A aplicação de diferentes combinações metodológicas até alcançar uma formulação lisossômica mais apropriada é necessária, uma vez que as características químicas dos compostos a serem encapsulados assim como a quantidade de lipídios são determinantes para escolha do método e a eficiência do processo de encapsulamento (HWANG et al. 2012).
No presente trabalho, alguns procedimentos testados no processo de desenvolvimento do LE39 e LBR foram determinantes na obtenção de uma formulação com filme lipídico homogêneo, sem precipitação após preparo, tamanho de partícula adequada e baixo índice de dispersão, que reflete a homogeneidade de tamanhos dos lipossomas (Tabela 3 e 4). Dentre eles, podemos destacar o aumento da quantidade de ENSJ39 acompanhada do aumento na quantidade de lipídio, o aumento da temperatura durante a rotoevaporação e a maior amplitude e tempo de sonicação.
As formulações que usaram 10 mg do composto não tiveram bons resultados, mesmo com mudanças em todos os parâmetros, sendo 6 mg a máxima quantidade de composto que conseguiu ser encapsulada (formulação eleita) que alcançou excelente uma taxa de encapsulamento (82,3% ± 0,04). As condições usadas no preparo dessa formulação foram semelhantes às usadas por Cavalcanti et al (2011a) na encapsulação da β-lapachona, que obtiveram uma formulação estável sob aspectos macroscópicos e microscópicos por 60 dias. A ocorrência, nas demais formulações de LE39 e LBR descartadas, de filme lipídico irregular com presenças de bolhas, precipitação e visualização de cristais de fármaco após preparo da formulação também foram aspectos relatados no trabalho de Oliveira (2017) que relacionaram esses achados à indícios de que o processo de encapsulação e/ou eficiência do processo pode não ter sido adequado ao composto de interesse.
Após o processo de preparo, outra etapa essencial é a mensuração do tamanho dos lipossomas e, nas últimas décadas, muitas técnicas têm sido aplicadas ao estudo das dimensões das nanopartículas. Dentre elas, há técnicas de microscopia que fornecem imagens diretas das partículas secas, como no caso da AFM, e existem ainda métodos aplicados a partículas em suspensão, como o ZetaSize que se vale da dispersão de luz e mobilidade das partículas. A técnica de mensuração usada no ZetaSize é conhecida como Dynamic Light Scattering (DLS) (ETON et al., 2017; BHATTACHARJEE, 2016).
Na avaliação do tamanho das nanopartículas de LE39 e LBR, usando essas duas metodologias, foram obtidos resultados diferentes para as mesmas amostras analisadas (Tabela 6) e isso pode ter sido ocasionado pelo fato das técnicas utilizadas apresentarem princípios diferentes.
A técnicas DLS mede o movimento browniano e relaciona esse movimento a um diâmetro hidrodinâmico equivalente e não visualiza as partículas. O tamanho médio é calculado a partir das flutuações dependentes do tempo, conforme a intensidade de espalhamento da luz causada por interferências construtivas e destrutivas resultantes dos movimentos brownianos relativos das partículas dentro da amostra (MARVEL PANALYTICAL, 2019; ISSO-22412, 2017; FILIPE et al., 2010).
O AFM, que emergiu como ferramenta efetiva para gerar imagens de nanopartículas (especialmente devido à sua capacidade de trabalhar em amostras biológicas ricas em água), é capaz de fornecer informações precisas sobre o tamanho e a forma da partícula. Além disso, ele permite reconhecer partículas de tamanhos diferentes em uma mistura e assim pode-se eleger e diferenciar as nanopartículas dos aglomerados de partículas de maneira mais criteriosa. Contudo, o número de partículas analisadas pelo AFM é muito menor e, portanto, o DLS fornece melhor distribuição de tamanho e PDI (BHATTACHARJEE, 2016; LAMPRECHT et
al., 2014).
