Avaliação in vivo

4.4.1 Animais

Foram utilizados camundongos swiss fêmeas, pesando entre 20 e 30 g, provenientes do Biotério Setorial do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal do Ceará (UFC). Os animais foram mantidos em condições padrão de acondicionamento, ou seja, 23-25°C com ciclo claro/escuro de 12h e alimentados com ração e água ad libitum. Cada grupo permaneceu em caixas de propileno, contendo de 1 a 5 animais por caixa.

4.4.2 Aspectos éticos

Os experimentos foram realizados somente após a aprovação do projeto no Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da UFC protocolada sob o CEUA nº 3040301118 (Anexo 1). A manipulação dos animais foi realizada de acordo com as diretrizes preconizadas pelo Conselho Nacional de Controle da Experimentação Animal (CONCEA). Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento e reduzir o número de animais usados nos ensaios. 4.4.3 Teste de dispersão das substâncias para administração in vivo

Para o ensaio de suspensão da ENSJ39 livre e encapsulada, para administração in vivo, foram usados os diferentes co-solventes: água, DMSO, polissorbato 80 e goma xantana em diferentes combinações e proporções (Quadro 4).

Quadro 4 - Teste de dispersão da ENSJ39 e dos lipossomas para administração in vivo em diferentes veículos.

AMOSTRA CÓDIGO DO TESTE DESCRIÇÃO PREPARO

ENSJ39

E1 _{Água para injeção} 4% de DMSO DMSO. Agitação em vortex por 3 min e sonicação por 5 Adição de água ao fármaco em pó e posteriormente min.

E2 _{Água para injeção} 5% de DMSO _{água. Agitação em vortex por 3 min e sonicação por 5 min.} Adição de DMSO ao fármaco em pó e posteriormente de E3 2,5% polissorbato 80 2,5% de DMSO

Água para injeção

Adição de DMSO ao fármaco em pó, posteriormente de água, seguido do polissorbato e ajuste do volume final com

água novamente. Sob agitação magnética. E4 30% de Diclorometano 2,5% polissorbato 80

Água para injeção

Adição de Diclometano ao fármaco em pó, posteriormente do polissorbato, evaporação do Diclorometano seguido da

água. Sob agitação magnética. E5

2,5% de DMSO 2,5% polissorbato 80 0,1% Goma Xantana Água para injeção

Adição de DMSO ao fármaco em pó, posteriormente de polissorbato, seguido do goma xantana e água. Sob

agitação magnética.

LE39 LE1 Água para injeção Agitação em vortex por 3 min

LBR LB1 Água para injeção Agitação em vortex por 3 min

Fonte: Próprio autor (2020).

Esses co-solventes já foram usados na literatura como tentativa de dispersão de outros compostos naftoquinônicos para administração in vivo (MUNDAY et al., 2007; PEREIRA et

4.4.4 Estimativa da DL50 da ENSJ39

A DL50 da ENSJ39 foi avaliada, via oral e intraperitoneal, em camundongos swiss. O protocolo adotado foi o Up and Down Procedure (OECD425, 2001) que permite estimar o valor da DL50 testando sequencialmente animais individuais, com a dose para cada animal sendo ajustada para cima ou para baixo. Esse protocolo avalia a sobrevida de cada animal após 48h de administração da primeira dose. Caso nesse período não haja morte, a um segundo animal será administrado dose superior. Porém, havendo a morte do primeiro animal após 48h, a um segundo animal será administrado dose inferior.

O aumento ou a diminuição da dose obedeceu ao fator de progressão fixo de 3,2 (proposto pelo Protocolo). Partindo desse fator de progressão, as doses previstas a serem administradas foram: 5,5; 17,5; 55; 175; 550; 1750 e 2000mg/kg.

O volume de administração foi padronizado em 200 µL. Na circunstância incomum de não ser possível uma dose única, a dose foi administrada em frações menores, por um período não superior a 24 horas, conforme previsto no protocolo (OECD, 2001).

Os dados de dose e morte/sobrevida de cada animal foram registrados no programa

AOT425StatPgm (Figura 19) ao longo do teste. O próprio programa indica a finalização do teste,

conforme os dados são plotados.

Figura 19 - Tela do software AOT425StatPgm, programa usado para calcular da DL50 estimada conforme o protocolo OECD425 (2001).

Por exemplo, o programa pode considerar o teste finalizado quando três animais consecutivos sobreviverem na maior dose limite (2000 mg/kg) ou quando ocorrerem cinco reversões1 em seis animais testados (este caso está exemplificado na Figura 19). Após finalizado o teste, o valor de DL50 é então calculado pelo programa.

Ainda de acordo com o protocolo, após a administração de cada dose, os animais foram observados periodicamente por 48 h (tempo de 30 min, 1h, 3h, 24h e 48h) e diariamente durante o total de 14 dias para a verificação de alterações de peso e observação de sinais, tais como: piloereção, tremores, convulsões, dor, alterações motoras, tônus muscular, letargia, diarreia e morte.

Ao final desse tempo, os animais foram anestesiados (ketamina 90 mg/kg e xilazina 10 mg/kg) e eutanasiados.

