Atividade antitumoral das Naftoquinonas

As quinonas são compostos químicos de ocorrência natural que possuem notória biodinamicidade, ou seja, apresentam múltiplas propriedades biológicas. Além dos processos bioquímicos vitais que esses metabólitos participam (tais como, respiração celular, fotossíntese, cascata de coagulação sanguínea e biossíntese de aminoácidos), os compostos quinônicos têm sido estudados por apresentarem pronunciados efeitos citotóxicos antitumorais, propriedades microbicidas, tripanossomicidas, moluscicidas, anti-inflamatóras, leishmanicidas e viruscidas (da SILVA-JÚNIOR et al., 2019; GUIMARÃES et al., 2013; LOURENÇO et al., 2011; BARBOSA et al., 2005; PINTO et al. 2000; GAFNER et al., 1996; ALMEIDA et al., 1990).

Muitos desses efeitos estudados decorrem de sua atuação como agente oxidante, visto a facilidade que sua estrutura química apresenta, particularmente seu núcleo quinônico, em ser reduzida. Essa redução ocorre através da formação de um sistema totalmente aromático que promove a aceitação de um elétron, formando um radical semiquinona, e a aceitação de um elétron adicional, formando um radical hidroquinona (Figura 12) (PINTO; de CASTRO, 2009; HILLARD et al., 2008; ASCHE, 2005).

Em condições aeróbicas, o radical semiquinona pode ser oxidado para a quinona original pelo oxigênio molecular. Este processo de redução, provocado por uma redutase, seguido de auto-oxidação leva a formação do radical ânion superóxido (O2•-) e é conhecido como ciclo redox das quinonas (Figura 11). Esse processo é dependente de oxigênio e se mantem até o sistema se tornar anaeróbico (ASCHE, 2005).

Figura 12 - Ciclo redox das quinonas.

Fonte: Adaptado de Asche (2005).

Em sistemas biológicos, as quinonas podem sofrer esse processo de redução bioquímica reversível catalisado por flavoenzimas usando o NADPH como fonte de elétrons. As enzimas

redutoras de 1 elétron são, a exemplo, NADPH: citocromo P450 redutase, NADPH: citocromo b5 redutase e NADPH: ubiquinona oxidoredutase. A enzima redutora de 2 elétrons mais importante é a NAD(P)H: quinona oxidase 1 (NQO1) (PEREYRA et al., 2019; SILVERS et al., 2017; ASCHE, 2005).

Os mecanismos propostos de citotoxicidade em células tumorais envolvem a ocorrência desse ciclo redox, que leva a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e à alquilação de nucleófilos celulares, havendo ligação covalente com proteínas e/ou DNA que causam os danos celulares (QUI et al., 2018; VESSECCHI et al., 2010; BOLTON et al., 2000).

As EROs incluem, além dos radicais livres superóxido (O2•-), o radical hidroxila (OH•), e moléculas não radicais, como peróxido de hidrogênio (H2O2). Essas moléculas são derivadas principalmente do oxigênio que é consumido em várias reações metabólicas que ocorrem principalmente nas mitocôndrias, peroxissomos e retículo endoplasmático. O desequilíbrio entre a geração e eliminação de EROs resulta em seus altos níveis e estresse oxidativo em células tumorais (GORRINI et al., 2013).

Com base na estrutura molecular, a principal característica das quinonas é a presença de dois grupos carbonílicos que formam um sistema conjugado com pelo menos duas ligações duplas entre carbonos. Em relação ao sistema aromático no qual o sistema de duplas e cetonas conjugadas está inserido, têm-se três grupos principais de quinonas (Figura 13): benzoquinonas – um anel benzênico; naftoquionas – um anel naftalênico; antraquinonas – um anel antracênico (ASCHE, 2005).

Figura 13 - Representação da estrutura química dos principais grupos de quinonas: benzoquinona (A),

naftoquinona (B) e antraquinona (C).

Fonte: Pinheiro (2017).