Além disso, é ainda reportado na literatura que a técnica AFM tende a causar achatamento e deformação dos lipossomas, provavelmente como resultado de sua adsorção na superfície da mica, o que também pode interferir nos diâmetros médios dessas partículas (ONYESOM et al., 2013). Briuglia et al. (2015) relata também que, em comparação a técnica DLS, o AFM revela uma diferença em termos de redução do tamanho das partículas lipídicas constituídas com colesterol, o que de fato foi observado no presente estudo (Tabela 6).
De qualquer modo, independente da técnica aplicada, cada uma com suas divergências de aplicabilidade, o resultado do encapsulamento em lipossomas foi a obtenção de formulações com diâmetros inferiores a 40 nm (Tabela 6) e ao avaliar as imagens geradas em AFM, foi possível identificar estruturas compatíveis com a estrutura vesicular de lipossomas unilamelares (Figura 23).
O tamanho de partícula lipossômica encontrado no presente estudo, próximo a 40 nm, as tornam de fato classificados como nanopartículas segundo as definições de Kalra e Bally (2013) e as diretrizes da União Europeia para nanomateriais (JORNAL OFICIAL DA UNIÃO EUROPEIA, 2011). Os primeiros definem uma nanopartícula como sendo estruturas entre 1 e 200 nm de tamanho, e pelas diretrizes europeias é considerado nanomaterial aquele cuja qualquer dimensão externa ou interna esteja na escala nanométrica de 1nm a 100 nm ou, no caso das misturas de partículas com tamanhos diferentes, pelo menos 50% das partículas presentes devem ter uma ou mais dimensões externas compreendidas nessa escala.
A avaliação do tamanho de partícula é indispensável, visto que ele influência nas propriedades físicas e nas interações com entidades biológicas, tais como células e
biomoléculas (ETON et al., 2017), além de interferir na eliminação dos lipossomas da circulação.
Um estudo usando lipossomas de composição lipídica idêntica, porém variando o tamanho (200 e 400 nm), revelou diferença significativa na taxa de remoção: os lipossomas grandes foram removidos do sangue mais rapidamente, com tempo de meia-vida de 0,2 h, comparado com as vesículas menores que foi de 1,5 h (SENIOR et al.,1985). Demonstrou-se também que nanopartículas na faixa de 100 a 200 nm conseguem extravasar através de fenestrações vasculares de tumores (efeito da EPR) e escapam à filtração pelo fígado e baço, caso dos lipossomas de LE39 aqui obtidos, enquanto à medida que o tamanho aumenta além de 200 nm, mais e mais nanopartículas são aprisionadas no fígado e no baço, bem como nos capilares dos pulmões (BLANCO et al., 2015; LONGMIRE et al. 2008).
Ainda com a análise do diâmetro médio dos lipossomas, viu-se que o LE39 apresentou tamanho menor que o LBR (Tabela 6). As partículas menores podem ter se formado em virtude da incorporação da ENSJ39 na membrana fosfolipídica, uma vez que o composto é lipofílico, e isso provocou uma maior estabilidade e compactação do lipossoma. De fato, na análise das imagens 2D obtidas por AFM, foi possível observar uma maior espessura da membrana lipídica no LE39 (Figura 22C e 22F), possivelmente devido a incorporação do composto entre os fosfolipídios.
Esse fenômeno é semelhante ao que ocorre quando se utiliza o colesterol para formular lipossomas, em que seus volumosos anéis esteroides intercalados na bicamada fosfolipídica são usados para conferir rigidez as partículas (DEMETZOS, 2008). Isso foi demostrado por Eloy (2016) que observou que a adição de colesterol causou a redução do tamanho de partícula, efeito atribuído ao maior ponto de fusão dessa substância que tornou a vesícula lipídica compacta.
Em associação com o diâmetro médio das partículas, é importante destacar o papel da distribuição de tamanho dessas partículas no que tange a saturação da solubilidade, a taxa de dissolução, a estabilidade física e o desempenho in vivo das nanossuspensões (PATEL; AGRAWAL, 2011). Nesse sentido, é importante a avaliação do PDI, sendo este uma medida adimensional de amplitude da distribuição de tamanho das partículas que reflete a homogeneidade ou heterogeneidade da amostra. Este índice deve ser o mais baixo possível para fornecer estabilidade a longo prazo das nanossuspensões (BHATTACHARJEE, 2016).
