Sérgio Manuel Bernardo Machado Lopes
Impacto da composição celular do
enxerto hematopoiético no sucesso
do alotransplante
Orientadora: Prof. Doutora Isabel Leal Barbosa
2008
Porto
DISSERTAÇÃO DE CANDIDATURA AO GRAU DE MESTRE APRESENTADA AO INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS ABEL SALAZAR E À
Agradecimentos
À Prof. Doutora Isabel Leal Barbosa, responsável pela orientação desta dissertação, pela disponibilidade, apoio e incentivo demonstrados.
À Dra. Alzira Carvalhais, directora do Departamento de Imuno-Hemoterapia, pela confiança e amizade sempre presentes.
Ao Dr. Fernando Campilho e ao Prof. Doutor Mário Dinis, cuja colaboração e orientação foram fundamentais para a realização desta tese.
Ao Dr. Laranja Pontes, director do IPO-Porto, e seus antecessores, pelo apoio concedido ao Mestrado em Oncologia.
Ao Prof. Doutor João Amado, ao Prof. Doutor Carlos Lopes e à restante comissão coordenadora, assim como a todos os docentes do Mestrado em Oncologia, pelo empenho demonstrado.
À Dra. Susana Roncon, directora do Serviço de Terapia Celular, por me ter aceite no Serviço e por todo o apoio.
À D. Alcina Ávila e à Dra. Helena Coelho, pela disponibilidade com que me acolheram e integraram no Serviço e na Instituição. À Sara e à Fátima pelo bom ambiente de trabalho no Seviço.
Às bolseiras, que passaram pelo Serviço de Terapia Celular, que me acompanharam e apoiaram no decurso desta tese, em particular à Elsa e à Carla por todo o apoio.
À Beatriz, à Rosa Maria, ao Rui, à Helena, à Conceição, ao Paulo e ao Milton, por me pouparem uma hora de viagens para um minuto de trabalho!
Ao Dr. António Campos Jr., director do Serviço de Transplantação de Medula Óssea por me facultar os dados clínicos dos doentes e à Rute, pela paciência e preciosa ajuda a reuni-los.
A todos os elementos do Departamento de Imuno-Hemoterapia, que de uma forma ou de outra contribuíram para a minha formação profissional.
À Liga Portuguesa Contra o Cancro, pelo apoio financeiro prestado. Ao IPO-Porto, onde foi realizado o trabalho conducente a esta tese.
Aos meus pais e aos pais da Joana, pelo constante incentivo, apoio, paciência, amizade e compreensão demonstrados em todos os momentos.
À Joana, por toda a ajuda, incentivo, sugestões e conselhos, …um obrigado, simplesmente por TUDO!!!
Abreviaturas e símbolos 15
Resumo 19
Summary 25
Introdução 31
1. Células estaminais e transplantação 33 1.1. Historial da transplantação de MO 34 1.2. Outras fontes de células progenitoras hematopoiéticas 35 1.3. Mobilização e colheita de células progenitoras hematopoiéticas 37 1.3.1. Principais factores de mobilização 39 1.3.2. Colheita por aférese 40 2. Imunobiologia do transplante 41 2.1. Composição celular do enxerto hematopoiético 41 2.2. Doença enxerto contra hospedeiro, efeito enxerto contra tumor
e imunovigilância
45 3. Condicionamento dos doentes 49 3.1. Condicionamento mieloablativo 49 3.2. Condicionamento não mieloablativo 50 4. Avaliação dos doentes pós-transplante 51 4.1. Avaliação hematológica 51
4.2. Avaliação clínica 51
5. Influência da composição do enxerto no sucesso do transplante 52 5.1. Efeito imunomodulador do G-CSF 52 5.2. Influência da composição celular 53
Material e métodos 59
1. População em estudo 61
1.1. Mobilização e colheita dos dadores 61 1.2. Avaliação dos doentes 62 2. Avaliação da colheita de células progenitoras hematopoiéticas 62 2.1. Avaliação hematológica 62
2.2. Imunofenotipagem 63
2.2.1. Marcação de superfície 63 2.2.2. Aquisição e análise 64 3. Detecção e quantificação de citocinas intracelulares 69 3.1. Isolamento e criopreservação das MNC 69 3.2. Descongelação das amostras 69 3.3. Determinação da viabilidade 70
3.4. Estimulação celular 70
3.5. Preparação dos reagentes 71
4. Análise estatística 72
Resultados 73
1. Composição celular dos enxertos de CPSP colhidos a dadores saudáveis 75 2. Células infundidas e condicionamento dos doentes 76 3. Seguimento dos doentes após o TPH 79 4. Influência da composição do enxerto no resultado do TPH 80 4.1. Composição do enxerto e arranque dos doentes 80 4.2. Ratio entre populações e arranque dos doentes 80 4.3. Recuperação de linfócitos e arranque hematológico 81 4.4. Influência das populações infundidas no desenvolvimento de GVHD 81 4.5. Avaliação da sobrevivência dos doentes 82 5. Influência das células produtoras de IFN-γ e IL-4 no arranque hematológico 91
5.1. Quantificação de linfócitos T produtores de citocinas 91 5.2. Influência no arranque dos doentes 92
Discussão 93
1. Enquadramento do estudo 95
2. Limitações do estudo 96
3. Condicionamento e arranque hematológico dos doentes 96 4. Influência da composição do enxerto no resultado do TPH 97 4.1. Composição do enxerto e arranque dos doentes 97 4.2. Ratio entre populações e arranque dos doentes 98 4.3. Recuperação de linfócitos e arranque hematológico 99 4.4. Influência das populações infundidas no desenvolvimento de GVHD 99 4.5. Avaliação da sobrevivência dos doentes 102 5. Influência das células produtoras de IFN-γ e IL-4 no arranque hematológico 105
Conclusões 108
Abreviaturas e símbolos AA Anemia aplástica
ADCC Antibody dependent cellular citotoxicity
ALC Linfócitos em circulação por μl de sangue ALC d15 ALC 15 dias após o transplante
APC Aloficocianina
APC Células apresentadoras de antigénios ATG Globulina anti-timocitária BFA Brefeldina A
CEH Células estaminais hematopoiéticas CD Cluster de diferenciação
CPH Células progenitoras hematopoiéticas CPSP Células progenitoras do sangue periférico D500 linf Recuperação de linfócitos (em dias) D500 Neut Arranque de neutrófilos (em dias) D20 PLT Arranque de plaquetas (em dias) DC Células dendríticas DH Doença de Hodgkin
DLI Infusão de linfócitos do dador DMSO Dimetil sulfóxido FITC Isotiocianato de fluoresceína FSC Forward Scatter
G-CSF Granulocyte Colony Stimulating Factor
GM-CSF Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor
GVHD Doença enxerto contra o hospedeiro
aGVHD Doença enxerto contra o hospedeiro aguda cGVHD Doença enxerto contra o hospedeiro crónica GVT Efeito enxerto contra o tumor
HLA Antigénios leucocitários humanos HPN Hemoglobinúria Paroxística Nocturna IFN Interferon
IL Interleucina kg Quilograma LMA Leucemia miéloide aguda LMC Leucemia miéloide crónica
LLA Leucemia linfoblástica aguda LLC Leucemia linfoblástica crónica
Abreviaturas e símbolos LNH Linfoma não Hodgkin
min Minutos ml Mililitro MM Mieloma Múltiplo MNC Células mononucleares MO Medula óssea NK Natural Killer
NKT Linfócitos T Natural Killer
PC5 Ficocianina PE Ficoeritina PerCP Peridinin chloropyll protein
PMA Phorbol 12-Myristate 13-Acetate
rpm Rotações por minuto SDF-1 Stromal Derived Factor-1
SMD Síndrome mielodisplásico SSC Side Scatter
Tc Linfócitos T citotóxicos TCR Receptor das células T
TGF Transforming growth factor
Th Linfócitos T auxiliares TNF Factor de necrose tumoral
TPH Transplante de Progenitores Hematopoiéticos Treg Linfócitos T reguladores
μl microlitro
Resumo A transplantação de progenitores hematopoiéticos (TPH) é uma prática corrente no tratamento de muitas doenças oncológicas, principalmente de foro hematológico. Os principais objectivos de um alotransplante são a eliminação da doença residual e a substituição do sistema imunitário do doente pelo do dador. As células utilizadas podem ser colhidas directamente da medula óssea ou do sangue periférico, após mobilização com factores de crescimento, por aférese. O factor mais utilizado na mobilização de células para transplantação é o G-CSF.
