Desenvolvimento e avaliação de lipossomas contendo a naftoquinona sintética ENSJ39: estudos in vitro e in vivo

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA. LUCIANA DE VASCONCELOS REBOUÇAS. DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DE LIPOSSOMAS CONTENDO A NAFTOQUINONA SINTÉTICA ENSJ39: ESTUDOS IN VITRO E IN VIVO. FORTALEZA - CE 2020.

(2) LUCIANA DE VASCONCELOS REBOUÇAS. DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DE LIPOSSOMAS CONTENDO A NAFTOQUINONA SINTÉTICA ENSJ39: ESTUDOS IN VITRO E IN VIVO. Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Farmacologia da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Farmacologia. Área de concentração: Ciências Biológicas II. Orientador: Profa. Dra. Claudia do Ó Pessoa. Coorientadora: Dra. Fátima de Cássia Evangelista de Oliveira.. FORTALEZA-CE 2020.

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(4) LUCIANA DE VASCONCELOS REBOUÇAS. DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DE LIPOSSOMAS CONTENDO A NAFTOQUINONA SINTÉTICA ENSJ39: ESTUDOS IN VITRO E IN VIVO. Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Farmacologia da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Farmacologia. Área de concentração: Ciências Biológicas II. Aprovada em: ___/___/______.. BANCA EXAMINADORA ________________________________________ Profa. Dra. Claudia do Ó Pessoa (Orientadora) Universidade Federal do Ceará (UFC) _________________________________________ Fabio Luiz Navarro Marques Universidade de São Paulo (USP) _________________________________________ Eufrânio Nunes da Silva Júnior Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG) ________________________________________ Marcilia Pinheiro da Costa Universidade Federal do Piauí (UFPI).

(5) A Deus. A minha mãe Lúcia Muniz. A minha família..

(6) AGRADECIMENTOS A Deus pelo dom de minha vida e por ter me abençoado até aqui, iluminando meus passos e me proporcionando caminhos tão magníficos. A minha mãe, Lúcia Muniz, que me trouxe ao mundo e que de mim não descuidou em nenhum instante. Gratidão àquela que suporta meus momentos de mau humor, que me acompanha, me aconselha, me incentiva e me auxilia com amor e prontidão. A minha família como um todo, pelo apoio, pelo acolhimento e por terem contribuído para formação do meu caráter. Aos amigos de graduação e mestrado, Gabrielle Dantheias, Mylena Melgaço, Daniel Moreira, João Victor Oliveira e Dulce Maria Coelho pelas dores compartilhadas, pelos medos confortados e pelas alegrias proporcionadas desde a caminhada no curso de Farmácia. Meu muito obrigada, ainda, à Nadine Salgueiro, por compartilhar os dramas da vida acadêmica e por seu companheirismo e amizade de décadas. A todos os amigos e companheiros do Laboratório de Oncologia Experimental (LOE), em especial, Renan Silva, Pedro Mikael Costa, Daisy Jereissati, Celina de Jesus Guimarães, Bruno Rodrigues, Maria Francilene Silva, Maria Claudia Luciano, Gabriel Gusmão, José de Brito, Daniel Pascoalino e Lucas Brito que contribuíram, cada um com suas particularidades, qualidades e expertise, para tornar essa caminhada científica mais rica, leve, otimista e recompensadora. Meu muito obrigada à Silvana França por todo apoio durante a rotina diária no laboratório. Gratidão a todos do LOE pelo excelente time que construímos. À Dra. Fátima de Cassia Oliveira, pelo apoio acadêmico e pessoal. Suas conversas, conselhos e coorientação foram fundamentais e contribuíram diretamente para o meu desempenho e para o desenvolvimento de todo esse trabalho. À Profa. Dra. Claudia Pessoa, pela excelente orientação e incentivo ao meu crescimento científico. Sou muito grata à senhora por ter me acolhido e acreditado que eu seria capaz de desenvolver todos os desafios que a mim foram confiados. A senhora inspira todos aqueles que têm o prazer de tê-la por perto e é, sem dúvidas, um exemplo a ser seguido. Ao Prof. Dr. Eufrânio Nunes (UFMG), por ter sintetizado e cedido o composto utilizado no presente estudo. Aos professores participantes da banca examinadora, Dr. Fábio Marques (USP), Dra. Marcília Costa (UFPI) e, novamente, Dr. Eufrânio Nunes (UFMG), pelo aceite do convite e pelas valiosas reflexões, críticas e sugestões recebidas. Aos pesquisadores e técnicos que contribuíram diretamente e paralelamente no.

(7) desenvolvimento de algumas etapas desse estudo: meu muito obrigado ao Dr. Agusto Cesar e Dr. Wesley Ribeiro, pelo auxílio durante todo o andamento dos estudos in vivo; à Dra. Niedja Fittipaldi, pela atenção que dedicou a mim ao estar sempre disponível para avaliação das minhas amostras junto à Embrapa e ao Dr. Guilherme Zocolo (Embrapa) por ter intermediado essa colaboração; ao Prof. Dr. Said Fonseca (UFC) e sua equipe que concederam equipamentos, conversas e conhecimentos; à Profa. Dra. Marcia Rizzo (UFPI) pela disponibilidade e empenho na avaliação do material histopatológico; ao Fabio Ribeiro e a Profa. Dra. Durcilene Silva (UFPI) por terem viabilizado a avaliação morfológica dos lipossomas; e ao Me. Francisco Evanir e a Débora Cavalcante que realizaram o processamento do material biológico dos camundongos. Ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia (PPGF) e à Universidade Federal do Ceará (UFC) por terem me proporcionado momentos tão únicos de aprendizagem e superação. Ninguém nunca disse que seria fácil (e realmente não foi) mas os frutos que colho hoje valeram cada obstáculo. Aqui encontrei professores, amigos e colegas. Encontrei desafios que me exigiram aptidões, força e resultaram em amadurecimento pessoal e profissional. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio financeiro com a manutenção da bolsa de auxílio..

(8) “Comece fazendo o que é necessário, depois o que é possível, e de repente você estará fazendo o impossível. ” São Francisco de Assis.

(9) RESUMO O câncer é um problema de saúde pública mundial, caracterizando-se pela proliferação descontrolada de células. A nanotecnologia vem ganhando destaque por amenizar os efeitos colaterais dos tratamentos quimioterápicos convencionais, por meio de sistemas nanoparticulados que permitem maior biodistribuição, biodisponibilidade, sítio-especificidade, menor toxicidade, além de reduzir a resistência e melhorar a eficácia terapêutica. Com isso, o objetivo do presente estudo foi encapsular a naftoquinona sintética ENSJ39, composto de alta atividade citotóxica in vitro, porém com característica hidrofóbica, em um sistema lipossomal, bem como caracterizá-los e avaliar sua atividade biológica in vitro e in vivo. Para isso, os lipossomas foram obtidos por método de hidratação do filme lipídico e passaram por caracterizações fisico-químicas (análise termogravimétrica, calorimetria exploratória diferencial, técnica de espalhamento dinâmico da luz e microscopia de força atômica), avaliação da eficiência de encapsulação e estudos de estabilidade que incluíram simulação das condições de transporte e estocagem. Foram realizados também teste de citotoxicidade in vitro por MTT, ensaio de exclusão por azul de Tripan e avaliação de alterações morfológicas em linhagem tumoral. Posteriormente, os lipossomas foram avaliados in vivo, quanto a toxicidade aguda, e foi verificado a DL50 da ENSJ39 pelo método Up and Down. Os lipossomas contendo ENSJ39 apresentaram alta taxa de encapsulamento (82,3% ± 0,04), tamanho médio de 31 nm (± 5,81), potencial zeta de +53,5 mV e índice de polidispersão de 0,24. Até 250° C, as nanopartículas mostraram-se termicamente estáveis conseguindo preservar a perda de massa de fármaco livre, e após 4 meses de estocagem mantiveram boas características físico-químicas. Os valores de CI50 do fármaco encapsulado não apresentaram diferença estatística significativa quando comparado ao fármaco livre e na avaliação morfológica em HCT-116 (colorretal), após 72 h de tratamento, a LE39 provocou tumefação e intensa vacuolização citoplasmática, além de ter promovido o aumento número de células não viáveis, semelhante a ENSJ39, quando comparado aos controles negativo e positivo (doxorrubicina). A DL50 do composto livre não foi definida por conta da baixa solubilidade, porém, a maior dose testada (175 mg/kg) não causou morte dos animais. Ambas as doses avaliadas (55 e 175 mg/kg) da ENSJ39 livre e encapsulada, no teste de toxicidade aguda, não ocasionaram alterações de peso, de comportamento, de parâmetros bioquímicos renais, hepáticos e de parâmetros hematológicas. Todavia, o estudo histopatológico renal evidenciou alterações nos animais que receberam o fármaco livre tanto via oral (55 mg/kg) quanto via intraperitoneal (55 e 175 mg/kg). Conclui-se que o método de encapsulamento da ENSJ39 foi eficaz na obtenção de lipossomas estáveis, foi capaz de melhorar a dispersão desse composto em veículo aquoso, e conseguiu prevenir danos ao tecido renal de camundongos em comparação ao fármaco não encapsulado. Palavras-chave: Câncer. Lipossomas. Naftoquinona. Nanoencapsulamento..

