EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE ZnO (ZnO-NP) NA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA E NAS PROPRIEDADES FÍSICAS E QUÍMICAS
DE COMPÓSITOS EXPERIMENTAIS
Niterói 2016
EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE ZnO (ZnO-NP) NA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA E NAS PROPRIEDADES FÍSICAS E QUÍMICAS
DE COMPÓSITOS EXPERIMENTAIS
NATASHA LAMÊGO BRANDÃO DE SOUZA
Tese apresentada à Faculdade de Odontologia da Universidade Federal Fluminense, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutora em Odontologia, pelo Programa de Pós-Graduação em Odontologia.
Orientador: Prof. Dr. Eduardo Moreira da Silva
Niterói 2016
(ZnO-NP) na atividade antibacteriana e nas propriedades físicas e químicas de compósitos experimentais / Natasha Lamêgo Brandão de; orientador: Prof. Dr. Eduardo Moreira – Niterói: [s.n.], 2016.
47 f.: il.
Tese (Doutorado em Odontologia) – Universidade Federal Fluminense, 2016.
Bibliografia: f. 41- 46
1. Resinas compostas 2.Óxido de zinco 3.Nanopartículas 4.Biofilme I.Silva, Eduardo Moreira da [orien.] II.Título CDD 617.695
Prof. Dr. Eduardo Moreira da Silva
Instituição: Faculdade de Odontologia da UFF
Decisão: _________________________Assinatura:_________________________
Prof. Dr. José Guilherme Antunes Guimarães Instituição: Faculdade de Odontologia da UFF
Decisão: _________________________Assinatura:_________________________
Profa. Dra. Lidiany Karla Azevedo Rodrigues Gerage
Instituição: Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem da UFC
Decisão: _________________________Assinatura:_________________________
Profa. Dra. Adriana Bona Matos
Instituição: Faculdade de Odontologia da USP
Decisão: _________________________Assinatura:_________________________
Profa. Dra. Aline de Almeida Neves
Instituição: Faculdade de Odontologia da UFRJ
Dedico este trabalho, primeiramente a Deus, que permitiu que este momento tão sonhado e esperado acontecesse na minha vida. Com Deus tudo é possível! É Dele mais essa vitória alcançada em minha vida.
Aos meus amados pais, Márcia e Antônio Carlos, que são anjos de Deus para mim e que tanto me amam, apoiam e incentivam a seguir sempre em frente em busca de cada sonho.
A minha avó Cecy, meu avô Dirson (in memorian) e tia Patrícia que tanto me amam e se alegram com cada conquista.
Aos meus avós, Antônia e Nivaldo, tios e primos que apesar da distância se fazem presentes, me incentivam e vibram com cada vitória.
Ao meu marido, meu grande amor, Ivo que mesmo quando não pode estar perto, fisicamente, consegue me acalmar e se fazer presente com um simples: “qualquer coisa estou aqui”.
A Deus por ter me dado saúde, força e pelas pessoas que colocou no meu caminho para que o desenvolvimento desse trabalho fosse possível.
Aos meus pais, Márcia e Antônio Carlos, por todo amor e suporte que me deram para que eu tivesse tranquilidade para buscar meus sonhos. E por sempre me incentivarem a seguir em frente, são exemplos de pessoas e pais. Amo muito! Esta vitória é de vocês!
A minha avó Cecy, meu avô Dirson (in memorian) e tia Patrícia por todo o amor e carinho, e por sempre estarem ao meu lado me apoiando em todos os momentos da minha vida.
Aos meus avós, Antônia e Nivaldo, por todo o amor e por compreenderem a minha ausência em tantos momentos.
Ao meu marido, Ivo, pelo amor, compreensão e cuidado. Pelas tantas vezes que se preocupou em levar um lanche ou em me buscar quando precisei sair tarde do laboratório. Agradeço pelo marido e companheiro que se tornou. Te amo!
Ao meu orientador, professor Eduardo, por acreditar e confiar na minha capacidade para o desenvolvimento desse trabalho. Por todos os ensinamentos, disponibilidade, amizade e carinho paternal.
A todo o corpo docente da disciplina de Dentística da Faculdade de Odontologia da UFF, professores José Guilherme, Laiza, Glauco, Cristiane e Alexandre, que contribuíram para minha formação profissional.
As professoras Lucianne e Andréa da Faculdade de Odontologia da UFRJ, por terem me recebido de braços abertos e por tantos ensinamentos no campo da Microbiologia. Para a professora Andréa meu especial obrigada pela confiança, amizade, experiências compartilhadas, por toda ajuda e carinho.
As amigas Alice, Luciana, Maria Elisa e Giselle com as quais compartilhei tantos momentos no laboratório e na vida. Vocês são presentes de Deus para mim! E aos amigos da UFRJ, Adrielle, Aline e Thiago que tanto me ajudaram e alegraram meus dias no laboratório.
A professora Maristela pela ajuda indispensável a realização desse trabalho. Aos amigos de todas as horas que sempre estiveram ao meu lado e me ajudaram a chegar nesse momento.
Souza NLB. Efeito da concentração de nanopartículas de ZnO (ZnO-NP) na atividade antibacteriana e nas propriedades físicas e químicas de compósitos experimentais [tese]. Niterói: Universidade Federal Fluminense. Faculdade de Odontologia; 2016.
O objetivo deste estudo foi a formulação e a caracterização de compósitos restauradores antibacterianos. O compósito base foi formado (% p/p) por uma matriz polimérica com 70% de Bis-GMA e 30% de TEGDMA e um sistema de cargas (70%) constituído de partículas de bário-boro-silicato com diâmetro médio de 0,7 µm. Foram produzidos seis compósitos experimentais com a adição de nanopartículas de óxido de zinco - ZnO-NP (40-100 nm) nas seguintes concentrações: E1= 0%, E2= 0,5%, E3= 1%, E4= 2%, E5= 5% e E6= 10%. A análise do potencial antibacteriano foi avaliada através da atividade metabólica pela redução do MTT [3– (4, 5-dimetiltiazol- 2- yl)- 2, 5- brometo de difeniltetrazólio] e pela produção de ácido lático por biofilme de Streptococcus mutans. Foram avaliadas as seguintes propriedades físicas e químicas: grau de conversão (GC%), resistência à flexão (RF), módulo de elasticidade (ME), dureza (DK), absorção (Ab), solubilidade (Sl) e translucidez (PT). Os dados foram submetidos à análise de variância e teste de Tukey HSD ( = 0,05). Os compósitos E3, E4, E5 e E6 diminuíram a atividade metabólica do biofilme e os compósitos E5 e E6 a produção de ácido lático (p < 0,05). E6 apresentou o menor valor de GC% (p < 0,05). Não houve diferença na resistencia à flexão e no módulo de elasticidade entre os compósitos (p > 0,05). E5 e E6 apresentaram os menores valores de dureza (p < 0,05). E6 apresentou maior valor de absorção do que E1 (p < 0,05) e a maior solubilidade (p < 0,05). A translucidez diminuiu significantemente com o aumento da concentração de ZnO-NP (p < 0,05). Concluiu-se que a incorporação de 5% de ZnO-NP produziu um compósito com potencial antibacteriano contra S. Mutans, sem prejuízo das propriedades físicas e químicas do material.
Palavras-chave: resinas compostas, óxido de zinco, nanopartículas, biofilme, Streptococcus mutans, propriedades físicas e químicas.
Souza NLB. Effect of the concentration of zinc oxide nanoparticles (ZnO-NP) on antibacterial activity and physical and chemical properties of model resin composites [thesis]. Niterói: Federal Fluminense University. School of Dentistry; 2016.