Além das células progenitoras CD34+, o enxerto hematopoiético é constituído por uma grande variedade de populações celulares, capazes de desenvolver uma resposta imune competente, sendo as mais importantes os linfócitos T, as células NK, NKT e as células dendríticas.
Antes do TPH é administrado ao doente quimioterapia (e/ou radioterapia) com objectivo de eliminar as células tumorais, globalmente designado por regime de condicionamento. Consoante a agressividade e grau de mielossupressão induzido, o condicionamento pode ser mieloablativo (MA) ou não mieloablativo (NMA).
Um dos perigos do transplante de células imunocompetentes surge quando estas reconhecerem as células do doente como patogénicas, podendo-se desenvolver a doença enxerto contra o hospedeiro (GVHD), que pode assumir uma forma aguda (aGVHD) ou crónica (cGVHD).
O sucesso do transplante está dependente de vários factores, nomeadamente a dose de células infundida, o tipo de condicionamento e a idade do doente.
Neste estudo foram avaliados os enxertos hematopoiéticos de 78 dadores adultos saudáveis, colhidos por aférese após 5 dias de mobilização com uma mediana de 13μg/kg/dia de G-CSF. Nos enxertos avaliou-se a dose de cada população infundida e o ratio entre as populações. Estudou-se a influência da composição do enxerto na recuperação de linfócitos, arranque hematológico, desenvolvimento e grau de aGVHD, extensão da cGVHD, assim como na sobrevivência global (OS) e livre de doença (DFS) dos doentes após TPH. Uma vez que o tipo de condicionamento induz
Resumo diferentes estados de imunossupressão os doentes com um condicionamento MA ou NMA foram avaliados separadamente.
A correlação entre a composição do enxerto e o resultado do transplante foi avaliada com o teste de Pearson ou Spearman no caso de variáveis contínuas paramétricas ou não paramétricas, respectivamente. As variáveis categóricas foram analisadas pelo teste t ou uma tabela ANOVA e a sobrevivência estimada pelo método de Kaplan-Meier com o teste de Log rank e de Breslow. As correlações foram consideradas significativas para p<0,05.
Apesar dos doentes com um condicionamento NMA apresentarem um arranque hematológico mais rápido do que os doentes com um condicionamento MA, não se observaram diferenças significativas na sobrevivência de ambos os grupos. Independentemente do condicionamento, os doentes mais novos (idade inferior a 45 anos) apresentaram melhor sobrevivência. Em ambos grupos o arranque hematológico estava associado à recuperação de linfócitos.
Nos doentes com um condicionamento MA o arranque hematológico foi tanto mais rápido quanto maior a dose de linfócitos Tc e de DC1 infundida. A rápida recuperação de linfócitos estava associada com o aumento da dose de células NKdimCD16+ infundida e com a diminuição da dose de DC2 infundida. Os doentes
mais velhos e os transplantados com doses mais altas de DC1 desenvolveram maior grau de aGVHD. Os doentes com maior grau de aGVHD apresentaram pior sobrevivência.
Nos doentes com um condicionamento NMA a recuperação de linfócitos foi tanto mais rápida quanto maior a dose infundida de leucócitos e de linfócitos T. O arranque hematológico foi mais rápido nos doentes transplantados com maior dose de células CD34+, de linfócitos Tc e de células NKdimCD16+. O aumento da dose
transplantada de células NK, NKbright, NKdim, NKT, linfócitos T, Tc e Th traduziu-se no
aumento do grau de aGVHD desenvolvida. Neste grupo, os doentes transplantados com doses de leucócitos superiores a 19x108/kg, assim como os que recaíram,
Resumo apresentaram pior sobrevivência. Os doentes transplantados com doses de células CD34+ superiores a 5,5x106/kg, com melhor recuperação de linfócitos ou com um arranque de plaquetas mais rápido, apresentaram uma melhoria na sobrevivência.
Foi utilizado o ratio entre populações infundidas na avaliação do impacto da composição do enxerto no resultado TPH, tendo-se obtido resultados semelhantes aos encontrados para a dose respectiva de cada população.
Num grupo independente de 16 dadores e respectivos doentes, foi avaliado o impacto da dose infundida de linfócitos T produtores de IFN-γ e produtores de IL-4 no arranque hematológico dos doentes. Observou-se que quanto maior a dose infundida de ambas as populações mais rápido foi o arranque de neutrófilos dos doentes.
Pode-se concluir que a composição celular do enxerto efectivamente influencia o resultado do TPH. Nos doentes com um condicionamento NMA essa influência é mais notória (maior número de associações encontradas), reflexo do estado de imunossupressão dos doentes.
Summary Haematopoietic stem cell transplant is a current treatment in a variety of oncological diseases, mainly of haematological origin. The main goals of an allotransplant are residual disease elimination and replacetment of the patient’s immune system with that of the donor. The stem cells used can be harvested directly from the bone marrow or from the peripheral blood, following mobilization with growth factors, by apheresis. The growth factor more commonly used in cell mobilization for transplantation is the G-CSF.
Apart from the CD34+ stem cells, aphaeresis collected haematopoietic grafts are composed of a large variety of cell populations, capable of starting an effective immune response, the more relevant being T lymphocytes, NK, NKT and dendritic cells.
Prior to the transplant, the patient is given a course of chemotherapy (with or without radiotherapy) in order to eliminate tumour cells, generally refered to as conditioning. According to the aggressiveness and degree of myelosuppression, the conditioning can be either myeloablative (MA) or nonmyeloablative (NMA).
One of the dangers of transplanting imunocompetent cells comes from the possibility of the recognisment of donor cells as pathogenics, leading to the development of graft versus host disease (GVHD), which can take either an acute (aGVHD) or chronic (cGVHD) form.
The outcome of the transplant depends on various parameters, namely the cell dose infused, the type of conditioning and the patient’s age.
For this study we evaluated the haematopoietic grafts of 78 healthy adult donors, harvested by aphaeresis after 5 days of mobilization with a median dose of 13μg/kg/day of G-CSF. The infused cell dose of each population and the ratio between populations were evaluated. The impact of the graft composition on the patient’s haematological engraftment, lymphocyte recovery, development and degree of aGVHD and cGVHD extension, overall survival (OS) and disease free survival (DFS), after
Summary transplant was evaluated. Since the type of conditioning induces a different state of immunossupression, patients with a MA or NMA conditioning were evaluated separately.
Correlations between graft composition and transplant outcome were calculated with either the Pearson or the Spearman test, for continuous parametric or non-parametric variables, respectively. Categorical variables were analysed with the t-test or an ANOVA table, and survival was estimated by the Kaplan-Meier method, with the Log rank and Breslow tests. Correlations were considered significant for a value of p<0,05.
Although patients with a NMA conditioning presented a faster haematological engraftment than those with a MA conditioning, there was no significant differences in the survival of both groups. Regardless of the type of conditioning, younger patients (below 45 years) had a better survival. In both groups the patient’s haematological engraftment was associated with the lymphocyte recovery.
Patients with a MA conditioning infused with a higher dose of Tc lymphocytes and DC1 had a faster haematological engraftment, while a faster lymphocyte recovery was associated with an increase in the NKdimCD16+ cell dose infused and a decrease
in the DC2 dose infused. Older patients and those transplanted with higher DC1 doses developed a higher degree of aGVHD. Patients with a higher degree of aGVHD present a worse survival.
Within patients with a NMA conditioning the lymphocyte recovery was faster in patients receving higher doses of leucocytes and T lymphocytes. The haematological recovery was faster in patients transplanted with higher doses of CD34+ cells, Tc lymphocytes and NKdimCD16+ cells. An increase in the infused cell dose of NK, NKbright,
NKdim and NKT cells and T, Tc and Th lymphocytes was associated with an increase in
the degree of aGVHD developed. In this group, patient receiving more than 19x108
leucocytes/kg and those with disease relapse had a worse survival, while patients
Summary receving more than 5,5x106 CD34+ cells/kg, with faster lymphocyte recovery or with
faster haematological engraftment showed an improved survival.
