Cap 3 - Microrganismos
Indicadores
1. Coliformes Totais
2. Coliformes Fecais e Escherichia coli
3. Enterococcus
4. Bactérias Aeróbias Mesófilas
5. Bactérias Psicrotróficas e Termófilas
6. Bactérias Anaeróbias
7. Bolores e Leveduras
Coliformes Totais
• Família Enterobacteriaceae
• Capazes de fermentar a lactose com produção de gás (35 - 37ºC/ 48 horas)
• Bacilos gram-negativos • Não formadores de esporos
• Fazem parte do grupo: Escherichia, Enterobacter,
Citrobacter e Klebisiella.
• Apenas a Escherichia tem como habitat primário o trato intestinal do homem e animais. Os demais podem ser encontrados nas fezes, vegetais e solo e são mais persistentes que as bactérias patogênicas de origem intestinal como a
Salmonella e Shigella.
• A ocorrência de Coliformes Totais não indica, necessariamente, a contaminação fecal recente ou ocorrência de enteropatógenos.
Método de Análise de Coliformes
Totais
• MEIOS DE CULTURA
– Caldo Lauril sulfato triptose
– Caldo lactose Bile Verde Brilhante ( CLBVB ) • TESTE PRESUNTIVO
A partir da amostra pura, fazer as respectivas diluições, e semear volumes de 1 mL em séries de três tubos contendo 10mL de caldo Lauril Sulfato Triptose e tubos invertidos de Durhan. Quando a semeadura for iniciada a partir da diluição 10-1, semear 10ml utilizando meio de cultura preparado com dupla concentração de ingredientes, para com isso ter amostra pura (10°).
Homogeneizar com cuidado e incubar 35 ± 1°C por 24 – 48 horas.
Fazer leitura em 24 e 48 horas, registrar os tubos com presença de gás e dar continuidade passando para o teste
Esquema de Análise do Coliformes
Totais – Teste Presuntivo
• TESTE CONFIRMATIVO
Com a utilização de uma alça de platina,
transferir 1 alçadas de cada tubo positivo no tubo de
Caldo Lauril Sulfato Triptose para os tubos de Caldo
Lactose Bile Verde Brilhante (CLBVB) com tubos
invertidos de Durhan.
Incubar a 35 ± 1°C por 24 – 48 horas.
A formação de gás confirma a presença de
bactérias do grupo coliformes totais. Anotar os tubos
positivos e consultar a tabela NMP para expressar os
resultados em NMP de coliformes totais / g ou ml.
Método de Análise de Coliformes
Totais
Esquema de Análise do Coliformes
Totais – Teste Confirmativo
Coliformes Fecais e Escherichia coli
• Pertencem aos Coliformes Totais, porém são capazes de fermentar a lactose com produção de gás quando incubados à temperatura de 44 - 45,5ºC.
• Dentro do grupo do Coliformes fecais está presente a espécie
Escherichia coli, capaz de causar doença ao homem. Embora
possa ser introduzida nos alimentos a partir de fontes não fecais, é o melhor indicador de contaminação fecal conhecido até o momento.
• Um grande número de coliformes fecais pode indicar falhas higiênicos sanitárias como: contaminação cruzada e higiene pessoas precária dos manipuladores.
Método de Análise de Coliformes
Fecais
• MEIOS DE CULTURA
Caldo Escherichia coli com tubos de Durhan invertidos. • TESTE CONFIRMATIVO DE COLIFORMES FECAIS
Como o auxílio da alça de platina, transferir 1 alçadas de cada tubo positivo do Caldo Lauril Sulfato Triptose para os tubos contendo Caldo EC e tubos invertidos de Durhan.
Incubar em banho-maria à temperatura de 44,5°C por 24 e 48 horas.
Considerar positivos os tubos com produção de gás nos tubos de Durhan.
Verificar na Tabela de NMP o número correspondente e expressar o resultado em NMP de coliformes fecais / g ou ml.
Esquema de Análise do Coliformes
Fecais
Esquema de Análise de E. coli
Enterococcus
• Antes um subgrupo do gênero Streptococcus, a partir de 1984 passaram a pertencer ao gênero Enterococcus, com 16 espécies reconhecidas atualmente.
• Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium mais comumente encontrados em alimentos
• São utilizados como indicadores de contaminação fecal com algumas restrições porque são encontrados no solo, vegetais, e em alimentos (desidratados, que sofreram ação de desinfetantes e flutuações de temperatura por serem mais resistentes) com maior sobrevida do que os enteropatógenos. • Sua presença em número elevado indica práticas sanitárias
inadequadas ou armazenamento inadequado do alimento. • Em alimentos fermentados a presença de um número elevado
de Enterococcus não tem o mesmo significado porque são
Enterococcus
• São bactérias láticas na forma de cocos
ou cocobacilos
• Gram positivos
• Catalase
negativo
e
anaeróbios
facultativos
• Crescem de 10 ºC a 45ºC
Método de Análise de
Enterococcus
• MEIOS DE CULTURAÁgar KF Streptococcus ou Ágar Gentamicina Tálio Carbonato fluorogênico (fGTC).
• TESTE Enterococcus
Selecionar 3 diluições adequadas e inocular 1 ml de cada diluição, em profundidade, no Ágar KF Streptococcus Ágar Gentamicina Tálio Carbonato fluorogênico.
Aguardas completa solidificação e Incubar à temperatura de 35°C por 48 horas para Ágar KF e a 35°C por 18 a 24 horas para o ágar fGTC .
Contar as colônias típicas:
Ágar KF – colônias vermelhas ou róseas Ágar fGTC – colônias todas as colônias.
Esquema de Análise de
Enterococcus
Contagem de Placas de Bactérias
Aeróbias Mesófilas
• É utilizada para indicar a qualidade sanitária dos alimentos • Um número elevado de microrganismos indica que o alimento é
insalubre (exceto alimentos fermentados), mesmo quando estes não sejam conhecidos como patógenos e não haja alteração de forma apreciável nos caracteres sensorias do alimento, segundo a Comissão Internacional de Padrões Microbiológicos para Alimentos (I.C.M.S.F. – International Commission on
Microbiological Specification fo Foods). Esta afirmação
prende-se aos seguintes fatos:
Contagem de Placas de Bactérias
Aeróbias Mesófilas
1. Contagens altas em alimentos estáveis, em geral, indicam matérias-primas contaminadas ou tratamentos não satisfatórios do ponto de vista sanitário. Nos produtos perecíveis podem indicar também condições inadequadas de tempo e/ou temperatura durante seu armazenamento. A presença de um número elevado de bactérias aeróbias mesófilas que crescem bem à temperatura corporal ou próximo a ela, significa que podem ter existido condições favoráveis à multiplicação de microrganismos patógenos de origem humana ou animal.
Contagem de Placas de Bactérias
Aeróbias Mesófilas
2. Algumas cepas de bactérias mesófilas comuns, não
geralmente
consideradas
como
agentes
transmissores de enfermidades por alimentos, por
exemplo, Proteus spp, Streptococcus spp e
Pseudomonas mesófilas, já foram incriminadas
como causa de enfermidades quando existia um
número elevado de células viáveis no alimento.
3. Todas as bactérias patogênicas conhecidas,
veiculadas por alimentos, são mesófilas e em
alguns casos contribuem com sua presença para
as contagens em placas encontradas.
Contagem de Placas de Bactérias
Aeróbias Mesófilas
4. A causa mais freqüente de alteração nos alimentos é
devida ao desenvolvimento de microrganismos,
podendo-se esperar, nos mesmos contagens
elevadas. Os níveis de população necessários para
produzir modificações sensoriais ostensivas variam
amplamente segundo o tipo de alimento e, de
modo particular, a classe dos microrganismos. No
momento em que a decomposição pode ser
detectada pelo odor, gosto ou aspecto, a
maioria dos alimentos contém mais de
10
6microrganismos por grama.
Contagem de Placas de Bactérias
Psicrotróficas e Termófilas
Bactérias Psicrotróficas
• Microrganismos Psicrotróficos são capazes de se desenvolver entre 0ºC a 7ºC, com produção de colônias ou turvação do meio de cultura em 7 a 10 dias.
• A contagem de bactérias psicrotróficas avalia o grau de deterioração de alimentos refrigerados.
Bactérias Termófilas
• O termófilos são microrganismos com temperatura mínima de crescimento ao redor de 45ºC, ótima entre 50ºC a 60ºC e máxima de 70ºC ou acima.
• A contagem de bactérias termófilas avalia o grau de deterioração de alimentos submetidos a tratamento térmico.
Contagem de Placas de Bolores e
Leveduras
• Os bolores e leveduras crescem mais lentamente que as bactérias nos alimentos não ácidos que conservam umidade e, por isso, poucas vezes determinam problemas em tais alimentos. Entretanto, nos alimentos ácidos e nos de baixa atividade de água, crescem com maior rapidez que as bactérias, determinando, dessa forma, importantes perdas por alteração de frutas frescas e sucos, vegetais, queijos, produtos derivados de cereais, alimentos curtidos, bem como em alimentos congelados e desidratados, quando seu armazenamento se dá em condições inadequadas.
