UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: ,ENGENHARIA DE PROCESSOS
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
PAR TIÇÃO DOS AMINOÁCIDOS L-FENILALANINA,
/Í
L-
TIROSINA E
L-
TRIPTOF ANO, E )}A PROTEÍNA INS+A
HUMANA, EM SISTEMAS AQUOSOS 'BIFÁSICOS CONTENDO
POLÍMEROS, COPOLÍMEROS E SAIS
AUTOR: ENG. SÉRGIO BERNARDO
ORIENTADOR: PROF. DR. RAHOMA SADEG MOHAMED
Dissertação submetida à Comissão de Pós-Graduação da Faculdade de Engenharia Química da UNICAMP como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de MESTRE EM ENGENHARIA QUÍMICA. CAMPINAS-SP AGOSTO DE 2000
UNICAMP
BIBLIOTECA CENTRAl.
SEÇÃO CIRCULANTP
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CM-00144288-9
I
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELABIBLIOTECA DA ÁREA DE ENGENHARIA - BAE - UNICAMP
B456p
Bernardo, Sérgio
Partição dos aminoácidos L-fenilalanina, L-tirosina e L-triptofano, e da proteína insulina humana , em sistemas aquosos bifásicos contendo polímeros, copolímeros e sais
I Sérgio Bemardo.--Campinas, SP: [s.n.], 2000.
Orientador: Rahoma Sadeg Mohamed
Dissertação (mestrado)- Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química.
1. Particionamento. 2. Equihbrio líquido-líquido. 3. Aminoácidos. 4. Insulina. 5. Polímeros. 6.
Planejamento experimental I. Mohamed, Rahoma Sadeg. li. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia Química. ID. Título.
Dissertação de Mestrado defendida por Sérgio Bernardo e aprovada em 23 de Agosto de 2000 pela Banca Examinadora constituída pelos seguintes membros:
Prof Dr. Rahoma Sadeg Mohamed - Orientador FEQ/ UNICAMP
José de Almeida Meirelles
Prof Dr. Everson Alves Miranda FEQ I UNICAMP
UNICAMP
BIBLIOTECA CENTRAl.
SEÇÃO CIRCULANTP
Esta versão corresponde à redação final da Dissertação de Mestrado em Engenharia Química, defendida pelo Engenheiro Químico Sérgio Bernardo e aprovada pela Comissão Julgadora em 23 de Agosto de 2000.
Prof. Dr. Rahoma Sadeg Mohamed Orientador
UNICAMP
BIBLIOTECA CENTR)
SEÇ..ÃO CIRCULANTl
11
Remexo, com um pedacinho de arame, nas minhas memórias fósseis.
Tem por lá um menino a brincar no terreiro:
Entre conchas, osso de arara, pedaços de pote, sabugos de milhos,
asas de caçarola, etc.
E tem um carrinho de bruços no meio do terreiro.
O menino cangava dois sapos e os botava a puxar o carrinho.
Faz de conta que ele carregava areia e pedras em seu caminhão.
O menino também puxava, nos becos de sua aldeia, por um barbante sujo,
umas latas tristes.
Era sempre um barbante sujo.
Eram sempre umas latas tristes.
O menino é hoje um homem doutor que trata com fisica quântica.
Mas tem nostalgia das latas.
Tem saudades de puxar, por um barbante sujo, umas latas tristes.
Aos parentes que ficaram na aldeia esse homem doutor encomendou
uma árvore torta - para caber nos seus passarinhos.
De tarde os passarinhos fazem árvore nele. 11
UNICAMP
BIBLIOTECA CENTF
SEÇÃO CIRCULANj
Retrato do Artista Quando Coisa.
" À minha amada mãe, Lia. Meu porto seguro. Exemplo de mulher que, mesmo diante de todas as dificuldades e no seio de toda sua humildade, ensina seus filhos a lutar e a acreditar que, com determinação, realizar um sonho é possível. E ao meu amado e saudoso pai, Dezinho. Hoje, lá do céu, continua sendo uma luz em minha vida. Dedico este trabalho a vocês, minha eterna inspiração. "
AGRADECIMENTOS
"Todos, ao favorecerem aos outros, favorecem a si mesmos; e não me refiro ao fato de que o socorrido quererá socorrer e o defendido proteger, ou de que o bom exemplo retoma,
descrevendo um círculo, àquele que o dá -como os maus exemplos recaem sobre seus autores ... -mas a que o valor de toda virtude tem raízes nela mesma, uma vez que não é
praticada com vistas a prêmio: a recompensa da ação virtuosa é tê-la realizado. " (Sêneca, Cartas a Lucílio).
A Deus, pela vida que me concedeu, e pela graça de estar construindo o meu caminho no alicerce de Sua palavra, através da qual tenho realizado todos os meus projetos.
Aos meus pais, Lia e Dezinho (in memorian), por me fazerem aquilo que sou. Mesmo sem ter um alto grau de instrução, me ensinaram a ver através da educação a ferramenta para a realização de todos os meus sonhos. Eternamente grato.
Aos meus irmãos: Marcelo, Caca, Célia, Célio, Cicinho e Cicinha, por acreditarem mais uma vez em mim e por terem me ajudado a concretizar este projeto. A todos, meus sinceros agradecimentos pela eterna confiança depositada. Cada um de vocês construiu, com seu carinho e suas palavras, um pedacinho desta tese. Peço licença aos demais para agradecer, em especial, a Cicinha, Caca e Célia, por todo o esforço que fizeram para segurar as "contas" no início de tudo. Sem palavras para agradecê-los ....
Aos meus primos, Regina, Sérgio e Rafael, pelo carinho com que me receberam em suas vidas e por me permitir fazer de sua casa uma extensão da minha.
Ao meu orientador, Prof Dr. Rahoma Sadeg Mohamed, por ter me ajudado a ser este aprendiz de pesquisador, me fazendo compreender que a paciência e a serenidade devem ser minhas virtudes neste caminho.
Ao Prof. Dr. Watson Loh, por seu apoio neste projeto. Por sua disponibilidade em me atender e por me abrir as portas de seu laboratório de pesquisa.
Aos amigos:
- Viram Kopcak, pela grande amizade e pelos conhecimentos transmitidos nos passos iniciais deste projeto;
- Marcos Prado Masliaev, por dividir comigo a metodologia das tie-lines;
-Eliana J. S. Argandofía, por sua sincera amizade e por ter aberto as portas do "Polo Sul" para as minhas análises na FEA;
- Pedro A.P. Pessôa, por sua amizade e pela disponibilidade em me ouvir e esclarecer minhas dúvidas;
- Almerinda Wanderley, por sua orientação via internet, esclarecendo as eternas dúvidas sobre a insulina humana.
Aos meus amtgos: Wagner, Felipe e Ronaldo. Companheiros de república da B3 e cúmplices na eterna saudade das Alagoas, por estarem ao meu lado nos altos e baixos e por tomarem este "exílio" uma agradável convivência. E a minha amiga Wanda, obrigado por continuar sendo esta grande companheira de vida.
A todos os amigos de Maceió que aqui estão (Karla, Elaine, Luciana, Emerson, Édler) por me ajudarem a não perder o "ochente", exemplo das minhas raízes. À Juliana de Souza Ferreira, por sua amizade sincera, presença marcante nesta caminhada. À turma do Lab. de Eng. de Processos, pela agradável convivência diária. A Lecsi, pela amiga que tem sido em todos os momentos. A Marleny, por sua amizade e pela ajuda na elaboração desta dissertação.
A Universidade Estadual de Campinas, pela excelente estrutura com a qual me recebeu e que permitiu o desenvolvimento deste trabalho. À CAPES, pelo apoio financeiro concedido através da minha bolsa de mestrado. À empresa BIOBRÁS S.A, pela doação da amostra de Insulina Humana. E a ICI Surfactantes, pela generosa doação dos blocos copolímeros usados neste projeto.