The use of the ratio between populations in the evaluation of the impact of graft composition in the transplant outcome was evaluated, producing similar results to those obtained with cell doses.
In an independent group of 16 donors and respective patients, we evaluated the impact of the IFN-γ and IL-4 secreting T lymphocytes dose infused on the patient’s haematological engraftment. For both populations, an increase of the infused cell dose led to a faster neutrophil engraftment.
We can conclude that the graft cell composition does influence the outcome of haematopoietic cell transplants. This influence is best shown in patients with a NMA conditioning (more correlations found), derived from the immunosuppression of the patients.
Introdução
1. Células estaminais e transplantação
As células estaminais representam uma população de células indiferenciadas com uma elevada capacidade de auto-renovação, podendo uma única célula originar milhares de células idênticas, mantendo o estado indiferenciado. Apresentam também um elevado potencial de diferenciação, podendo originar uma grande variedade de células adultas diferenciadas.1
Durante a vida embrionária as células estaminais encontram-se em grande número em circulação e no fígado fetal, sendo a extracção do sangue do cordão umbilical (SCU) e da placenta a principal forma de acesso a estas populações celulares. Nos adultos e nas crianças, a medula óssea (MO) é a principal fonte de uma variedade de células estaminais e progenitoras (Figura 1). As células progenitoras hematopoiéticas (CPH) têm a capacidade de se diferenciarem em todas as linhagens celulares hematopoiéticas, mielóide (incluindo a eritróide) e linfóide.2
Caracteristicamente estas células exprimem à superfície o antigénio CD34 à superfície, sendo por isso designadas como células CD34+. As células CD34+ mais imaturas podem exprimir ainda o receptor para o stem cell factor (SCF) (CD117ou c-kit) e o antigénio CD133.3
A transplantação de CPH é uma prática corrente no tratamento de muitas doenças oncológicas, principalmente de foro hematológico, podendo as células utilizadas serem provenientes do próprio doente (transplante autólogo ou autotransplante) ou de um dador saudável compatível com o doente (transplante alogénico ou alotransplante).5 Os principais objectivos de um alotransplante são, além de destruir a doença residual, substituir o sistema imuno-hematopoiético do doente pelo do dador. O alotransplante é uma verdadeira forma de imunoterapia celular adoptiva, facto que tem sido cada vez mais explorado, recorrendo, em casos seleccionados, a esquemas de quimioterapias menos agressivos, essencialmente imunosupressores.5
Introdução
Figura 1 – Células progenitoras presentes na medula óssea e respectivo potencial de diferenciação (www.stemcells.nih.gov).
1.1. Historial da transplantação de medula óssea
O conceito de transplantação de células hematopoiéticas já existe há muito tempo, tendo tido como pioneiros Brown-Sequard e D’Arsonaval, que em 1891 administraram MO por via oral, na tentativa de tratar doentes com anemia secundária à leucemia. Passados 45 anos, Schretzenmayr começou a administrar MO por via intramuscular e, em 1940, Marisson e Samwick relataram que doentes com anemia aplástica se encontravam curados após 3 injecções intramedulares de apenas 13 ml de MO proveniente de irmãos.
Inspirados por estes bons resultados começaram a surgir vários estudos bem sucedidos, com ratinhos e humanos, a demonstrar o efeito protector de células da MO em indivíduos sujeitos a radiação. Apesar do sucesso obtido em laboratório, as décadas de 50 e 60 foram marcadas por desilusões clínicas, em grande parte devido a terem sido realizados em doentes terminais, e ao desconhecimento do sistema dos antigénios humanos leucócitarios (HLA Human Leukocyte Antigens). Os primeiros transplantes com sucesso foram realizados no final dos anos 60.6
Introdução Nos anos 70, devido a um aumento dos conhecimentos teóricos da imunologia e desenvolvimento de novas drogas, começaram a ser realizados os primeiros alotransplantes de MO bem sucedidos. Com a padronização de protocolos, cooperação internacional e aumento do número de centros de transplantação, o número de transplantes efectuados aumentou largamente (Figura 2).
Nº de transplant
es realizados
Ano do transplante
Figura 2 – Evolução do número de alotransplantes realizados na Europa (adaptado de European Group
for Blood and Marrow Transplantation).
1.2. Outras fontes de células progenitoras hematopoéticas
Apesar de ser conhecida a existência de células estaminais em circulação, só a partir dos anos 90 é que o transplante de células progenitoras obtidas do sangue periférico (CPSP) foi efectuado de um modo crescente. Actualmente a colheita de CPSP ultrapassa, em número, a colheita de MO (Figura 3).
Como já foi referido, um alotransplante utiliza células provenientes de um dador saudável. A procura de um dador compatível começa nos familiares directos, que apresentam maiores probabilidades de compatibilidade. Como nem sempre é possível encontrar um familiar compatível, foram criados registos de dadores voluntários não aparentados.
Introdução
Nº de transplant
es realizados
Ano do transplante
Figura 3 – Evolução do número de alotransplantes realizados nos EUA, de acordo com a fonte das células (adaptado de National Marrow Donor Program).
As bases de registos nacionais foram integradas em grandes registos internacionais, o que permitiu aumentar largamente a probabilidade de encontrar um dador não aparentado compatível (Figura 4). Adicionalmente à actividade de manter registos dos haplotipos dos dadores inscritos, as redes de registo internacionais também produzem dados e estatísticas relativamente ao tipo e volume de transplantes efectuados anualmente. As principais redes internacionais são a European Bone
Marrow Transplant (EBMT) e o Center for International Bone & Marrow Transplant Research (CIBMTR), Norte-americano.
.
Introdução
Nº de transplant
es realizados
Ano do transplante
Figura 4 – Número de alotransplantes realizados por ano, em função do tipo de dador (adaptado de
Center for International Blood and Marrow Transplant Research).
1.3. Mobilização e colheita de células progenitoras hematopoiéticas
A MO actua como nicho para as células estaminais, fornecendo-lhes suporte físico e biológico. As células de estroma que revestem internamente a cavidade medular produzem moléculas de adesão, responsáveis pela retenção das células estaminais hematopoiéticas (CEH) e factores solúveis que lhes permitem manterem-se num estado indiferenciado.2 Estas células de suporte aparentam ser osteoblastos que
se especializaram em função de suporte, com uma morfologia ovalada e elevados níveis de expressão de n-caderinas, sendo designadas por “Spindle shaped
N-cadherin expressing Osteoblasts” (SNO).7
As CEH e CPH distribuem-se na medula óssea de acordo com o grau de diferenciação, estando as CEH, mais imaturas, localizadas junto dos osteoblastos, na interface osso-MO (endósteo) e as CPH, mais diferenciadas, no lúmen do osso, em contacto com elementos fibroblastóides (Figura 5).2 Estudos demonstraram que outras
células progenitoras têm igualmente nichos preferenciais.8
Introdução
Figura 5 – Distribuição das células estaminais hematopoiéticas (CEH) e células progenitoras hematopoiéticas (CPH) na medula óssea (adaptado de Levesque et al., 2007).
A interacção entre osteoblastos e células estaminais é mediada por vários factores. Durante o processo de formação do osso, caracterizado pelas actividades antagónicas de osteoblastos e osteoclastos, ocorre a libertação de cálcio solúvel (Ca2+), formando um gradiente que atrai as CEH, por acção dos seus receptores de
Ca2+.9 Os osteoblastos produzem ainda elevados níveis de SDF-1 (ou CXCL12) que é
um potente quimiotáctico de CEH, por acção do seu receptor CXCR4. A par de produção desta citocina, os osteoblastos expressam uma grande variedade de moléculas de adesão, nomeadamente Vascular Cell Adhesion Molecule-1 (VCAM-1) e SCF transmembranar, que se ligam aos respectivos receptores na membrana das CEH. 2
Em situações de stress, lesão de tecidos ou estimulação da medula, parte destas células imaturas passa para a circulação periférica, num processo denominado mobilização (Figura 6). Para que as CPH possam ser recolhidas no sangue periférico é necessário proceder à sua mobilização. A mobilização pode ser efectuada recorrendo a quimioterapia ou ao uso de factores de crescimento.