(10) ABSTRACT DEVELOPMENT AND EVALUATION OF LIPOSOMES CONTAINING SYNTHETIC NAPHTHOQUINONE ENSJ39: IN VITRO AND IN VIVO STUDIES Cancer is a public health problem in world, characterized by uncontrolled cell proliferation. Nanotechnology is gaining prominence for mitigating the side effects of conventional chemotherapy treatments and for developing nanoparticulate systems that allow greater biodistribution, bioavailability, site-specificity, less toxicity, reduces resistance, and improves therapeutic efficacy. This study aimed to encapsulate the synthetic naphthoquinone ENSJ39 (a compound with high cytotoxic activity in vitro, but with hydrophobic characteristic) in liposomes, characterize them and evaluate their biological activity in vitro and in vivo. Liposomes were obtained by hydration method of the lipid film and subjected to physicochemical characterizations (thermogravimetric analysis, differential exploratory calorimetry, dynamic light scattering technique and atomic force microscopy), evaluation of the encapsulation efficiency and studies of stability that included simulation transport and storage conditions. In vitro cytotoxicity test by MTT, Trypan blue exclusion assay and evaluation of morphological changes in tumor lineage were also analised. Subsequently, the liposomes were evaluated in vivo for acute toxicity and the LD50 of ENSJ39 was verified by the Up and Down method. Liposomes containing ENSJ39 showed a high encapsulation rate (82.3% ± 0.04), average size of 31 (± 5.81) nm, a zeta potential of +53.5 mV and a polydispersity index of 0.24. Up to 250° C, the liposomes were thermally stable, able to preserve the loss of mass of the free drug, and after 4 months of storage they maintained good physical-chemical characteristics. The IC50 values of the encapsulated drug showed no statistically significant difference when compared to free drug and the morphological evaluation in HCT-116 (colorectal), after 72 hours of treatment, showed the LE39 caused swelling and intense cytoplasmic vacuolization, in addition to promoting an increase in number of non-viable cells, similar to ENSJ39, when compared to negative and positive controls (doxorubicin). LD50 of the free compound was not defined due to the poor solubility, however, the highest dose tested (175 mg/kg) did not cause death of the animals. Both doses evaluated (55 and 175 mg/kg) of ENSJ39 and its encapsulated form, in acute toxicity test, did not cause changes in weight, behavior, renal biochemical, hepatic and hematological parameters. However, renal histopathological study showed changes in the animals that received the free drug via oral (55 mg/kg) and intraperitoneal (55 and 175 mg/kg). In conclusion, ENSJ39 encapsulation method was effective in obtaining stable liposomes, was able to improve the dispersion of this compound in an aqueous vehicle and was able to prevent damage to the renal tissue of mice compared to the free drug. Keywords: Cancer. Liposomes. Nanoencapsulation. Naphthoquinone..

(11) LISTA DE FIGURAS Figura 1. − Representação esquemática de características clássicas das células cancerosas utilizadas como estratégias de manutenção e crescimento tumoral. ...................................................................................................... 14. Figura 2. − Distribuição proporcional dos 10 tipos de câncer mais incidentes estimados para 2020 por sexo, exceto pele não melanoma*. ....................................... 15. Figura 3. − Casos e mortes mais comuns de câncer em mulheres e homens em 185 países …........................................................................................................ 16. Figura 4. − Direcionamento terapêutico de algumas classes de fármacos para as características do câncer. ............................................................................ 16. Figura 5. − Representação esquemática de alguns diferentes tipos e design de nanopartículas aplicadas à nanomedicina ................................................. 18. Figura 6. − Progressão anual de artigos publicados ao longo de 10 anos nas bases PubMed e Web of Science, associando ao descritor “ nanotechnology and cancer”........................................................................................................ 19. Figura 7. − Passagem passiva nas nanopartículas para o ambiente tumoral por efeito do processo de retenção e permeabilidade aumentada (EPR)..................... 20. Figura 8. − Estrutura da bicamada lipídica e do lipossoma............................................ 21. Figura 9. − Classificação dos lipossomas quanto as lamelas ......................................... 22. Figura 10 − Representação esquemática de diferentes tipos de lipossomas. .................. 22 Figura 11 − Representação dos diferentes tipos de interação dos lipossomas com uma célula .......................................................................................................... 25 Figura 12 − Ciclo redox das quinonas. ............................................................................ 26 Figura 13 − Representação da estrutura química dos principais grupos de quinonas: benzoquinona (A), naftoquinona (B) e antraquinona (C). ......................... 27 Figura 14 − Representação das formas isoméricas para-quinonoídica e ortoquinonoídica. ............................................................................................. 28 Figura 15 − Progressão anual de artigos publicados ao longo de 20 anos nas bases PubMed e Web of Science, associando ao descritor “naphthoquinone and cancer”. ...................................................................................................... 29 Figura 16 − Rota sintética para obtenção da naftoquinona ENSJ39 ............................... 30 Figura 17 − Esquema metodológico experimental das avaliações realizadas para concretização dos objetivos propostos no presente trabalho ....................... 37 Figura 18 − Etapas do preparo das nanopartículas de lipossoma LE39 e LBR .............. 39 Figura 19 − Tela do software AOT425StatPgm, programa usado para calcular da DL50 estimada conforme o protocolo OECD425 (2001) ..................................... 47 Figura 20 −. Histograma de distribuição do tamanho de partículas dos lipossomas LE39 não liofilizado (A), liofilizado com 0,1% (B), 5% (C) e 10% de.