The purpose of this study was to evaluate the antibacterial activity of model resin composites doped with ZnO-NP and characterized their physical and chemical properties. A model resin composite constituted of (wt.%): Bis-GMA (70%), TEGDMA (30%), barium-boro-silicate particles of 0.7 m (70%), camphorquinone (0.5%) and EDMAB (1.0%) was doped with different concentrations of ZnO-NP (40-100 nm): E1= 0%, E2= 0.5%, E3= 1%, E4= 2%, E5= 5% and E6= 10%. Antibacterial activity was evaluated by biofilm metabolic activity assay through reduction of MTT and by inhibition of lactic acid production by biofilm of S. mutans. Scanning electron microscopy (SEM) images of biofilm onto composite surfaces were also taken. In order to verify the impact of ZnO-NP in the model composite, the follow physicochemical properties were characterized: degree of conversion (DC%), flexural strength (FS), elastic modulus (EM), hardness (KHN), water sorption (Wsp), solubility
(Wsl) and translucency (TP). Data were analyzed by ANOVA and Tukey HSD’s test
(α= 0.05). E3, E4, E5 and E6 decreased the biofilm metabolic activity and E5 and E6 the lactic acid production (p < 0.05). E6 presented the lowest DC% (p < 0.05). It was not found statistical significance for flexural strength and elastic modulus (p > 0.05). E5 and E6 presented the lowest values of microhardness (p < 0.05). E6 presented higher water sorption than E1 (p < 0.05) and the highest solubility (p < 0.05). The translucency significantly decreased with the increasing of ZnO-NP (p < 0.05). It was conclude that the incorporation of 5 wt.% of ZnO-NP may endow antibacterial activity to resin composites, without jeopardizing their physical and chemical properties.
Keywords: composite resin, zinc oxide, nanoparticles, biofilm, Streptococcus mutans, physicochemical properties.
1 INTRODUÇÃO...10
2 PROPOSIÇÃO...13
3 MATERIAL E MÉTODOS...14
3.1 Formulação dos compósitos experimentais ...14
3.2 Potencial antibacteriano...14
3.2.1 Preparo dos espécimes...14
3.2.2 Preparo do inóculo para formação de biofilme...15
3.2.3 Atividade metabólica do biofilme...16
3.2.4 Dosagem da produção de ácido lático pelo biofilme...16
3.3 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)...18
3.4 Grau de conversão monomérica (GC%)...18
3.5 Resistência à flexão (RF) e Módulo de elasticidade (ME)...19
3.6 Dureza...20 3.7 Absorção e Solubilidade...20 3.8 Translucidez...21 3.9 Análise estatística...22 4 ARTIGO PRODUZIDO...23 5 CONCLUSÃO...47
1 INTRODUÇÃO
Desde o desenvolvimento dos compósitos restauradores, o emprego deste tipo de material na prática clínica vem aumentando de forma exponencial.1,2,3
Compósitos restauradores são constituídos basicamente de uma matriz polimérica, partículas inorgânicas de carga e de um agente de união organo-silano que estabelece ligações químicas entre a matriz e as partículas de carga.5 Apesar de
apresentar vantagens tais como a capacidade de mimetizar as características ópticas das estruturas dentais perdidas, bem como o controle de sua reação de polimerização através de um processo de fotoativação, estes materiais ainda apresentam limitações relativas ao seu desempenho clínico, principalmente em relação ao alto índice de formação de cáries secundárias na interface dente-compósito.4 Em consequência, estudos recentes têm sugerido inovações no sentido
de melhorar o desempenho dessa classe de material restaurador.6-9
Neste campo, o desenvolvimento de compósitos capazes de combater a colonização bacteriana nas margens das restaurações, inibindo ou reduzindo a taxa de formação de biofilme sobre suas superfícies, pode ser visto como a fronteira do conhecimento.10-16 A formulação deste tipo de material pode ser obtida através de
duas estratégias: a partir do desenvolvimento de compósitos com monômeros que impeçam ou diminuam a aderência de microrganismos na superfície da restauração ou através da incorporação de substâncias que liberem componentes bioativos que atuem na lise e/ou na inibição da proliferação bacteriana.6-8,14,18,25
Diversas formulações de compósitos antimicrobianos têm sido propostas nos últimos anos.17,18 Nanopartículas de prata foram avaliadas no sentido de aumentar as
propriedades antimicrobianas e também a biocompatibilidade de compósitos restauradores, mostrando a capacidade de inibir a formação de biofilme de Streptococcus mutans.18 Também se verificou que os componentes de prata
inseridos nas formulações não foram liberados, o que resultou na manutenção das propriedades mecânicas do compósito ao longo do tempo. Por outro lado, compostos à base de prata afetam as propriedades ópticas dos compósitos restauradores, aspecto que, considerando a indicação estética dessa classe de material, torna inviável a sua utilização clínica.
Outro componente antibacteriano empregado na formulação de compósitos restauradores é o monômero 12-MDPB.9 Este monômero foi desenvolvido pela
combinação de amônia quaternária, um agente antimicrobiano, com um grupo metacrílico capaz de copolimerizar por ligações covalentes com os demais monômeros empregados na formulação de compósitos restauradores. Desta forma, como o agente antimicrobiano fica imobilizado na cadeia polimérica, a sua ação antimicrobiana não é por liberação no meio, mas sim por inibição quando a bactéria entra em contato direto com a superfície do material. Entretanto, como para os produtos à base de componentes de prata, o uso do 12-MDPB pode afetar a estabilidade de cor, causando uma rápida descoloração do material. Apesar dos aspectos positivos em termos de poder antimicrobiano, as limitações observadas nestes componentes encorajam a continuação das pesquisas nesta linha de investigação.
Ao longo dos anos, diversos estudos têm mostrado o efeito antimicrobiano do óxido de zinco (ZnO) quando empregado em materiais de preenchimento temporário, cimentos endodônticos, cimentos ortodônticos e, mais recentemente, como cobertura de superfícies de implantes dentais. O mecanismo antimicrobiano do ZnO ocorre através da formação de peróxidos de hidrogênio (H2O2), um agente
oxidante que exibe atividade bactericida a partir de sua superfície. Entretanto, estudos propondo a aplicação do óxido de zinco na formulação de compósitos restauradores são ainda escassos.26,27 Recentemente, Travassoli et al.,201326 e
Aydin Sevinç & Hanley30 adicionaram ZnO a um compósito odontológico comercial
para avaliar a eficácia deste componente como agente antibacteriano. Os resultados mostraram uma inibição significativa da formação de unidades formadoras de colônias de Streptococcus mutans26 e uma redução de 80% na formação de
biofilmes bacterianos (Streptococcus sobrinus)30, quando comparados ao material
controle. No entanto, os autores não apresentaram dados referentes à influência da adição do ZnO sobre as demais propriedades do material restaurador. Considerando-se que a composição de compósitos comerciais não é totalmente conhecida, podendo substâncias presentes atuar sinergicamente ou antagonicamente ao ZnO, e também considerando que, junto ao potencial antimicrobiano, é relevante a manutenção das propriedades físicas e químicas do material, o presente estudo foi desenvolvido no sentido de formular e avaliar a
influência de nanopartículas de óxido de zinco (ZnO-NP) no potencial antibacteriano e nas propriedades físicas e químicas de compósitos restauradores experimentais.
2 PROPOSIÇÃO
Formular e caracterizar fisicamente e quimicamente compósitos restauradores experimentais com atividade antibacteriana mediada pela incorporação de nanopartículas de óxido de zinco (ZnO-NP) em diferentes concentrações.
2.1 Objetivos específicos
2.1.1 Avaliar se a incorporação de ZnO-NP conferirá atividade antibacteriana aos compósitos restauradores
2.1.2 Definir qual a melhor concentração para o efeito antibacteriano
2.1.3 Avaliar se a incorporação de ZnO-NP afetará negativamente as propriedades físicas e químicas dos compósitos
2.2 Hipótese nula do estudo (H0)
H01: a incorporação de ZnO-NP não propiciará potencial antibacteriano e não afetará
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Formulação dos compósitos experimentais
Foram formulados seis compósitos experimentais (Tabela 1). A matriz polimérica de todos os materiais foi composta de 70 % p/p de Bis-GMA e 30 % p/p de TEGDMA (Aldrich Chemical Inc., Milwaukee, WI, EUA). Para permitir a fotoativação das matrizes, foram incorporados 0,5% p/p de canforoquinona e 1,0% p/p de etil N, N -dimetil - 4 aminobenzoato (EDMAB) para atuarem, respectivamente, como fotoiniciador e agente de redução (Aldrich Chemical Inc., Milwaukee, WI, EUA). O sistema de cargas inorgânicas foi composto de partículas de bário-boro-silicato com diâmetro médio de 0,7 µm (Esstech. Inc., Essington, PA, USA). Após a incorporação das nanopartículas de óxido de zinco (ZnO-NP, 40-100nm), (AlfaAesar, Ward Hill, MA, USA) nas concentrações descritas na Tabela 1, os compósitos experimentais foram centrifugados em dois ciclos com duração de 1 min / 1300 rpm e um ciclo final de 2 min / 2400 rpm (DAC 150.1 FVZ SpeedMixer FlackTek Inc., Hauschild, Germany).