Um valor de PDI de 0,1 a 0,25 mostra uma distribuição de tamanho bastante estreita, e um valor acima de 0,5 indica uma distribuição muito ampla (PATEL; AGRAWAL, 2011). Sistemas com PDI menor ou igual a 0,1 são considerados altamente monodispersos (situação rara), valores de 0,1 a 0,4 são considerados moderadamente polidispersas e valores superiores a 0,4 são ditos altamente polidispersas (BHATTACHARJEE, 2016). Os valores de PDI
alcançados para LE39 e LBR (Tabela 4) revelam, diante dessas classificações, que essas formulações apresentaram uma boa distribuição de tamanho e são favoravelmente estáveis.
Outro fator intrinsicamente relacionado a estabilidade de sistemas coloidais, no qual se incluem os lipossomas, é o potencial zeta, visto que ele aumenta proporcionalmente às forças de repulsão entre as partículas, conduzindo a uma formulação mais estável. Se as partículas em suspensão apresentarem um grande potencial zeta (negativo ou positivo) elas não tendem à agregação (MADY et al., 2012).
Segundo a literatura, um potencial zeta mínimo de ± 30mV é necessário para garantir suspensões eletrostaticamente estáveis e um mínimo de ± 20mV é necessário para estabilização estérica. Valores próximos a ± 60mV são considerados ótimos e conferem boa estabilidade física ao sistema coloidal, inclusive durante a estocagem (PATEL; AGRAWAL, 2011; CHEN
et al., 2006). Bhattacharjee (2016) classifica ainda as dispersões de nanopartículas em altamente
instável, relativamente estável, moderadamente estável e altamente estável com bases nos valores de ± 0–10 mV, ± 10–20 mV, ± 20–30 mV e ± 30 mV, respectivamente.
Assim, podemos inferir que a obtenção de valores próximos a 60 mV para LE39 e LBR (Tabela 4) traduziu o predomínio de altas forças repulsivas, o que contribui, em associação aos baixos valores de PDI, para essas formulações terem apresentado boa estabilidade físico- química.
De fato, durante os quatro meses de avaliação, foi verificada pouca formação de precipitado, de fácil ressuspensão, nas amostras de LE39 submetidas a repouso em temperatura ambiente (Figura 24) e sob refrigeração (Figura 25), com pouca diferença nos tamanhos de partícula comparado às amostras recém preparadas (Tabela 7).
Os valores de PDI tiveram maior aumento nas amostras armazenadas em temperatura ambiente em comparação à refrigeração, mas ainda assim, permaneceram inferiores a 0,4. Com relação a redução nos valores de potencial zeta observada, essa redução também foi mais expressiva nas amostras mantidas em temperatura ambiente (Tabela 7), e pareceu exercer maiores efeitos na amostra de LE39 na qual apresentou formação de precipitado visível ao longo da avaliação de estabilidade em ambas as condições testes (Figura 24 e 25) e apresentou mudança no perfil de distribuição (Figura 26), quando comparado ao LBR. Contudo, sob refrigeração, o valor de potencial zeta da LE39 mesmo tendo sofrido redução, continuou dentro do padrão considerado estável (˃ ±30 mV).
Assim, no geral, as diferenças de valores nos aspectos avaliados foram menores nas amostras de LE39 mantida sob refrigeração, o que indica que essa é a melhor condição de estocagem a longo prazo, em relação ao armazenamento em temperatura ambiente.
(Figura 23). Esse teste de centrifugação simula a passagem acelerada do tempo, a agitação mecânica e as condições de transporte (Lira et al., 2009). Os dados obtidos reforçam que ocorreu a obtenção de lipossomas estáveis contendo ENSJ39.