Introdução
Figura 6 – Mobilização de CPH da medula óssea para a periferia, por acção do G-CSF (www.rndsystems.com).
1.3.1. Principais factores de mobilização
Existem várias moléculas, produzidas naturalmente no organismo, capazes de induzir a mobilização de CPH, nomeadamente o Granulocyte-Colony Stimulating
Factor (G-CSF), o Granulocyte Macrophage – Colony Stimulating Factor (GM-CSF), a
interleucina-13 (IL-13), a IL-18 e o SCF.
O factor mais utilizado na mobilização é o G-CSF, que aumenta em mais de 10 vezes o número de leucócitos em circulação, e em até 50 vezes o número de CPSP.5
Apesar de identificado inicialmente como indutor da diferenciação de progenitores em granulócitos, este factor tem uma acção pleiotrópica, por mecanismos não inteiramente identificados. Alguns autores defendem que a mobilização de CPSP pelo G-CSF ocorre devido à degradação do SDF-1, expresso pelas células de estroma medular, por enzimas produzidas pelos neutrófilos, em particular a elastase.10
A interacção entre o SDF-1, e o seu receptor, o CXCR4 está envolvida, tanto na mobilização induzida, como no normal tráfico de células progenitoras. As células progenitoras residentes na medula exprimem níveis significativamente superiores de CXCR4 do que as células mobilizadas para a periferia.11 Moléculas antagonistas do
CXCR4 têm sido estudadas como agentes de mobilização, o plerixafor (AMD3100) em 39
Introdução particular tem apresentado resultados promissores quando utilizado em conjunto com o G-CSF, em maus mobilizadores.12
Além de ser um eficaz mobilizador de CPH, o G-CSF provoca menos efeitos secundários do que outros agentes, podendo no entanto ocorrer náuseas, tonturas, dores nos ossos e em casos raros efeitos mais graves.13 A mobilização de CPH é
efectuada pela injecção subcutânea diária de G-CSF, cerca de 10μg/Kg/dia, podendo este ser administrado em casa pelo próprio doente ou dador.
1.3.2. Colheita por aférese
Apesar do enorme aumento do número de CPSP após mobilização, estas continuam a ser uma população minoritária (normalmente inferior a 1% do total de leucócitos), pelo que a colheita é realizada por aférese, que permite fazer uma colheita selectiva de células. A colheita do enxerto hematopoiético por aférese é normalmente iniciada ao quinto dia de mobilização, repetindo-se nos dias seguintes, se necessário, até ser atingida a dose celular pretendida. A aférese é normalmente realizada em separadores celulares automáticos de fluxo contínuo, que separam a fracção celular de interesse em função da sua densidade, sendo os restantes componentes sanguíneos devolvidos ao próprio dador/doente.
Ao contrário da colheita de MO, qualificada como um acto cirúrgico e efectuada num bloco operatório, normalmente sob anestesia geral, a aférese pode ser realizada numa sala de colheitas normal, não necessitando de condições de esterilidade específicas. A aférese demora cerca de 3 horas e é um procedimento pouco invasivo, podendo os dadores/doentes retomar a actividade normal pouco tempo após o procedimento, ao passo que para a colheita de um volume de MO que contenha células suficientes para um transplante, é necessário efectuar múltiplas aspirações (cerca de 2 a 5 ml cada), pelo que a intervenção pode ter uma recuperação algo dolorosa.
Introdução
2. Imunobiologia do transplante
O enxerto hematopoiético, colhido por aférese, é constituído por uma grande variedade de populações celulares, capazes de desenvolver uma resposta imune competente.
2.1. Composição celular do enxerto hematopoiético
As populações mais importantes, e as mais estudadas, no contexto do transplante de células progenitoras hematopoiéticas (TPH) são as células CD34+, os linfócitos T, as células NK, as células NKT e as células dendríticas (DC dendritic cells).
O linfócito T é a principal célula efectora do sistema imunitário e, consequentemente, a mais estudada. Esta população é caracterizada pela expressão de CD3 e receptores de células T (TCR) na membrana, que através da ligação a moléculas de HLA das células apresentadoras de antigénios (APC), reconhecem péptidos apresentados por estas. O TCR é incapaz de reconhecer moléculas solúveis, estando a acção dos linfócitos T restrita a HLA. Os linfócitos T dividem-se em duas grandes subpopulações, os linfócitos T auxiliares (Th) e linfócitos T citotóxicos (Tc).14
Os linfócitos Th caracterizam-se pela expressão de CD4, molécula que reconhece a região não polimórfica de moléculas HLA classe II, apenas expressas pelas APC. São designadas auxiliares porque não actuam directamente nos alvos do sistema imunitário, mas coordenam e potenciam a acção de elementos efectores.
Esta subpopulação produz uma grande variedade e quantidade de citocinas, que vão coordenar a resposta imunitária, pela atracção e estimulação de determinadas células efectoras, e inibição de outras.15 Consoante o perfil de citocinas segregadas e,
consequentemente o tipo de resposta desencadeado, as células Th podem ser divididas em Th1 e Th2.
As células Th1 desencadeiam uma resposta do tipo celular, ou tipo 1, caracterizada pela estimulação do potencial citotóxico e proliferação de macrófagos,
Introdução células NK e linfócitos Tc. As células Th1 produzem interferon-γ (IFN-γ), factor de necrose tumoral β (TNF-β) e IL-2. O IFN-γ estimula a produção de IL-12 pelas células dendríticas e macrófagos; esta citocina por sua vez estimula a produção de IFN-γ por linfócitos T. A produção de IFN-γ vai também inibir a produção de IL-4 (característica das Th2), funcionando como regulação autócrina na manutenção de um perfil Th1.
As células Th2 desencadeiam uma resposta do tipo humoral, ou tipo 2, caracterizada pela activação de linfócitos B e consequente produção de anticorpos. Estas células produzem caracteristicamente IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13. A IL-4 vai estimular a produção de citocinas Th2 (incluindo a própria) e a IL-10 vai inibir a produção citocinas, particularmente IL-2 e IFN-γ. A produção de IL-10 vai também diminuir a secreção de citocinas pelas Th2, mas estimula a produção de anticorpos pelos plasmócitos.16
Os linfócitos T reguladores ou Treg compõem uma população heterogénea de linfócitos, cuja principal função é atenuar ou potenciar a resposta imunitária.17,18
Os linfócitos Tc expressam caracteristicamente CD8, que reconhece a região não polimórfica de moléculas HLA classe I, molécula expressa por quase todas as células do organismo.
Após processarem antigénios internos, as APC vão apresentá-los através de moléculas HLA classe I, pelo que os linfócitos Tc respondem principalmente a auto-antigénios.
As células NK (Natural Killer) são uma população linfócitária distinta, que apresenta uma extensa acção citolítica e funções na regulação da hematopoiese e da resposta imune.19
Estas células representam ente 10 e 30% dos linfócitos em circulação, expressam caracteristicamente CD56 e não expressam CD3 nem TCR.20 A
intensidade de expressão de CD56 permite identificar duas subpopulações distintas. As células com menor intensidade de expressão são denominadas células NK CD56dim, ou NKdim, sendo as mais frequentes em circulação (cerca de 90%), as
Introdução restantes 10% são denominadas células NK CD56bright, ou NKbright, devido à expressão
de elevados níveis daquela molécula. As subpopulações bright e dim não só diferem nos níveis de expressão de CD56, como apresentam funções biológicas distintas.21
Os principais alvos desta população são células infectadas com patogénios intracelulares, em especial vírus, e células tumorais.22 O reconhecimento de alvos
pelas células NK é independente de antigénios apresentados por moléculas HLA; no entanto, as moléculas HLA actuam como inibidores da activação das células NK. As células tumorais apresentam normalmente uma diminuição da quantidade de moléculas HLA expressas, tornando-se assim potenciais alvos para a lise pelas células NK. Neste contexto as células NK têm um papel complementar aos linfócitos Tc cuja acção está restrita a células com um número de moléculas HLA normal, exprimindo antigénios anormais.