Tabela 1 – Composição dos compósitos experimentais.
Compósito base Compósito ZnO-NP (%p/p)
Matriz orgânica (%p/p) Carga (%p/p) E1 0 – Controle
70 % de Bis-GMA + 30 % de TEGDMA 70 % Ba-B-Si E2 0,5 E3 1,0 E4 2,0 E5 5,0 E6 10,0 3.2 Potencial antibacteriano
Utilizando uma matriz metálica ( = 6,0 x h = 1,0 mm), foram confeccionados dez espécimes para cada compósito experimental. Após o preenchimento da matriz e a colocação de uma lamínula de vidro sobre os materiais, foi realizada compressão com uma massa de 0,5 kg durante 30 s até o total extravasamento de excessos e eliminação de porosidades. Após a remoção da carga, os espécimes foram fotoativados, pelos lados superior e inferior, com irradiância de 650 mW/cm2 ,
30 s (Optilux 501, Demetron Inc., Danburry, USA). Em seguida, os espécimes foram polidos sequencialmente com lixas de carbeto de silício # 1200 e 4000 sob refrigeração (250rpm / 60s em cada lixa) em politriz (DPU 10, Struers, Denmark), submetidos a processo de esterilização por óxido de etileno (Bioxxi, Serviços de Esterilização LTDA, Rio de Janeiro) e posicionados em placa de poliestireno de 24 poços. Cinco espécimes foram utilizados para avaliação da atividade metabólica através da redução de MTT [3–(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-brometo de difeniltetrazólio] e cinco para dosagem de ácido lático produzido por biofilme formado por Streptococcus mutans.
3.2.2 Preparo do inóculo para formação de biofilme
Amostra de S. mutans (ATCC 25175) foi inicialmente avaliada para verificação do grau de pureza através da técnica do esgotamento em placa. Em seguida, as colônias bacterianas isoladas foram transferidas para erlenmeyer contendo 20 ml de meio de cultura BHI (Brain Heart Infusion, Difco, Sparks, EUA) e foram incubadas a 37°C em microaerofilia por 24 h. Após o crescimento, o inóculo foi ajustado utilizando a turvação da escala 0,5 McFarland (150 x 106 células/ml),
com auxílio de um espectrofotômetro UV/Vis (Beckman Coulter DU® 530, LifeScience, San Diego, CA, USA) no comprimento de onda de 550 nm, conforme informações do fabricante da escala McFarland (Biomérieux Brasil S.A., Rio de Janeiro, Brasil). Após a leitura, o valor da densidade óptica obtida foi aplicada na seguinte relação, considerando-se os valores fornecidos pelo fabricante da escala:
150 x 106 células/ml____________0,125 nm
onde X é a concentração de células contida no inóculo e Y a densidade óptica do inóculo lida pelo espectrofotômetro.
Após a obtenção do inóculo ajustado, este foi diluído na proporção 1:10028,
sendo pipetado 10 µl em cada poço contendo um volume final de 2 ml de meio BHI suplementado com 2% de sacarose. O meio foi trocado a cada 24 horas.
3.2.3 Atividade metabólica do biofilme
Após a incubação das placas de 24 poços por 72 h a 37°C, em microaerofilia, para a formação do biofilme de S. mutans, os espécimes foram removidos e a atividade metabólica do biofilme foi avaliada. Antes da incubação com MTT, todo o meio de cultura foi removido e os espécimes foram transferidos para uma nova placa de 24 poços, sendo submetidos a três lavagens suaves com 1 ml de PBS (solução salina fosfato, pH=7,2).17 Em seguida, em cada poço, foram adicionados 500 µl de
MTT (Sigma – Aldrich, St. Louis, MO, USA) na concentração de 1 mg/ml. Após, a placa foi protegida da luz e incubada a 37°C em microaerofilia por 1 h, sendo adicionados 500 µl de DMSO (sulfóxido de dimetil) por poço e a placa novamente protegida da luz e incubada em temperatura ambiente sob agitação por 20 min. Em seguida, 200 µl da solução contida em cada poço foram transferidos para uma placa de 96 poços, que foi levada para um leitor de microplacas (ELx 808, BioTek Instruments, Winooski, VT, USA) para se obter os valores de absorbância na faixa de 540 nm.17 Esses valores de absorbância foram subtraídos do valor do branco
(poço somente com a solução) para serem submetidos ao teste estatístico.
3.2.4 Dosagem da produção de ácido lático pelo biofilme
Após o período de 72 h de formação de biofilme, todo o meio de cultura foi removido, e os espécimes reservados para a dosagem de ácido lático produzido pelo biofilme foram submetidos a uma lavagem suave com 1 ml de PBS. Após, foram transferidos para uma nova placa de 24 poços, submetidos a lavagem suave
com 1 ml de água peptonada suplementada com 0,2% de sacarose, e em seguida foi adicionado um novo volume de 1 ml desse meio e a placa foi incubada a 37°C em microaerofilia por 3 h.17 Após o período de incubação, 10 µl do meio contido em cada
poço foram transferidos para uma placa de 96 poços para uma dosagem enzimática de ácido lático. Nessa mesma placa também foi preparada uma curva padrão de ácido lático, em triplicata, a fim de relacionar as densidades ópticas obtidas com a quantidade de ácido lático produzido pelo biofilme. Para a curva padrão foram utilizados sete pontos de ácido lático (0,5 mM a 3,5 mM). Assim, em cada poço foram adicionadas as soluções descritas na Tabela 2.
Tabela 2 – soluções para curva padrão do ácido lático
Concentração de ácido lático Solução de ácido lático 100 mM Solução C Solução D 0,5 mM 10 µl 170 µl 20 µl 1,0 mM 20 µl 160 µl 20 µl 1,5 mM 30 µl 150 µl 20 µl 2,0 mM 40 µl 140 µl 20 µl 2,5 mM 50 µl 130 µl 20 µl 3,0 mM 60 µl 120 µl 20 µl 3,5 mM 70 µl 110 µl 20 µl
A solução C foi preparada, no momento do uso, através da adição de uma parte da solução de glicina 1 M (75 g/L) (solução A) a uma parte da solução de sulfato de hidrazina 0,8 M (104 g/L) (solução B). O mesmo aconteceu para o preparo da solução D, que resultou da adição de água destilada ao NAD+ a 26 mM (18
mg/ml) (Sigma – Aldrich, St. Louis, MO, USA). Em seguida, foi realizada uma primeira leitura em leitor de microplacas na faixa de absorbância de 340 nm. Após, foram adicionados em todos os poços um volume de 10 µl da solução F, que também foi preparada na hora do uso, a partir da diluição em 5 vezes de uma solução estoque de lactato desidrogenase (LDH) (5 mg/ml). Depois, a placa foi incubada em temperatura ambiente por 1 h, e em seguida foi feita uma segunda leitura na mesma faixa de absorbância da primeira (340 nm). Os valores de absorbância da segunda leitura foram subtraídos da primeira e os valores obtidos foram utilizados para a avaliação da produção de ácido lático pelo biofilme formado sobre cada espécime de compósito, usando a curva padrão como referência. Para isso, foi calculada a média dos valores de absorbância obtidos para os pontos 0,5 a
3,5 mM da curva padrão. Em seguida, obteve-se a média desses valores, que corresponde à média de absorbância para produção de 0,5 mM de ácido lático, através da seguinte relação:
Média de absorbância____________0,5 mM X____________Y,
onde X é o valor da absorbância obtida e Y é o valor de ácido lático produzido pelo biofilme formado no espécime de compósito correspondente.
