SÍNTESE DE NANOPARTÍCULA MAGNÉTICA PELO MÉTODO DE COPRECIPITAÇÃO RECOBERTA COM SÍLICA E FUNCIONALIZADA COM TRISCARBOXIMETIL AMINA (NTA) PARA
SEPARAÇÃO DE HISTIDINA
Daniely Ferreira de Queiroz (Bolsista de pós-doutorado PNPD/CAPES - UNIAN - SP)
danielyfqueiroz@gmail.com.br
Alejandra Hortencia Miranda González (Orientadora – UNIAN – SP) alejandra.horten@anhanguera.com
Introdução
Para separar magneticamente proteínas marcadas com Histidina (His) a partir de lisados celulares, a chave é acoplar agentes de afinidade apropriados na superfície das nanopartículas magnéticas. Para o DNA, o métodos atual de separação têm vários inconvenientes que os tornam impróprios para a fabricação de materiais de grau farmacêutico. Esses métodos geralmente envolvem o uso de solventes; tóxico produtos químicos tais como cloreto de césio, brometo de etídio, fenol, e clorofórmio; ou enzimas de origem animal, como a ribonuclease A e lisozima que não são aprovadas ou não recomendadas por agências reguladoras. Além disso, o gradiente de densidade ultracentrifugação de sacarose ou cloreto de césio ou etídio o brometo é demorado e difícil de escalar e usa-se reagentes tóxicos e mutagênicos. A viabilidade de funcionalizar quimicamente as nanopartículas magnéticas recobertas com sílica (MNPs@SiOH) para separação magnética de DNA com alto rendimento de processo usando interação eletrostática com um fosfato negativo presente na estrutura química do DNA. Com o advento da tecnologia do DNA recombinante, foi possível a incorporação de caudas (tag) em proteínas que não contêm naturalmente espécies doadoras de elétrons, tal como a fusão de sequência de seis histidinas na porção C ou N-terminal da proteína alvo, conferindo à mesma a possibilidade de purificação.
Neste presente trabalho serão estudados os aspectos fundamentais da seleção de íons metálicos (Ni, Fe), do agente quelante (NTA), a química de ativação e de imobilização e as condições operacionais (pH e força iônica da fase líquida, tipo ou composição da solução tamponante, etc). As vantagens da técnica de IMAC serão discutidas, bem como problemas que eventualmente surgem quando esta técnica é utilizada no processo de produção de proteínas de interesse farmacêutico.
Material e Métodos
Síntese utilizando ácido oleico como agente de superfície Síntese de óxido de ferro (OxFe-01) Para a síntese da OxFe-01 foram adicionados ao sistema FeCl3∙ 6H2O (2,0 mmol), FeSO4∙ 7H2O (1,0 mmol), ácido oleico (2,0 mmol), água destilada (50mL) sob agitação. Inicialmente o sistema foi aquecido até 70°C por 30 minutos para a solubilização dos reagentes e em seguida, foram adicionados 10mL de hidróxido de amônia (28%) e a temperatura foi aumentada para a temperatura de (~ 80°C) e mantida por uma hora. Após o resfriamento do sistema, a dispersão contendo as partículas foi transferida para tubos de centrífuga de 50 mL, sendo o volume completado com solução de HCl (10% solução aquosa) para neutralização da base, a solução contendo as partículas foram homogeneizadas e separadas com o auxilia de uma imã permanente externo e, para promover a precipitação e purificação das mesmas foram feitas mais 4 lavagens com água destilada e centrifugadas a 6500 rpm. Após lavagens as partículas foram armazenadas em frasco de vidro e dispersas em etanol.
Recobrimento das nanopartículas magnéticas com sílica pelo método de Stöber
Em um balão de três bocas foi adicionado 80 mL de isopropanol, 40 mL de água deionizada e 2mL de hidróxido de amônia 28%, o sistema de reação foi homogeneizado por 10 min e foram adicionados
um agitador mecânico com haste de vidro. Após o período de reação as partículas foram lavadas várias com etanol e centrifugado a 6000 rpm por 20 min. A amostra foi codificada como FeOx-01_100@SiOH. Este procedimento foi realizado modificando a quantidade em massa de amostra de óxido de ferro (FeOx-
01) para 150mg codificada como FeOx-01_150@SiOH. Todo procedimento foi realizado em atmosfera inerte de N2.