Um estudo com lipossomas de β-lapachona mostrou que a formulação obteve resultado de PDI de 0,30 e foi resistente a teste de estabilidade acelerada, mantendo suas propriedades mesmo após 60 dias em forma de suspensão e apresentou, após esse período, um pequeno aumento no valor de PDI (0,34) e mudança no tamanho de partícula (104,35 nm no tempo zero e 100,20 nm após 60 dias). Na forma liofilizada, o estudo revelou manutenção da estabilidade por até 1 ano (CAVALCANTI et al., 2011a).
A presença de um lipídio carregado positivamente na bicamada, papel atribuído à octadecilamina, pode também ter contribuído para a estabilização dos lipossomas contendo ENSJ39, uma vez que lipossomas neutros e aniônicos avaliados em outros trabalhos mostraram- se instáveis após a preparação. No trabalho de Anchieta-Júnior et al (2014), por exemplo, foi visto que os lipossomas catiônicos apresentaram os melhores resultados nos testes de estabilidade acelerada, por atribuição aos valores de tamanho médio de partícula e PDI, quando comparado a lipossomas neutros ou aniônicos. Resultado similar foi obtido por Lira et al (2009), após testes de estabilidade acelerada, lipossomas de carga positiva contendo Ácido úsnico preservaram suas características iniciais sem alterações significativas, mantendo, inclusive, sua estabilidade por mais de 24 meses e permanecendo nesse tempo com ótimas taxas de encapsulamento.
Nekkanti e Kalepu (2015) esclarecem que a estabilidade dos lipossomas é majoritariamente regida pela composição final da formulação, de modo que a instabilidade física ocorre predominantemente devido à oxidação de cadeias acil insaturadas ou hidrólise de ligações éster, vazamento de drogas e agregação de vesículas resultando em lipossomas maiores que são rapidamente eliminados pelo sistema retículo-endotelial. Os autores sugerem que algumas dessas questões podem ser resolvidas com o processo de liofilização da suspensão lipossômica. Esse processo é uma alternativa para aumentar a meia-vida da formulação, pois em estado seco tem-se maior estabilidade, e além disso permite que a formulação seja reconstituída com veículo na hora da administração (BATISTA et al., 2007).
Na liofilização é comum o uso de agentes crioprotetores que protegem os materiais durante o processamento. Nas nanoformulações lipidídicas, destacam-se o uso de trealose, glicose, sacarose e manitol, carboidratos esses capazes de formarem uma matriz vítrea protetora sobre as nanopartículas, tornando possível preservar as características dos lipossomas que, durante o procedimento de liofilização, podem ser danificados devido a formação de cristais de gelo (CHEN et al., 2016; KALRA; BALLY, 2013; CHANGSAN et al., 2009).
No presente estudo, foram avaliados tamanho, potencial zeta e PDI nas formulações antes e pós-liofilização, e o resultado revelou que tanto a concentração de 5% quanto a de 10% de trealose foram eficazes na manutenção das características iniciais do LE39 e LBR (Tabela 5 e Figura 20), permitindo a preservação e estabilidade das nanoestruturas. Quando a trealose é utilizada em quantidades adequadas no processo de liofilização de lipossomas, verifica-se que 100% das características originais da formulação são mantidas (AKBARZADEH et al., 2013; KALRA; BALLY, 2013). Isso mostra que a trealose é um excelente crioprotetor para esse tipo de nanossistema. A sua utilização como agente crioprotetor eficaz já havia sido relatada na literatura, que cita diferentes concentrações que variaram de 0,1 a 10% (OLIVEIRA, 2017; CAVALCANTI et al., 2011a; LIRA et al, 2009), contudo a menor concentração avaliada (5%) neste presente estudo não foi capaz de manter as características inicias das formulações de LE39 produzidas.
Além da excelente estabilidade, o encapsulamento da ENSJ39 apresentou ótima eficiência de encapsulação (82,3% ± 0,04). Essa notável taxa de encapsulação de ENSJ39 está de acordo com outros valores de encapsulamento de compostos naftoquinônicos. Trabalhos anteriores com β-lapachona encapsulada em lipossomas, usando o mesmo método de filme lipídico e condições de preparação semelhantes às de LE39, obtiveram 97,09% (CAVALCANTI
et al., 2011a) e 97,4% (CAVALCANTI et al., 2018) de eficiência de encapsulamento.