4.4.5 Avaliação da toxicidade aguda da ENSJ39 e dos lipossomas

As doses de 55 mg/kg e 175 mg/kg foram utilizadas para avaliação da toxicidade aguda da ENSJ39 e dos lipossomas. No caso do fármaco livre, a avaliação foi feita via oral e intraperitoneal, e no caso dos lipossomas, apenas via intraperitoneal.

Foram usados cinco camundongos swiss por grupo (ENSJ39, LE39 e LBR). Dois grupos controles foram usados no teste: água para injetável (usada na administração dos lipossomas) e um veículo contendo de 2,5% de DSMO, 2,5% de polissorbato 80 e água para injetável (usado na administração do fármaco ENSJ39). Uma dose única foi dada em cada animal via intraperitoneal e durante 14 dias foi realizada a avaliação diária de peso e comportamento dos animais. No 15º dia os mesmos foram anestesiados (ketamina 90 mg/kg e xilazina 10 mg/kg) e foram coletados o sangue dos animais por meio do plexo orbital (por meio da utilização de capilares de vidro sem heparina), até ocasionar o óbito dos animais por exsanguinação. Posteriormente, foram avaliados os parâmetros bioquimicos e hematológicos, bem como foi realizada a histopatologia de órgãos coletados.

4.4.5.1 Avaliação dos parâmetros bioquímicos e hematológicos

Cerca de 200 µL do sangue foi coletado em microtubos contendo EDTA (Microvette) destinado a análises hematológicas. Essas análises foram realizadas no equipamento SDH-

3VET (Labtest). O restante do sangue foi coletado em microtubos contendo 10 µL de heparina

1 Reversão é a situação na qual uma resposta é seguida por uma resposta contrária. Ou seja, a sobrevida de um

animal em uma dose e o óbito de outro animal na dose subsequente, ou vice-versa, é considerado como um evento de reversão.

para análises bioquímicas. Após coletado, esse material foi centrifugado (3500 rpm, 10 min) e o sobrenadante (plasma) foi reservado para as análises no LabMax Plenno (Labtest).

As análises hematológicas compreenderam de eritograma, índices hematimétricos, leucograma e plaquetograma. As análises bioquímicas compreenderam por dosagem de ureia, creatinina, alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) (Kit Labtest).

As análises estatísticas dos dados coletados foram realizadas com o auxílio do programa

Prism versão 5.0 (GraphPad, Intuitive Software for Science, San Diego, CA). A comparação

entre as médias de cada grupo foi realizada utilizando análise de variância (ANOVA) seguida pelo Teste de Tukey. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas usando p<0,05.

4.4.5.2 Avaliação Histopatológica

Após a colheita do sangue e eutanásia dos animais, coletou-se fragmentos de fígado, rins, baço e coração dos animais tratados por via oral e intraperitoneal (IP). Os órgãos coletados foram imediatamente fixados em solução de formalina à 10%, por 24 h. Após a fixação dos fragmentos, as amostras foram conduzidas à rotina histológica habitual, que consistiu nas etapas de desidratação (com porcentagens crescentes de etanol), diafanização (com o uso de xilol) e inclusão em parafina. Essas etapas foram feitas no processador automático de tecidos TP1020

(Leica).

Cortes macroscópicos foram realizados para exposição do conteúdo interior das peças que foram, posteriormente, incluídas em parafina. Cortes de 2µm ou 4µm de espessura foram feitos em micrótomo (Lupetec MRP09), levados ao banho histológico (Lupetec BH2015) e coletadas em lâminas de microscopia. Depois de levadas à estufa por 24h, as lâminas com os cortes histológicos passaram rapidamente por solução de xilol (desparafinização), e por uma série alcoólica decrescente (hidratação) antes de serem coradas pela hematoxilina/eosina. Após a coloração, a montagem seguiu com a selagem das lamínulas usando Entellan (Merck).

As lâminas foram examinadas por patologista da Universidade Federal do Piauí para avaliação de alterações teciduais. As análises e a fotodocumentação foram realizadas por meio de microscópio de luz (Opticam O500R) com ocular de 10X e objetivas de 10X, 20X e 60X.

A análise histopatológica baseou-se em avaliação qualitativa (descritiva) para todos os órgão e avaliação semi-quantitativa para o rim. A severidade das alterações de quatro parâmetros recebeu a seguinte graduação de escores: (-): sem alterações; (+): alterações leves; (++): alterações moderadas; (+++): alterações severas (ANSARI et al., 2019). Os parâmetros avaliados foram:

 Processos degenerativos: túbulo-intersticial (nefrose, necrose tubular, cilindros proteicos) ou glomerulares;

 Alterações corticais: atrofia tubular, hipertrofia glomerular, fibrose e inflamação intersticial;

 Infiltrado de células inflamatórias: tipo (polimorfonuclear ou mononuclear), intensidade variada e padrão de distribuição (focal ou difuso).

Os escores foram, posteriormente, analisados estatisticamente com o auxílio do programa Prism versão 5.0 (GraphPad, Intuitive Software for Science, San Diego, CA). A comparação entre as médias de cada grupo foi realizada utilizando análise de variância (ANOVA) seguida pelo Teste de Tukey. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas usando p<0,05.