Métodos de Detecção de Mutações dos genes B-RAF e C-KIT em Melanomas

Métodos de Detecção

de Mutações dos genes

B-RAF e C-KIT em

Melanomas

Dra Isabela Werneck da Cunha, MD phD

Divisão de Patologia Molecular Departamento de Anatomia Patológica

DNA

RNA

Proteínas

Funções

celulares

Detecção das mutações

• Detecção de proteínas alteradas, supressas ou

super-expressas

– Imunoistoquímica

• Aumento ou diminuição do mRNA

– RT-PCR

• Análise do DNA

– PCR

– Real time PCR – Sequenciamentos

– Hibridização in situ (se alterações no numero de cópias ou translocações de genes inteiros)

O DNA – principais características

• Dupla-Fita

• Anti-Paralelas

• Complementares

 A

T



C

G

Códon Códon Códon Códon Códon

4 nucleotídeos= 64 combinações diferentes de 3 em 3 (Temos 20 aminoácidos) Redundância: Vários códons codificam o mesmo aminoácido

• Mutações em

Melanoma

• Vias similares

• Mutualmente

exclusivas

• Diferentes tipos de

Melanoma

Melanoma

•Diferentes vias

moleculares

•Diferentes

tratamentos

Subtipos de Melanoma

Mike Davies, MDACC

–

GENE BRAF

– Gene da família das Kinases da via MAP kinase/ERKs – Participa dos processos de divisão celular e diferenciação.

– A mutação leve a produção de uma proteína com atividade 10x maior que a selvagem, favorecendo proliferação celular, invasão, angiogênese e

Mutação do BRAF vista em 66% dos melanomas (Davies et al.2002)

– 97% das mutações envolvem o codon 600 (GTG>GAG) (Valina>Ac.Glutâmico) (V600E)

– Associação com resposta (78%) a tratamento de melanoma

metastático com inibidores de BRAF (vemurafenib) (Eggermount et al 2011).

(JaKob J et al, Cancer 2012)

Targeted therapy for metastatic melanoma

Garnett MJ et al. Cancer Cell 2004;6:313–319; Wan PT et al. Cell 2004;116:855–887.

Zelboraf mode of action BRAF V600E MEK ERK Arrested cell proliferation and survival

x

MAPK, Mitogen-activated protein kinase

BRAF Normal cell proliferation and survival MEK P ERK P Oncogenic BRAF signaling BRAF V600E Excessive cell proliferation and survival MEK ERK P P

– Gene da família das Proteínas Tirosino-Kinases

– Participa dos processos de divisão celular e diferenciação.

– A mutação leve a produção de uma proteína constantemente ativa, favorecendo proliferação celular, invasão, angiogênese e metástase.

–

Cytogenetic Location: 4q11-q12

Molecular Location on chromosome 4: base pairs 55,524,094 to 55,606,880

•Seleção dos casos

•Extração do DNA

•PCR de amplificação dos genes envolvidos

•Real Time, sequenciamento,

pirosequenciamento, análise de fragmentos,

next sequencing generation, etc...

•Análise dos dados

Mistura de células tumorais e estromais: Necessidade de microdissecção. Heterogeneidade intratumoral. DNA mutado misturado com DNA selvagem: Desafio para detectar baixas taxas de

mutação.

Fixação tecidual pode levar a dano do DNA. Tecido necrótico pode não ter DNA

amplificado. Tipo de fixação e outras impurezas como melanina podem interferir na amplificação do DNA

% tumoral _mutantes % cópias _amplificado % DNA Tipo de fixação

A grande maioria dos melanomas para testes

moleculares estão emblocados em parafina

• PARA 1 litro

• 100 ML DE FORMALDEIDO A 37%

• 4,0 gramas de Fosfato de Sódio Monobásico NA H2 P04

H20

• 12,26 gramas de Fosfato de Sódio Bibasico Na2H PO4.7 H20 • 900 ml de Água destilada

• Acertar o PH = 7.2 a 7.4 com Hidróxido de Sódio NaOH=5

normal

Fixação do Material

FORMOL TAMPONADO A 10%

Formol tamponado 10%

Confirmação Diagnóstica

Seleção da amostra

• Microdissecção a

laser

• Microdissecção manual /scrape

Tumor content study

Correct detection of V600E mutations in specimens with at least 15% tumor content and/or mutation level >5%

Specimen Tumor content* % mutation Test result

1 5%/5% 3% Mutation not detected

4 10%/10% 4% Mutation not detected

5 10%/10% 14% Mutation not detected

8 15%/15% 3% Mutation detected 12 20%/20% 28% Mutation detected 14 20%/20% 2% Mutation detected 17 30%/25% 20% Mutation detected 22 35%/35% 7% Mutation detected 26 40%/35% 7% Mutation detected 31 40%/45% 36% Mutation detected

cobas® _{4800 BRAF V600 Mutation Test. CE-IVD Package Insert. Roche Molecular Systems, Inc., USA. 2011.} *Tumor content for first and last of 12 adjacent 5µm sections from each specimen