3.3 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
Após a remoção das células não aderidas através de uma lavagem suave com PBS, os espécimes com os biofilmes aderidos tiveram suas superfícies analisadas através de MEV. Para isso, as amostras foram fixadas com solução de glutaraldeído 2,5 % contendo 3,7 % de sacarose por 1 hora a temperatura ambiente. Após, foram lavadas com PBS, pH 7,2 e, posteriormente, pós-fixadas com tetróxido de ósmio 1% em uma solução tampão de cacodilato 0,1 M contendo 0,8 % de ferrocianeto de potássio e cloreto de cálcio 5 mM por 30 min a temperatura ambiente. As amostras foram desidratadas em etanol, secas em ponto crítico com CO2 e metalizadas com Au-Pd. As imagens foram analisadas em microscópio
eletrônico de varredura (JEOL-JSM-5310, Tokyo, Japan), utilizando detector de elétrons secundários.
3.4 Grau de conversão monomérica (GC%)
O grau de conversão monomérica foi avaliado através de espectroscopia infravermelha com transformada de Fourier, utilizando a técnica de refletância total atenuada – ATR – (ALPHA-P FT-IR Spectrometer, Bruker Optics, Ettlingen, Germany). Incrementos dos compósitos experimentais foram inseridos em uma matriz cilíndrica de teflon ( = 4,0 e h = 1,0 mm) posicionada sobre o cristal de ATR
do espectrômetro, sendo obtidos espectros com 120 varreduras e resolução de 4 cm-1, no intervalo entre 1800 e 1600 cm-1, com temperatura controlada de 25 1ºC.
Após, os compósitos foram fotoativados (650 mW/cm2 . 30 s) e os espectros dos
incrementos polimerizados foram obtidos utilizando os mesmos parâmetros. O grau de conversão (GC%) de cada compósito foi calculado utilizando a razão entre as integrais das bandas em 1638 cm-1 e em 1608 cm-1, correspondentes,
respectivamente, as ligações alifáticas do grupamento funcional metacrilato e vinílicas aromáticas do bisfenol A dos compósitos polimerizados e não polimerizados, de acordo com a seguinte equação:
GC% = 100 x {1-(R polimerizado / R não polimerizado)}, (1)
onde R = integral da banda em 1638 cm-1 / integral da banda em 1608 cm-1
3.5 Resistência à flexão (RF) e Módulo de elasticidade (ME)
Foram confeccionados dez espécimes para cada compósito experimental. Os materiais foram inseridos em incremento único em uma matriz metálica bipartida (1,0 x 2,0 x 10,0 mm) posicionada sobre uma lâmina de vidro. Após a colocação de uma lamínula de vidro sobre os materiais, foi realizada compressão com uma massa de 0,5 kg durante 30 s e fotoativação com duas sobreposições (650 mW/cm2 . 30 s) a
partir das extremidades, pelos dois lados (superior e inferior). Após armazenagem em água destilada a 37 1°C por 24 h (Q316B15, Quimis, Rio de Janeiro, Brasil), os espécimes foram submetidos a ensaio de flexão, empregando-se o método de três pontos, em uma máquina de ensaios mecânicos (EMIC DL 2000, com célula de carga de 50 N e velocidade de deslocamento de 1,0 mm/min). A distância entre os dois pontos inferiores foi de 6,0 mm. A resistência à flexão (MPa) foi obtida com base na carga final no momento da ruptura dos espécimes e o módulo de elasticidade (GPa) com base na porção retilínea da curva tensão-deformação, de acordo com as equações abaixo:
(2) 2 2 3 wh lF RF
d wh F l ME 3 3 4 , (3)
onde l é a distancia (mm) entre os pontos inferiores, F a carga (N) aplicada no momento da ruptura do espécime, h a altura (mm) do espécime, w a largura (mm) do espécime e d a deflexão do espécime, sobre a carga F, durante o regime elástico.
3.6 Dureza
Através de uma matriz metálica ( = 2,0 e h = 3,0 mm) foram confeccionados cinco espécimes para cada compósito experimental. Após a inserção dos materiais e o posicionamento de uma lâmina de vidro sobre a matriz, os espécimes foram fotoativados (650 mW/cm2 . 30 s) e as superfícies não-irradiadas foram marcadas
com uma lâmina de bisturi. Os grupos foram embutidos, individualmente, em resina epóxica quimicamente ativada, dentro de cilindros de PVC, com as faces irradiadas apoiadas em uma placa de vidro. As superfícies irradiadas foram polidas sequencialmente com lixas de carbeto de silício # 600, 1200 e 4000 sob refrigeração (250 rpm / 60 s em cada lixa) em politriz (DPU 10, Struers, Denmark). Após armazenagem durante 24 h em ambiente escuro, foi avaliada a dureza Knoop nas superfícies irradiadas. Foram realizadas cinco indentações (carga de 25 g por 15 s) em pontos espaçados de 500 µm (Micromet 5104 - Full MHT software, Buëhler, Lake Bluff, IL, USA). A média aritmética das indentações foi considerada como valor de dureza para cada espécime.
3.7 Absorção e Solubilidade
Utilizando uma matriz de teflon ( = 6,0 e h = 1,0 mm), foram confeccionados cinco espécimes para cada compósito experimental. Após o preenchimento da matriz e a colocação de lamínula de vidro sobre os materiais, foi realizada compressão com uma massa de 0,5 kg durante 30 s até o total extravasamento de
excessos e eliminação de porosidades. Após a remoção da carga, os espécimes foram fotoativados (650 mW/cm2 . 30 s). Os espécimes foram colocados em um
dessecador com sílica gel azul, mantidos em estufa a 37 1ºC e pesados em balança analítica com precisão de 0,01 mg (XP 205, Mettler Toledo, Columbus, OH, USA), em intervalos de 24 h, até a obtenção de uma massa constante (variação menor que ± 0,01 mg = m1). Após, o diâmetro e a espessura dos espécimes foram mensurados com um paquímetro digital (MPI/E-101, Mytutoyo, Tokyo, Japan). O diâmetro foi mensurado em quatro pontos equidistantes e a espessura no centro e em quatro pontos espaçados na circunferência do espécime. Com os valores obtidos foram calculados os volumes (V) dos espécimes em mm3. Em seguida, os
espécimes foram imersos, individualmente, em 10 mL de água destilada em tubos falcon durante 7 dias em estufa a 37 1ºC e pesados em balança analítica com precisão de 0,01 mg = m2. Após, os espécimes foram submetidos ao mesmo processo de secagem descrito para m1, até a obtenção de nova massa constante (variação menor que ± 0,01 mg = m3). A absorção e a solubilidade (g/mm3) foram
obtidas através das seguintes equações:
Ab = V m m2 3 (4) Sl = V m m1 3 (5) 3.8 Translucidez
Através de uma matriz metálica ( = 8,0 e h = 2,0 mm), foram confeccionados cinco espécimes para cada compósito experimental. Após o preenchimento da matriz e a colocação de outra lâmina de vidro sobre os materiais, foi realizada compressão com uma massa de 0,5 kg durante 30 s para eliminação de porosidades. Após a remoção da carga, os espécimes foram fotoativados (650 mW/cm2 . 30 s) em ambos os lados (superior e inferior). Em seguida, os espécimes
foram polidos sequencialmente com lixas de carbeto de silício # 1200 e 4000 sob refrigeração (250rpm / 60 s em cada lixa) em politriz (DPU 10, Struers, Denmark).
A translucidez foi obtida com base no sistema colorimétrico CIE L*a*b*, utilizando um espectrofotômetro (CM2600d, Konica Minolta Sensing Inc, Osaka, Japão). Antes das aferições, o equipamento foi calibrado utilizando um padrão de calibração branco fornecido e de acordo com as instruções do fabricante. As coordenadas L *, a * e b * de cada espécime foram aferidas em triplicata, tendo como fundo padrões espectrofotométricos de cerâmica branca e preta (Konica Minolta Sensing Inc, Osaka, Japão). Foi utilizado um iluminador D65 com ângulo de entrada de 45˚ e 0˚ de ângulo geométrico de observação. A translucidez (PT) foi obtida através da equação abaixo:
PT = [(Lp – Lb)2 + (ap – ab)2 + (bp – bb)2]1/2, (6)
onde as letras subscritas p e b representam as leituras feitas contra os padrões espectrofotométricos preto e branco, respectivamente.