(12) trealose (D), e dos lipossomas LBR não liofilizado (E), liofilizado com 0,1% (F), 5% (G) e 10% de trealose (H)................................................... 53 Figura 21 − Microscopia óptica da ENSJ39 (A) e das preparações de lipossomas LE39 (B) e LBR (C)............................................................................................. 53 Figura 22 − Imagens dos lipossomas LE39 (A, B e C) e LBR (D, E e F) obtidas por AFM. .......................................................................................................... 54 Figura 23 − Formulações submetidas aos testes de estabilidade acelerada: centrifugação 6000 rpm, 4°C por 1 hora após preparo do LE39 (A) e LBR (B) e agitação por 48 horas a 37°C após preparo do LE39 (C) e LBR (D). Setas amarelas indicam formação de precipitado........................................ 55 Figura 24 − Formulações submetidas aos testes de estabilidade em temperatura ambiente 24h (A e B), 1 mês (C e D), 2 meses (E e F), 3 meses (G e H) e 4 meses (I e J) após o preparo do LE39 e do LBR, respectivamente. Seta amarela indica a formação de precipitado ................................................... 56 Figura 25 − Formulações submetidas aos testes de estabilidade sob refrigeração de 8ºC 24h (A e B), 1 mês (C e D), 2 meses (E e F), 3 meses (G e H) e 4 meses (I e J) após o preparo do LE39 e do LBR, respectivamente. Seta amarela indica a formação de precipitado ............................................................... 56 Figura 26 − Histograma de distribuição do tamanho de partículas dos lipossomas LE39 recém preparados (A), após 4 meses em repouso em temperatura ambiente (B) e refrigeração (C); e dos lipossomas LBR recém preparados (D), após 4 meses em repouso (E) e refrigeração (F)................................................... 58 Figura 27 − Curvas de Análise Termogravimétrica (TGA) (A) e de Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) (B) da drogra livre, ENSJ39 (preto), e dos lipossomas contendo o fármaco, LE39 (vermelho) e sem fármaco, LBR (azul)........................................................................................................... 58 Figura 28 − Espectro de absorção (A) e espectro de absorção de primeira derivada (B) do composto ENSJ39, em acetonitrila, obtidos por espectrofotometria UV/visível ................................................................................................... 59 Figura 29 − Sobreposição dos espectros de absorção (A) e espectro de absorção de primeira derivada (B) do composto ENSJ39 e das amostras LE39 (total e purificado) e LBR (total e purificado), em acetonitrila, obtidos por espectrofotometria UV/visível ..................................................................... 60 Figura 30 − Curva analítica de calibração da ENSJ39 por espectrofotometria direta (A) e por espectrofotometria de primeira derivada (B) ...................................... 61 Figura 31 − Valores de CI50 para ENSJ39 livre e encapsulada (LE39) após 72 h de tratamento em diferentes linhagens celulares ............................................. 62 Figura 32 − Efeito da ENSJ39 e LE39 na viabilidade de células HCT-116 determinado pelo ensaio de exclusão de Azul de Tripan, após 72h de tratamento ................................................................................................... 63 Figura 33 − Análise morfológica das células HCT-116 coradas com Panótico rápido após 72h de tratamento com ENSJ39 (B e C) LE39 (D e E), respecivamente 2,32 µg/ml e 3,48µg/ml, e com LBR (F e G) nos mesmos volumes de.

(13) administração de LE39. O controle negativo (A) não recebeu nenhum tratamento .................................................................................................... 64 Figura 34 − Teste de dispersão do LE39 em água para injetável ..................................... 66 Figura 35 − Dose de 175mg/kg de ENSJ39 a ser administrada no animal...................... 67 Figura 36 − Animais tratados com ENSJ39 na dose de 175mg/kg, via intraperitoneal .... 68 Figura 37 − Acompanhamento diário de peso dos animais tratados com ENSJ39, via oral e intraperitoneal, para avaliação da DL50............................................ 68 Figura 38 − Acompanhamento diário de peso dos animais tratados com ENSJ39 (via oral e intraperitoneal), LE39 e LBR (via intraperitoneal) para avaliação da toxicidade aguda......................................................................................... 69 Figura 39 − Ganho de peso dos animais tratados com ENSJ39 (via oral e intraperitoneal), LE39 e LBR (via intraperitoneal) para avaliação da toxicidade aguda ........................................................................................ 70 Figura 40 − Fotomicrografias de tecido renal de camundongos tratados por via oral com veículo (A), ENSJ39 55 mg/kg (B) e 175 mg/kg (C).................................... 72 Figura 41 − Fotomicrografias de tecido renal de camundongos tratados por via IP com os controles veículo (A) e água (B); ENSJ39 55 mg/kg (C) e 175 mg/kg (D); LE39 55mg/kg (E) e 175 mg/kg (F); e LBR no mesmo volume de administração do LE39 (G e H)..................................................................... 73 Figura 42 − Avaliação semi-quantitativa das alterações teciduais renais dos animais tratados com veículo, água, ENSJ39 por via oral e intraperitoneal, LE39 e LBR por via intraperitoneal. 74.

(14) LISTA DE TABELAS Tabela 1. − Diferentes combinações metodológicas utilizadas no desenvolvimento das formulações de lipossomas de ENSJ39 ..................................................... 38. Tabela 2. − Linhagens celulares e suas especificações.................................................... 43. Tabela 3. − Avaliação comparativa das cinco formulações de lipossomas de ENSJ39 desenvolvidas ............................................................................................ 51. Tabela 4. − Tamanho de partícula, potencial zeta e PDI das três últimas formulações desenvolvidas de LE39 e LBR ................................................................. 51. Tabela 5. − Tamanho de partícula, potencial zeta e PDI dos lipossomas LE39 e LBR não liofilizados e liofilizados com duas distintas concentrações de trealose ...................................................................................................... 52. Tabela 6. − Tamanho das partículas dos lipossomas LE39 e LBR avaliado por diferentes técnicas .................................................................................... 55. Tabela 7. − Tamanho de partícula, potencial zeta e PDI das formulações LE39 e LBR recém preparadas e após 4 meses de repouso em temperatura ambeinte e sob refrigeração (8°C) ............................................................................... 57. Tabela 8. − Atividade citotóxica de ENSJ39, LE39 e doxorrubicina (DOX), como controle positivo, avaliada pelo ensaio MTT após 72 h de exposição para 62 diferentes linhagens celulares......................................................... Tabela 9. − Índice de seletividade das amostras testadas................................................ 62. Tabela 10 − Resultados da estimativa da DL50 via oral e intraperitoneal da ENSJ39...... 66 Tabela 11 − Parâmetros bioquímicos referente a avaliação da toxicidade aguda da ENSJ39, LE39 e LBR................................................................................. 70 Tabela 12 − Parâmetros hematológicos referente a avaliação da toxicidade aguda da ENSJ39, LE39 e LBR. .............................................................................. 71.

(15) LISTA DE QUADROS Quadro 1. − Lista com alguns fármacos encapsulados em nanossistemas comercializados no mercado para o tratamento de câncer ............................ 18. Quadro 2. − Publicações e patentes dos últimos cinco anos, relacionadas ao tema naftoquinonas, do grupo de pesquisadores do Laboratório de Oncologia Experimental – LOE/UFC ........................................................................... 31. Quadro 3. − Ensaios realizados por Pinheiro (2017) e seus respectivos resultados obtidos na avaliação do mecanismo de ação e atividade antitumoral in vitro do composto ENSJ39......................................................................................... 32. Quadro 4. − Teste de dispersão da ENSJ39 e dos lipossomas para administração in vivo em diferentes veículos..…............................................................................. 46. Quadro 5 −. Resultados do teste de dispersão da ENSJ39 para administração in vivo em diferentes veículos ....................................................................................... 65.

(16) LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AFM. Microscópio de Força Atômica. ALT. Alanina aminotransferase. ANOVA Análise de variância AST. Aspartato aminotransferase. CHOL. Colesterol. CI50. Concentração capaz de inibir 50% do crescimento celular. DL50. Dose capaz de levar a morte 50% dos animais. DLS. Dynamic Light Scattering. DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s Medium DMSO. Dimetilsulfóxido. ENSJ39 2,2-dimetil-3-(2-metil-4-nitro-arilamino)-2,3-diidro-nafto[1,2-b]furan-4,5-diona EPR. Efeito de retenção e permeabilidade aumentada. EROs. Espécies reativas de oxigênio. h. Horas. IC. Intervalo de confiança. INCA. Instituto Nacional do Câncer José Alencar Gomes da Silva. IP. Intraperitoneal. L. Litro. LBR. Lipossoma branco, vazio. LE39. Lipossoma contendo a ENSJ39. LOE. Laboratório de Oncologia Experimental. LUV. Vesículas unilamelares grandes. min. Minuto. ml. Mililitro. MLV. Vesículas multilamelares.