RESUMO
A partição entre duas fases aquosas, contendo de 70 a 900/o de água em cada fase, revelou-se uma técnica adequada e conveniente para a purificação de biomoléculas, como aminoácidos e proteínas. Esta partição depende de diversos fatores: pH, massa molecular do polímero e temperatura. Recentemente, propôs-se a utilização de copolímeros do tipo bloco PEO-PPO-PEO para a formação de tais sistemas. O aumento da temperatura leva à auto-agregação destes copolímeros em micelas e à redistribuição das moléculas de água da fase contendo estes copolímeros, formando meios cujas características são ideais para a separação de biomoléculas hidrofóbicas. Este trabalho teve como objetivo obter dados experimentais sobre o comportamento de equilíbrio e a partição dos aminoácidos L-Triptofano, L-Fenilalanina e L-Tirosina e da proteína Insulina Humana, em sistemas aquosos bifásicos (ATPS) contendo os polímeros PEG4600 e PEG 1 0000; os copolímeros F38, F68 e F88 e os sais de fosfato de potássio monobásico e dibásico, visando caracterizar os ATPS e identificar as variáveis termodinâmicas que influenciam a partição das biomoléculas nestes sistemas. Os experimentos de partição foram organizados através de um planejamento fatorial, avaliando-se a influência das variáveis: temperatura (1 O, 25 e 40°C), pH (5, 7 e 9) e massa molecular dos polímeros e dos copolímeros no coeficiente de partição das biomoléculas acima citadas. Os resultados revelaram que a partição dos aminoácidos é influenciada pelo pH e pela temperatura, e que o L-Triptofano apresentou os maiores coeficientes de partição (K=2,8) em relação aos demais amínoácidos, atribuído a sua maior característica hidrofóbica. A partição da molécula Insulina Humana também foi influenciada pela temperatura e pelo pH. Os valores altos dos coeficientes de partição da Insulina (K=22) foram atribuídos às características dos copolímeros blocos. O estudo do comportamento de equilíbrio destes ATPS indicou que há um aumento na região bifásica com o aumento da concentração do sal de fosfato dibásico, representado pelo aumento do pH. Observou-se também que a composição global do sistema ínfluencia o coeficiente de partição, obtendo-se um aumento nos valores de K com o aumento do comprimento da linha de amarração.
Palavras-chave: Partição, comportamento de equilíbrio, aminoácidos, insulina, copolímeros, polímeros, sistemas aquosos bifásicos, planejamento fatorial.
ABSTRACT
The partitioning between two aqueous phases, containing each phase from 70 to 90% of water, is considered a suitable and an appropriate technique for the purification of biomolecules like amino acids and proteins. This partitioning depends on different factors like pH, polymer molecular weight and temperature. Recently, the use of some types of copolymer PEO-PPO-PEO has been suggested in the formation of these systems. The increase in temperature origin the auto-aggregation of copolymers in micelles and the redistribution of the water molecules of the phase containing these copolymers, forming means which characteristics are ideais for a separation ofhydrophobic biomolecules.
The objective of this work was to obtain experimental data on the equilibrium behavior and partitioning of the amino acids Tryptophane, Phenylalanine and L-Tyrosine, and the protein Human Insulin, in Aqueous Two-Phase Systems (ATPS) containing polymers PEG4600 and PEGIOOOO, copolymers F38, F68 and F88 and salts such as monobasic and dibasic potassium phosphate, in order to identify the thermodynamics variables that influence on the biomolecules partitioning in these systems. The partitioning experiments were organized and carried out according to a Factorial Design Plan, evaluating the influence of the variables temperature (1 O, 25 and 40°C), pH ( 5, 7 and 9) and molecular weight of the polymer and copolymer in the biomolecules partition coefficients studied. Results showed that amino acids partitioning was influenced by pH and temperature. L-Tryptophane presented the highest partition coefficient (K=2,8) in comparison to other amino acids studied dueto its higher hydrophobicity. The partition of the Human Insulin was also influenced by the temperature and pH. Human Insulin partition was found to be successful (K=22) which could be attributed to the use of copolymers blocks. The equilibrium behavior of these ATPS showed an increase in the two-phase region with the increase of the dibasic phosphate salt concentration due to the pH increment. Also was observed that the global composition of the system influence the partition coefficient, obtaining an increase the K values with the increasing of the tie line lengths, meaning an increasing in the copolymer proportion in the system.
KEYWORDS: Partitioning, equilibrium behavior, amino acids, insulin, copolymers, polymers, A TPS, factorial design plan.
SUMÁRIO PÁGINA -Resumo IX - Abstract X -Sumário xi - Lista de Tabelas XV
- Lista de Figuras XVII
- Capítulo 1: INTRODUÇÃO 01
- Capítulo 2: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 05
2.1- Introdução aos Sistemas Aquosos Bifásicos. 05
2.2- Fatores que Influenciam a Partição de Biomoléculas
em Sistemas Aquosos Bifásicos. 07
2.2.1- Temperatura. 07
2.2.2- Tamanho da Biomolécula. 08
2.2.3- Propriedades da Interface do Biomaterial. 08
2.2.4- Carga da biomolécula e Sistema de Composição Iônica. 09
2.2.5- pH da Solução. 1 O
2.2.6- Concentração da Biomolécula. 1 O
2.3- O Coeficiente de Partição. 11
2.3.1- Métodos de Determinação da concentração de proteínas 12
2.4- Avanços na Área de Partição de Biomoléculas em Sistemas
CONT. PÁGINA
Capítulo 3: CARACTERÍSTICAS DOS POLÍMEROS,
COPOLÍMEROS, SAIS E BIOMOLÉCULAS. 19
3 .1- Características dos Polímeros, Copolímeros e Sais. 19
3.1.1- Os Polímeros. 19
3. 1 .2- Os Copolfmeros. 20
3 .1.2.1- Nomenclatura e Propriedades Físicas. 21
3 .1.3- Fosfato de Potássio Monobásico e Dibásico. 23
3.2 -As Biomoléculas em estudo: Aminoácidos e Insulina. 24
3 .2.1- Aminoácidos. 24
3.2.1.1- Propriedades Físico-químicas e Químicas. 26
3.2.2- A Insulina Humana. 30
3.3- Considerações Finais 32
-Capítulo 4: OBJETIVOS DO TRABALHO. 33
-Capítulo 5: MATERIAIS E MÉTODOS. 35
5.1- Materiais. 35
5.2- Metodologia. 36
5 .2.1-Estudo do Comportamento de Equilíbrio em Sistemas
Aquosos Bifásicos. 36
5 .2.1.1- Diagramas de Separação de Fases. 36 5.2.2- Estudo do Comportamento de Partição de Biomoléculas
em Sistemas Aquosos Bifásicos. 37
CONT. PÁGINA 5.2.2.2- Experimentos de Partição de Biomoléculas. 37
5.2.2.3- Ensaios de Partição. 40
5.2.2.4- Determinação dos Coeficientes de Partição. 43
5.2.3- Análise dos Resultados através da Metodologia de
Superficies de Resposta. 45
5.2.4- Estudo da Influência da Composição Global do
sistema no Coeficiente de Partição. 47 5.2.4.1-Determinação das Linhas de Amarração para os
copolímeros F38, F68 e F88. 47
5.2.4.2- Estimativa do Erro envolvido no Método
para a Determinação das Linhas de Amarração. 51
-Capítulo 6: RESULTADOS E DISCUSSÕES 53
6. 1- Comportamento de Fases nos Sistemas Aquosos Bifásicos. 53
6.1.1- Diagramas Temários. 53
6.2- Partição dos aminoácidos L-Triptofano, L-Fenilalanina e L-Tirosina emATPS.
6.2.1- Estudo da Partição dos Aminoácidos através um
planejamento a dois níveis e três fatores.
6.2.1.1.- Partição do L-Fenílalanina.
6.2.1.2 -Partição do L-Triptofano. 6.2.1.3 -Partição do L-Tirosina.
6.2.2- Estudo da Partição dos Aminoácidos através um
planejamento a três níveis e três fatores.
6.3 - Análise dos Resultados obtidos para os aminoácidos
através da Metodologia do Planejamento Fatorial.
60 60 60 61 62 63 67
CONT.
6.3 .1- L-F enilalanina.
6.3.2- L-Triptofano.
6.3 .3-L-Tirosina.
6.4- Partição da Proteína Insulina Humana em ATPS.