3.9 Análise estatística
A análise estatística foi realizada com o software Statgraphics Centurion XVI (STATPOINT Technologies, Inc, USA). Inicialmente foram aplicados os testes de Shapiro-Wilk e Levene para verificação da normalidade das distribuições e da homocedasticidade das variâncias. Em função dos resultados, cada variável foi submetida à análise de variância de um fator e teste de Tukey HSD para contraste entre as médias. Análise de regressão foi utilizada para avaliar a correlação entre a concentração de ZnO-NP e o grau de conversão, entre a concentração de ZnO-NP e a dureza e entre a concentração de ZnO-NP e a translucidez. Também foi avaliada a correlação entre o grau de conversão e a dureza, bem como com a solubilidade. Todas as análises foram realizadas com um nível de significância α = 0,05.
4. ARTIGO PRODUZIDO (Será submetido ao periódico Dental Materials)
ZnO-NP doped model resin composites: Activity against S. mutans and physicochemical properties characterization
Natasha Lamêgo Brandão de Souza, DDS, MSca
Maristela Barbosa Portela, DDS, MSc, PhD, Adjunct professorb
Lucianne Cople Maia, DDS, MSc, PhD, Professorc
Andréa Gonçalves Antonio, DDS, MSc, PhD, Adjunct professorc
Vanessa Loureiro Moreira e Silva, DDS, MSc studenta
Eduardo Moreira da Silva, DDS, MSc, PhD, Associate professora
aAnalitical Laboratory of Restorative Biomaterials – LABiom-R, School of Dentistry,
Federal Fluminense University, Niterói, Rio de Janeiro, Brazil
bOdontopediatric Division, School of Dentistry, Federal Fluminense University,
Niterói, Rio de Janeiro, Brazil
cDepartment of Pediatric Dentistry and Orthodontics, School of Dentistry, Federal
University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil
*Corresponding author: Dr, Eduardo Moreira da Silva – Universidade Federal Fluminense / Faculdade de Odontologia - Rua Mário Santos Braga, nº 30 - Campus Valonguinho, Centro, Niterói, RJ, Brazil - CEP 24040-110 - Phone: 55 21 2629-9832 - Fax: 55 21 2622-5739 - e-mail: em_silva@id.uff.br
ABSTRACT
Objectives: To evaluate the activity against S. mutans biofilm of model resin composites doped with different concentrations of ZnO-nanoparticles (ZnO-NP) and characterize their physicochemical properties.
Methods: A model resin composite consisting of (wt.%): Bis-GMA (70%) TEGDMA (30%), barium borosilicate particles (70%), camphorquinone (0.5%) and tertiary amine (1.0%) was doped with different concentrations of ZnO-NP: E1= 0%, E2 = 0.5%, E3 = 1%, E4 = 2%, E5 = 5% and E6 = 10%. The activity against S. mutans biofilm was evaluated by metabolic activity and lactic acid production. Scanning electron microscopy (SEM) images of biofilm on the composite’s surfaces were also taken. The following physicochemical properties were characterized: degree of conversion (DC%), flexural strength (FS), elastic modulus (EM), hardness (KHN), water sorption (Wsp), water solubility (Wsl) and translucency (TP). Data were analysed
by ANOVA and Tukey HSD’s test (α= 0.05).
Results: E3, E4, E5 and E6 decreased the biofilm metabolic activity and E5 and E6 decreased the lactic acid production (p < 0.05). E6 presented the lowest DC% (p < 0.05). No significant difference in FS and EM was found for all resin composites (p > 0.05). E5 and E6 presented the lowest values of KHN (p < 0.05). E6 presented a higher Wsp than E1 (p < 0.05) and the highest Wsl (p < 0.05). The translucency
significantly decreased as the ZnO-NP concentration increased (p < 0.05).
Significance: Incorporation of 5 wt.% of ZnO-NP endowed activity against S. mutans biofilm without jeopardizing the physicochemical properties of the model resin composite.
Keywords: resin composite, zinc oxide, nanoparticles, S. mutans, biofilm, physicochemical properties
1. Introduction
Since their development, the use of resin composites in the dental clinical practice has increased exponentially [1-3]. However, irrespective of advantages such as the capacity to mimic the optical properties of the hard dental tissues and the on demand polymerization reaction, which facilitates the reconstruction of the dental structures lost due to traumas or caries, this class of restorative biomaterials still present limitations that impair its clinical performance. The accumulation of biofilm at the surface and the development of recurrent caries at the tooth-composite interface can be see as the principal shortcoming in this field [4]. Thus, innovative studies to solve or at least diminishes this matter are welcome.
Basically, resin composites consist of an organic matrix and inorganic filler particles bonded together by a bifunctional silane, photosensitizer substances that start their polymerization reaction and additives such as stabilizers and pigments [5]. In the last decade, however, several dental scientists have proposed the introduction of new components to improve different properties of these restorative biomaterials [6-9]. Nowadays, the development of bioactive composites capable of counterattacking the action of acidophilic bacteria, as well as the development of recurrent caries, seems to occupy the frontier of knowledge in this field [10-16]. Different strategies have been proposed to develop antibacterial resin composites [17, 18]. However, none of them completely fill the needed requisites to produce composites with antibacterial activity without harming their physicochemical properties.
Methacrylate quaternary ammonium monomers (MQAM) chemically immobilized into the polymeric matrix have been used as a promising method to inhibit bacterial growth at resin composite surfaces. The positive charge of these monomers interacts with the negatively charged cell membrane of bacteria, interfering with their protein activity and damaging the bacterial DNA [19, 20]. This mechanism is called bacteriolysis [21]. It is claimed that the great advantage of this approach is that the bioactive agent is not released from the matrix, which could contribute to the maintenance of the composites’ properties. However, previous reports have shown that depending on the functionality and the concentration in which they are immobilized into the organic matrix, MQAMs can also reduce the
mechanical properties [22, 23], and increase the water sorption of the composites [24]. Doping with different bacteriostatic and bactericide chemicals, e.g., chlorhexidine, Ag salts and particles, oxides, and others, have also been tested to confer antibacterial activity to resin composites [6-8, 14, 18, 25]. Unfortunately, these chemicals also jeopardized the composites' physicochemical properties. These aspects show that the horizon is still open into this research field.
Two recent studies have shown that resin composites doped with ZnO presented antibacterial activity against S. mutans and S. sobrinus [26, 27]. However, both works have used commercially available resin composites to test this possibility. Since the exact composition of commercial resin composites is not known, it is plausible to claim that any chemical present in them could mask or interfere with the action mechanism of ZnO. Therefore, the goal of the present study was to evaluate the activity of a model resin composite doped with different concentrations of ZnO-NP against S. mutans biofilm and to characterize their physicochemical properties. The hypotheses tested were: (1) the ZnO-NP doped resin composites would present activity against S. mutans biofilm; and (2) the incorporation of ZnO-NP would not impair the physicochemical properties of the model resin composites.
2. Materials and Methods
2.1. Formulation of model resin composites
A total of six experimental resin composites were formulated (Table 1). The composites consisted of (wt.%): 2,2-Bis[p-(2’-hydroxyl-3’-methacryloxy propoxy)phenyl]propane (Bis-GMA) and triethylene glycol dimethacrylate (TEGDMA) (Essthec, Inc. Essington, PA, USA), with a mass ratio of 70:30. The monomers were weighed in an analytical balance (AW 220, Shimadzu, Tokyo, Japan) and mixed with centrifuge at 1300 rpm for 1 min (SpeedMixer DAG 150FVZ-K, FlackTech Inc., Hauschild, Germany). The photosensitizer (camphorquinone = 0.5%) and the reducing agent (ethyl N, N-dimethyl- 4-aminobenzoato – EDMAB = 1.0%) (Aldrich Chemical Company, Inc., Milwaukee, WI, USA) were added and centrifuged at 1300 rpm for 1 min. Finally, 70% of barium borosilicate glass particles with an average size
of 0.7 µm (Esstech, Inc., Essington, PA, USA) and ZnO-NP, 40-100 nm (AlfaAesar, Ward Hill, MA, USA), according to the tested concentrations (Table 1), were incorporated and the composites homogenized at 2400 rpm for 2 min.