As naftoquinonas parecem ter melhores taxas de aprisionamento quando usados em nanossistemas lipossômicos. Dados anteriores demonstraram que a eficiência do encapsulamento de β-lapachona em micelas de PLA-PEG foi de 41,9% (BLANCO et al., 2007) e o encapsulamento usando microcápsulas PLGA mostrou uma taxa de captura de 19,36% (COSTA et al., 2017).
A extensão da eficiência do encapsulamento é geralmente mais alta para fármacos não polares quando comparado com fármacos polares (NEKKANTI; KALEPU, 2015) o que corrobora com a taxa obtida para o LE39, visto que a ENSJ39 é um composto altamente apolar. Este fato foi, também, observado quando comparada a eficiência de encapsulação da daunomicina com a citosina arabinosideo, pois o primeiro, que é uma molécula apolar, apresentou uma maior eficiência em comparação ao segundo, uma molécula polar. (JULIANO; STAMP, 1979). Este fato pode ser explicado porque a taxa de encapsulamento pode ser elevada com o aumento da concentração de lipídios, refletindo, assim, em um maior volume interno disponível (HWANG et al. 2012).
O método de determinação da eficiência de encapsulação por espectrofotometria UV/visível foi também adotado em outros trabalhos envolvendo diferentes nanoformulações (SIQUEIRA-MOURA et al., 2008; LIRA et al., 2009) e inclusive para lipossomas contendo
naftoquinonas (CAVALCANTI et al., 2018; CAVALCANTI et al., 2011b). A aplicação dessa metodologia é recorrente para análise quantitativa de componentes farmacêuticos, inclusive os métodos farmacopeicos utilizam-na para a determinação de componentes ativos. Tal método pressupõe, porém, que não haja interferência de excipientes presentes na formulação e que a amostra esteja livre de matéria em suspensão (o que causaria dispersão de luz), fatores que comprometeriam a validade dos resultados por impedir detectar a verdadeira absorção do composto de interesse (WATSON, 2013).
Com a sobreposição do espectro de absorção das amostras foi possível verificar a não interferência do lipossoma branco (LBR purificado e total) nas análises a partir do uso do espectro direto (Figura 29A), resultando em uma curva com ótimo coeficiente de correlação. Esse achado foi reforçado com o uso do espectro de primeira derivada (Figura 29B), visto que na sobreposição de espectros de derivadas dos componentes de uma mistura é possível individualizar melhor os constituintes e até eliminar a interferência de um componente (WATSON, 2013; PASCHOAL et al., 2003). Por isso, essa é uma operação matemática capaz de aumentar a sensibilidade de detecção de características difíceis de observar na espectrofotometria direta (SANCHEZ et al., 1988).
A escolha da ordem da derivada depende das características do espectro de ordem zero (constituintes da mistura e interferentes). Já na primeira derivação das amostras LE39 e LBR foi possível detectar o ponto de zero crossing (269 nm), não sendo necessário a aplicação de segunda ou terceira derivada. O uso da técnica do ponto de anulação é considerado a mais utilizada para a quantificação de misturas binárias de fármacos com sobreposição de espectros (EL-SAYED; EL-SALEM, 2005).
Vale ressaltar ainda que a aplicação da suavização à derivação, reduz o ruído e é necessária pelo fato da diferenciação do espectro degradar a relação sinal/ruído (DONATO et
al., 2010; SANCHEZ et al., 1988), motivo pelo qual foi utilizada neste trabalho.