Se por um lado as células NK conseguem lisar células infectadas e tumorais, desempenhando um importante papel na defesa inata, através das citocinas produzidas conseguem estimular e polarizar a resposta dos linfócitos T, estabelecendo uma ligação entre resposta inata e imunidade adaptativa.23 Estudos recentes
demonstraram que as células NK podem assumir funções de APC, reforçando assim a importância da sua interacção com os linfócitos T no desenvolvimento de uma resposta imunitária.24
As células NKT são um grupo heterogéneo de células T, que expressa um TCR semi-invariante restrito para CD1d, que é uma molécula não polimórfica, relacionada com HLA classe I, expressa por várias APC, responsável pela apresentação de antigénios lipídicos, tanto endógenos como exógenos.25,26 Mesmo quando isoladas do SCU, as células NKT apresentam um fenótipo característico de células activadas ou de memória, o que sugere que respondem principalmente a antigénios endógenos na periferia.27
As células NKT apresentam características comuns a células NK e linfócitos T, nomeadamente a expressão de TCR, CD3, CD56. 25
Introdução Após activação, estas células produzem grandes quantidades de citocinas, do tipo 1 e do tipo 2, estimulando células envolvidas tanto na resposta inata como adaptativa, estabelecendo uma ligação entre os dois tipos de resposta.28 Um dos modelos propostos para a regulação destas células defende que o perfil de citocinas produzidas pelas células NKT é função das citocinas existentes no microambiente e da afinidade do seu TCR para o ligando de activação.24 Esta população desempenha um
papel muito importante na indução de tolerância, desenvolvimento de autoimunidade e vigilância antitumoral. 28
As DC consistem num grupo heterogéneo de APC profissionais, especializadas no processamento e apresentação de antigénios, com capacidade de estimular directamente linfócitos T näive, assumindo assim um papel crucial no desenvolvimento de uma resposta imunológica (Figura 7). Além de activar os linfócitos, as DC polarizam o tipo de resposta (Th1 ou Th2) desencadeada e conseguem “dirigir” os linfócitos para a origem do sinal inflamatório, permitindo uma resposta específica para órgãos.29
Figura 7 – Polarização da resposta imune pelas células dendríticas (adaptado de www.accp.com).
Introdução As DC tanto podem apresentar antigénios internos, através das moléculas HLA classe I, como antigénios externos, através de moléculas HLA classe II. Esta capacidade, associada à expressão de níveis variáveis de moléculas co-estimulatórias, permite às DC induzir uma resposta imunitária ou tolerância, assumindo um papel central na manutenção do equilíbrio imunológico.30
As DC podem ser divididas em duas grandes subpopulações, as DC mielóides (mDC) ou DC1, e as DC plasmocitóides (pDC) ou DC2 que apresentam várias diferenças estruturais e funcionais.
2.2. Doença enxerto contra hospedeiro, efeito enxerto contra tumor e imunovigilância
O TPH alogénico consiste na substituição do sistema imuno-hematopoiético do doente pelo de um dador, levando a coexistência de duas linhas celulares distintas.
Sendo a principal função dos linfócitos Tc a identificação e destruição de células não-próprias, caso haja incompatibilidade de HLA entre o dador e o receptor, as células podem ser identificadas como patogénicas. Mas, mesmo existindo compatibilidade HLA pode ocorrer o reconhecimento das células do dador pelos linfócitos do receptor e das células do receptor pelos linfócitos do dador. Se os linfócitos do receptor reconhecerem o aloenxerto como não próprio pode ocorrer a rejeição do enxerto. Caso os linfócitos do enxerto reconheçam as células do receptor como estranhas, principalmente por acção das APC do receptor, pode ocorrer doença enxerto contra o hospedeiro (GVHD graft versus host disease).31 A GVHD é uma complicação importante após o alotransplante, sendo uma das principais causas de mortalidade do mesmo. No entanto, pode ocorrer uma reacção semelhante à GVHD em alguns autotransplantes.32
Classicamente nos primeiros 100 dias após o transplante e por vezes na primeira semana pode surgir uma GVHD de desenvolvimento rápido. Apesar de variar entre indivíduos, atinge principalmente a pele e mucosas, o fígado e o tracto
Introdução gastrointestinal. Devido ao rápido desenvolvimento e gravidade das lesões é denominada GVHD aguda (aGVHD), podendo ser letal se não tratada. A idade representa um importante factor de risco, tendo doentes mais velhos uma maior probabilidade de ocorrência de GVHD.
A patofisiologia da aGVHD, estabelecida através de modelos animais, está dependente do tratamento. A quimioterapia e a radioterapia provocam uma reacção inflamatória, com uma grande produção de citocinas, potencialmente responsáveis pela activação de linfócitos T autoreactivos.33 As APC do receptor, resistentes ao
tratamento, são capazes de desencadear aGVHD devido à apresentação de autoantigénios aos linfócitos Tc transplantados34 (Figura 8).
Figura 8 – Diagrama da patofisiologia da doença enxerto contra hospedeiro (GVHD) (Adaptado de www.ojrd.com).
A especificidade dos alvos da aGVHD está associada aos locais de maior densidade de APC e de contacto com microrganismos (capazes de activar as DC). As DC destes locais são particularmente eficazes em dirigir linfócitos para o seu lugar de maturação, podendo sequestrar células T aloreactivas da periferia para locais específicos.35
Introdução A partir dos 100 dias, e por vezes meses após o transplante, pode surgir uma GVHD de desenvolvimento mais lento, com um espectro mais largo de acção, designada de GVHD crónica (cGVHD). O tratamento passa igualmente pela imunossupressão. A apresentação clínica da cGVHD é semelhante a várias doenças autoimunes. Esta forma de GVHD pode surgir como progressão da forma aguda ou de novo.33 A patofisiologia desta doença não está completamente esclarecida, mas
parece estar associada à apresentação de autoantigénios por DC de origem do dador.36
A depleção dos linfócitos dos enxertos pré transplante, com o fim de minimizar a ocorrência e severidade da GVHD, além de aumentar a taxa de falências de enxerto pode levar a um aumento na taxa de recaída, constituindo um dos argumentos de que os linfócitos do dador são capazes de eliminar células tumorais, denominado efeito enxerto contra tumor (GVT graft versus tumor). Estratégias para maximizar o efeito GVT sem ocorrência de GVHD têm sido desenvolvidas.37 Os dois fenómenos
partilham no entanto grande parte da sua biologia, pelo que são difíceis de separar.38
A infusão de linfócitos do dador (DLI Donor Lymphocyte Infusion) após o TPH tem sido utilizada quer como tratamento de recaídas quer como tentativa, em casos seleccionados, de diminuição da probabilidade de recaída. O sucesso da DLI é dependente da doença, de acordo com a imunogenicidade das células tumorais e capacidade das APC do receptor em apresentar antigénios apropriados (Figura 9).39,40
Figura 9 – Magnitude do efeito enxerto contra tumor inferido pela taxa de resposta à DLI, por doença (adaptado de Hart et al., 2007).
Introdução Estudos demonstraram que células NK aloreactivas são capazes de eliminar DC e linfócitos T do hospedeiro, minimizando a ocorrência de GVHD e rejeição do enxerto, e de eliminar células tumorais (Figura 10). Protocolos para a utilização de células NK aloreactivas pré-transplante, de modo a permitir aumentar a dose de linfócitos T infundida (e portanto de GVT), prevenindo a ocorrência de GVHD, estão a ser desenvolvidos.41
Uma resposta do tipo 1 é a mais adequada para a eliminação de células tumorais, pelo que o balanço entre o número de células Th1 e Th2 infundidas, determinado pela quantificação de células produtoras de IFN-γ e IL-4 respectivamente, poderá afectar o sucesso do transplante. Por outro lado um ambiente inflamatório no doente pós transplante é favorável ao desenvolvimento de GVHD.42
Figura 10 – Potencial benefício do transplante de células NK aloreactivas (adaptado Ruggeri et al., 2008).