(17) MTT. 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-brometo de tetrazólio. NQO1. NAD(P)H: quinona oxirredutase 1. NTA. Nanoparticle Tracking Analysis. OCTA. Octadecilamina. OECD. Organization for Economic Cooperation and Development. PBS. Solução Tampão Fosfato. PC. Fosfatidilcolina de soja. PDI. Índice de polidispersão. PEG. Polietilenoglicol. PLGA. Poli(ácido lático-co-ácido glicólico). rpm. Rotações por minuto. RPMI. Roswell Park Memorial Institute Medium. SBF. Soro Bovino Fetal. SUV. Vesículas unilamelares pequenas. ULV. Vesículas unilamelares.

(18) SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO …............................................................................................ 14. 1.1. Câncer ............................................................................................................... 14. 1.2. Nanotecnologia e sua aplicação tratamento do câncer ................................. 17. 1.3. Lipossomas ........................................................................................................ 20. 1.4. Atividade antitumoral das Naftoquinonas ..................................................... 26. 2. JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA .............................................................. 34. 3. OBJETIVOS ..................................................................................................... 36. 3.1. Objetivo geral .................................................................................................. 36. 3.2. Objetivos específicos ....................................................................................... 36. 4. METODOLOGIA ............................................................................................ 37. 4.1. Esquema metodológico experimental ............................................................. 37. 4.2. Desenvolvimento dos lipossomas .................................................................... 38. 4.2.1. Preparo das nanopartículas de lipossoma ........................................................ 38. 4.2.2. Caraterização dos lipossomas ........................................................................... 40. 4.2.2.1. Tamanho de partícula, potencial zeta e PDI....................................................... 40. 4.2.2.2. Análise morfológica das partículas por AFM..................................................... 40. 4.2.2.3. Estudos de interação qúimica............................................................................. 41. 4.2.2.4. Eficiência de encapsulação ................................................................................ 41. 4.2.2.5. Avaliação de estabilidade .................................................................................. 42. 4.3. Avaliação in vitro .............................................................................................. 43. 4.3.1. Manutenção das linhagens celulares ............................................................... 43. 4.3.2. Teste do MTT ..................................................................................................... 43. 4.3.3. Ensaio de exclusão por azul de Tripan............................................................. 44. 4.3.4. Análise morfológica .......................................................................................... 45. 4.4. Avaliação in vivo ............................................................................................... 46. 4.4.1. Animais ............................................................................................................. 46. 4.4.2. Aspectos éticos ................................................................................................... 46. 4.4.3. Teste de dispersão das substâncias para administração in vivo....................... 46. 4.4.4. Estimativa da DL50 da ENSJ39 ........................................................................ 47. 4.4.5. Avaliação da toxicidade aguda da ENSJ39 e dos lipossomas ......................... 48. 4.4.5.1. Avaliação dos parâmetros bioqúimicos e hematológicos .................................... 48. 4.4.5.2. Avaliação Histopatológica ................................................................................. 49. 5. RESULTADOS ................................................................................................. 51. 5.1. Lipossomas: obtenção, caracterização e estabilidade ................................... 51.

(19) 5.2. Avaliação in vitro .............................................................................................. 61. 5.3. Avaliação in vivo ............................................................................................... 64. 5.3.1. Dispersão das substâncias para testes in vivo ............................................. 5.3.2. Estimativa da DL50 e avaliação da toxicidade aguda ...................................... 66. 6. DISCUSSÃO ..................................................................................................... 75. 7. CONCLUSÃO .................................................................................................. 90. 64. REFERÊNCIAS ............................................................................................... 91 ANEXO 1 – CERTIFICADO DE APROVAÇÃO CEUA ............................. 105.

(20) 14. 1 INTRODUÇÃO 1.1 Câncer O câncer caracteriza-se pela alteração no padrão de crescimento celular normal devido a uma desorganização no circuito-controle que é responsável pela sincronização entre crescimento e divisão das células, levando a formação de tumores, ou neoplasias. Nesse processo, podem ser evidenciados dez características (distintas, porém complementares) que permitem o crescimento e metástase dos tumores. São elas: autossuficiência de sinais de crescimento, resistência a sinais anti-proliferativos, evasão do sistema imune, proliferação ilimitada, inflamação, invasão tecidual e metástase, angiogênese, instabilidade genética e mutação, resistência a morte celular e reprogramação do metabolismo energético (HANAHAN; WEINBERG, 2011). Essas características essenciais (Figura 1) ajudam a fornecer a base para a compreensão da biologia do câncer, sendo elas as responsáveis por tornar o câncer uma doença tão complexa, as quais requerem, na grande maioria dos casos, diferentes combinações de abordagens terapêuticas como finalidade de tratamento. Figura 1 - Representação esquemática de características clássicas das células cancerosas utilizadas como estratégias de manutenção e crescimento tumoral.. Fonte: Adaptado de Hanahan e Weinberg (2011).. O câncer é uma doença de alta incidência e uma das principais causas de mortalidade em todo mundo. De acordo com Jemal et al. (2019) é considerado como a primeira ou a segunda causa principal de morte prematura (entre 30-69 anos de idade) em 134 países do mundo. O custo mundial do câncer deverá aumentar em cerca de 60% de 2018 a 2040 devido ao envelhecimento e crescimento da população: com mais de 18 milhões de casos em 2018, em.

(21) 15. 2040 é possível esperar 29 milhões de casos (JEMAL et al.,2019). Estima-se em 2020, no Brasil, a ocorrência de mais de 620 mil casos novos de câncer. Excetuando-se o câncer de pele não melanoma (176.940 casos novos), ocorrerão no país mais de 440 mil casos novos de câncer: para o sexo masculino, são esperados um total de 225.980 casos novos e para o sexo feminino, 223.110 novos casos (INCA, 2020). As estimativas para o Brasil mostraram que os cânceres mais incidentes, excetuando os casos de pele não melanoma, serão os de próstata, mama feminina e cólon retal (INCA, 2020) (Figura 2). Figura 2 - Distribuição proporcional dos 10 tipos de câncer mais incidentes estimados para 2020 por sexo, exceto pele não melanoma*.. *Números arredondados para múltiplos de 10. Fonte: INCA, 2020.. Vale destacar que, considerando ambos os sexos, os cânceres de mama, próstata e cervical são os diagnosticados com mais frequência em mais de 70% dos países e o câncer de pulmão também tem sua relevância, pois se apresenta como a principal causa de morte por câncer, em 93 países (JEMAL et al., 2019) (Figura 3). Segundo a American Cancer Society (2019), as terapias disponíveis para o tratamento do câncer incluem a associação entre técnicas como excisão cirúrgica, radiação terapêutica, imunoterapia, terapia hormonal, transplante de célula tronco e quimioterapia. Nesta última, o progresso no surgimento de opções terapêuticas, que vêm ocorrendo nas últimas décadas, baseia-se nas tentativas de se opor a uma ou mais características biológicas do câncer (Figura 4). Atualmente, os medicamentos contra o câncer vêm sendo desenvolvidos com direcionamentos baseados em alvos moleculares específicos, envolvidos de uma maneira ou de outra na habilidade de agir em fatores específicos próprios dos tumores. A busca pela especificidade de ação tende a refletir positivamente na redução da toxicidade inespecífica (HANAHAN; WEINBERG, 2011). Todavia, não se pode deixar de mencionar que, existem fatores limitantes para o sucesso terapêutico ser alcançado. Entre esses fatores, pode-se citar falhas nos esquemas terapêuticos em decorrência da resistência, redução da sobrevida dos pacientes, os altos índices de recidivas e os efeitos adversos (LUO et al., 2013)..

(22) 16. Figura 3 - Casos e mortes mais comuns de câncer em mulheres e homens em 185 países.. Fonte: Adaptado de JEMAL et al (2019).. Figura 4 - Direcionamento terapêutico de classes de fármacos no combate as características clássicas tumorigênicas.. Fonte: Adaptado de Hanahan e Weinberg (2011)..