PÁGINA
67
74
80
86
6.4.1- Análise da influência das variáveis T, pH e MM sobre o
Coeficiente de Partição da Tnsu1ina, segundo a Metodologia
das Superfícies de Resposta. 90
6.5- Estudo da influência da Composição Global dos ATPS sobre
o Coeficiente de Partição das Biomoléculas. 94
-Capítulo 7: CONCLUSÕES 101
-SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS. 103
-REFERÊNCIAS BffiLIOGRÁFICAS. 105
- APÊNDICE A: Diagramas Ternários para os Sistemas Estudados. 113
-APÊNDICE B: Dados sobre as Linhas de Amarração 119
-APÊNDICE C: Curvas de Calibração para as Biomoléculas. 121
-APÊNDICE D: Análise de Variância dos Resultados Obtidos para as Biomoléculas Estudadas. D.l- L-Fenilalanina. D.2- L-Triptofano. D.3- L-Tirosina. D.4- Insulina Humana. 125 125 126 128 129
LISTA DE TABELAS
PÁGINA
- TABELA 3.1: Copolímeros PEO-PPO-PEO arranjados segundo a
classificação Pluronic. 22
- TABELA 3.2: Aminoácidos Protéicos. 25
- TABELA 3.3: Escala de Hidrofobicidade dos Aminoácidos Protéicos. 28
- TABELA 5 .2.1: Modelo de Distribuição dos Ensaios no Planejamento 23. 41
-TABELA 5.2.2: Modelo de Distribuição dos Ensaios no Planejamento 33. 42 -TABELA 5.2.3: Linhas de Amarração usadas no estudo da influência da
Composição Global sobre K para o copolímero F38. 49 - TABELA 5 .2. 4 Linhas de Amarração usadas no estudo da influência da
Composição Global sobre K para o copolímero F68. 50 -TABELA 5.2.5: Linhas de Amarração usadas no estudo da influência da
Composição Global sobre K para o copolímero F88. 50 -TABELA 5.2.6: Estimativa do erro na Determinação das Linhas de Amarração. 52
-TABELA 6.1.1: Composição Global dos Sistemas Estudados para PEG10000. 58
-TABELA 6.1.2: Composição Global dos Sistemas estudados para PEG4600. 58
-TABELA 6.1.3: Composição Global dos Sistemas estudados para F38. 59
-TABELA 6.1.4: Composição Global dos Sistemas estudados para F68. 59
-TABELA 6.1.5: Composição Global dos Sistemas estudados para F88. 60
-TABELA 6.2.1: Coeficientes de partição para a L-Fenilalanina. 61
-TABELA 6.2.2: Coeficientes de partição para a L-Triptofano. 62
-TABELA 6.2.3: Coeficientes de partição para a L-Tirosina. 63
-TABELA 6.2.4: Resultados no Planejamento 33 para a L-Fenilalanina. 64
-TABELA 6.2.5: Resultados no Planejamento 33 para o L-Triptofano. 65
CONT. PÁGINA
- TABELA 6.3 .I: Estimativa dos Efeitos para os Ensaios da L-F enilalanina. 68
-TABELA 6.3.2: Estimativa dos Efeitos para os Ensaios do L-Triptofano. 75
-TABELA 6.3.3: Estimativa dos Efeitos para os Ensaios da L-Tirosina. 80
-TABELA 6.4.I: Resultados no Planejamento 33 para a Insulina Humana. 87
-TABELA 6.4.2: Estimativa dos Efeitos para os Ensaios do Coeficiente de
Partição da Insulina Humana. 88
-TABELA 6.5.1: Resultados encontrados no estudo da influência da
composição global sobre o Coeficiente de Partição para
o copolímero F38 (T =IO °C e pH 7). 95
-TABELA 6.5.2: Resultados encontrados no estudo da influência da
composição global sobre o Coeficiente de Partição para
o copolímero F68 (T =I O ° C e pH 7). 96 - TA BELA 6.5 .3: Estudo da influência da composição global sobre o
K para o copolímero F88 (T =I O ° C e pH 7). 97 - TABELA B I: Pontos obtidos para a construção das Linhas de Amarração
(F38- 10°C- pH 7). 119
- TABELA B2: Pontos obtidos para a construção das Linhas de Amarração
(F68- 10°C- pH 7). I20
-TABELA B3: Pontos obtidos para a construção das Linhas de Amarração
(F88- I 0°C- pH 7). I20
- TABELA DI: Análise de V ariância (ANOV A) dos Ensaios para a
L-F enilalanina. I25
-TABELA D2: Análise de Variância (ANO V A) dos Ensaios para o
L-Triptofano. I27
-TABELA 03: Análise de Variância (ANOVA) dos Ensaios para a
L-Tirosina. I28
-TABELAD4: Análise de Variância (ANOVA) dos Ensaios para a
LISTA DE FIGURAS
PÁGINA
- FIGURA 3 .I: Estrutura Plana de um Aminoácido.
-FIGURA 3.2: Estrutura plana dos Aminoácidos L-Fenilalanina, L-Tirosina
e L-Triptofano.
- FIGURA 3.3 Estrutura Primária da Insulina Humana.
-FIGURA 6.l.I: Diagramas Ternários para o Sistema PEGIOOOO/ Água/ fosfato de potássio, na temperatura de 40 °C.
-FIGURA 6.I.2: Diagramas Temários para o Sistema PEG 4600 I Água!
fosfato de potássio, na temperatura de 40°C.
-FIGURA 6.I.3: Diagramas Ternários para o sistema F68 I Água I
24 27 30 53 55 fosfato de potássio, em pH
=
9. 56-FIGURA 6.I.4: Diagramas Temários para os sistemas PEG4600/Águal fosfato de potássio e PEG I 0000/ Fosfato de Potássio/ Água,
Condições: T = 25 °C e pH 7. 57
- FIGURA 6.3 .I: Relação entre os valores previstos pelo modelo e os Valores
Observados para o Coeficiente de Partição da L-Fenilalanina. 69
-FIGURA 6.3.2: Superfície de Resposta para o K e as Variáveis Te pH
em sistemas contendo PEG4600 para a L-Fenilalanina. 7I
-FIGURA 6.3.3: Curvas de Nível para o K e as Variáveis Te pH
em sistemas contendo PEG4600 para a L-Fenilalanina. 7I
-FIGURA 6.3.4: Superfície de Resposta para o K e as Variáveis Te MM
em sistemas a pH =7 para a L-Fenilalanina. 72
-FIGURA 6.3.5: Curvas de Nível para o K e as Variáveis Te MM
CONT. PÁGINA -FIGURA 6.3.6: Superficie de Resposta para o K e as Variáveis MM e pH
em sistemas a T = 25 °C para a L-Fenilalanina. 73
-FIGURA 6.3.7: Curvas de Nível para o K e as Variáveis M:M e pH
em sistemas a T
=
25 °C para a L-Fenilalanina. 73 -FIGURA 6.3.8: Curva de valores previstos pelo modelo e os ValoresObservados para o Coeficiente de Partição do L-Triptofano. 76
-FIGURA 6.3.9: Superficie de Resposta paraK e as variáveis Te pH
em sistemas contendo F68 para o L-Triptofano. -FIGURA 6.3.10: Curvas de Nível para K e as variáveis Te pH.
em sistemas contendo F68 para o L-Triptofano.
-FIGURA 6.3.11: Superficie de Resposta para o K e as Variáveis Te MM
77
77
em sistemas a pH
=
9 parao L-Triptofano. 78 -FIGURA 6.3.12: Curvas de Nível para o K e as Variáveis Te MMem sistemas a pH
=
9 para o L-Triptofano. 78 -FIGURA 6.3.13: Curvas de Nível para o K e as Variáveis M:M e pHem sistemas a T = 25 °C para o L-Triptofano. 79
-FIGURA 6.3.14: Curva de valores previstos pelo modelo e os Valores
Observados para o Coeficiente de Partição da L-Tirosina. 82
-FIGURA 6.3.15: Superficie de Resposta para K e as variáveis Te pH
em sistemas contendo PEG 10000 para a L-Tirosina. 83
-FIGURA 6.3.16: Curvas de Nível para K e as variáveis Te pH
em sistemas contendo PEG 10000 para a L-Tirosina. 83
-FIGURA 6.3.17: Curvas de Nível para o K e as Variáveis Te MM
CONT. PÁGINA -FIGURA 6.3.18: Curvas de Nível para o K e as variáveis MM e pH
em sistemas a T = 25 °C para o L-Tirosina.
-FIGURA 6.4.1: Curva de Valores Previstos x Valores observados para o coeficiente de partição da Insulina Humana.
- FIGURA 6.4.2: Curvas de Nível para o K e as variáveis T e pH
em sistemas contendo F38 para a Insulina Humana.
-FIGURA 6.4.3: Curvas de Nível para o K e as variáveis Te MM
em sistemas a pH = 5 para a Insulina Humana.