Em decorrência de diferentes arranjos isoméricos, com um mesmo tipo de anel pode-se ter, dependendo das disposições relativas das carbonilas, diferentes quinonas. Por exemplo, no arranjo de base naftalênica tem-se a forma isomérica orto-quinonoídica (1,2-naftoquinonas), quando as carbonilas são vizinhas (Figura 14A) ou a forma isomérica para-quinonoídica (1,4 – naftoquininas), com as carbonilas tendo entre si dois carbonos (Figura 14B). Outros arranjos isoméricos são conhecidos, principalmente em sistemas policíclicos, nos quais os distanciamentos entre as carbonilas podem ser maiores (SILVA et al., 2005).

Figura 14 - Representação das formas isoméricas orto-quinonoídica (β-lapachona) e para- quinonoídica

(α-lapachona).

Fonte: Adaptado de Silva et al. (2005).

As formas isoméricas diferem muito em suas propriedades físicas, químicas e quanto à sua atuação biológica. A exemplo, tem sido relatado que a β-lapachona (Figura 13A) é capaz de induzir seletivamente a morte celular em várias células cancerígenas humanas e na terapia combinada com o taxol também exibiu potentes efeitos citotóxicos in vitro (HUSSAIN; GREEN, 2017; CAVALCANTE et al. 2010; LI et al., 1999). Já a α-lapachona (Figura 13B) demonstrou possuir efeitos tripanocidas em Trypanosoma cruzi e seus análogos, efeitos contra

Leishmania amazonensis e L. braziliensis (HUSSAIN; GREEN, 2017; SOUZA-SILVA, et al.,

2014; MOURA et al., 2001).

Dentre os vários compostos quinônicos, as naftoquinonas são moléculas consideradas privilegiadas com relação a sua química medicinal (CONSTANTINO; BARLOCCO, 2006).

As naftoquinonas naturais de maior destaque, extensivamente investigadas para o tratamento do câncer, são o lapachol e a β-lapachona. Considerado um dos primeiros representantes do grupo, o lapachol é conhecido desde 1858 e tem maior ocorrência no cerne do lenho de árvores da família Bignoniaceae, particularmente no gênero Tabebuia (árvores de ipês), nativas das Américas Central e do Sul (SILVA et al., 2003).

A β-lapachona, encontrada também nas árvores de ipê (porém como constituinte minoritário), tal qual o lapachol, mostra uma diversificada ação farmacológica, principalmente relacionada ao ciclo redox e exigindo bioativação pela enzima NQO1. Essa enzima exibe expressão elevada na maioria dos tumores sólidos e, portanto, é um potencial alvo específico em células tumorais (SILVERS et al., 2017; RÍOS-LUCI et al., 2012; ASCHE, 2005).

O número crescente de publicações sobre essa classe, demostra o grande interesse pelo conhecimento da farmacologia e mecanismo de ação destas substâncias no campo da oncologia. Um levantamento de publicações feitas nos últimos 20 anos (1998-2018) nas bases PubMed e

Web of Science, utilizando os descritores “naphthoquinone and cancer”, revelou um grande

Figura 15 - Progressão anual de artigos publicados ao longo de 20 anos nas bases PubMed e Web of

Science, associando ao descritor “naphthoquinone and cancer”.

Fonte: Próprio autor (2020).

A nível de patentes, um estudo de revisão dedicado a avalição de patentes relacionadas ao lapachol, β-lapachona e α-lapachona nas últimas duas décadas, mostrou que a maioria das patentes publicadas estão relacionadas aos efeitos anticancerígenos (HUSSAIN; GREEN, 2017). O que reafirma o interesse nesse campo de pesquisa.

Quase 300 tipos estruturais relacionados a naftoquinonas já foram isolados de plantas, bactérias e fungos, e além da avaliação biológica relacionada aos compostos de origem natural, tem-se buscado a síntese e estudo de compostos bioativos sintéticos e semi-sintéticos baseados no esqueleto naftoquinônico. As naftoquinonas têm sido muito utilizadas na química medicinal como modelo para síntese de derivados com potencial anticâncer e outras doenças tropicais negligenciadas, como Chagas e Leishmaniose (da SILVA-JÚNIOR et al., 2019; TANDOR; KUMAR, 2013; PHILLIPS et al., 2004).