(23) 17. 1.2 Nanotecnologia e sua aplicação no tratamento do câncer A nanotecnologia é um campo interdisciplinar de pesquisa que envolve a produção, processamento e aplicação de materiais ou dispositivos que têm uma ou mais dimensões em escala nanométrica, conferindo propriedades físico-químicas particulares aos produtos criados (AKBARZADEH et al., 2013). Essa tecnologia tem sido aplicada em diversas áreas, incluindo cosméticos, agricultura e alimentos, e vem, particularmente, revolucionando a área da medicina com a chamada nanomedicina (KALRA; BALLY, 2013). Os sistemas de liberação de fármacos foi uma das primeiras áreas a crescer nesse cenário, e uma das que mais se desenvolveu ao longo dos anos. Esses sistemas nanotecnológicos, além de funcionarem como reservatórios de fármacos, são capazes de proteger as moléculas de fármaco contra degradação química e conseguem melhorar a estabilidade e outras características relacionadas a solubilidade, superando limitações farmacocinéticas e farmacodinâmicas de medicamentos convencionais (CANCINO et al., 2014; KIM et al., 2009). Nesse contexto, tem se destacado na literatura os avanços decorrentes da aplicação dos nanomateriais nas áreas de diagnóstico e tratamento do câncer como alternativas complementares à medicina tradicional (RAMPADO et al., 2019; FERRARI, 2005). No âmbito do diagnóstico, o uso das nanopartículas oferece alta sensibilidade no caso da detecção de cânceres em estágios iniciais. Isso é possível pela identificação de lesões précancerosas e malignas através dos fluidos biológicos com o emprego de nanopartículas de alta especificidade para detecção de DNA e proteínas (CAI, et al., 2019; CHANTADA-VÁZQUEZ et al., 2019; FERRARI, 2005). Além disso, o desenvolvimento de nanopartículas com radiomarcação para aplicações em imagens e radioterapia tem-se mostrado eficiente em casos de cânceres na região do pescoço e cabeça (KONG et al., 2013; VENDITTO; SZOKA, 2013). No âmbito das estratégias terapêuticas, já foram reportados o uso de vetores virais e nanopartículas vírus-like (SHOEB; HEFFERON, 2019; MOHSEN et al., 2019; BADRINATH et al., 2016), além de agentes tumorais conjugados a diferentes tipos de nanopartículas, tais como lipossomas, dendrímeros, micelas poliméricas, nanocristais, nanopartículas magnéticas, nanopartículas de ouro, de carbono e outras nanopartículas (RAJ et al., 2019; LI et al., 2016; BLANCO et al. 2015; CANCINO et al.,2014; KALRA; BALLY, 2013). A Figura 5 mostra resumidamente esses diferentes tipos e design de nanopartículas aplicados à nanomedicina. Inúmeras substâncias quimioterápicas encapsuladas nos dispositivos mencionados anteriormente já apresentaram resultados satisfatórios contra o câncer (Quadro 1)..

(24) 18. Figura 5 - Representação esquemática de alguns diferentes tipos e design de nanopartículas aplicadas à nanomedicina.. Fonte: Adaptado de Rampado (2019).. Quadro 1 - Lista com alguns fármacos encapsulados em nanossistemas comercializados no mercado para o tratamento de câncer. NOME COMERCIAL. FÁRMACO. CARACTERÍSTICAS. Abraxane. Paclitaxel. Nanopartícula complexada à albumina. Atragen Daunoxome Depocyt Doxil. Tretinoina Daunorubicina Citarabina Doxorubicina. Lipossoma convencional Lipossoma convencional Lipossma convencional Lipossoma peguilado. Genexol PM. Paclitaxel. Micela Polimérica. Marqibo Myocet. Vincristina Doxorubicina. Nanotherm. Óxido de Ferro. Rexin-G. Ciclina G1. Lipossoma convencional Lipossoma convencional Nanopartículas magnéticas Proteína marcada com lipídio e microRNA. Onivyde. Irinotecano. Lipossoma peguilado. INDICAÇÃO Adenocarcinoma de pâncreas metastático, câncer de mama, câncer de pulmão de células não pequenas Leucemia promielocitica aguda Sarcoma de Kaposi na AIDS Sarcoma de Kaposi na AIDS Sarcoma de Kaposi na AIDS Câncer de mama, câncer de pulmão de células não pequenas Leucemia linfoblastica aguda Câncer de mama metastático. REFERÊNCIA Li; Kwon, 2019 Swaminathan et al., 1999 Fassas; Anagnostopoulos, 2005 Glantz et al., 1999 Barenholz et al., 2012 Lee et al., 2008 Bedikian et al., 2011 Gardikis et al., 2010. Ablação térmica de Glioblastoma. Gil et al., 2010. Sarcoma, osteosarcoma, câncer de pâncreas e tumores sólidos. Chawla et al., 2018. Câncer de pâncreas metastático. Lamb et al., 2017. Fonte: Próprio autor (2020).. Um levantamento de publicações feitas nos últimos 10 anos (2008-2018) nas bases científicas PubMed e Web of Science, utilizando os descritores “nanotechnology and cancer”, revelou um total de 12.109 e 4.507 artigos, respectivamente (Figura 6). Esses dados revelam o interesse da comunidade científica nesse âmbito de pesquisa, que ao longo dos anos vêm crescendo em publicações e aplicações clínicas traduzidas em terapias e produtos direcionados ao combate do câncer..

(25) 19. Número de publicações. Figura 6 - Progressão anual de artigos publicados ao longo de 10 anos nas bases PubMed e Web of Science, associando ao descritor “nanotechnology and cancer”. 2500 2000 1500 1000. Pub Med. 500. Web of Science. 0 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017 2018 2019 Ano. Fonte: Próprio autor (2020).. Apesar dos vários benefícios relacionados às aplicações nanotecnológicas em sistemas de entrega de fármacos, alguns obstáculos ainda precisam ser contornados. Um deles refere-se à interação desses produtos nanotecnológicos com o organismo. Uma vez administrados no corpo, eles tendem a sofrer ação dos macrófagos e de outras barreiras fisiológicas que, somadas, podem limitar a quantidade total do medicamento que atinge o tumor, afetando o resultado terapêutico. Os macrófagos presentes em diferentes órgãos, como fígado, baço, pulmões, nódulos linfáticos e pele, podem fagocitar e degradar as nanopartículas que passam a ser alvo desse sistema fagocitário mononuclear (SENGUPTA, 2017). Essa fagocitose é aumentada caso as nanopartículas sejam opsonizadas com proteínas séricas, sofram agregação, apresentem tamanho grande ou possuam carga superficial catiônica (WIHELM, 2016; BLANCO et al., 2015). Uma alternativa para permitir o escape da captação pelos macrófagos e consequentemente aumentar o tempo de circulação das nanopartículas, é o revestimento com polímeros hidrofílicos inertes e biocompatíveis, tais como polietilenoglicol (PEG), gangliosídeo GM1 e fosfatidilinositol. Essa estratégia reduz a opsonização e atua como uma capa (o termo em inglês usado é stealth) em torno das nanopartículas (LILA; ISHIDA, 2017; OWENS, 2006). O acesso das nanopartículas para o microambiente tumoral se dá de modo passivo através da hipervascularização anormal do tumor como efeito do processo de retenção e permeabilidade aumentada (EPR). Em comparação com vasos fisiológicos normais, que impedem o extravasamento de nanopartículas, a vasculatura tumoral é caracterizada por uma fina barreira endotelial desprovida do suporte de pericitos, com membrana basal interrompida e lacunas interendoteliais de até 500 nm que favorecem o escoamento das nanopartículas (Figura 7) (RAJ et al., 2019; MAEDA et al., 2000)..