-FIGURA 6.4.4: Curvas de Nível para o K e as variáveis MM e pH
em sistemas a T
=
40 °C para a Insulina Humana.-FIGURA 6.5.1: Comprimento de Linhas de Amarração para o sistema F38/
fosfato de potássio/Água, Temperatura 10°C e pH 7.
-FIGURA 6.5.2: Comprimento de Linhas de Amarração para o sistema F68/
fosfato de potássio/Água, Temperatura 10°C e pH 7.
-FIGURA 6.5.3: Comprimento de Linhas de Amarração para o sistema F88/ 85 89 90 92 93 95 97
fosfato de potássio/Água, Temperatura 10°C e pH 7. 98 -FIGURA AI: Diagramas Temários para o sistemaPEGlOOOO/
fosfato de potássio/ Água, na temperatura de 10 °C. - FIGURA A2: Diagramas Temários para o sistema PEG4600/
113
fosfato de potássio/ Água, na temperatura de 1 O °C. 113 -FIGURA A3: Diagramas Temários para o sistema F68/ fosfato de potássio
/Água, na temperatura de 25 °C. 114
-FIGURA A4: Diagramas Temários para o sistemaPEGIOOOO/
fosfato de potássio/ Água, na temperatura de 25 °C. -FIGURA AS: Diagramas Temários para o sistema PEG4600/
fosfato de potássio/ Água, na temperatura de 25 °C.
114
CONT. PÁGINA
-FIGURA A6: Diagramas Temários para o sistema F68/ fosfato de potássio/ Água, na temperatura de 40 °C.
- FIGURA A7: Diagramas Temários para o sistema PEG 10000/
fosfato de potássio/ Água, na temperatura de 40 °C. -FIGURA A8: Diagramas Ternários para o sistema PEG4600/
fosfato de potássio/ Água, na temperatura de 40 °C.
-FIGURA A9: Diagramas Temários para o sistema F38/ fosfato de potássio/ Água, em sistemas a pH 7.
-FIGURA AlO: Diagramas Temários para o sistema F88/ fosfato de potássio/ Água, em sistemas a pH 7.
- FIGURA A11: Diagramas Temários para o sistema F68/ fosfato de potássio/ Água, em sistemas a pH 9.
-FIGURA Cl: Curva de calibração para a L-Fenilalanina a 258nm. - FIGURA C2: Curva de calibração para a L-Triptofano a 279nm. -FIGURA C3: Curva de calibração para a L-Tirosina a 276nm. -FIGURA C4: Curva de calibração para a Insulina a 277nm.
115 116 116 117 117 118 121 122 122 123
Capítulo 1 : Introdução
CAPÍTULO 1
INTRODUÇÃO
Nas últimas décadas, com o crescente desenvolvimento da área biotecnológica, tomou-se necessário o conhecimento de novas técnicas de separação e purificação de compostos obtidos em baixas concentrações nestes processos (Silva, 1994). Devido à grande sensibilidade e fragilidade de biomoléculas (proteínas, aminoácidos, peptídeos, etc.), é necessário escolher um método de separação que não as agrida, mantendo as suas propriedades fisicas e químicas inalteradas.
Quando dois polímeros diferentes, cada um deles em solução aquosa de concentração conhecida, são misturados, eles podem se separar em duas fases macroscópicas. Se a separação das fases é segregativa, o que corresponde ao caso geral, um dos polímeros é enriquecido em uma das fases e o outro polímero na outra fase. Podem também ser formados a partir da mistura de uma solução aquosa polimérica e outra solução aquosa contendo eletrólitos. Estas misturas levam à formação de um sistema bifásico, no qual ambas as fases têm uma alta concentração de água (70 a 95% ). Estes sistemas aquosos são conhecidos como Sistemas Aquosos Bifásicos ("Aqueous Two-Phase Systems-ATPS") e têm sido extensivamente estudados em operações de separação de materiais biológicos (Albertsson, 1960).
Algumas das vantagens do uso de sistemas aquosos bifásicos como uma técnica de separação em biotecnologia incluem: i) as altas concentrações de água (70 a 95%) que oferecem um ótimo meio para biomoléculas sensíveis e ii) baixa tensão interfacial que facilita a migração de biomoléculas e também de partículas celulares entre as fases e, ainda, minimiza o risco de comprometimento da estrutura de células e proteínas ( Albertsson, 1960).
A partição de biomoléculas entre as fases depende de diversos fatores, tais como pH, massa molecular do polímero e a presença de vários tipos de eletrólitos (Johansson et al., 1984). A presença de sais causa uma diferença de potencial ao longo da interface das
Capítulo 1: Introdução
fases. Este potencial interfacial, então, influencia a partição de moléculas carregadas, pois no equilíbrio considera-se a igualdade dos potenciais totais (eletroquímico).
O sistema mais utilizado, conforme a literatura, é constituído pelos polímeros polietilenoglicol e dextrana. Este sistema, porém, apresenta uma desvantagem econômica, comparada com outros métodos de purificação, devido ao alto custo para a dextrana fracionada (Kroner et al., 1984). A possibilidade do uso de dextrana bruta e a substituição da dextrana por um polímero de menor custo e com propriedades similares contribuirão positivamente para a aplicação industrial de sistemas aquosos bifásicos baseados em dois polímeros (Kroner et al., 1982). Outros tipos de sistemas aquosos bifásicos, baseados em polietilenoglicol e dextrana ou polietilenoglicol e soluções salinas (de fosfato de potássio por exemplo), têm sido usados para purificação de enzimas em larga escala ( Kroner et al.,
1982 ).
Um exemplo da aplicação dos ATPS para fins de recuperação de bioprodutos está relatado nos trabalhos de Hughes et al.(1988), os quais purificaram parcialmente a proteína Albumina da Soro Bovino (BSA), a partir do plasma sangüíneo, usando ATPS com um único estágio na extração. Kitahara et al.(1993) utilizaram ATPS formados pelo copolímero F68/Sal para estudar a separação de anticorpos a partir do extrato bruto de várias culturas de hidribromas. Neste caso, a extração com ATPS mostrou-se um método de separação e concentração simples e rápido, com alta capacidade de recuperação. O uso de ATPS para a recuperação de enzimas está também relatado no trabalho de Kilikian et al.(1998), que realizaram um estudo envolvendo a extração, em dois estágios, da enzima glucoamilase, com a utilização de ATPS formado por PEG/Sal, obtendo-se uma recuperação equivalente a 96,3% da glucoamilase.
A utilização de alguns copolímeros formados por grupos EO (óxido de etileno) e PO (óxido de propileno) aleatórios (Alexandridis et al., 1995) ou do tipo bloco PEO-PPO-PEO (Svensson et al., 1996), denominados como "pluronic", tem sido sugerida para a formação de sistemas aquosos bifásicos, devido aos altos coeficientes de partição de proteínas, células e peptídeos com copolímeros bloco atribuídos à formação de micelas nestes sistemas (Svensson et ai., 1996; Kopcak, 1998). Além disso, devido à diminuição acentuada da solubilidade de copolímeros bloco com o aumento da temperatura, sua utilização na formação de sistemas aquosos bifásicos toma-se bastante atrativa, devido à separação mais eficiente da biomolécula de interesse com a precipitação do polímero.
Capítulo 1: Introdução
Dependendo da estrutura do polímero utilizado, esta precipitação pode ocorrer a temperaturas próximas à ambiente, de modo que este tipo de separação ocorre sem prejuízo à biomolécula.
Estes sistemas, então, são ferramentas muito úteis para a extração de biomoléculas de interesse industrial, como as proteínas. Porém, muitas questões referentes à partição de biomoléculas nestes sistemas aquosos bifásicos e ao uso de copolímeros bloco do tipo PEO-PPO-PEO, ainda não foram totalmente esclarecidas. A utilização destes copolímeros na formação de ATPS é ainda recente, havendo poucos dados sobre ATPS constituídos por estes copolímeros, bem como sua influência na separação de biomoléculas. Ainda, são conhecidas poucas informações acerca dos efeitos de vários parâmetros, como pH, massa molecular do polímero e temperatura sobre o coeficiente de partição em sistemas formados por copolímero/sal.
O presente trabalho teve como objetivo contribuir para a melhor compreensão da separação de biomoléculas em sistemas aquosos bifásicos através do levantamento experimental de dados de partição de biomoléculas em sistemas aquosos contendo polímeros, copolímeros e eletrólitos. Especificamente, objetivam-se : i) a determinação dos coeficientes de partição dos aminoácidos L-Fenilalanina, L-Triptofano e L- Tirosina, e da proteína Insulina em sistemas contendo fosfato de potássio, polímeros PEG4600 e PEGIOOOO, e os copolímeros bloco F38, F68, F88 e ii) o estudo da influência das variáveis pH, temperatura e massa molecular do polímero sobre os coeficientes de partição. Os experimentos foram realizados seguindo a técnica do planejamento fatorial.