Impacto da quantidade relativa de estroma na

sensibilidade de detecção de mutação do gene

KRAS

• Lâminas histológicas submetidos a análise de imagens

para estimar a proporção de tumor em relação ao

estroma

Impacto da quantidade relativa de estroma na sensibilidade

de detecção de mutação do gene KRAS

Extração do DNA

Inúmeros métodos

Inúmeros kits

• Espectofotômetro • Mede quantidade e

qualidade do DNA obtido

• Usar o DNA para realizar a

PCR

• Polymerase Chain Reaction (reação em cadeia da

polimerase)

• Amplificação do DNA (criação de múltiplas cópias)

• Consiste em fazer cópias de DNA “in vitro”, usando os

elementos básicos do processo de replicação natural do DNA.

• Pode ser usada para amplificar todo o gene ou somente

parte de um gene

595 596 597 598 599 600 601 602 603 ...

Área de interesse

DNA

PCR

Sequenciamento Gênico

• Determinar a ordem das bases nitrogenadas A G C

T da molécula de DNA

• Métodos:

• Sanger – conceito de sequenciamento por ``Chain

termination´´

• Pirosequenciamento: sequenciamento por síntese

• Next sequencing generation

• Análise de fragmentos, etc

• RT-PCR

Um Pouco de História...

"for their contributions concerning the

determination of base sequences in nucleic acids“

Nobel Prize in Chemistry - 1980

Frederick Sanger 1918-

Walter Gilbert 1932-

Pirossequenciamento

PPi ATP

Emissão de luz

Tempo

•Se baseia no conceito de liberação de pirofosfato após incorporação de cada nucleotídeo- conceito do sequenciamento por síntese

•Mais sensível que Sanger •Quantitativo

cobas® _{4800 BRAF V600 Mutation Test. CE-IVD Package Insert. Roche Molecular Systems, Inc., USA. 2011.}

cobas

4800 BRAF V600 Mutation Test

Based on TaqMan® PCR

Probe and primer binding Polymerization Fluorescence

TaqMan® _probe

Fluoroph ore

Quench

er Amplifica

tion Cleavage _products

Forward PCR primer

Competitive landscape

cobas® 4800 BRAF V600 Mutation Test – comparison to other methods Feature cobas ® _BRAF test1 therascreen BRAF RGQ2 _kit Direct sequencing Next generation sequencing PCR-based LDT % tumor

required ≥50% Undefined Undefined Undefined Undefined

DNA input

required 125 ng/25 μl

requires PCR

titration Undefined Undefined Undefined

Sensitivity ≤5% FFPET 1–5% in cell line ~20% ~1%–5% Undefined

Storage

conditions 2 to 8°C -18°C to -25°C Variable Variable Variable

Control/result

interpretation Automated Manual Manual Manual Manual

Workflow <8 hours ~16 hours ~3 days ~5 days ~16 hours

IVD platform CE-IVD, FDA _approved RUO RUO RUO RUO

1_cobas® _{4800 BRAF V600 Mutation Test. CE-IVD Package Insert. Roche Molecular Systems, Inc., USA.}

2011; 2_{therascreen BRAF RGQ PCR Kit CE-IVD Handbook, Qiagen Manchester Ltd, UK, 2011.}

• Imuno-histoquímica

– VE1

– Anticorpo monoclonal anti-BRAF V600E • Representa a sequência de aa da mutação V600E • aa 596-606: GLATEKSRWSG – Negativo em: • Gene tipo-selvagem

Assessment of BRAF V600E mutation status by immunohistochemistry with a mutation-specific

monoclonal antibody

David Capper • Matthias Preusser • Antje Habel • Felix Sahm • Ulrike Ackermann • Genevieve Schindler • Stefan Pusch • Gunhild Mechtersheimer • Hanswalter Zentgraf • Andreas von Deimling

Acta Neuropathology (2011) 122:11–19

Immunohistochemical testing of BRAF V600E status in 1,120 tumor tissue samples of patients with brain metastases

David Capper • Anna Sophie Berghoff • Manuel Magerle • Aysegu¨ l Ilhan • Adelheid Wo¨hrer • Monika Hackl • Josef Pichler • Stefan Pusch • Jochen Meyer • Antje Habel • Peter Petzelbauer • Peter Birner • Andreas von Deimling • Matthias Preusser

Em resumo

• Condições pré analíticas

– Tamanho/Tipo da amostra

– DNA degradado (descalcificação)

– Fixação inadequada

• Métodos (sensibilidade X especificidade)

Taxa de resultados inconclusivos: 2 a 3 %

(dados americanos)