(26) 20. Figura 7 - Passagem passiva nas nanopartículas para o ambiente tumoral por efeito do processo de retenção e permeabilidade aumentada (EPR).. Fonte: Adaptado de NEKKANTI; KALEPU (2015).. Os nanossistemas com tamanho entre 100 e 200 nm apresentam a tendência de acúmulo preferencial nas proximidades da massa tumoral e propiciam uma melhor citotoxicidade das moléculas neles contida e contribuem com a internalização celular do fármaco resultando em mínima toxicidade fora do alvo (ELOY et al., 2019; WILHELM, 2016; NOBLE et al., 2014). 1.3 Lipossomas Os lipossomas são vesículas lipídicas concêntricas formadas por diferentes composições de lipídios. Como ele é um análogo sintético da membrana celular, os dois tipos de lipídios comumente usados para construir a estrutura básica da vesícula também são encontrados na membrana celular: fosfolipídios e colesterol (KALRA; BALLY, 2013). Os fosfolipídios são moléculas anfifílicas, contendo uma parte hidrofílica e outra lipofílica que quando dispersas na água, formam vesículas em bicamadas (Figura 8). Isso permite o encapsulamento de substâncias hidrofílicas que ficam no compartimento aquoso e de substâncias lipofílicas que permanecem inseridas ou adsorvidas na bicamada (EDWARDS; BAEUMNER, 2006; PUISIEUX et al., 1995; NEW, 1990). Os fosfolipídios comuns usados na preparação da vesícula incluem lipídios derivados de fontes naturais, como fosfatidilcolina de ovo e fosfatidilcolina de soja, e como exemplos de lipídios sintéticos incluem-se o 1,2-disteasteroil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), o 1,2distearol-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DSPE), o 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC) e o 1,2-dioleoil-sn-glicero-3- fosfocolina (DOPC). A escolha do(s) lipídio(s) dependerá da função desejada e das propriedades da formulação que está sendo feita (KALRA; BALLY, 2013)..

(27) 21. Figura 8 - Estrutura da bicamada lipídica e do lipossoma.. Fonte: Adaptado de Nekkanti e Kalepu (2015).. Os lipossomas foram relatados pela primeira vez por A. D. Bangham que, no início dos anos 1960, observou a formação de estruturas esféricas quando fosfolipídios entravam em contato com a água. Essa descoberta levou, desde então, ao encapsulamento de uma ampla categoria de substâncias em bicamadas fosfolipídicas para melhorar o desempenho de terapias (BANGHAM et al., 1965). Pode-se destacar que estruturas lipossômicas compostas apenas por fosfolipídios podem ser instáveis em sistemas como soro ou plasma. Para minimizar a instabilidade, o colesterol pode ser incorporado na mistura lipídica, intercalando-se com a bicamada fosfolipídica e seus volumosos anéis esteroides permitem que o colesterol confira rigidez à membrana, restringindo a mobilidade dos fosfolipídios a temperaturas mais altas e aumentando a fluidez em temperaturas mais baixas e, portanto, conferindo maior estabilidade à vesícula (KALRA; BALLY, 2013; DEMETZOS, 2008; BATISTA et al., 2007). A literatura mostra vários tipos de lipossomas diferenciados com base no número de bicamadas/lamelas, tamanho de partícula, composição lipídica, modificação da superfície e métodos de preparação (OLIVEIRA, 2017; AKBARZADEH et al., 2013; KALRA; BALLY, 2013). Quando o parâmetro avaliado é o número de lamelas, os lipossomas podem ser chamados de vesículas multilamelares (MLV) ou vesículas unilamelares (ULV). As MLVs consistem em duas ou mais bicamadas e têm uma faixa de tamanho 0,5-5 µm. Essas vesículas têm um volume retido moderado e são estáveis em armazenamento a longo prazo. Por outro.

(28) 22. lado, as ULVs, com lamelas únicas, podem ser agrupadas em vesículas unilamelares grandes (LUV) e vesículas unilamelares pequenas (SUV). As LUVs são maiores que 100 nm de tamanho e possuem grande volume interno, enquanto as SUVs são menores que 100 nm e apresentam volume interno pequeno (Figura 9) (KALRA; BALLY, 2013). Figura 9 - Classificação dos lipossomas quanto as lamelas.. Fonte: Adaptado de Nekkanti e Kalepu (2015).. Sercombe et al. (2015) categorizaram os sistemas de liberação lipossômicos em quatro principais tipos: lipossomas convencionais, lipossomas estericamente estabilizados (nos quais se incluem os lipossomas peguilados), lipossomas conjugados a ligantes alvo direcionados (nos quais se incluem os lipossomas teranósticos) e lipossomas que possuem combinações dos tipos anteriores mencionados (Figura 10). Figura 10 - Representação esquemática de diferentes tipos de lipossomas.. Fonte: Adaptado de Sercombe (2015)..

(29) 23. O desenvolvimento dos lipossomas teranósticos é fruto dos avanços no campo de pesquisa dos lipossomas. Eles são um subtipo dos lipossomas conjugados a ligantes, onde um único sistema contendo a nanopartícula apresenta um elemento de direcionamento, um componente de imagem e um componente terapêutico (Figura 10) (LILA; ISHIDA, 2017; SERCOMBE et al., 2015). Os lipossomas conjugados a ligantes objetivam otimizar e aprimorar a seletividade desses sistemas de entrega. Essa funcionalização pode se dar com a ligação a anticorpos, peptídeos e outras moléculas. O acoplamento a anticorpos, particularmente anticorpos monoclonais ou fragmentos de anticorpos, dão origem aos chamados imunolipossomas. Esses anticorpos representam um dos tipos de ligantes mais versáteis que podem ser afixados às superfícies dos lipossomas. Com o intuito de aumentar o tempo de circulação desses imunolispossomas, os ligantes alvo-específico são estericamente estabilizados com PEG, o que melhora significativamente a farmacocinética desses nanosssitemas (ELOY et al., 2017; PURI et al., 2009; MARUYAMA, 2002). Além dos anticorpos, outras estratégias para funcionalização dos lipossomas que demostraram boas avaliações in vitro e in vivo incluem o uso de aptâmeros (oligonucleotídeos de DNA e RNA produzidos pela tecnologia de Evolução Sistemática de Ligantes por Enriquecimento Exponencial), folato e transferrina (RIAZ et al., 2018; ELOY et al.,2017; LOPALCO et al., 2018; MOLES et al., 2017; PLOURDE et al.,2017). Dessa forma, por serem biodegradáveis, biocompatíveis e não imunogênicos, além de serem capazes de carrear fármacos hidrofílicos e lipofílicos, os lipossomas são altamente versáteis para uso na pesquisa e terapêutica e são, atualmente, os mais bem investigados nanocarreadores para entrega direcionada de medicamentos (ELOY et al., 2019; PANAHI et al., 2017; SERCOMBE et al., 2015; EDWARDS; BAEUMNER, 2006). Os lipossomas foram os primeiros produtos farmacêuticos em aplicações de nanotecnologia aprovados para câncer e para outras aplicações terapêuticas. O Doxil® foi a primeira formulação lipossômica comercial, aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) em 1995, carregado com o fármaco antitumoral doxorrubicina. Ele é estericamente estabilizado em 100 nm, sendo composto por colesterol, fosfatidilcolina de soja e mPEGdiastearoiletanolamina. A doxorrubicina está encapsulada no compartimento aquoso a uma proporção de 12% de fármaco/lipídio (%p/p) (BARENHOLZ, 2012). Todo o potencial de sistema de liberação demonstrado pelos produtos lipossômicos, resultou em sua entrada rápida e crescimento no mercado dos EUA. Um estudo feito por Kapoor et al. (2017) revelou que entre todos os tipos de produtos contendo nanomateriais comercializados, os lipossomas tiveram a maior participação de mercado, representando quase.