A aplicação da química orgânica e medicinal em compostos de ocorrência natural é bastante recorrente. Uma avaliação de compostos antitumorais aprovados entre 1950 e 2014, mostrou que cerca de 50% dos compostos utilizados para quimioterapia do câncer são provenientes de produtos naturais, de seus derivados ou são inspirados em sua estrutura química original (NEWMAN; CRAGG, 2016).

Os esforços mais recentes nessa linha, envolvem principalmente a busca e desenvolvimento de novos análogos naftoquinônicos cada vez mais potentes e menos tóxicos. A nor-β-lapachona, análogo semi-sintético da β-lapachona, faz parte desse contexto (PEREYRA et al., 2019; da SILVA JÚNIOR et al., 2011, 2007; MONTENEGRO et al., 2010). Isso porque, a β-lapachona, embora tenha pronunciado potencial biológico, sendo citotóxico para uma variedade de linhagens celulares de câncer humano, que geralmente são células mais sensíveis às lesões oxidativas associadas à EROs, tem uso reduzido como quimioterápico pois sua alta hidrofobicidade provoca metemoglobinemias em pacientes (da SILVA-JÚNIOR et al.,

0 50 100 150 200 250 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017 2018 2019 N ú m ero d e p u b li caçõ es Ano Pub Med Web of Science

2019; SILVERS et al., 2017).

O desenvolvimento de compostos naftoquinônicos derivados dessa molécula tem sido o propósito do grupo de pesquisa liderado pelo Prof. Dr. Eufrânio Nunes da Silva Júnior, da Universidade Federal de Minas Gerais. A nor-β-lapachona e seus derivados, concebidos pelo referido grupo, mostraram potente efeito citotóxico contra várias linhagens celulares de câncer, alcançando pronunciada atividade citotóxica em comparação a linhagens não-tumorais (COSTA et al., 2017; CAVALCANTI et al., 2011a; da SILVA JÚNIOR et al., 2010, 2008, 2007).

As principais estratégicas químicas envolvidas na síntese dos análogos quinônicos bioativos envolvem modificações em três zonas principais: anel C, centro redox, e anel A. Essas modificações permitiram a obtenção de moléculas com excelente atividade biológica, dentre elas o composto químico 2,2-dimetil-3-(2-metil-4-nitro-arilamino)-2,3-diidro-nafto[1,2- b]furan-4,5-diona, também chamado de ENSJ39. A sua obtenção, a partir do lapachol (Figura 16), foi previamente descrita na literatura (da SILVA JÚNIOR et al, 2019, 2010; CAVALCANTI, 2010).

Figura 16 – Rota sintética para obtenção da naftoquinona ENSJ39.

Fonte: Adaptado de Silva-Júnior et al (2010).

O grupo de pesquisa do Laboratório de Oncologia Experimental (LOE), da Universidade Federal do Ceará (UFC), liderado pela Profa. Dra. Claudia do Ó Pessoa, tem investigado, ao longo dos últimos anos, as propriedades farmacológicas de uma série de novos compostos quinonas, planejados como possíveis agentes antitumorais.

O grupo apresenta patentes depositadas em âmbito nacional e internacional, da qual se abordam os métodos de uso de derivados de lapachona (BR1120180080764, WO2017070012A1 e US1656986). Para as publicações, tem-se estudos de síntese de compostos híbridos selênio-quinolina com potencial atividade antitumoral, estudos de citotoxicidade envolvendo análogos lapachônicos contendo grupos ariloaminos, tiocompostos, conjugação com compostos organobóricos associados a corantes fluorescentes e outras combinações (Quadro 2).

Quadro 2 - Publicações e patentes dos últimos 5 anos, relacionadas ao tema naftoquinonas, do grupo de

pesquisadores do Laboratório de Oncologia Experimental – LOE/UFC.

Fonte: Próprio autor (2020).

PATENTES

1. Derivados de lapachona contendo dois centros redox e métodos de uso dos mesmos.BR1120180080764. Publicação Nacional.

20/04/2018

2. Lapachone derivatives containing two redox centers and methods of use thereof.WO2017070012A1. International publicated.