No capítulo 2 encontra-se a Revisão Bibliográfica, onde são apresentados os fundamentos básicos sobre a partição de biomoléculas em sistemas aquosos bifásicos, incluindo as características, propriedades e os fatores que influenciam esta partição. Na seqüência, os principais trabalhos publicados sobre a partição de biomoléculas em sistemas aquosos bifásicos são discutidos.
Em seguida, no capítulo 3, apresentam-se conceitos básicos e generalidades sobre polímeros, copolímeros, aminoácidos e a proteína Insulina.
No capítulo 4 apresentam-se os objetivos do trabalho.
No capítulo 5 apresentam-se a Metodologia e os Materiais utilizados nos experimentos deste trabalho. Uma descrição detalhada dos procedimentos para a construção
Capítulo 1: Introdução
de diagramas temários para os ATPS em questão e a determinação do coeficiente de partição é mostrada. A técnica do planejamento fatorial utilizada neste trabalho é descrita com o objetivo de preparar o leitor para a discussão dos resultados no capítulo 6.
No capítulo 6 apresentam-se os resultados experimentais obtidos e as discussões em tomo de cada resultado. O comportamento de equilíbrio dos ATPS, através dos seus diagramas temários, é detalhado. Os coeficientes de partição obtidos para cada uma das biomoléculas são apresentados e comparados entre si. As discussões envolvendo a análise da influência dos fatores pH, temperatura e massa molecular no coeficiente de partição dos aminoácidos citados são mostradas com o auxílio de superficies e gráficos que complementam os resultados experimentais. Encerrando o capítulo, tem-se um estudo da influência da composição global dos ATPS sobre o coeficiente de partição.
No capítulo 7 apresentam-se as conclusões extraídas a partir das discussões mostradas no capítulo 6, buscando-se uma ligação entre todos os resultados encontrados e o que fora proposto no trabalho. Finalizando o trabalho, apresentamos algumas sugestões para trabalhos que venham a ser realizados nesta área de pesquisa.
Capítulo 2: Revisão Bibliográfica
CAPÍTUL02
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1- INTRODUÇÃO AOS SISTEMAS AQUOSOS BIFÁSICOS
Os sistemas aquosos bifásicos foram inicialmente descritos por Beijerinck, no final do século passado, que observou a turvação de soluções aquosas de gelatina e ágar, ou gelatina e um amido, quando misturadas. A mistura turva separava-se, subseqüentemente, em duas camadas líquidas. A camada inferior continha mais do ágar (ou amido) e a camada superior continha maior quantidade de gelatina (Albertsson, 1960). Tais sistemas foram redescobertos e primeiramente aplicados nos anos de 50 por Albertsson para particionar biomateriais.
Foram propostos dois mecanismos que levem à formação destes sistemas bifásicos, dependendo se estes sistemas são do tipo polímero/sal ou polímero/polímero. No caso de sistemas do tipo polímero/sal, observou-se uma forte correlação entre a capacidade de induzir à formação de duas fases e o efeito dos íons destes sais sobre os pontos de turvação dos polímeros (Ananthapadmanabhan et al., 1986). Segundo estes autores, o efeito de redução de solubilidade ("salting out") dos polímeros PEG é observado quando soluções salinas são adicionadas a soluções de PEG. Quanto maior a valência do ânion do sal, menor será a quantidade de sal necessária para ocorrer a separação de fases e formação de ATPS. Com relação aos cátions, sais de cátions monovalentes são mais efetivos na redução da solubilidade dos polímeros do que aqueles bivalentes e trivalentes. Isto porque cátions multivalentes, em geral, parecem interagir fortemente com o oxigênio éter do PEG, fato que gera um aumento na solubilidade do PEG no meio ( efeito "salting in") numa proporção bem maior do que o efeito "salting out". Ainda, a alta solubilidade dos polímeros PEG em água é atribuída à hidratação das unidades EO do PEG com duas a três moléculas de água. Da mesma forma, espécies iônicas em solução são conhecidas como hidratadas e
Capítulo 2: Revisão Bibliográfica
a extensão da hidratação depende da valência do íon. O efeito dos ânions na diminuição do ponto de turvamento dos PEG's segue a seguinte ordem: fosfato>sulfato>hidroxila. Quanto aos cátions, esta seqüência seria: Na+> Mg2+ > Zn2+ >
Lt.
Os diagramas de fase para a formação de ATPS mostram que a efetividade de vários íons para formar estes sistemas segue precisamente a mesma ordem (Ananthapadmanabam et al.,1986).Nos casos em que o outro componente também é um polímero (sistemas polímero/polímero), usualmente dextrana, o fenômeno de formação de ATPS tem sido atribuído ao grande volume excluído pelos dois polímeros (Guan et al., 1993).
Sistemas compostos por soluções aquosas de PEG (polietilenoglicol) e dextrana (um polissacarídeo bacteriano) constituem o sistema aquoso polimérico mais estudado. Desde que dextrana e PEG são enriquecidos em fases opostas, eles podem ser usados como transportadores para grupos (ligantes) com afinidades para certas proteínas. Proteínas com pontos hidrofóbicos, como a Albumina de Soro Bovino (BSA), mostram um aumento de sua afinidade para a fase contendo PEG quando um ligante hidrofóbico é incorporado no polímero. O aumento ocasionado no coeficiente de partição, em decorrência da adição de um ligante, é um indicativo da hidrofobicidade da proteína e está em concordância com os resultados obtidos por outros métodos (Johansson et al.,1984).
Os parâmetros que influenciam a partição de biomoléculas têm sido estudados em detalhes nas três últimas décadas. Esforços vêm sendo concentrados no desenvolvimento de sistemas bifásicos com alto grau de seletividade para a purificação de enzimas. Três tipos principais de extrações seletivas têm sido estudados, todos baseados na modificação química das fases poliméricas formadas, especialmente de PEG. Estas modificações envolvem a ligação covalente de grupos carregados, de grupos hidrofóbicos ou de ligantes por afinidade (Johansson et al., 1984). Nos últimos 30 anos, muitos grupos de pesquisa utilizaram os sistemas aquosos bifásicos para separações, em escala de laboratório, de proteínas, células, organelas celulares, vírus, fragmentos da membrana celular e outros materiais biológicos. A técnica tem sido aplicada por Albertsson (1960), Walter et al.(1991) e Zaslavsky (1995) como um modo de determinar propriedades da interface de biomateriais, tais como carga e hidrofobicidade, enquanto o trabalho de Kula e co-autores (1995) têm concentrado interesse em extrações utilizando sistemas aquosos bifásicos como um método de separação em escala industrial. Este último foi motivado pela substituição de
Capítulo 2: Revisão Bibliográfica
solventes orgânicos por soluções aquosas em sistemas bifásicos, permitindo a aplicação dos métodos clássicos de separação na extração de componentes de uma mistura pela partição, não apenas de macromoléculas mas também de células, membranas e organelas.
Apresentam-se a seguir os principais fatores que influenciam a partição de biomoléculas, com uma discussão de tais influências.
2.2 - FATORES QUE INFLUENCIAM A PARTIÇÃO DE BIOMOLÉCULAS EM SISTEMAS AQUOSOS BIFÁSICOS
A partição de biomoléculas em ATPS é influenciada por diversos fatores, incluindo a massa molecular da biomolécula, concentrações e massas moleculares dos polímeros (Baskir et al., 1989). A adição de sais, uma mudança no pH do meio, variação da temperatura ou a adição de ligantes de afinidade são freqüentemente usados para alterar a partição de uma biomolécula (Diamond et al., 1989). Alguns sais migram unicamente para uma das fases. Conseqüentemente, se a biomolécula possuir uma carga elétrica líquida, sua partição pode ser alterada pela presença de íons de sais nesta fase (Sandler et al., 1990). As propriedades dos polímeros (por exemplo, massa molecular, carga e resíduo hidrofóbico) têm mostrado grande influência no mecanismo da partição (Walter, 1991). Ainda, a concentração total do polímero no sistema afeta o comprimento das linhas de amarração. A adição de sal tem grande influência sobre o comportamento da partição de moléculas que possuem uma carga local. Alguns destes fatores podem ser descritos como segue:
2.2.1- Temperatura:
A temperatura pode alterar a forma da curva binodial do diagrama de fases, influenciando, por conseguinte, na partição da biomolécula. Ou então, especificamente, mudanças na temperatura podem levar a mudanças na estrutura da biomolécula, como a proteína, levando à sua desnaturação, e também influenciando em sua partição.