All the specimens in the present study were light-cured with a quartz-tungsten-halogen light unit (Optilux 501, Demetron Inc., Danburry, USA) using an irradiance of 650 mW/cm2 for 30 s (radiant exposure = 19.5 J/cm2).
Table 1 – Experimental resin composites formulation.
Model composite (wt.%) Experimental composite ZnO-NP concentration (wt.%)
Organic matrix Filler system E1 0
70 % wt of Bis-GMA E2 0.5
+ 70 % wt of Ba-B-Si E3 1
30 % wt of TEGDMA E4 2
E5 5
E6 10
2.2. Activity against S. mutans biofilm
2.2.1. Preparation of specimens
Ten disk-shaped specimens (6.0 mm in diameter and 1.0 mm tick) were prepared for each experimental composite. Five of them were used in the biofilm metabolic activity assay and the other five used to inhibition of lactic acid production by the biofilm of S. mutans. The composites were inserted onto a stainless-steel mould, covered with a polyester strip and a glass slide, and light-cured from the top and bottom surfaces. Then, the specimens had their top and bottom surfaces wet polished with 1200 and 4000 grit SiC paper, sterilized with ethylene oxide and placed in a 24-well plate.
2.2.2. Streptococcus mutans inoculation and biofilm formation
S. mutans ATCC 25175 (American Type Culture Collection, Rio de Janeiro, RJ, Brazil) was cultured in 20 ml of brain heart infusion (BHI) (Difco, Sparks, USA) broth supplemented with 2 % sucrose at 37 °C in an anaerobic condition for 24 h.
Afterwards, the bacterial suspension was adjusted to an optical density of 0.5 at 550 nm using an UV/Vis Spectrophotometer (Beckman Coulter DU® 530, LifeScience, San Diego, CA, USA) in accordance to the McFarland scale (Biomérieux Brazil S.A., RJ, Brazil). The suspension was diluted by 1:100. Ten µl of this suspension was added into each well with 2 ml of BHI broth supplemented with 2 % sucrose [28]. The 24-well plates were incubated at 37 °C in an anaerobic condition for 72 h. During the 3 days of the biofilm formation, the growth medium was changed every 24 h.
2.2.3. MTT assay of metabolic activity
The composite disks of the 72 h S. mutans biofilm were transferred to a new 24-well plate for MTT [3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)-2,5-dyphenyltetrazolium bromide] evaluation, which is based on the enzymatic reduction of yellow tetrazolium into purple formazan. The specimens were rinsed three times with 1 ml of phosphate buffered saline (PBS, pH=7.2) to remove cells not adhering to the biofilm, and 500 µl of MTT (1 mg/ml) (Sigma – Aldrich, St. Louis, MO, USA) was added into each well and incubated at 37°C in a dark and in anaerobic condition for 1 h. Afterwards, 500 µl of dimethyl sulfoxide (DMSO) was added into each well and the plate was incubated at room temperature, in the dark for 20 min under gentle agitation. Then, 200 µl from each well was transferred to a 96-well plate and the optical density at 540 nm was measured in a microplate reader (ELx 808, BioTek Instruments, Winooski, VT, USA) [11]. A higher value of absorbance indicates more metabolic activity of S. mutans biofilm. The values of absorbance were subtracted from the blank (solution only, without biofilm) to be used in the statistical analysis.
2.2.4. Lactic acid production
After 72 h of biofilm formation, the medium growth was removed and the composite disks were rinsed with 1 ml of PBS. Then, the specimens were transferred to a new 24-well plate and rinsed with 1 ml of buffered peptone water supplemented with 0.2 % sucrose (BPW). This medium was replaced with a fresh one and the plate was incubated at 37°C in an anaerobic condition for 3 h [11]. After the incubation period, the BPW solutions were used for lactic acid analysis, which was determined using a lactate dehydrogenase (LDH) reaction [29]. Standard curves of the different
concentrations of lactic acid were prepared in triplicate. The microplate reader (ELx 808, BioTek Instruments, Winooski, VT, USA) was used to measure the optical density at 340 nm.
2.2.5. Scanning electron microscopy (SEM)
Two disks with S. mutans biofilm of each experimental composite were analysed by SEM. The disks were fixed in 2.5% glutaraldehyde supplemented with 3.7% sucrose for 1 h at room temperature, then gently washed with PBS to remove non-adherent biofilm. They were then fixed with 1% osmium tetroxide in 0.1 M of sodium cacodylate buffer containing 0.8% potassium ferrocyanide and 5mM of calcium chloride at pH 7.2 for 30 min at room temperature. Then, the disks were dehydrated in ascending ethanol series, submitted to critical point drying with CO2
and sputter-coated with Au-Pd. The specimens were mounted in aluminium stubs and viewed under SEM (JEOL-JSM-5310, Tokyo, Japan) operating in electron secondary mode. The images were taken at a magnification of 5,000x.
2.3. Physicochemical properties
2.3.1. Degree of conversion
Increments of each resin composite were inserted into a teflon mold (0.785 mm3) positioned onto an ATR crystal of the FT-IR spectrometer (Alpha-P/Platinum
ATR Module, Bruker Optics GmbH, Ettlingen, Germany) and the spectra between 1600 and 1800 cm-1 were recorded with 120 scans at a resolution of 4 cm-1.
Afterwards, the increments were light-cured and the spectra were recorded again (n = 3). The DC% was calculated from the ratio between the integrated area of absorption bands of the aliphatic C=C bond (1638 cm-1) to that of aromatic C=C bond
(1608 cm-1), used as an internal standard, which were obtained from the cured and
uncured increments, using the following equation:
DC% 100x 1 (aliphaticC C) / (aromaticC C)cured
(aliphaticC C) / (aromaticC C)uncured
é ë
ê ù
û
2.3.2. Flexural strength and elastic modulus
Ten bar-shaped specimens were prepared for each experimental composite. The composite was bulk inserted into a stainless-steel mold with 10 mm x 2 mm x 1 mm dimensions, which was positioned upon a glass slide. After the mold was covered with a polyester strip and another glass slide, composites were light-cured, from the top and bottom sides using an overlapping regimen. The specimens were wet polished with 1200 and 4000 grit SiC paper, stored in distilled water at 37°C for 24 h and submitted to three-point bending test in an universal testing machine (DL 2000, EMIC, SP, Brazil) with 6 mm span, at a cross-head speed of 1 mm/min. The flexural strength (FS) in MPa and the elastic modulus (EM) in GPa were calculated using the following equations:
FS 3lF
2wh2 (2)
EM Fl3 4wh3d (3)
where l is the span (mm) between supports, F is the failure load (N), h is the height
(mm), w is the width (mm) and d is the deflexion of specimen during elastic regimen.
2.3.3. Microhardness (KHN)
Five disk-shaped specimens (2.0 mm in diameter x 3.0 mm in thickness) were
prepared for each experimental composite. The specimens were embedded in epoxic
resin, inside PVC cilinders, with the irradiated surfaces facing a glass plate. After the
Denmark) with 1200 and 4000 grit SiC paper (250 rpm / 60 s in each paper) and five
knoop indentations spaced of 500 m were made in each specimen with 25 g load
and dweel time of 15 s (Micromet 5104 / Full MHT software, Buëhler, Lake Bluff, IL,
USA). The average of five indentations were take as the KHN for each specimen.
2.3.4. Water sorption and water solubility
Five disk-shaped specimens (6.0 mm in diameter x 1.0 mm in thickness) were
prepared for each experimental composite. After light-curing, the specimens were
placed in a desiccator containing dehydrated silica gel and transferrred to an oven at
37°C. After 24 h, the specimens were daily weighed using an analytical balance with
a precision of 0.01 mg (XP205, Mettler-Toledo Inc,, Greifensee, Switzerland) until
reach a constant mass (m1) (three consecutive days with a mass variation less than
± 0.01 mg). The thickness and the diameter of each specimen was measured at four
points spaced equally at circumference using a digital caliper (MPI/E-101, Mytutoyo,
Tokyo, Japan) and the volume (V) was calculated in mm
3
. The specimens were then
individually immersed in 10 mL of distilled water at 37°C for seven days and weighed
submmited to the same process described to obtain m1 until a new constant mass
was achieved (m3). Water sorption (Wsp) and water solubility (Wsl), in µg/mm
3
, were
calculated using the following equations:
Wsp m2 m3 V (4) Wsl m1 m3 V (5) 2.3.5. Translucency (TP)
Five disk-shaped specimens (8.0 mm in diameter x 2.0 mm in thickness) were constructed for each experimental composite. The color parameters were recorded according to the CIE L*a*b* system, against white and a black spectrophotometry ceramic standards (Konica Minolta Sensing Inc, Osaka, Japão), by using a spectrophotometer (model CM2600d, Konica Minolta Sensing Inc, Osaka, Japão). A D65 illuminant was used with 45˚ entrance angle and 0˚ observation angle geometry. The translucency parameter (TP) for each specimen was calculated using the following equation: TP (LW* L B *)+ (a W * a B *)+ (b W * b B *) (6)
where the superscript B and W letters represent the measurements against the black and white backgrounds, respectively.