Contagem de Placas de Bolores e
Leveduras
Existe também o perigo da produção de micotoxinas pelos bolores micotoxigênicos. Para eliminar ou reduzir tais problemas, os manipuladores de alimentos suscetíveis de contaminação deverão:
• reduzir a carga de esporos, observando boas práticas higiênicas;
• reduzir os tempos de armazenamento e vender os alimentos o quanto antes possível;
• armazenar os alimentos congelados em temperaturas inferiores a -12 °C;
• eliminar ou reduzir o contato com o ar (mediante envase ou por outros procedimentos);
• aquecer os alimentos em seu envase final para destruir as células vegetativas e os esporos;
Contagem de Placas de Bolores e
Leveduras
• Os bolores são quase sempre aeróbios estritos. As
leveduras geralmente crescem tanto na presença
quanto na ausência de oxigênio.
• Nos alimentos frescos e nos congelados, podem ser
encontrados números reduzidos de esporos e células
vegetativas de leveduras, porém sua presença
nesses alimentos é de pouco significado. Somente
quando os alimentos apresentarem contagens
elevadas de leveduras ou bolores visíveis é que o
consumidor se dará conta da alteração. A alteração
por leveduras não constitui um perigo para a saúde.
• adicionar conservantes químicos, tais como os
sorbatos e os benzoatos.
Contagem de Placas de Bolores e
Leveduras
• Nem o homem, nem os animais devem consumir
alimentos visivelmente contaminados por bolores e
leveduras, exceto os produtos nos quais o
microrganismo faz parte da técnica de produção,
como em alguns queijos, tais como Roquefort ou
Camembert, e certos salames, que devem seus
sabores especiais para alguns bolores. As leveduras
crescem mais rapidamente que os bolores, porém
com freqüência, crescem juntamente com eles.
Método de Análise de Bactérias Aeróbias
Mesófilas, Psicrotróficas e Termófilas
• MEIO DE CULTURA:Plate Count Ágar
TTC ( 2,3,5 Cloreto de Trifenil Tetraxílico ) – ajuda a colorir as colônias • PROCEDIMENTO
Para mesófilos (profundidade): após a preparação das diluições pipetar assepticamente 1 mL de cada diluição e transferí-la para placas de Petri devidamente identificadas. Adicionar a cada placa 15 mL de Ágar, previamente fundido e mantido em banho-maria a temperatura entre 40 – 50 °C. Homogeneizar com movimentos suaves, em forma de “oito”, 10 vezes, deixar solidificar e incubar as placas invertidas.
Para Psicrotróficas e Termóflilos (superfície): semear sobre a superfície do ágar 0,1mL da amostra pura e de cada diluição utilizando a alça de drigalsk ou bastão em “L”. Espalhar cuidadosamente o inóculo até que tenha sido totalmente absorvido.
Incubar:
Mesófilos : 35 ± 1°C por 48 horas Psicrotróficos: 7 ± 1 °C por 10 dias. Termófilos: 55 ± 1 °C por 48 horas.
Método de Análise de Bactérias
Aeróbias Mesófilas
• RESULTADO
Após o período de incubação fazer a contagem usando os seguintes critérios:
• Ausência de crescimento em 10-1, expressar como “abaixo de 10 UFC/
grama”.
• Leituras acima de 300 colônias na maior diluição expressar como “maior que 300 x 104 UFC/grama”.
• Leituras entre 30 e 300 colônias, expressar o resultado multiplicando-se o valor encontrado, pelo fator de diluição correspondente. Por exemplo: 3 x 10 –2 = 300 UFC/g
Atenção: Para contagens em duplicata, na obtenção dos resultados, utilizar a média aritmética das contagens nas placas que apresentarem entre 30 e 300 colônias.
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Método de Análise de Bolores e
Leveduras
• MEIO DE CULTURA
Ágar D. R. B. C. ou PCA-clorafenicol ou PDA acidificado • PROCEDIMENTO
Semear sobre a superfície do ágar 0,1mL da amostra pura e de cada diluição, utilizando a alça de drigalsk ou bastão em “L”. Espalhar cuidadosamente o inóculo até que tenha sido totalmente absorvido. Inverter as placas e incubar ã temperatura de 20 – 25 °C, por 05 dias. • RESULTADO
Após o período de incubação, selecionar as placas que apresentarem colônias rosadas, contá-las, e multiplicar o número obtido pelo respectivo fator de diluição expressando os resultados em unidades formadoras de colônias por grama de produto (UFC/g ).
Por exemplo 3 x 10-2 = 300 UFC/g.