(30) 24. 30% do total (excluindo lipossomas de gama-mícrons). Os autores mostraram ainda, que o câncer foi a indicação mais comum (63%) para a qual os lipossomas foram desenvolvidos, seguido de infecções (17%), doenças oculares (7%) e dor (5%). Essa inserção dos produtos lipossômicos no mercado americano motivou a FDA a lançar, em 2002, um projeto de orientação sobre medicamentos lipossômicos (Guidance on Liposomal Drug Products – edição mais recente foi revisada em 2018) para apoiar a estratégia de desenvolvimento de produtos para administração de medicamentos à base de lipossomas e estabelecer os requisitos de mínimos de qualidade (FOOD AND DRUG ADMINISTRATION, 2018). Existem limitações associadas ao desenvolvimento dos lipossomas, tais como estabilidade, baixo aprisionamento de fármacos, ausência de biodisponibilidade oral, baixo tempo de circulação e altos custos de produção (NEKKANTI; KALEPU, 2015). Todavia, como os lipossomas oferecerem diversas vantagens, que vão desde inovações na produção de medicamentos ou na forma de administração até a incorporação de novas terapêuticas (FRIBERG; NYSTRÖM, 2015), pesquisas vêm sendo realizadas para contornar tais obstáculos. Dentre as estratégias para diminuir a captação dos lipossomas pelas células do sistema fagocitário, além do uso do estabilizante PEG, o uso de fosfolipídios saturados ou incorporação de colesterol, que aumenta o conteúdo de fosfolipídios na bicamada lipídica também reduz a captação lipossômica pelas células do sistema fagocitário mononuclear (SENIOR et al., 1982; DAMEN et al., 1981). Vale destacar também que lipossomas carregados e/ou lipossomas com tamanho grande são eliminados da circulação sistêmica mais rapidamente do que lipossomos neutros e/ou de tamanho pequeno (BLANCO et al., 2015). No que se refere a interação com as células, os lipossomas podem interagir de quatro formas principais: via transferência intermembranar dos componentes lipídicos, sem necessidade de ruptura do lipossoma ou prejuízo da integridade membranar de modo que não há perda de conteúdo do compartimento aquoso; por adsorção, resultado de forças físicas atrativas ou da ligação de moléculas da membrana do lipossoma a receptores específicos; os lipossomas podem também ser incoporados em endossomas por ação fagócitica da célula; ou ainda, pode ocorre o processo de fusão. Este último resulta na mistura completa dos lipídios do lipossoma com os da célula, permitindo a libertação do seu conteúdo no citoplasma (Figura 11) (LILA; ISHIDA, 2017; FROHLICH, 2012; NEPOMUCENO, 2012; FERREIRA, 2006)..

(31) 25. Figura 11 - Representação dos diferentes tipos de interação dos lipossomas com uma célula.. Fonte: Ferreira (2006).. Vários métodos são preconizados para a preparação dos lipossomas, e variações nas condições de preparo dentro do mesmo método pode resultar em diferentes propriedades, como por exemplo, a capacidade de encapsulação, a permeabilidade da bicamada ou a estabilidade (FERREIRA, 2006). O processo clássico de preparo envolve o método de hidratação do filme lipídico (LASIC, 1992). Neste método, os componentes lipídios são dissolvidos em solvente orgânico, seguido da evaporação do solvente que culmina na deposição de uma fina camada nas paredes de um balão de vidro em rotação. O filme lipídico preparado é posteriormente hidratado com água ou solução tampão. O fármaco a ser encapsulado pode ser incorporado na solução tampão (hidrofílicos) ou dissolvido na mistura lipídica (lipofílicos). A hidratação do filme lipídico se dá sob agitação, o que conduz a formação espontânea das MLVs, uma população de vesículas lipossômicas heterogénea, em tamanho e número de bicamada. A partir da dispersão das MLVs, diferentes métodos são utilizados para produzir dispersões homogêneas de SUVs e LUVs, podendo-se empregar processos mecânicos, eletrostáticos ou químicos. Os mais frequentes são os processos mecânicos, em que estão incluídos: extrusão através de membranas de policarbonato com diferentes porosidades, prensa de French ou uso de homogeneizador/microfluidificador e a sonicação (FERREIRA, 2006). As SUVs e LUVs também podem ser preparadas pelo método de injeção de etanol ou éter (processo químico). Neste método, os lipídios são dissolvidos no solvente e então injetados em solução aquosa aquecida, seguido de evaporação do solvente (FERREIRA, 2006). Outros métodos de preparo de lipossomas incluem a evaporação de fase reversa, uso de vesículas pré-formadas, execução de ciclos de congelamento/ descongelamento, e técnicas de desidratação/reidratação (KAPOOR et al., 2017; AKBARZADEH et al., 2013)..

(32) 26. 1.4 Atividade antitumoral das Naftoquinonas As quinonas são compostos químicos de ocorrência natural que possuem notória biodinamicidade, ou seja, apresentam múltiplas propriedades biológicas. Além dos processos bioquímicos vitais que esses metabólitos participam (tais como, respiração celular, fotossíntese, cascata de coagulação sanguínea e biossíntese de aminoácidos), os compostos quinônicos têm sido estudados por apresentarem pronunciados efeitos citotóxicos antitumorais, propriedades microbicidas, tripanossomicidas, moluscicidas, anti-inflamatóras, leishmanicidas e viruscidas (da SILVA-JÚNIOR et al., 2019; GUIMARÃES et al., 2013; LOURENÇO et al., 2011; BARBOSA et al., 2005; PINTO et al. 2000; GAFNER et al., 1996; ALMEIDA et al., 1990). Muitos desses efeitos estudados decorrem de sua atuação como agente oxidante, visto a facilidade que sua estrutura química apresenta, particularmente seu núcleo quinônico, em ser reduzida. Essa redução ocorre através da formação de um sistema totalmente aromático que promove a aceitação de um elétron, formando um radical semiquinona, e a aceitação de um elétron adicional, formando um radical hidroquinona (Figura 12) (PINTO; de CASTRO, 2009; HILLARD et al., 2008; ASCHE, 2005). Em condições aeróbicas, o radical semiquinona pode ser oxidado para a quinona original pelo oxigênio molecular. Este processo de redução, provocado por uma redutase, seguido de auto-oxidação leva a formação do radical ânion superóxido (O2•-) e é conhecido como ciclo redox das quinonas (Figura 11). Esse processo é dependente de oxigênio e se mantem até o sistema se tornar anaeróbico (ASCHE, 2005). Figura 12 - Ciclo redox das quinonas.. Fonte: Adaptado de Asche (2005).. Em sistemas biológicos, as quinonas podem sofrer esse processo de redução bioquímica reversível catalisado por flavoenzimas usando o NADPH como fonte de elétrons. As enzimas.

(33) 27. redutoras de 1 elétron são, a exemplo, NADPH: citocromo P450 redutase, NADPH: citocromo b5 redutase e NADPH: ubiquinona oxidoredutase. A enzima redutora de 2 elétrons mais importante é a NAD(P)H: quinona oxidase 1 (NQO1) (PEREYRA et al., 2019; SILVERS et al., 2017; ASCHE, 2005). Os mecanismos propostos de citotoxicidade em células tumorais envolvem a ocorrência desse ciclo redox, que leva a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e à alquilação de nucleófilos celulares, havendo ligação covalente com proteínas e/ou DNA que causam os danos celulares (QUI et al., 2018; VESSECCHI et al., 2010; BOLTON et al., 2000). As EROs incluem, além dos radicais livres superóxido (O2•-), o radical hidroxila (OH•), e moléculas não radicais, como peróxido de hidrogênio (H2O2). Essas moléculas são derivadas principalmente do oxigênio que é consumido em várias reações metabólicas que ocorrem principalmente nas mitocôndrias, peroxissomos e retículo endoplasmático. O desequilíbrio entre a geração e eliminação de EROs resulta em seus altos níveis e estresse oxidativo em células tumorais (GORRINI et al., 2013). Com base na estrutura molecular, a principal característica das quinonas é a presença de dois grupos carbonílicos que formam um sistema conjugado com pelo menos duas ligações duplas entre carbonos. Em relação ao sistema aromático no qual o sistema de duplas e cetonas conjugadas está inserido, têm-se três grupos principais de quinonas (Figura 13): benzoquinonas – um anel benzênico; naftoquionas – um anel naftalênico; antraquinonas – um anel antracênico (ASCHE, 2005). Figura 13 - Representação da estrutura química dos principais grupos de quinonas: benzoquinona (A), naftoquinona (B) e antraquinona (C).. Fonte: Pinheiro (2017).. Em decorrência de diferentes arranjos isoméricos, com um mesmo tipo de anel pode-se ter, dependendo das disposições relativas das carbonilas, diferentes quinonas. Por exemplo, no arranjo de base naftalênica tem-se a forma isomérica orto-quinonoídica (1,2-naftoquinonas), quando as carbonilas são vizinhas (Figura 14A) ou a forma isomérica para-quinonoídica (1,4 – naftoquininas), com as carbonilas tendo entre si dois carbonos (Figura 14B). Outros arranjos isoméricos são conhecidos, principalmente em sistemas policíclicos, nos quais os distanciamentos entre as carbonilas podem ser maiores (SILVA et al., 2005)..