2.4. Statistical analysis
The data were analysed using Statgraphics Centurion XVI software (STATPOINT Technologies, Inc., USA) by using one-way ANOVA and Tukey HSD’s
post hoc test. Regression analysis was performed to investigate the follow correlations: ZnO-NP (Wt.%) vs. DC%; ZnO-NP (Wt.%) vs. KHN and ZnO-NP (Wt.%) vs. TP. Regression analysis was also used between DC% and KHN and between DC % and Wsl. The analyses were performed at a significance of α=0.05.
3. Results
3.1. Activity against S. mutans biofilm
The results of the MTT assay metabolic activity are depicted in Fig. 1. The composites E3, E4, E5 and E6 decreased the metabolic activity of the S. mutans biofilm (p < 0.05). Contrarily, the MTT absorbance of E2 was not statistically different from that of E1 (p > 0.05). It can be seen from Fig. 2 that only the composites E5 and E6 reduced the production of lactic acid by the S. mutans biofilm (p < 0.05).
Fig. 1 – MTT assay of metabolic activity of S. mutans biofilm on experimental composites. Bars bellow each horizontal line are not statistically different from each other (p > 0.05). *ns = not significant
Fig. 2 – Lactic acid production by S. mutans biofilm incubated with experimental composites. Bars below each horizontal line are not statistically different (p > 0.05). *ns = not significant
Representative SEM images of S. mutans biofilm on experimental composite surfaces are shown in Fig. 3. Several spherical structures suggesting colonies of S. mutans (white circles) are evident on the surface of composites E1 and E2 (0 and 0.5 wt.% of ZnO-NP, respectively). A remarkable decrease in the number of these colonies were noted when the amount of ZnO-NP increased from 1 wt.% to 10 wt.% (composites E3, E4, E5 and E6). White pointers show the emergence of structures suggesting a connective EPS between bacterial colonies on all composite surfaces. Moreover, these EPS structures also showed vacuoles in areas with a low number of bacteria, which can be better viewed in composites E4, E5 and E6 (white asterisks).
E
1
E2
E3
E4
E5
E6
Fig. 3 – SEM images (magnification 5,000x) of S. mutans biofilm on experimental composite surfaces. Spherical structures suggesting colonies of S. mutans are evident on the surfaces of composites E1 and E2 composites (white circles). A remarkable decrease in the number of these colonies can be noted when the amount of ZnO-NP increased from 1 wt.% to 10 wt.% (E3, E4, E5 and E6). White pointers show structures suggesting connective EPS between bacterial colonies on all the composites’ surfaces. These EPS structures formed vacuoles in areas with a low number of bacteria, which are better viewed in composites E4, E5 and E6 (white asterisks).
3.2. Physicochemical properties
The results of the physicochemical properties of all the composites are summarized in Table 2. The ZnO-NP concentration significantly influenced the DC% (F = 30.8; p < 0.0001), with E6 presenting the lowest DC% (p < 0.05). E1 E2, E3 and E4 presented similar DC% (p > 0.05), while E5 developed an intermediate DC%, but was similar to those of E2 and E4 (p > 0.05).
Table 2 – Mean (SD) of Degree of conversion (DC%), Flexural strength (FS), Elastic modulus (EM), Hardness (KHN), Water sorption (Wsp), Solubility (Wsl) and translucency (TP)
DC% FS (MPa) EM (GPa) KHN (kgf/cm2) Wsp (g/mm3) Wsl (g/mm3) TP E1 68.6 (3.4)a 83.3 (12.1) 5.3 (1.2) 67.2 (2.2)a
24.8 (0.5)a 2.8 (0.6)a 21.6 (1.5)a
E2 64.9 (1.3)a.b 77.9 (9.7) 5.2 (0.9) 64.4 (3.3)a.b 25.6 (0.9)a,b 2.4 (0.1)a 12.7 (0.7)b E3 66.9 87.2 5.3 62.7 25.0 3.0 (0.4)a 9.9 (1.1)c
(1.0)a (6.9) (0.9) (2.1)a.b (0.6)a,b E4 64.3 (1.5)a.b 86.4 (15.5) 4.9 (1.1) 59.8 (2.5)b.c 25.1 (0.4) a,b 2.8 (0.3)a 6.0 (0.7)d E5 60.6 (2.0)b 82.1 (8.8) 4.6 (0.7) 57.5 (2.9)c.d 25.6 (0.6) a,b 3.0 (0.2)a 2.3 (0.5)e E6 51.0 (4.3)c 90.9 (7.9) 5.1 (0.6) 54.4 (1.9)d 26.1 (0.5)b 3.9 (0.5)b 0.7 (0.1)f In each column, means followed by different lowercase letters are statistically different (Tukey´s HSD, p < 0.05).
One-way ANOVA showed that the ZnO-NP concentration had no statistical influence on flexural strength (F = 1.85; p = 0.1189) and elastic modulus (F = 0.76; p = 0.5786).
For hardness, one-way ANOVA showed that the ZnO-NP concentration had a statistically significant influence (F = 17.38; p < 0.0001). The lowest hardness values were presented by E5 and E6 (p > 0.05), although the value of E5 was similar to that of E4 (p > 0.05). The hardness values of E1, E2 and E3 were not different from each other (p > 0.05).
The water sorption was significantly influenced by the ZnO-NP concentration (F = 5.77; p = 0.0012), with E6 presenting a higher water sorption than E1 (p < 0.05). The solubility of E6 was statistically higher than those of E1, E2, E3, E4 and E5 (p < 0.05), which were not different from each other (p > 0.05).
Translucency (TP) was highly influenced by the ZnO-NP concentration (F = 384.56; p < 0.0001): E1 > E2 > E3 > E4 > E5 > E6 (p < 0.05). Fig. 4 shows representative specimens of each experimental composite photographed against a white/black background. It can be noted that the greater the ZnO-NP concentration, the more opaque the experimental composite.
Fig. 4 – Photograph of representative specimens of each experimental composite against white/black background.
Regression analysis (linear models) showed a strong positive correlation between DC% and microhardness (r = 0.90; p = 0.0147 / Fig. 5a) and a negative correlation between DC% and solubility (r = -0.84; p = 0.0353 / Fig. 5b). Regression analysis also showed that the concentration of ZnO-NP strongly influenced the DC% (linear model; r = -0.98; p = 0.0004 / Fig. 6a), microhardness (square root-X model; r = -0.99; p = 0.0001 / Fig. 6b), and translucency (square root-X model; r = -0.94; p = 0.0057 / Fig. 6c).
Fig. 5 – Linear Regression lines (linear models) of (a) DC% plotted against the microhardness and (b) DC% plotted against solubility.
Fig. 6 – Linear Regression lines of (a) ZnO-NP concentration plotted against DC % (linear model); (b) ZnO-NP concentration plotted against microhardness (square-root X model) and (c) ZnO-NP concentration plotted against translucency (square-root X model).