As células NKT, através da produção de IFN-γ e polarização de uma resposta do tipo 1, exercem um importante efeito antitumoral. Estudos demonstraram que estas células podem eficazmente mediar a eliminação de vários tipos de tumor. Paradoxalmente podem também eliminar linfócitos Tc específicos para tumores, facilitando recaídas.27
Introdução As DC além de polarizarem o tipo de resposta desencadeado pelos linfócitos T, como principais coordenadoras da resposta imune, assumem um papel central na defesa antitumoral, sendo capazes de desencadear GVT e GVHD, potenciar células activadas ou induzir anergia e tolerância.~
3. Condicionamento dos doentes
A combinação de quimioterapia e TPH, com ou sem radioterapia, é um tratamento potencialmente curativo para várias doenças onco-hematológicas. Este tratamento administrado antes da infusão das CPH do dador, com objectivo de eliminar as células tumorais, é globalmente designado por regime de condicionamento. São também administrados agentes imunossupressores para minimizar a rejeição do enxerto e a ocorrência de GVHD.43
3.1. Condicionamento mieloablativo
O TPH foi desenvolvido para acelerar a recuperação da severa mielossupressão induzida em doentes pelo tradicional condicionamento com altas doses de quimioterapia, superiores ao limite de toxicidade para a MO, sendo por isso designado condicionamento mieloablativo (MA). Apesar de reduzir a taxa de recaída, esta combinação não altera a sobrevivência global dos doentes transplantados devido ao aumento do número de mortes associadas ao tratamento.44 Devido à elevada toxicidade, o condicionamento MA é pouco tolerado por doentes com idades superiores a 55 anos, receptores de um segundo transplante ou doentes com co-morbilidades, pelo que exclui uma grande parte dos doentes oncológicos.43
O controlo da doença pelo TPH está dependente de vários factores, nomeadamente a carga tumoral, a intensidade do condicionamento e a fonte e composição do enxerto hematopoiético. O acumular de dados clínicos demonstrou que em muitas doenças o principal benefício do TPH é devido ao efeito GVT, notoriamente
Introdução exemplificado pela indução de remissão em doentes em recaída através da DLI, o menor risco de recaída em doentes com GVHD e o aumento do risco de recaída e persistência de doença residual em receptores de enxertos depletados de células T.44
3.2. Condicionamento não mieloablativo
O reconhecimento da importância do efeito GVT levou ao desenvolvimento do condicionamento de intensidade reduzida ou não mieloablativo (NMA), de menor toxicidade.45 Este tipo de condicionamento induz um estado de imunossupressão, com
o objectivo de aumentar a tolerância do receptor para o enxerto, permitindo o estabelecimento da hematopoiese num estado de quimerismo misto, e através da DLI eliminar a doença residual e estabelecer quimerismo completo do dador (Figura 11).46
Devido à menor toxicidade, o desenvolvimento de condicionamentos NMA permitiu alargar a acessibilidade do TPH a doentes mais velhos ou com mau estado geral.31
Apesar da redução na toxicidade, o condicionamento NMA está associado a um maior risco de recaída da doença, o que afecta o potencial benefício na sobrevivência.47
A escolha do tipo de condicionamento vai depender da idade e condição física do doente, do tipo de doença e da disponibilidade de dadores capazes de exercer aloreactividade (e consequentemente GVT) 40
Figura 11 – Mecanismo de acção do condicionamento não mieloablativo seguido de infusão de linfócitos do dador (DLI) (www.edoc.hu-berlin.de).
Introdução
4. Avaliação dos doentes pós-transplante
4.1. Avaliação hematológica
O arranque hematológico do doente após o transplante, que traduz o estabelecimento da hematopoiese, é definido pelo tempo em dias até à obtenção de valores de neutrófilos em circulação superiores a 0,5x109/L (D500 Neut) e de
plaquetas superiores a 20 x109/L (D20 PLT) durante três e sete dias consecutivos sem
recurso a transfusões, respectivamente. Para a recuperação imunológica não existem marcadores globais; no entanto, alguns autores correlacionaram o sucesso do TPH com o total de linfócitos (ALC) em circulação após transplante.48,49 O tempo até à
obtenção de contagens de ALC em circulação superiores a 0,5x109/L (D500 linf) e o
valor de ALC no 15º dia após transplantes (ALC d15) podem ser utilizados como indicadores da recuperação imunológica.
4.2. Avaliação clínica
Os principais parâmetros analisados na avaliação do resultado do TPH são a ocorrência e grau de GVHD, o tempo para o arranque hematológico, a progressão livre de doença (DFS), considerada como a sobrevivência em remissão completa contínua, a mortalidade associada ao transplante (TRM), definida como as mortes ocorridas em remissão completa, normalmente por infecção ou GVHD, e a sobrevivência global (OS) que traduz o número de doentes que se encontram vivos num dado período de tempo.50
Consoante os tecidos atingidos e a gravidade da doença, a aGVHD é dividida em 4 graus, sendo os graus I e II doença ligeira e moderada, e os graus III e IV doença severa a potencialmente fatal. A cGVHD divide-se em doença limitada ou extensa.
Introdução
5. Influência da composição do enxerto no sucesso do transplante
O tipo de condicionamento vai influenciar o resultado do transplante, uma vez que determina o estado de imunocompetência do receptor.
Apesar do elevado número de células efectoras, em particular linfócitos T maduros, o TPH com CPSP mobilizadas com G-CSF está normalmente associado a uma taxa de aGVHD surpreendentemente baixa, segundo alguns estudos até inferior a TPH com enxertos de MO.51 Esta observação levantou a hipótese de o G-CSF exercer
um efeito imunomodulador nas células colhidas.52 5.1. Efeito imunomodulador do G-CSF
O G-CSF tem um potente efeito na modulação da resposta imune, por vários mecanismos complementares. A administração de G-CSF leva a um aumento do número de linfócitos Tregs e de células produtoras de IL-10, à indução de DC tolerogénicas e desvio do balanço Th1/Th2 para uma resposta do tipo 2. A acção conjunta desta modulação traduz-se na supressão da actividade dos linfócitos T (Figura 12).53,54,52 Esta imunomodelação é provavelmente responsável pela taxa de
GVHD inferior ao inicialmente esperado nos TPH com CPSP.
O G-CSF induz a mobilização preferencial de DC2, sendo o número de DC1 em circulação pouco afectado, o que promove a manutenção de um perfil Th2.54,55
Apesar do desenvolvimento da aGVHD estar associado a uma resposta do tipo 1, o paradigma Th1/Th2 não é aplicável a todos os aspectos de aloreactividade.56
Introdução
Figura 12 – Indução da supressão de linfócitos T por acção do G-CSF (Rutella et al., 2007).
5.2. Influência da composição celular
Apesar da imunomodulação induzida pela mobilização com G-CSF, as células transplantadas continuam a ser competentes. Como tal vários grupos estudaram a interacção entre células infundidas e o resultado do TPH.
A relação entre a dose de células CD34+ infundida e o arranque hematológico é provavelmente a mais estudada, havendo no entanto estudos para a relação entre linfócitos56, células NK57, DC58 e outras populações presentes no enxerto e os
restantes indicadores de sucesso do transplante.
Os dados disponíveis na literatura são muitas vezes contraditórios, com alguns grupos a descreverem um efeito protector associado a altas doses de uma população e outros grupos a descreverem um efeito adverso. Uma explicação possível será diferenças no condicionamento e no estado de activação das células do enxerto.
A dose mínima de células CD34+ capaz de reconstituir eficazmente a hematopoiese é consensualmente aceite como 2x106 células/Kg de peso do
receptor.5,60 A definição de uma dose máxima recomendada origina mais controvérsia.