Capítulo 2: Revisão Bibliográfica
A temperatura é um parâmetro importante quando se usa copolímeros da classe "pluronic" como um dos polímeros formando fase nas partições em ATPS. Um aumento da temperatura causa a redução da solubilidade dos mesmos e, por conseguinte, um aumento na hidrofobicidade dos diferentes blocos, os quais promovem a auto-agregação das cadeias de polímeros em estruturas micelares consistindo de grupos PEO hidratados (Rachem et al., 1996). O aumento da temperatura também conduz a uma forte redistribuição da água. Por exemplo, no sistema pluronic/dextrana/água, a água migra da fase pluronic para a fase dextrana. Isto é conduzido tanto pela menor quantidade de solutos (implicando a uma menor pressão osmótica, desde que se considera uma micela como soluto ), quanto pela hidrofobicidade aumentada do polímero "pluronic".
Portanto, considerando o efeito da temperatura sobre o comportamento de agregação, é possível melhorar o uso de ATPS. Se uma das fases deste sistema consiste de unímeros numa dada temperatura, ao aumentar-se esta temperatura os unímeros se agregarão em micelas, criando um domínio hidrofóbico. Isto implica num ambiente favorável para biomoléculas hidrofóbicas (Zaslavsky, 1995).
2.2.2- Tamanho da biomolécula
Geralmente, quanto maior é a biomolécula, mais desigual é a sua partição entre as fases (Berggren et al., 1995). Grandes proteínas tendem a particionar de um modo mais diferente do que as pequenas proteínas. Biomoléculas com massas moleculares elevadas (tais como as moléculas de DNA) e vírus particionam quase que inteiramente em uma das fases. Moléculas extremamente grandes geralmente distribuem-se entre a interface e uma das duas fases, ou, em algumas situações, são coletadas inteiramente na interface entre as fases (Albertssom,1960).
2.2.3- Propriedades da superficie do biomaterial
A partição de biomateriais está relacionada às propriedades interfaciais do material, e alguns pesquisadores têm usado a partição como um método para medir as hidrofobicidades relativas de diferentes proteínas (Forciniti et al., 1992).
Capítulo 2: Revisão Bibliográfica
As proteínas são compostas de aminoácidos, os quais são compostos de grupos polares e apoiares naturais. Na conformação das proteínas nativas, a maioria dos grupos apoiares reside no interior da molécula, fora do contato com a solução. Isto porque a superficie de muitas biomoléculas apresenta propriedades diferentes das propriedades gerais que as caracterizam.
A superficie de uma proteína geralmente contém uma gama de resíduos polares de aminoácidos e grupos laterais carregados, mas também pode conter regiões hidrofóbicas significativas (representadas por alguns dos radicais orgânicos que compõem a cadeia lateral de seus aminoácidos). Esta região hidrofóbica pode agir como parte de um centro ativo na proteína. A influência deste caráter hidrofóbico pode ser compreendida quando se trabalha com copolímeros do tipo bloco, por exemplo. Estes copolímeros apresentam a propriedade de se auto-associarem a altas temperaturas, formando micelas. Em conseqüência, há perda de água na fase polimérica, deixando-a com características hidrofóbicas, ou seja, um ótimo meio para as proteínas que apresentam tais regiões hidrofóbicas significativas (Per Linse, 1993).
2.2.4- Carga da biomolécula e sistema de composição iônica
A maioria das proteínas contém um grande número de grupos carregados, ou que podem ser carregados em soluções de acordo com os valores de pH. Os diversos grupos laterais nas proteínas geralmente têm diferentes valores de pK, tal que, como o pH da solução muda de valores ácidos para valores básicos, a proteína torna-se positivamente ou negativamente carregada. Quando a soma de todas as cargas na proteína é zero, a proteína está em seu ponto isoelétrico (pl). Em valores de pH diferentes do pi, a proteína possui uma carga líquida. Sais adicionados em sistemas bifásicos a concentrações da ordem de 100 a 200 mM criam uma diferença de potencial distribuída entre as fases (Johansson et ai., 1996). Esta diferença de potencial, a qual resulta de preferências dos diferentes íons do sal para as diferentes fases do sistema, pode afetar a partição na interface de biomateriais carregados (Albertsson, 1960). Este efeito aumenta com o potencial de distribuição, o qual depende do tipo de sal ou sais adicionados, mas não com a força iônica a baixas concentrações de sais e na carga das proteínas (Johansson et ai., 1984).
Capítulo 2: Revisão Bibliográfica
A elevados valores de força iônica, a partição de proteínas mostra uma forte dependência da concentração do sal. Sistemas bifásicos podem igualmente ser produzidos por combinação de PEO com altas concentrações de tampão fosfato de sódio (Johansson et ai., 1984). A separação de fases em tais sistemas pode ser atingida mais rapidamente do que em sistemas po1ímero/po1ímero, desde que a baixa viscosidade da fase salina é menor que a da fase polimérica. Isto torna os sistemas bifásicos polímero/sal mais fáceis de serem usados em aplicações industriais do que muitos sistemas polímero/polímero (Kula et al., 1995).
2.2.5- pH da solução
Como descrito anteriormente, a partição de moléculas carregadas em sistemas bifásicos contendo sais tamponantes freqüentemente depende da carga líquida da biomolécula, a qual é uma função do pH da solução.
As mudanças no pH podem também induzir a mudanças conformacionais na estrutura da proteína, causando uma mudança no comportamento da partição da proteína. A valores de pH muito extremos, é possível causar a desnaturação da proteína. Proteínas desnaturadas geralmente particionam de modo diferente das proteínas em seu estado nativo, devido ao fato de que a proteína desnaturada tem uma área interfacial significativamente maior do que a da proteína nativa, e a interface exposta é bem mais hidrofóbica.
Portanto, o efeito do pH na partição de biomoléculas em ATPS é diretamente relacionado com o pl da biomolécula e com a carga que esta venha a adquirir quando posta no sistema (Forciniti et al., 1992).
2.2.6- Concentração da biomolécula
Se a concentração da biomolécula no ATPS é mantida baixa (da ordem de magnitude menor do que a concentração do polímero na fase polimérica), ela não afeta significativamente a sua partição (Zaslavsky, 1995). A altas concentrações, porém, é
Capítulo 2: Revisão Bibliográfica
possível que a presença da biomolécula altere as propriedades do sistema. Por exemplo, no caso de partição de proteínas, se a concentração destas for superior à da fase polimérica, elas podem igualmente formar fases separadas (Forciniti et al., 1991-B).
A seguir, daremos uma descrição do conceito de coeficiente de partição e quais são as formas de determiná-lo.
2.3- O COEFICIENTE DE PAR TIÇÃO
Conforme apresentado no item 2.2, a partição de biomoléculas é uma função complexa de uma variedade de diferentes fatores, desde a concentração dos polímeros nas fases à escolha de sais usados para tamponar o sistema.
Em geral, a partição de biomoléculas em sistemas aquosos bifásicos é definida em termos do seu coeficiente de partição (K):
( 2.1)
Onde [C]1 é a concentração da biomolécula na fase de topo e [C]z é a concentração na fase de fundo.
O coeficiente de partição K é a medida tomada como padrão comparativo para a eficiência da separação do soluto (biomolécula) nos sistemas aquosos bifásicos.
O coeficiente de partição é igual a um quando a concentração da biomolécula for igual em ambas as fases, ou seja, indica que o soluto particionou igualmente entre as duas fases. Quanto mais afastado de 1 for o coeficiente de partição, melhor será a recuperação do soluto (Albertsson, 1960). Por exemplo, quando o coeficiente de partição for igual a 10, isto significa que o soluto particiona 1 O vezes mais na fase de topo que na fase de fundo, mostrando o potencial de sua purificação neste sistema.
Capítulo 2: Revisão Bibliográfica
2.3 .1- Métodos de determinação da concentração de Proteínas
Diversos métodos podem ser usados para a determinação experimental da concentração de proteínas e, por conseguinte, do coeficiente de partição destas biomoléculas. Para se escolher qual o método mais conveniente a ser utilizado deve-se levar em consideração caracteristicas como tempo de análise, custo (reagentes, vidrarias, do equipamento, etc.), acurácia do método e segurança quanto ao procedimento de utilização.