4. Discussion
Aydin Sevinç and Hanley [30] were the first authors who tested the antibacterial activity of composites doped with ZnO-NP. They reported a reduction of 80% in S. sobrinus biofilm growth when 10 wt.% of ZnO-NP was incorporated into a commercially available resin composite. More recently, Tavassoli Hojati et al. [26] showed that S. mutans biofilm growth was significantly diminished with the increase in theZnO-NP concentration. The authors also showed that the incorporation of 1 wt. % of ZnO-NP did not interfere with some mechanical properties of the resin composite. Although these two important studies have added interesting concepts regarding the effectiveness of ZnO-NP on biofilm growth inhibition, it is noteworthy that both incorporated the ZnO-NP particles into commercially available resin composites. Although the principal chemicals present in the composition of commercially available resin composites do not present antibacterial activity, it is reasonable to infer that some ingredients not disclosed by the manufacturers could interfere with the antibacterial mechanism of ZnO-NP. For example, in the study of Tavassoli Hojati et al. [26], ZnO-NP was added to Heliomolar Flow, a resin composite with ytterbium trifluoride in its composition. However, there is scientific evidences that Zn may enhance the glycolysis-inhibition effect of fluoride against S. mutans [31]. Thus, in the present study the effectiveness of ZnO-NP was tested using a model resin composite with a known composition. To the best of the authors’ knowledge, this is the first study conducted in this way.
Thanks to its special abilities such as the production of extracellular polymeric substance (EPS) from the sucrose hydrolysis, which, in turns, facilitates the adherence of other bacteria onto tooth surfaces and contributes to the dynamic arrangement of the biofilm [32], S. mutans is the first agent involved in bacterial colonization and biofilm growth. Previous studies have shown that S. mutans is the most prevalent bacteria within the biofilm in the early stages of caries development [33, 34]. This was the rational behind using a single S.mutans biofilm in the present study. The MTT assay of metabolic activity was chosen to evaluate the activity of an experimental resin composite against S. mutans biofilm because it has been extensively used to evaluate the antibacterial potential of dental materials [11, 14, 16].
Only the experimental composites with 1 to 10 wt.% of ZnO-NP presented activity against S. mutans biofilm (Fig. 1), results that corroborate those of Aydin Sevinç and Hanley [30]. Thus, the first null hypothesis of the present study was partially accepted. Two pathways have ben described as the possible mechanisms for the antibacterial activity of ZnO. The first advocates that ZnO reacts with water from the environment, releasing Zn2+ into the growth media that may interfere with the
bacterial metabolism by displacing Mg2+, which is extremely necessary to the
enzymatic activity of the biofilm [35]. The second advocates that ZnO can also generate reactive peroxides, e.g., H2O2, that penetrate the membrane cell, causing
damage and inhibiting bacterial growth [36]. Taking into account that both mechanisms involve release of active species from ZnO surfaces, it is clear that in the high surface area to volume ratio (derived from the 40-100 nm of the ZnO-NP) had influenced the behaviour of the experimental composites in this study with a higher content of these particles in the present study [37]. Contrarily, the result of the composite with only 0.5 wt.% of ZnO-NP (E2) did not differ from that of E1. This means that this low concentration of ZnO-NP was unable to release sufficient Zn2+ or
generated reactive peroxides in a quantity sufficient enough to act against S. mutans biofilm.
Fully hydrated biofilms are composed of cells (± 15 vol%) and EPS (± 85 vol %). Thus, after killing bacteria, more voids-like structures will be formed on the biofilm structure [38]. The analysis of Fig. 3 shows that the number of S. mutans colonies (white circles) inversely decreased with the increase in the amount of ZnO-NP. In composites E3, E4, E5 and E6, it is clear the emergence of structures suggesting connective EPS between bacterial colonies (white pointers) and EPS vacuoles in areas with a low number of bacteria (asterisks). These aspects reinforce the antibacterial effectiveness of experimental composites doped with 1 to 10 wt.% of ZnO-NP. According to Weber et al. [32], these vacuoles represent spaces in the polysaccharide-rich EPS structure due to lower number of bacteria. On the other hand, the similarities between the images of E1 and E2 (Fig. 3) meet the idea that the concentration of 0.5 wt.% of ZnO-NP is not sufficient to kill enough bacteria to create an antibacterial resin composite.
Caries starts with the progressive damage of the mineral structure of the dental hard tissues by organic acids produced by the cariogenic biofilm after fermentable carbohydrate intake [39]. Thus, quantifying the amount of acids
produced by S. mutans biofilm is also of great relevance in terms of antibacterial activity [11, 17]. The evaluation of lactic acid was performed as this acid corresponds to 70 % of the total acid produced after sucrose degradation by cariogenic biofilms [40]. Only the composites with 5 and 10 wt.% of ZnO-NP significantly reduced the production of lactic acid by S. mutans biofilm (Fig. 2), with the total amount of acid being three-fold less than that produced by the control composite. According to He et al. [41], this reduction in lactic acid production is due to the ability of Zn2+ to interfere
with the bacterial glycolysis and be retained in plaque by electrostatic interaction, which may provides a prolonged bacteriostatic effect.
In the current study, the DC% of the experimental composites ranged from 51.0 to 68.6 (Table 2), values which nicely agree with others obtained from commercially available resin composites [42]. On the other hand, a strong negative correlation (-0.98) was observed between the ZnO-NP wt.% and DC% (Fig. 6a). Two aspects can explain this finding. Firstly, the size of ZnO-NP (40-100 nm) is closer to the half of the wavelength of the light curing unit than the 0.7 m barium borosilicate glass particles, an aspect that may increase the light scattering inside the composite [43]. Secondly, the refractive index of the Bis-GMA:TEGDMA (70:30) blend equals 1.52 [44] is far from that of ZnO-NP, which equals 2.02 [45]. This dissimilarity could have been responsible for the decrease in the translucency with the increase in the concentration of ZnO-NP, as showed in Fig. 6c and viewed in Fig. 4, where it can be seen that the greater the concentration of ZnO-NP, the higher the opacity of the specimens [46].
As in the present study, Tavassoli Hojati et al. [26] also showed that the flexural strength was not affected by the incorporation of ZnO-NP. On the other hand, in that study the elastic modulus of composites with ZnO-NP were significantly higher than those of the control composite. As FS and EM are properties that involve a 3-dimensional material behavior [47], which is dependent on the material microstructure, it is assumed that in the current study the ZnO-NP reached a good dispersion inside the composites [26], thereby not jeopardizing FS and EM (Table 2).
Microhardness suffered a linear (Fig. 6b) and significant decrease with the increase of ZnO-NP concentration (Table 2). This finding can first be linked to the ZnO-NP hardness itself being lower than that of barium borosilicate glass particles [48]. Additionally, the strong positive correlation between DC% and hardness (Fig. 5a), could also explain this result. This possibility corroborates the results of previous
studies that showed a positive relationship between DC% and the microhardness of unfilled resins [49] and resin composites [50].
The water sorption (24.4 to 26.1 g/mm3) and the water solubility (2.4 to 3.9
g/mm3) obtained in the current study (Table 2) are in agreement with the maximum
values established by the SO4049 standard: Wsp ≤ 40 g/mm3 and Wsl ≤ 7.5 g/mm3
[51], suggesting that the composites formulated here may be resistant to hydrolytic degradation. Only the composite E6 presented a higher water sorption (26.1 g/mm3)
than E1 (24.8 g/mm3). As all composites were formulated with the same organic
matrix (Bis-GMA:TEGDMA = 70:30 wt.%), this result clearly shows the role the higher surface area to volume ratio of ZnO-NP played on the performance of E6. With the increase in the amount of unsilanated ZnO-NP, more water could have accumulated onto the surfaces of ZnO-NP, thereby increasing the sorption of E6 [52, 53]. E6 presented the highest solubility (3.9 g/mm3), while the other composites did not
differ from each other (Table 2). As ZnO is an amphoteric oxide insoluble in water and alcohols, this behaviour can only be explained through the lowest DC% developed by E6 (Table 2). The strong negative correlation (r = -0.84; p = 0.0353) depicted in Fig. 5b, supports this thought, which corroborates those of previous studies that also showed good relationships between the degree of conversion and solubility of different resin-based materials [54, 55]. Because the degree of conversion, hardness, water sorption, water solubility, and translucency were influenced by the different amounts of ZnO-NP, the second research hypothesis of the current study was rejected.
Summarizing the present results, it is reasonable to conclude that the incorporation of 5 wt.% of ZnO-NP could endow antibacterial activity to resin composites, without jeopardizing their physicochemical properties. Irrespective of these findings, aspects such as the effect of pH-cycling, in situ simulations, and long-term evaluation must be addressed in future investigations.
REFERENCES