27/04/2017

3. Derivatives containing two redox centers and methods of use thereof. US1656986. International publicated. 14/10/2016.

PRINCIPAIS PUBLICAÇÕES

1. Jardim, Guilherme; Lima, Daisy; Valença, Wagner ; Lima, Daisy ; Cavalcanti, Bruno ; Pessoa, Claudia ; Rafique, Jamal ;

Braga, Antonio ; Jacob, Claus ; Da Silva Júnior, Eufrânio ; Da Cruz, Eduardo . Synthesis of Selenium-Quinone Hybrid Com- pounds with Potential Antitumor Activity via Rh-Catalyzed C-H Bond Activation and Click Reactions. MOLECULES, v. 23, p. 83, 2018.

2. Baiju, Thekke V. ; Almeida, Renata G. ; Sivanandan, Sudheesh T. ; de Simone, Carlos A. ; BRITO, LUCAS M. ; Cavalcanti,

Bruno C. ; Pessoa, Claudia ; Namboothiri, Irishi N.N. ; da Silva Júnior, Eufrânio N. Quinonoid compounds via reactions of lawsone and 2-aminonaphthoquinone with α-bromonitroalkenes and nitroallylic acetates: Structural diversity by C-ring modi- fication and cytotoxic evaluation against cancer cells. European Journal Of Medicinal Chemistry, v. 151, p. 686-704, 2018.

3. Gontijo, Talita B. ; De Freitas, Rossimiriam P. ; Emery, Flavio S. ; Pedrosa, Leandro F. ; Vieira Neto, José B. ; Cavalcanti,

Bruno C. ; Pessoa, Claudia ; King, Aaron ; De Moliner, Fabio ; Vendrell, Marc ; da Silva Júnior, Eufrânio N. . On the Synthe- sis of Quinone-based BODIPY Hybrids: New Insights on Antitumor Activity and Mechanism of Action in Cancer Cells. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, v. 4, p. 150, 2017.

4. Valença, Wagner O. ; Baiju, Thekke V. ; Brito, Fernanda G. ; Araujo, Maria H. ; Pessoa, Claudia ; Cavalcanti, Bruno C. ;

De'simone, Carlos A. ; Jacob, Claus ; Namboothiri, Irishi N. N. ; Da'silva'júnior, Eufrânio N. Synthesis of Quinone-Based N - Sulfonyl-1,2,3-triazoles: Chemical Reactivity of Rh(II) Azavinyl Carbenes and Antitumor Activity. ChemistrySelect, v. 2, p. 4301-4308, 2017.

5. da Cruz, E. H. G. ; Silvers, M. A. ; Jardim, G. A. M. ; Resende, J. M. ; Cavalcanti, B. C. ; Bomfim, I. ; Pessoa, C. ;

Simone, C. A. ; Braga, A. L. ; Namboothiri, I. N. N. ; Boothman, D. A. ; Silva Junior, E. N. Molecular hybridization as a powerful tool towards multitarget quinoidal systems: synthesis, trypanocidal and antitumor activities of naphthoquinone-based 5-iodo-1,4-disubstituted-, 1,4- and 1,5- disubstituted-1,2,3-triazoles. MedChemComm, p. 1555-1563, 2016.

6. Da Cruz, Eduardo H.G. ; Silvers, Molly A.; Jardim, Guilherme A.M.; Resende, Jarbas M.; Cavalcanti, Bruno C. ;

Bomfim, Igor S. ; Pessoa, Claudia ; De Simone, Carlos A. ; Botteselle, Giancarlo V. ; Braga, Antonio L. ; Nair, Divya K. ; Namboothiri, Irishi N.N. ; Boothman, David A. ; Da Silva Júnior, Eufrânio N. Synthesis and antitumor activity of sele- nium-containing quinone-based triazoles possessing two redox centres, and their mechanistic insights. European Journal of Medicinal Chemistry, v. 122, p. 1-16, 2016.