Os métodos mais usados hoje para determinar a concentração de proteínas baseiam-se na absorção de luz na região ultravioleta (UV) da solução contendo a biomolécula, ou em espectrofotometria na região do visível, após reação da proteína com um determinado reagente para formar complexos. Para cada um dos métodos a serem citados, a determinação do coeficiente de partição é feita pela análise da concentração da biomolécula nas fases de topo e de fundo.
O método da espectrofotometria de absorção UV baseia-se na propriedade que muitas biomoléculas (como as proteínas) apresentam de absorver luz incidente sobre elas na faixa de comprimento de onda entre 250 e 280 nm, a qual é atribuída ao grupo fenólico da tirosina e do triptofano. As análises destes solutos exigem que se faça previamente uma curva de calibração do soluto, para se detectar faixas de concentração e de absorção de luz com as quais se procederão as análises. O método exige apenas uma quantidade pequena de amostra para análise, as quais são acondicionadas em cubetas de quartzo (Macrae, 1987). Não há a necessidade de adicionar nenhum outro reagente (ou corantes) ao meio antes da
análise.
O método de Lowry é um método que se baseia na complexação da proteína com cobre (C~) e quatro átomos de nitrogênio, sendo dois átomos de cada cadeia do peptídeo adjacente. Com a adição de um reagente fenólico o meio é levado a uma coloração azul,
onde a absorbância da proteína pode ser medida entre 700 a 750nm. Um inconveniente é que o pH do meio deve ser mantido entre 10 e 10,5. Além disso, o método requer a adição de um reagente ao meio, o que pode causar perturbações no sistema bifásico (Macrae, 1987).
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O método de Bradford, como o método de Lowry, baseia-se na utilização de um corante, o ligante azul de Coomassie, para quantificar o soluto (Macrae, 1987), e apresenta como desvantagem a exigência da adição deste corante, para se realizar posteriormente a medida de sua absorbância.
Dos métodos acima discutidos, o método da espectrofotometria de absorção UV é o que reúne os melhores requisitos para a análise pois: i) o equipamento é de manuseio seguro , ii) não requer que reagentes específicos sejam adicionados ao meio, iii) o método apresenta fácil assimilação e iv) pode ser usado para qualquer tipo de biomolécula, em todas as faixas de massas moleculares.
Portanto, coeficiente de partição pode ser diretamente obtido dividindo-se a absorbância da biomolécula na fase superior pela absorbância na fase inferior, isto porque a absorbância é diretamente proporcional a concentração da biomolécula em cada fase, segundo a lei de Beer-Lambert (ou Lei de Beer ), que é o relacionamento linear entre absorbância e concentração de uma espécie absorvendo luz num espectrofotômetro.
2.4- AVANÇOS NA ÁREA DE PAR TIÇÃO DE BIOMOLÉCULAS EM SISTEMAS AQUOSOS BIFÁSICOS
Lei et al. (1990) estudaram o comportamento do equilíbrio em sistemas aquosos bifásicos PEG/Fosfato de Potássio a 4°C e pH 7 para várias massas moleculares do polímero, e a influência do pH nos sistema PEG3400/fosfato de potássio. Concluíram que com o aumento da massa molecular do polímero, a curva binodial se desloca para concentrações menores de PEG e fosfato de potássio. Observaram, também, que o mesmo ocorre à medida que o pH aumenta.
Sandler et ai. (1990) estudaram o efeito do pH e sais na partição de vancomicina, um importante agente terapêutico usado para tratamento de infecções causadas por microrganismos resistentes a antibióticos (3-lactamicos. Observaram um aumento no coeficiente de partição ao adicionar sais neutros, como sulfato de sódio e cloreto de sódio,
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ao sistema. Este aumento foi atribuído a interações hidrofóbicas entre a vancomicina e o polímero PEG e a efeitos eletrostáticos. A alteração no valor do pH (4, 7 e 9.3) levou a mudança conformacional do vancomicin, alterando o seu coeficiente de partição.
Forciniti et ai. (1992) determinaram os coeficientes de partição de Lisozima, Albumina e Catalase em 64 sistemas do tipo PEG/Dextrana. As medidas foram realizadas a quatro valores de pH para cada proteína. Os efeitos simultâneos de mudanças de pH, massa molecular do polímero e concentração no coeficiente de partição de cada proteína foram analisados. Observaram que o coeficiente de partição da Lisozima (pl = 1 0,5) apresenta o valor mínimo em seu ponto isoelétrico e tem seu valor máximo em soluções com pH ácido. Os coeficientes de partição da Albumina (pl = 4,6) e da Catalase (pi=5,6) apresentaram os valores mínimos nas soluções cujo pH situava-se na faixa de 5,6 a 8,5 e apresentaram valores máximos à medida que pH da solução tomava-se mais alcalino (acima de pH
=
8,5) ou mais ácido (abaixo de pH = 5,6). O efeito do pH no coeficiente de partição da Lisozima a altas concentrações do polímero é maior do que a baixas concentrações, mas o efeito do pH no coeficiente de partição da Albumina e Catalase a altas concentrações do polímero é menor do que a baixas concentrações do polímero. Ainda, encontrou-se que o coeficiente de partição das proteínas estudadas tomou-se menos sensível a mudanças na massa molecular a altas concentrações de PEG.Kitahara et ai. (1993), estudaram a relação entre pH e coeficiente de partição de biomoléculas como a Lisozima em sistemas aquosos bifásicos contendo PEG4000/fosfato de potássio ou pluronic F68/fosfato de potássio. Para a faixa de pH abaixo do ponto isoelétrico (proteína positivamente carregada) o comportamento da partição da proteína é determinado pela diferença de hidrofobicidade entre as fases. Para pH acima do ponto isoelétrico há um grande aumento no coeficiente de partição, causado pela interação eletrostática entre o sistema e a proteína, isto é, a Lisozima tem preferência pela fase superior (PEG) devido à repulsão da carga negativa da proteína neste pH e os íons de fosfato da fase inferior.
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Grof3man et al. (1993) demostraram que a adição de pequenas quantidades (1 mg/g) de aminoácidos e peptídeos em sistemas PEG/dextrana não influenciam a formação do sistema bifásico. Através de dados obtidos próximos ao ponto isoelétrico de três aminoácidos (forma neutra), observaram que glicina(GL Y) e glutamina(GLN), preferem a fase de dextrana, enquanto que a fenilalanina(PHE), prefere a fase contendo PEG. Eles concluíram que isto ocorre devido à hidrofobicidade dos componentes. PEG é mais hidrofóbico que a dextrana. As fórmulas estruturais dos aminoácidos mostram que todos têm em suas estruturas dois grupos hidrofilicos polares (Coo- e Nff"3). GLY tem o menor grupo hidrofóbico (H), e a PHE o maior grupo hidrofóbico (tolueno ). A explicação para a preferência da PHE pela fase PEG está em suas propriedades predominantemente hidrofóbicas. Já a GL Y, com características predominantemente hidrofilicas, preferiu a fase dextrana. GLN também possui características mais hidrofilicas, porém não tão pronunciadas como a GL Y, daí ter-se encontrado coeficientes de partição mais baixos para este aminoácido.
Svensson et al. (1996) estudaram sistemas contendo o copolímero pluronic PIOS e sais. Demonstraram que o efeito da temperatura é muito significativo em relação à partição de aminoácidos, obtendo-se um grande incremento no valor de K com o aumento da temperatura. Este fenômeno foi atribuído à auto-agregação das moléculas do copolímero em micelas conforme o aumento da temperatura. Devido à formação destas novas estruturas, a concentração de copolímero na fase superior aumenta. Em seus experimentos, elevou-se a temperatura de 5 para 40°C, obtendo-se um aumento da porcentagem em massa do copolímero de 9 para 17% na fase polimérica. Concluíram que a formação de micelas não influencia diretamente os coeficientes de partição das biomoléculas, mas, como há um decréscimo na concentração de água devido a este fenômeno, existe uma maior preferência destas biomoléculas hidrofóbicas para esta fase, aumentando os coeficientes de partição.
