSY) [Morris et al., 1992] e saturation transfer
difference (STD) [Mayer et al., 1999; Mayer et al., 2001; Meyer et al., 2003;
Carlomagno, 2005].
1.8.1 – Rotational Frame Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy (ROESY 1D).
O acoplamento dipolar intermolecular e intramolecular é o alicerce para o
estudo de complexos moleculares detectado através do efeito Overhauser nuclear
(nOe) [Neuhaus et al., 1989]. O efeito nOe é a manifestação da relaxação cruzada
entre dois spins nucleares que estão próximos no espaço (normalmente < 5 Å para
INTRODUÇÃO
importante para caracterizar espacialmente núcleos relacionados, tornando-se nos
dias de hoje essencial para elucidações de estruturas e análises conformacionais. O
fenômeno nOe é um método poderoso para identificações estruturais em
compostos orgânicos e determinar estruturas primárias e secundárias de
macromoléculas biológicas (nOe intramolecular). Na química supramolecular é
uma ferramenta essencial para examinar as interações intermoleculares, sendo
aplicado ao estudo dos complexos revelando as associações supramoleculares.
Observar o efeito nOe exige uma sintonia entre a técnica utilizada e o
sistema em estudo, pois a relaxação cruzada depende do produto de τ
c(tempo de
correlação para reorientação molecular) e w
0(frequência de Larmor do núcleo)
[Neuhaus et al., 1989; Meyer et al., 1997]. Para moléculas pequenas (< 500 Da, em
campos magnéticos menores de 400 MHz para frequência do hidrogênio) que
apresentam
τ
cpequenos (wτ
c<< 1), os nOes são positivos, entretanto, para
moléculas com alto peso molecular ou moléculas pequenas em solventes viscosos
na presença de campos magnéticos maiores que 500 MHz para frequênica do
hidrogênio, onde o tempo de reorientação molecular é longo (wτ
c>> 1), os nOes
apresentam valores negativos [Gunther, 1994; Sanders et al., 1994] . Quando o
produto wτ
c≈ 1, os efeitos de nOe são muito pequenos, praticamente nulos, isto
ocorre para substâncias de tamanhos intermediários (500 a 2000 Da) e na presença
de campos magnéticos próximos a 500 MHz para frequência do hidrogênio.
Portanto, experimentos com trava de spin (spin-lock), tais como ROESY (Rotating
Frame Overhauser Effect Spectroscopy, uni- e bidimensionais) são apropriados,
pois a relaxação cruzada é positiva para todos os valores do tempo de correlação
rotacional, isto é, ela é praticamente a mesma para moléculas pequenas e grandes
(Figura 6) [Otter et al., 1988].
INTRODUÇÃO
_
ν (MHz)
Figura 6 – Dependência do NOE/ROE entre hidrogênios em relação ao produto da frequência de
ressonância (w0) e o tempo de correlação molecular (τc), levando em consideração o Bo (ν MHz). Figura modificada do artigo [Otter et al., 1988].
Finalmente para complexos a condição essencial para a observação de nOe
ou rOe intermolecular é que a concentração e o tempo de vida da espécie
complexada seja suficiente para possibilitar a observação da relaxação cruzada
entre os núcleos de interesse, uma vez que o nOe é um efeito relativamente
pequeno [Mo et al., 1997].
1.8.2 – Diffusion-Ordered Spectroscopy (DOSY).
O uso de experimentos de RMN de ecos de spin com gradiente de campo
magnético pulsado (PFGSE) para a determinação da difusão translacional nos
estudos do tamanho e forma das moléculas se tornaram crescentes nos últimos
anos. O número de aplicações desta técnica em diferentes áreas refletem a
INTRODUÇÃO
[Stilbs, 1987].
estudo de associações e movimentos moleculares [Price, 1997; Price, 1998;
Diaz et al., 2000; Cabrita et al., 2001; Morris, 2002; Schlorer et al., 2002]. Como o
coeficiente de difusão
1de uma determinada molécula sob certas condições
depende do seu peso molecular, tamanho e forma (raio hidrodinâmico), fica
evidente que a difusão pode ser usada para estudo das interações moleculares ou
eventos de complexações. Logo, o coeficiente de difusão pode fornecer
informações importantes sobre organização molecular. Valores típicos de
coeficiente de difusão em líquidos, a temperaturas moderadas (25-30ºC), vão desde
10
-12m
2s
-1(polímeros de alta massa molar) até 10
-9m
2s
-1(moléculas pequenas em
soluções pouco viscosas)
Em 1992 Morris e Johson [Morris et al., 1992] desenvolveram uma forma
amigável para processar e apresentar os dados de difusão obtidos a partir de uma
série de experimentos aplicando gradiente de campo magnético pulsado (PFGSE)
que permite discriminar e caracterizar os diversos componentes de uma mistura,
denominado de DOSY (Diffusion-Ordered Spectroscopy) [Dehner et al., 2005;
Nakakoshi et al., 2006]. A técnica de DOSY separa os sinais de uma mistura de
componentes de acordo com os seus coeficientes de difusão. Em virtude de sua
habilidade em resolver misturas complexas e permitir a simultânea identificação
dos compostos, a técnica de DOSY vem sendo sugestivamente denominada pelos
químicos como a “cromatografia de spins” [Gounarides et al., 1999].
DOSY é um experimento rápido e proporciona uma visão global da
dinâmica translacional dos constituintes de uma mistura, sejam eles moléculas
pequenas, macromoléculas, complexos ou agregados moleculares.
1 Coeficiente de difusão é um valor que representa a facilidade com que cada soluto em particular se move em um solvente determinado. Depende de três fatores: tamanho e forma do soluto, viscosidade do solvente e temperatura.