7. Costa, Marcilia ; Feitosa, Anderson ; Oliveira, Fátima ; Cavalcanti, Bruno ; Da Silva, Eufrânio ; Dias, Gleiston ; Sales, Fran-

cisco ; Sousa, Bruno ; Barroso-Neto, Ito ; Pessoa, Cláudia ; Caetano, Ewerton ; Di Fiore, Stefano ; Fischer, Rainer ; Ladeira, Luiz ; Freire, Valder . Controlled Release of Nor -β-lapachone by PLGA Microparticles: A Strategy for Improving Cy- totoxicity against Prostate Cancer Cells. Molecules (Basel. Online), v. 21, p. 873, 2016.

8. Gontijo, Talita B. ; De Freitas, Rossimiriam P. ; De Lima, Guilherme F. ; De Rezende, Lucas C. D. ; Pedrosa, Leandro F. ;

Silva, Thaissa L. ; F. Goulart, Marilia O. ; Cavalcanti, Bruno C. ; Pessoa, Claudia ; Bruno, Marina P. ; Corrêa, José R. ; Emery, Flavio S. ; Da Silva Júnior, Eufrânio N. Novel fluorescent lapachone-based BODIPY: synthesis, computational and electrochemical aspects, and subcellular localisation of a potent antitumour hybrid quinone. Chemical Communications (Lon- don. 1996. Print), v.52, p. 13281-13284, 2016.

9. Dias, Gleiston; Rodrigues, Bernardo; Resende, Jarbas Magalhães; Calado, Hállen; Simone, Carlos; Silva, Valter; Neto,

Brenno A. D.; Goulart, M. O. F; Meira, Assuero; Pessoa, Cláudia; Corrêa, José; Silva Junior, Eufranio . Selective endocytic trafficking in live cells with fluorescent naphthoxazoles and their boron complexes. Chemical communications (London. 1996. Print), v. 51, p. 9141-9144, 2015.

10. Jardim, Guilherme A. M. ; Guimarães, Tiago T. ; Pinto, Maria Do Carmo F. R. ; Cavalcanti, Bruno C.; De Farias, Kaio M. ;

Pessoa, Claudia ; Gatto, Claudia C. ; Nair, Divya K. ; Namboothiri, Irishi N. N. ; Da Silva Júnior, Eufrânio N. Naphthoqui- none-based chalcone hybrids and derivatives: synthesis and potent activity against cancer cell lines. MedChemComm, v. 6, p. 120-130, 2015.

11. Guimaraes, E. ; Hussene, C. ; Diogo, E. B. T.; Melo, I. M. M.; Rodrigues, B. L.; Oliveira, R. N. ; Paiva, Y. G. ; Goulart,

M. O. F. ; Cavalcanti, B. C. ; Do Ó Pessoa, Claudia, ; Eufrânio N. Da Silva Júnior. 1,2,3-Triazole-, arylamino- and thio-sub- stituted 1,4-naphthoquinones: Potent antitumor activity, electrochemical aspects, and bioisosteric replacement of C-ring- modified lapachones. Bioorganic & Medicinal Chemistry (Print), v. 22, p. 1608-1619, 2014.

12. De Moraes, Thiago ; Filha, Maria ; Camara, Celso ; Silva, Tania ; Soares, Bruno ; Bomfim, Igor ; Pessoa, Claudia ; Ximenes,

George ; Silva, Valdemiro . Synthesis and Cytotoxic Evaluation of a Series of 2-Amino-Naphthoquinones against Human Cancer Cells. Molecules (Basel. Online), v. 19, p. 13188-13199, 2014.

13. Pessoa, C.; Feitosa, A.C.S. ; Costa, M.P. ; Evangelista, F.C.; Sales, F.A.M.; Bomfim, I.S.; Junior, E.N. Silva; Dias, G.G. ;

Freire, V.N. ; Caetano, W.S. Improved cytotoxic activity of Nor-β-lapachone-loaded PLGA microcapsules in PC3M prostate cancer cell line. European Journal of Cancer, v. 50, p. 87, 2014.