(34) 28. Figura 14 - Representação das formas isoméricas orto-quinonoídica (β-lapachona) e para- quinonoídica (α-lapachona).. Fonte: Adaptado de Silva et al. (2005).. As formas isoméricas diferem muito em suas propriedades físicas, químicas e quanto à sua atuação biológica. A exemplo, tem sido relatado que a β-lapachona (Figura 13A) é capaz de induzir seletivamente a morte celular em várias células cancerígenas humanas e na terapia combinada com o taxol também exibiu potentes efeitos citotóxicos in vitro (HUSSAIN; GREEN, 2017; CAVALCANTE et al. 2010; LI et al., 1999). Já a α-lapachona (Figura 13B) demonstrou possuir efeitos tripanocidas em Trypanosoma cruzi e seus análogos, efeitos contra Leishmania amazonensis e L. braziliensis (HUSSAIN; GREEN, 2017; SOUZA-SILVA, et al., 2014; MOURA et al., 2001). Dentre os vários compostos quinônicos, as naftoquinonas são moléculas consideradas privilegiadas com relação a sua química medicinal (CONSTANTINO; BARLOCCO, 2006). As naftoquinonas naturais de maior destaque, extensivamente investigadas para o tratamento do câncer, são o lapachol e a β-lapachona. Considerado um dos primeiros representantes do grupo, o lapachol é conhecido desde 1858 e tem maior ocorrência no cerne do lenho de árvores da família Bignoniaceae, particularmente no gênero Tabebuia (árvores de ipês), nativas das Américas Central e do Sul (SILVA et al., 2003). A β-lapachona, encontrada também nas árvores de ipê (porém como constituinte minoritário), tal qual o lapachol, mostra uma diversificada ação farmacológica, principalmente relacionada ao ciclo redox e exigindo bioativação pela enzima NQO1. Essa enzima exibe expressão elevada na maioria dos tumores sólidos e, portanto, é um potencial alvo específico em células tumorais (SILVERS et al., 2017; RÍOS-LUCI et al., 2012; ASCHE, 2005). O número crescente de publicações sobre essa classe, demostra o grande interesse pelo conhecimento da farmacologia e mecanismo de ação destas substâncias no campo da oncologia. Um levantamento de publicações feitas nos últimos 20 anos (1998-2018) nas bases PubMed e Web of Science, utilizando os descritores “naphthoquinone and cancer”, revelou um grande número de publicações, 2.563 e 673 artigos, respectivamente (Figura 15)..

(35) 29. 250 200. 150 100. Pub Med Web of Science. 50 2019. 2018. 2017. 2016. 2015. 2014. 2013. 2012. 2011. 2010. 2009. 2008. 2007. 2006. 2005. 2004. 2003. 2002. 2001. 2000. 0 1999. Número de publicações. Figura 15 - Progressão anual de artigos publicados ao longo de 20 anos nas bases PubMed e Web of Science, associando ao descritor “naphthoquinone and cancer”.. Ano Fonte: Próprio autor (2020).. A nível de patentes, um estudo de revisão dedicado a avalição de patentes relacionadas ao lapachol, β-lapachona e α-lapachona nas últimas duas décadas, mostrou que a maioria das patentes publicadas estão relacionadas aos efeitos anticancerígenos (HUSSAIN; GREEN, 2017). O que reafirma o interesse nesse campo de pesquisa. Quase 300 tipos estruturais relacionados a naftoquinonas já foram isolados de plantas, bactérias e fungos, e além da avaliação biológica relacionada aos compostos de origem natural, tem-se buscado a síntese e estudo de compostos bioativos sintéticos e semi-sintéticos baseados no esqueleto naftoquinônico. As naftoquinonas têm sido muito utilizadas na química medicinal como modelo para síntese de derivados com potencial anticâncer e outras doenças tropicais negligenciadas, como Chagas e Leishmaniose (da SILVA-JÚNIOR et al., 2019; TANDOR; KUMAR, 2013; PHILLIPS et al., 2004). A aplicação da química orgânica e medicinal em compostos de ocorrência natural é bastante recorrente. Uma avaliação de compostos antitumorais aprovados entre 1950 e 2014, mostrou que cerca de 50% dos compostos utilizados para quimioterapia do câncer são provenientes de produtos naturais, de seus derivados ou são inspirados em sua estrutura química original (NEWMAN; CRAGG, 2016). Os esforços mais recentes nessa linha, envolvem principalmente a busca e desenvolvimento de novos análogos naftoquinônicos cada vez mais potentes e menos tóxicos. A nor-β-lapachona, análogo semi-sintético da β-lapachona, faz parte desse contexto (PEREYRA et al., 2019; da SILVA JÚNIOR et al., 2011, 2007; MONTENEGRO et al., 2010). Isso porque, a β-lapachona, embora tenha pronunciado potencial biológico, sendo citotóxico para uma variedade de linhagens celulares de câncer humano, que geralmente são células mais sensíveis às lesões oxidativas associadas à EROs, tem uso reduzido como quimioterápico pois sua alta hidrofobicidade provoca metemoglobinemias em pacientes (da SILVA-JÚNIOR et al.,.

(36) 30. 2019; SILVERS et al., 2017). O desenvolvimento de compostos naftoquinônicos derivados dessa molécula tem sido o propósito do grupo de pesquisa liderado pelo Prof. Dr. Eufrânio Nunes da Silva Júnior, da Universidade Federal de Minas Gerais. A nor-β-lapachona e seus derivados, concebidos pelo referido grupo, mostraram potente efeito citotóxico contra várias linhagens celulares de câncer, alcançando pronunciada atividade citotóxica em comparação a linhagens não-tumorais (COSTA et al., 2017; CAVALCANTI et al., 2011a; da SILVA JÚNIOR et al., 2010, 2008, 2007). As principais estratégicas químicas envolvidas na síntese dos análogos quinônicos bioativos envolvem modificações em três zonas principais: anel C, centro redox, e anel A. Essas modificações permitiram a obtenção de moléculas com excelente atividade biológica, dentre elas o composto químico 2,2-dimetil-3-(2-metil-4-nitro-arilamino)-2,3-diidro-nafto[1,2b]furan-4,5-diona, também chamado de ENSJ39. A sua obtenção, a partir do lapachol (Figura 16), foi previamente descrita na literatura (da SILVA JÚNIOR et al, 2019, 2010; CAVALCANTI, 2010). Figura 16 – Rota sintética para obtenção da naftoquinona ENSJ39.. Fonte: Adaptado de Silva-Júnior et al (2010).. O grupo de pesquisa do Laboratório de Oncologia Experimental (LOE), da Universidade Federal do Ceará (UFC), liderado pela Profa. Dra. Claudia do Ó Pessoa, tem investigado, ao longo dos últimos anos, as propriedades farmacológicas de uma série de novos compostos quinonas, planejados como possíveis agentes antitumorais. O grupo apresenta patentes depositadas em âmbito nacional e internacional, da qual se abordam. os. métodos. de. uso. de. derivados. de. lapachona. (BR1120180080764,. WO2017070012A1 e US1656986). Para as publicações, tem-se estudos de síntese de compostos híbridos selênio-quinolina com potencial atividade antitumoral, estudos de citotoxicidade envolvendo análogos lapachônicos contendo grupos ariloaminos, tiocompostos, conjugação com compostos organobóricos associados a corantes fluorescentes e outras combinações (Quadro 2)..