Kopcak: (1999) estudou a influência de pH, temperatura e quantidade de grupamentos PPO de copolímero (L61, L62, L64 e F68)/fosfato de potássio no coeficiente de partição da Insulina Regular Iolin (comercial). Concluiu que o pH não influencia a partição da Insulina Regular. Observou que o parâmetro de maior influência é o tipo de
Capítulo 2: Revisão Bibliográfica
copolímero utilizado e, por conseguinte, a hidrofobicidade da fase polimérica. Isto porque quanto maior a quantidade de grupos PPO no copolímero, maior será a sua hidrofobicidade e, portanto, maior a partição de moléculas hidrofóbicas, como a Insulina. A temperatura, diretamente, altera a partição no sentido de que a micelização de blocos copolímeros ocorre à medida que a temperatura aumenta.
Svensson et al. (1999), estudaram o efeito da temperatura e da adição de ligantes na partição de uma série de proteínas em ATPS contendo copolímeros da família pluronic PIOS e F68 numa das fases e dextrana TSOO na outra fase. A partição foi estudada nas temperaturas de 5 e 30°C. Concluíram que o efeito da temperatura dependia do tipo de molécula estudada. Em proteínas hidrofilicas (BSA, Lisozima) o efeito da temperatura foi moderado, ou seja, com relação a este tipo de proteína, os sistemas contendo pluronic são similares a outros polímeros análogos. As proteínas hidrofóbicas (ZTO, ZTl e ZT2) mostraram um aumento no valor de K a 30 °C. Isto foi atribuído ao aumento do número de grupos hidrofóbicos destas proteínas. Um grande aumento no valor de K com relação à temperatura foi observado na proteína gramicidina-D, sendo atribuído à micelização do pluronic P 105. Segundo os autores, este resultado provavelmente foi devido à alta afinidade do surfactante Triton X-100 com a fase superior (pluronic), que foi adicionado ao sistema para solubilizar a proteína gramicidin-D.
Pessôa P et al. (1999), estudaram a partição de alguns aminoácidos e da proteína Insulina Regular Iolin (comercial)~ em ATPS contendo copolímeros (L62, L64 e F68), polímeros (PEG3350 e PEGlOOOO) e eletrólitos. Concluiram que os sistemas contendo copolímeros apresentaram maiores coeficientes de partição, evidenciando a influência do grupamento PPO do copolímero na partição de biomoléculas hidrofóbicas.
Van Berlo et al.(2000) estudaram o comportamento de partição dos aminoácidos Glicina, L-Serina, L-Alanina, L-Valina, L-Metionina, L-Isoleucina e L-Fenilalanina em ATPS contendo sais voláteis (Carbamato de Amônio, Bicarbonato de Amônio) e PEG. Os resultados mostraram que os aminoácidos particionam em ATPS do tipo PEG/sal volátil de
Capítulo 2: Revisão Bibliográfica
um modo similar aos tradicionais ATPS do tipo polímero/sal. Observaram também que o aumento da hidrofobicidade do aminoácido leva ao aumento dos coeficientes de partição. A relação entre coeficientes de partição relativos e as hidrofobicidades relativas de aminoácidos em sistemas de extração estudados neste trabalho é comparável às encontradas em outros sistemas.
A análise destes estudos aponta uma lacuna de algumas informações necessárias a uma compreensão adequada do fenômeno da partição de biomoléculas em ATPS, particularmente as recentes aplicações utilizando copolímeros bloco e sais. Existem poucos dados sobre comportamento de equilíbrio, fundamental para o estudo da formação de ATPS e posterior uso destes sistemas na partição de biomoléculas, onde a literatura apresenta uma grande quantidade de estudos envolvendo sistemas formados por polímeros da classe PEG e sais (Lei et al.,1990; Silva, 1994). Porém, não encontramos estudos sobre este comportamento de equilíbrio para copolímeros do tipo bloco PEO-PPO-PEO relacionando influências de pH e temperatura. Ainda com relação ao uso de copolímeros do tipo bloco, são poucas as informações referentes ao seu uso na partição de biomoléculas em ATPS.
Os últimos estudos apontam em direção à um grande potencial para a separação de biomoléculas usando ATPS contendo copolímeros blocos. Estes estudos, porém, estão no início e a ausência de informações sobre estes sistemas e suas propriedades e características estimulam este estudo, nos levando a buscar subsídios que apontem para aplicações potenciais na separação e purificação de material biológico pela manipulação apropriada de variáveis que os influenciam, como pH, temperatura e o tipo de copolímero.
Capítulo 3: Características dos Polímeros. Co polímeros. Sais e Biomoléculas
CAPÍTUL03
CARACTERÍSTICAS DOS POLÍMEROS, COPOLÍMEROS, SAIS E
BIOMOLÉCULAS
3.1- CARACTERÍSTICAS DOS POLÍMEROS, COPOLÍMEROS E SAIS
3 .1.1- OS POLÍMEROS
O polietilenoglicol (PEG), HO(CH2CH20)NH, é uma classe de polímeros de grande importância comercial, e como tal, é produzido mundialmente em grande quantidade e em várias faixas de massas moleculares, variando de algumas centenas até milhares de unidades de massa atômica.
Os polietilenoglicóis são moléculas relativamente estáveis e não-tóxicas. São muito utilizados na indústria alimentícia, cosméticos e farmacêutica. São bastante estáveis na forma de solução, pó seco ou flocos, como geralmente são vendidos (em massas moleculares baixas têm a forma líquida ou de pasta). O comportamento de solubilidade do PEG é muito peculiar. Ele é solúvel em água, benzeno, diclorometano e tetracadofurano; com um pequeno aquecimento, é solúvel em metano!, acetona, etanol e tolueno; é insolúvel em hexano e éter etílico (Silva, 1994).
São comercializados com o nome PEG associado ao valor de sua massa molecular, medida em unidades de massa atômica (u.m.a). Arbitrariamente, a designação PEG é usada para polímeros com massas moleculares pequenas (abaixo de 20000 u.m.a), facilmente determinadas pelos grupos hidroxila, enquanto a designação PEO, óxido de polietileno, é freqüentemente restrita a materiais com massas moleculares elevadas (maiores que 100000 u.m.a), que não evidenciam a funcionalidade da hidroxila. Aqueles polímeros cujas massas
Capítulo 3: Características dos Polímeros, Copolímeros. Sais e Biomoléculas
moleculares situam-se entre 20000 u.m.a e 100000 u.m.a não possuem designações específicas. Ambos os grupos de massas moleculares podem ser chamados de polioxietileno.
Os materiais com massas moleculares altas (maiores que 100000 u.m.a) e baixas (menores que 20000 u.m.a) se distinguem pelo método de preparo. PEG é elaborado pela polimerização do Óxido de Etileno com um catalisador ácido ou básico, enquanto para a produção de PEO utiliza-se catalisadores heterogêneos. O processo de preparação de polímeros da classe PEG com massa molecular acima de 100000 u.m.a é um processo que requer um rigoroso controle operacional, devido à fácil desidratação do terminal hidroxietileno, produzindo um alqueno na polimerização (Silva, 1994).
3 .1.2- OS COPOLÍMEROS
Copolímeros são sintetizados por polimerizações simultâneas de pelo menos dois diferentes tipos de monômeros. O resultado desta síntese é chamado de um copolímero bloco se os monômeros que o formam, individualmente, encontram-se como blocos de vários tamanhos na molécula do copolímero. Os diferentes tipos de blocos dentro do copolímero são geralmente incompatíveis entre si. Então, como conseqüência, os copolímeros sofrem auto-agregação quando em fusões e em soluções. No caso de copolímeros anfifilicos em soluções aquosas, pode ocorrer a agregação em microestruturas que se assemelham a micelas formadas por surfactantes de baixa massa molecular.
Copolímeros triblocos solúveis em água constituídos de Óxido de Polietileno (PEO) e Óxido de Polipropileno (PPO), freqüentemente denotados PEO-PPO-PEO ou (EO)nt(PO)m(EO:k2, são comercializados como agentes surfactantes, ativos, macromoleculares e não-iônicos. A variação da composição do copolímero (razão PPO/PEO) e a massa molecular (tamanho do bloco PEO e PPO) durante a síntese dos mesmos leva à produção de moléculas com propriedades que encontram aplicações específicas em diversas áreas de interesse tecnológico. Como resultado, copolímeros bloco do tipo PEO-PPO-PEO representam uma importante classe de surfactantes e encontram amplo campo de aplicações em detergentes, estabilizantes de dispersão, espumantes, emulsificantes, lubrificantes e na formulação de cosméticos e tintas, juntamente com