Após vários estudos com doses muito altas de CD34+ não terem demonstrado uma 53
Introdução melhoria na sobrevivência, a dose utilizada no contexto de alotransplante pela maioria dos centros foi fixado entre 4 e 5x106 células/kg. Neste tipo de estudo é difícil separar a influência das células CD34+ da acção das outras populações presentes no enxerto. Os enxertos de CPSP podem conter até 10 vezes mais linfócitos T e 19 vezes mais células NK que colheitas de medula, o que parece afectar o sucesso do transplante, desenvolvimento de GVHD e GVT, e até a sobrevivência.59
Apesar do efeito dos linfócitos T estar bem demonstrado, uma correlação entre o número de células infundidas e o sucesso do transplante nem sempre é evidente. O papel das células NK na transplantação ainda não está completamente esclarecido, por um lado têm a capacidade de eliminar células tumorais, contribuindo para o efeito GVT, e eliminar APC do receptor, prevenindo a aGVHD.61 Por outro lado alguns
estudos apontam para uma acção prejudicial das células NK em casos particulares de alotransplantes.62 As células NKT e as DC, como principais iniciadores e reguladores
da resposta imune, são igualmente candidatas a influenciarem o resulta do TPH. Uma vez que cada população celular presente no enxerto parece afectar (quer positiva, quer negativamente) o resultado do TPH, e que estas populações são altamente interactivas, necessitando umas das outras nos processos de activação e regulação, a definição da dose de cada população a infundir, que resulte num maior sucesso do transplante, é de grande importância. Sendo o estado de imunossupressão diferente nos doentes com um condicionamento MA ou NMA, a interacção entre células infundidas e resultado do TPH pode ser diferente nos dois casos, e consequentemente a dose ideal de uma dada população ser diferente consoante o tipo de condicionamento a que o doente foi submetido.
Objectivos Este estudo teve como principais objectivos:
1. Avaliar a composição celular de enxertos de progenitores hematopoiéticos e determinar a sua influência no sucesso do TPH alogénico.
2. Avaliar a utilidade do ratio entre populações na avaliação do sucesso do TPH. 3. Comparar o impacto da composição do enxerto na resposta ao TPH dos doentes com um condicionamento MA e NMA.
4. Avaliar a influência da dose infundida de infócitos T produtores de IFN-γ e IL-4 no arranque hematológico dos doentes.
Material e métodos
1. População em estudo
Para a realização deste estudo foram analisados os enxertos de CPSP colhidos a 78 dadores adultos saudáveis no IPO – Porto entre Maio de 2003 e Dezembro de 2006. Após o transplante, os respectivos doentes transplantados foram acompanhados, e a sua evolução clínica avaliada. As principais características dos dadores e dos doentes estão apresentadas na Tabela 1.
Tabela 1 – Características dos dadores e doentes
Doentes Dadores Género, nº masculino/feminino 39/39 46/32
Idade (anos), mediana (intervalo) 45 (17-66) 43 (19-75) Peso (kg), mediana (intervalo) 70 (42-96) 71 (43-110) Diagnóstico, nº (%) LMA
20 (26) LNH 16 (21) LLA 10 (13) MM 6 (8) SMD 5 (6) LMC 5 (6) DH 4 (5) AA 4 (5) LLC 2 (3) L bifenotípica 2 (3) Outros* 4 (5) Condicionamento mieloablativo 26 não mieloablativo 52
* inclui síndrome de Sézary, HPN e metaplasia miéloide.
1.1. Mobilização e colheita dos dadores
Os dadores foram mobilizados com a injecção diária de G-CSF (Filgrastrim®, Amgen), numa dose média de 13μg/kg/dia. A colheita de CPSP foi iniciada ao quinto dia de mobilização, tendo a maioria dos dadores, 57 (73%), obtido um número de células suficiente em apenas uma colheita. Dos restantes dadores, 18 (23%) necessitaram de dois dias de colheita e 3 dadores (4%) precisaram de três dias de colheita para obter a dose alvo de células CD34+.
Todos os dadores tinham um genótipo HLA compatível com o doente, e excepto em um caso, todos eram familiares.
Material e métodos
1.2. Avaliação dos doentes
Os dados da avaliação clínica dos doentes foram obtidos pelo Serviço de Transplante de Medula Óssea (STMO) do IPO – Porto. Aos doentes foi colhido sangue periférico diariamente após o TPH, o que permitiu a determinação do arranque hematológico, definido como o tempo em dias até ao primeiro de três dias consecutivos com contagens superiores a 500 neutrófilos/μl (D500 Neut) e o primeiro de sete dias consecutivos com contagens superiores a 20x103 plaquetas/μl (D20 PLT),
sem suporte transfusional. A recuperação de linfócitos, definida como o tempo em dias até à obtenção de contagens superiores a 500 linfócitos/μl (D500 linf), e a contagem de linfócitos no 15º dia após transplante (ALC d15) foram igualmente estudadas.
A incidência e o grau da aGVHD e extensão da cGVHD foram determinados de acordo com os critérios adoptados pela instituição.
A DFS e OS dos doentes foram calculadas como o tempo, em dias, desde o transplante até à ocorrência de recidiva ou morte, respectivamente.
2. Avaliação da colheita de células progenitoras hematopoiéticas
2.1. Avaliação hematológica
A concentração de leucócitos em cada colheita de CPSP foi determinada com um contador hematológico automático, sysmex XE-2001 ou XT-1800-i. O número total de células no enxerto foi calculado pelo produto da concentração pelo volume colhido.
A partir do número de células totais infundidas e da percentagem, calculada por imunofenotipagem e citometria de fluxo, foi calculada a dose de cada população presente no enxerto infundida.
Material e métodos
2.2. Imunofenotipagem
2.2.1. Marcação de superfície
Para a imunofenotipagem utilizaram-se anticorpos monoclonais conjugados com os fluorocromos isotiocianato de fluoresceína (FitC), ficoeritrina (PE), Peridinin
chloropyll protein (PerCP), ficocianina (PC5) e aloficocianina (APC).
Para cada população ou subpopulação estudada foi elaborado um painel de anticorpos apropriado. A combinação e volume de anticorpos utilizados estão apresentados na Tabela 2.
Para a marcação, 100 μL de amostra (com concentração entre 20 e 50x106/ml)
foram incubadas com os respectivos anticorpos durante 15 min no escuro e à temperatura ambiente, de modo a permitir a ligação do anticorpo ao antigénio. De seguida os eritrócitos foram lisados pela incubação com 2 ml de FACS Lysing
solution® (BD Biosciences) durante 10 min nas condições anteriores. A amostra foi
centrifugada a 1500 rprm durante 5 min, o sobrenadante rejeitado (para remover o excesso de anticorpo, plaquetas e restos celulares) e as células ressuspensas em 300 μL de FACS Flow® (BD Biosciences).
Tabela 2 – Painel de anticorpos utilizado na caracterização do enxerto
População alvo FitC Volume (μL) PE Volume (μL) Perc-P Volume (μL) APC Volume (μL)
C – - - - - Células CD34+ CD45 10 CD34 10 - - Linfócitos T CD4 5 CD3 5 CD8 10 CD45 5 NK e NKT CD16 5 - CD56* 4 CD3 3 DC Lin** 25 CD123 10 HLA-DR 10 CD11c 4 * conjugado com PC5 ** CD3 (5µl), CD14 (5µl), CD19 (5µl), CD56 (10µl) 63
Material e métodos
2.2.2. Aquisição e análise
Após a marcação, as amostras foram adquiridas num citómetro de fluxo (FACSCalibur, BD Biosciences) com dois lasers, um de árgon e um de néon. Foi utilizado o software Cell Quest Pro. Para a análise de células CD34+, NK, NKT e DC foram adquiridos 150.000 eventos e para a análise de linfócitos T foram adquiridos apenas 30.000 eventos, uma vez que constituem uma população muito frequente.
Com excepção das DC, cada população foi analisada e a sua proporção calculada, com o programa Cell Quest Pro. As DC foram analisadas e quantificadas com o programa Paint-a-Gate.
As células CD34+ foram quantificadas de acordo com as directrizes da
International Society for Hematotherapy and Graft Engineering (ISHAGE). Primeiro
seleccionam-se as células CD45+ (Figura 13A), de seguida fez-se um gate alargado nas células CD34+ (Figura 13B), seleccionando-se por fim as células com intensidade de expressão de CD45+ (Figura 13C) e dimensão características (Figura 13D).
Material e métodos
A
BC D
Figura 13 – Análise das células CD34+ segundo as indicações da ISAHGE, (A) selecção das células positivas para CD45; (B) selecção das células positivas para CD34; (C) selecção das células com expressão caracteristica de CD45; (D) selecção das células com dimensão característica.
Os linfócitos T foram seleccionados através de um gate na região característica no plot CD45 vs side scatter (SSC) (Figura 14A), seguida da quantificação de células CD3+ (Figura 14B). Para diferenciar os linfócitos Th e Tc, foram seleccionadas as células CD4+ (Figura 14C) e CD8+ (Figura 14D) respectivamente.