Resultados e Discussão
Síntese utilizando ácido oleico como agente de superfície Síntese de óxido de ferro (OxFe-01) No difratograma de raios X apresentado na Figura 1, obtido para as amostras de óxido de ferro, a OxFe-01 é possível observar os planos de difração (220), (311), (400), (511) e (440), compatíveis com a fase de coerência cristalográfica cúbica de fase centrada (FCC) comparada com do padrão de difração da magnetita (JCPDS 19-629), centrados respectivamente nos seguintes valores em 2θ: 30,5°, 35,1°, 43,1°, 56,8°, 62,5°. Devido ao tamanho de partícula pequeno da amostra OxFe-01, a relação área/volume diminui e o perfil do difratograma apresenta picos alargados.
Figura 1: Difratograma de raios-X obtido para amostra de OxFe-01, comparado ao padrão de difração para fase FCC da Magnetita (JCPDF 19-629).
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75
2 Theta
Fonte: Autoria Própria
(311) Magnetita JCPDF 19-629 FeOx-01 (220) (440) (511) (400) In te n s id a d e ( a .u )
A forma e o tamanho das partículas da OxFe-01 analisadas por imagens de MET que estão apresentados na Figura 2, mostrou um diâmetro médio de partícula de 3,2 ± 1,4 nm. Devido a presença de ácido oleico na síntese foi possível obter um controle de tamanho e forma de partícula e, propiciou uma melhor estabilidade coloidal quando as partículas são dispersas mesmo em orgânico (etanol) evitando assim a formação de aglomerados.
Figura 2: Microscopia eletrônica de transmissão da amostra de óxido de ferro OxFe-01.
Fonte: Autoria Própria
As propriedades magnéticas da amostra OxFe-01, indicaram através da curva de histerese magnética na Figura 3, magnetização de saturação Ms= 73,85 emu g-1 e comparado com a literatura
que reporta o valor para a fase bulk para Fe3O4 (94 emug-1), a presença de grande quantidade de
agente de superfície (ácido oleico) na partícula sendo que suas massas não foram subtraídos da massa total para o tratamentos dos dados. Ainda, partículas nanométricas tendem a apresentar defeitos devido a elevada superfície, características que afetam diretamente o comportamento magnético, diminuindo a magnetização de saturação. É possível notar é notado um pequeno valor de coercividade próximo a 0,007 kOe indicando um comportamento muito próximo ao superparamagnético.
Figura 3: Curva de histerese magnética da amostra OxFe-01 a temperatura de 300 K, submetida a um campo magnético aplicado de até 20 kOe.
80 60 40 20 0 -20 -40 -60 -80 -20 -15 -10 -5 0 5 10 15 20 H (kOe) Fonte: Autoria Própria
Conclusão
O método de síntese se mostrou satisfatório e foi possível obter nanopartículas magnéticas de óxido de ferro com controle de tamanho e forma de partículas com 3,2 ± 1,4 nm, compatível com a fase cúbica de face centrada (FCC) da magnetita e magnetização de saturação Ms= 73,85
emu/g. As caracterizações das nanopartículas magnéticas recobertas e funcionalizadas com aminoproprilsilano (APTS) ainda estão sendo analisadas.
Agradecimentos
Agradecimento ao apoio financeiro à Capes, CNPQ, Fapesp e projeto CEPID. Ao Prof. Daniel Cornejo pelas medidas de VSM no IF/USP. Ao Prof. Emerson Camargo por ceder a estrutura do LIEC (Laboratório Interdisciplinar de Eletroquímica e Cerâmica) na UFSCar.
Referências Arnold. F. H.; Bio-Technology 1991, 9, 151. FeOx-01 300 K Ms= 73,85 M a g n e ti z a ç a o ( e m u /g )
Chaga, G. S.; J. Biochem. Biophys. Methods 2001, 49, 313.
Gaberc-Porekar, V.; Menart, V.; J. Biochem. Biophys. Methods 2001, 49, 335. Gutiérrez, R.; Martín del Valle, E. M.; Galán, M. A.; Sep. Purif. Rev. 2007, 36, 71. Sharma, S.; Agarwal, G. P.; Sep. Sci. Technol. 2002, 37, 3491.