Nas análises térmicas foram usados o TGA e o DSC para avaliar as interações químicas das nanopartículas desenvolvidas. O TGA é uma técnica que analisa perdas de massa de amostras em decorrência do aumento de temperatura ao longo do tempo, permitindo identificar as temperaturas de início de decomposição, bem como suas etapas/estágios (DAN et al., 2014), presumindo consequentemente sua estabilidade térmica. No DSC, quando a amostra é submetida a uma variação controlada de temperatura, são analisados os eventos térmicos envolvidos, associados aos processos exotérmicos e endotérmico relacionados a capacidade calorífica, possibilitando a informação de propriedades energéticas envolvidas (SUR et al., 2019).
lipídicos como lipossomas, sendo capaz de determinar as interações entre substâncias misturadas e avaliar as alterações termodinâmicas das bicamadas lipídicas após a incorporação de um medicamento, ao mesmo tempo que prever como essas alterações podem estar relacionadas às interações do medicamento com o transportador lipídico que afeta a biodisponibilidade dos medicamentos (DEMETZOS, 2008).
Na avaliação do TGA (Figura 27A), foi visto que a degradação da ENSJ39 conseguiu ser preservada pelos lipossomas. Achados semelhantes foram encontrados por Eloy (2016), em que os fármacos antitumorais rapamicina e paclitaxel foram protegidos da degradação quando encapsulados em lipossomas. Cavalcanti et al (2011a), na avaliação termogravimétrica da β- lapachona em lipossomas, também mostrou que esse sistema de encapsulação preveniu a degradação ocorrida na substância livre.
Na análise do DSC (Figura 27B), o pico duplo referente ao evento endotérmico de fusão (transição do estado cristalino para amorfo) da ENSJ39 livre desapareceu no espectro do LE39. Esse fato pode sugerir que a ENSJ39 estava de fato molecularmente dispersa no lipossoma, porém não estava em seu estado cristalino e sim, parcialmente convertida para sua forma amorfa (COSTA et al., 2017; ZIDAN et al., 2006). Isso pode ter contribuído para melhora da solubilidade do composto, visto que fármacos amorfos são mais solúveis que os cristalinos, acarretando em maior biodisponibilidade (ELOY et al., 2012; SANNA et al., 2012).
A conversão de estado cristalino para amorfo de uma substância dentro de uma formulação lipossômica foi semelhantemente descrita por Eloy (2016) em lipossomas contendo rapamicina.
Outro fato que reforça a encapsulação da ENSJ39 foi que, embora tendo o mesmo padrão de pico de fusão do LBR, o pico do LE39 apresentou um alargamento e apareceu em uma temperatura intermediária entre o fármaco livre e lipossoma vazio.
Além da execução dos ensaios referentes a caracterização morfológica e físico- químicas dos lipossomas desenvolvidos, foram realizados ensaios in vitro para avaliação da inibição de crescimento celular dos compostos.
Os dados de citotoxicidade via MTT obtidos para a ENSJ39 neste trabalho (Tabela 8) reproduziram valores semelhantes a outros estudos que se dedicaram a avalição deste e de outros análogos ariloaminos: alguns compostos exibiram valor de CI50 inferior a 1 µM contra as linhagens celulares de câncer HL-60, MDA-MB-435, HCT-8, SF-295, PC-3 e B-16 (da SILVA-JUNIOR et al., 2010, 2019; PINHEIRO, 2017; CAVALCANTI, 2010, 2013).
A ENSJ39 exibiu atividade potente nas células HL-60, corroborando com dados anteriores que identificaram que alguns nor-β-lapachona arilamino substituídos tinham atividade considerável contra linhagens leucêmicas, semelhante ao efeito observado com a
molécula precursora (nor-β-lapachona) (CAVALCANTI et al., 2010, 2013).
Deve-se ressaltar que a HL-60 apresenta baixa expressão do NQO1 (BELLO et al., 2005), sugerindo, portanto, que a bioativação do ENSJ39 pode ser induzida por outras redutases, além do NQO1. De fato, nenhum agente antitumoral bioredutivo é ativado por uma única enzima redutora (FOURIE et al. 2002). Alguns trabalhos usando o dicumarol (inibidor de NQO1) e drogas naftoquinônicas mostraram que, apesar de ter ocorrido proteção das células tumorais que superexpressam NQO1, não houve efeito significativo sobre linhagens com pouca