Material e métodos
A B
C D
Figura 14 – Análise das linfócitos T, (A) selecção das células positivas para CD45; (B) selecção das células positivas para CD3; (C) selecção das células positivas para CD3 e CD4; (D) selecção das células positivas para CD3 e CD8.
Para a análise de células NK foi efectuado um gate na região característica dos linfócitos no plot FSC vs SSC (Figura 15A), seleccionaram-se as células negativas para CD3 (Figura 15B). De acordo com a intensidade de fluorescência do CD56 as células foram divididas em células NK CD56bright e CD56dim (Figura 15C). Foi realizado
um gate em cada subpopulação e calculado o número de células positivas para CD16 (Figuras 15D e 15E).
Material e métodos A B C D E
Figura 15 – Análise das células NK, (A) selecção da região dos linfócitos; (B) selecção das células negativas para CD3; (C) selecção das células CD56dim e CD56bright; (D) selecção das células CD56dim positivas para CD16+; (E) selecção das células CD56bright positivas para CD16.
As NKT foram analisadas a partir da região dos linfócitos no plot FSC vs SSC (Figura 16A), seleccionando as células simultaneamente positivas para CD3 e CD56 (Figura 16B).
Material e métodos
A
B
Figura 16 – Análise das células NKT, (A) selecção da região dos linfócitos; (B) selecção das células positivas para CD3 e CD56.
As DC foram identificadas pelas suas propriedades de FSC e SSC (Figura 17A), positividade para HLA-DR e negatividade para antigénios de linhagem (Figura 17B). No plot CD123 vs CD11c foram identificadas as DC1 (CD123-CD11c+) e as DC2 (CD123+CD11c-) (Figura 17C).
Figura 17 – Análise das DC, (A) selecção da região característica; (B) selecção das células negativas para linhagem e positivas para HLA-DR; (C) selecção das células positivas para CD11c ou positivas para CD123.
A
B
A
B
C
Material e métodos
3. Detecção e quantificação de citocinas intracelulares
A detecção e caracterização do perfil de citocinas produzidas foram realizadas em células mononucleares (MNC) isoladas da citaférese dos dadores, congeladas no dia de colheita e posteriormente descongeladas. Num grupo independente de 16 dadores saudáveis de CPSP foi realizado o mesmo ensaio, tendo as células sido estimuladas a fresco, sem separação prévia, no dia da colheita.
3.1. Isolamento e criopreservação das MNC
A solução de congelação foi preparada pela diluição de DMSO em albumina (numa concentração de 20% de DMSO) e mantida no frigorífico. Para isolar as MNC diluiu-se a amostra com RPMI 1:6 (para uma concentração entre 20 e 50x106/ml) e
dividiu-se por 2 tubos de fundo redondo com cerca de 5 ml de Ficoll (Lymphoprep®, Axis Shield). Após 20 min de centrifugação a 1600 rpm foi recolhida a camada de MNC, que se encontra entre o plasma e o Ficoll, para um tubo de fundo cónico. Adicionou-se cerca de 12 ml de RPMI, centrifugou-se 10 min a 1100 rpm, o sobrenadante foi rejeitado, para remover restos de ficoll e plasma, e as células ressuspensas em albumina, ajustando a concentração. Para a criopreservação retiraram-se 0,9 ml de células para um criotubo, adicionou-se igual volume da solução de congelação (perfazendo uma concentração final de 10% de DMSO) e colocou-se em azoto líquido.
3.2. Descongelação das amostras
Cada amostra foi retirada do azoto e colocada no banho entre 37º e 39ºC, agitando-se até a maioria da amostra descongelar. Lavou-se com RPMI à temperatura ambiente e centrifugou-se durante 10 min a 1100 rpm, rejeitou-se o sobrenadante e as células foram ressuspensas em 1 ml de albumina. Determinou-se a viabilidade e a concentração.
Material e métodos
3.3. Determinação da viabilidade
A viabilidade das células foi determinada pela capacidade de exclusão de um corante tóxico, o azul de tripano. As células viáveis apresentam membranas intactas, capazes de impedir a entrada do corante, permanecendo incolores, enquanto que as células mortas ou não viáveis são incapazes de o fazer, apresentando-se coradas de azul.
Diluiu-se a amostra em FACS Flow®, retiraram-se 20 μl de amostra diluída aos quais se adicionou igual volume de azul de tripano. Preparou-se a câmara de Neubauer, pipetaram-se 10 μl da diluição anterior e contou-se no microscópio o número de células viáveis (transparentes) e não viáveis (azuis). A viabilidade da amostra foi determinada pela proporção de células viáveis.
3.4. Estimulação celular
As células foram ressuspensas em meio RPMI completo (cRPMI) numa concentração de 6x106/ml e mediram-se 170μL da suspensão para cada um de 4
poços (poços 1 a 4) de uma placa de 96 poços de fundo em V (Nunc®), de modo a obter um total de 1x106 células por poço.
Nos poços 1 e 2 adicionou-se 1 μl de anti-CD28, 1 μl de PMA e 1 μl de ionomicina e a placa foi incubada numa estufa a 37ºC e atmosfera com 5%CO2
durante uma hora, ao fim da qual foram adicionados 2 μl de BFA aos poços 1, 2 e 3. A placa foi incubada nas condições anteriores por 5 horas e colocada no frigorífico durante a noite.
Na manha seguinte a placa foi centrifugada 5 min a 1400 rpm, o sobrenadante rejeitado, as células lavadas com 180 μl de cRPMI frio e ressuspensas em 180 μl de PBS+0.02%EDTA frio e colocadas na estufa (37ºC, 5%CO2) durante 10 min. As
células foram de novo lavadas com 180 μl de cRPMI, centrifugadas e os eritrócitos
Material e métodos lisados por incubação com 200 μl de solução de lise (BD Biosciences) durante 10 min no escuro.
Após nova centrifugação e rejeição do sobrenadante as células foram ressuspensas em 100 μl de cRPMI. Retiraram-se 40 μl do poço 1 para um poço vazio (poço 5) e se os anticorpos de superfície, Nos poços 1,2 e 3 adicionaram-se 3 μl de CD3 APC e no poço 5 a marcação de linfócitos T (Tabela 2), e incubou-adicionaram-se durante 15 min no escuro à temperatura ambiente. As células foram centrifugadas, os poços 1, 2 e 3 ressuspensos em 100 μl de solução A (Dako®) e os poços 4 e 5 ressuspensos em 100 μl de cRPMI e incubou-se mais 15 min no escuro. Centrifugou-se de novo, ressuspenderam-Centrifugou-se os poços 1, 2 e 3 em 100 μl de solução B (Dako®) e adicionaram-se os anticorpos intracitoplasmáticos (10ul de anti IFN-γ e IL-4), os poços 4 e 5 foram ressuspensos em 100 μl de cRPMI e incubou-se por mais 15 min no escuro. Após nova centrifugação as células de cada poço foram transferidas para tubos de citómetro em 300 μl de Cell Fix®.
3.5. Preparação dos reagentes
O cRPMI foi preparado pela adição de 10 ml de antibiótico/antimicótico 10x (Gibco) e albumina humana (Octapharma) numa concentração final de 20% a um frasco de RPMI com glutamax (Gibco 61870). O cRPMI foi armazenado no frigorífico.
Para a preparação da PMA (Sigma P8139), dissolveu-se 1mg de PMA em 2 ml de DMSO [0,5mg/ml], diluiu-se imediatamente em RPMI (1:10) [50μg/ml] e armazenaram-se aliquotas de 50 μl e 1 ml a -20ºC. Para a solução de trabalho, descongelou-se uma aliquota e ressuspendeu-se em RPMI (1:10) [5μg /ml].
Para a preparação da BFA (Sigma B6542), dissolveram-se 5mg de BFA em 1 ml de etanol puro [5mg/ml] e armazenaram-se aliquotas de 100 μl a -20ºC. Para a solução de trabalho, descongelou-se uma aliquota e ressuspendeu-se em cCRPMI (1:5) [1mg/ml = 1μg /μl].