A avaliação da atividade antiproliferativa de quatro compostos análogos da nor-β- lapachona, revelou que todos os compostos testados foram fortemente citotóxicos nas linhagens tumorais humanas utilizadas, com valores de CI50 < 6,9 µM, apresentando potência superior ao seu próprio análogo, a nor-β-lapachona. Dentre essas moléculas testadas, sintetizadas e cedidas pelo Prof. Dr. Eufrânio, destaca-se a ENSJ39, a única a demonstrar valores de CI50 próximos ou abaixo de 1 µM em todas as linhagens tumorais avaliadas (PINHEIRO, 2017), motivando o estudo dessa molécula no presente trabalho.

A ENSJ39 já foi estudada pelo LOE quanto aos aspectos referentes ao seu mecanismo de ação e efeitos citotóxicos em diferentes linhagens celulares (PINHEIRO, 2017). Os resultados desses achados estão sintetizados no Quadro 3.

Quadro 3 - Ensaios realizados por Pinheiro (2017) e seus respectivos resultados obtidos na avaliação do mecanismo de

ação e atividade antitumoral in vitro do composto ENSJ39.

ESTUDO ENSAIO RESULTADOS

1. Alteração na viabilidade

celular

1.1. Alteração na viabilidade celular – ATPlite CI50 nas linhagens tumorais: MCF7: 0,85µM; HCT116:

1,18µM; SW480: 1,05µM; DU145: 1,18µM;

OVCAR3:1,01µM; HL60:1,09µM; COLO205: 1,55µM;. CI50 na linhagem não-tumoral L929: 5,62µM.

1.2. Potencial hemolítico Não presente.

1.3. Efeito citotóxico – SRB & Xcelligence Induz efeito antiproliferativo, seguido de efeito citotóxico (concentração-dependente).

1.4. Atividade em células quiescentes – 3T3 Composto ativo em células quiescentes, com relação de 2,6 quando comparado com células em divisão.

2. Estudos do mecanismo

de ação

2.1. Inibição da topoisomerase Inibição de topoisomerase II, com formação de topo2cc; e _{possível inibição catalítica de topoisomerase I.}

2.2. Bioativação da droga Bioativada pela enzima NQO1.

2.3. Efeito sobre a indução de morte celular Apoptose com participação da via intrínseca; _{secundariamente envolvimento da extrínseca.} 2.4. Efeito sobre o ciclo celular Parada na fase G2/M.

2.5. Geração de Espécies Reativas de Oxigênio (EROs) Produção de EROs concentração-dependente. 2.6. Painel de Linhagens DT40 – Vias de reparo de dano

ao DNA

Ativação das vias de reparo NHEJ, HR e TLS (Genes: Ligase IV e DNAPks – NHEJ; BRCA1 e BRCA2 – HR; PCNAK164R – TLS)*.

2.7. Dano ao DNA / Genotoxicidade - Ensaio do Cometa & H2AX

Dano ao DNA via produção de EROs. H2AX (+): quebra de

dupla fita de DNA. 3. Estudos in

silico

3.1. Docking molecular - Topoisomerase II (topoII) Identificação dos sítios de ligação com topoII. 3.2. Docking molecular - NQO1 Identificação dos sítios de ligação com NQO1. *NHEJ: junção de extremidades não homólogas; HR: recombinação homóloga; TLS: síntese translesão. Fonte: Pinheiro (2007). Dados sob proteção de patente.

Resumidamente, a ENSJ39 é bioativada pela enzima NQO1 e induz efeito antiproliferativo seguido de efeito citotóxico, de maneira concentração dependente, inibindo a progressão do ciclo celular com parada em G2/M. Esses efeitos foram relacionados ao dano de DNA causado por EROs geradas pelo fármaco, que culminam na ativação de morte celular por apoptose através da via intrínseca (mitocondrial) e possivelmente ativação da via extrínseca como um mecanismo secundário (PINHEIRO, 2017).

A investigação do mecanismo de ação da β-lapachona e seus derivados, incluindo a ENSJ39, revelou que a adição exógena de glutationa reduzida as culturas tumorais resultou na redução da sensibilidade celular dos compostos, indicando assim, a importância do EROs sobre a toxicidade celular promovida por esses compostos (CAVALCANTI, 2010). A glutationa reduzida é usada como co-substrato na decomposição de superóxidos orgânicos em água e glutationa oxidada, diminuindo o potencial lesivo dos radicais livres.