Desenvolvimento dos lipossomas

4.2.1 Preparo das nanopartículas de lipossoma

O preparo dos lipossomas se deu com a utilização do método de hidratação de filme lipídico, seguido por sonicação, proposto por Lira et al (2009) e Lasic (1992), com modificações. Para o preparo do lipossoma contendo ENSJ39 (LE39), foram adicionados, sob agitação magnética, a fosfatidilcolina de soja (PC) (Sigma-Aldrich), o colesterol (CHOL) (Sigma-Aldrich), a octadecilamina (OCTA) (Sigma-Aldrich), e a ENSJ39 em solução de clorofórmio/metanol (Merck) na proporção 3:1 (Figura 18A). O lipossoma branco (LBR) foi formulado com os mesmos constituintes, sem adição da ENSJ39.

Após a total solubilização de todos os constituintes, a solução orgânica foi transferida para um balão de fundo redondo (Figura 18B), levada para o rotoevaporador (IKA RV10 digital), mantido imerso em banho maria (IKA B10 digital) e sob pressão reduzida, para remoção do solvente (Figura 18C) e obtenção do filme lipídico seco (Figura 18D). Em seguida, foi realizada a hidratação o filme lipídico, por meio da adição de 10 mL de solução tampão fosfato (PBS) pH 7,4, adicionada de 0,1%, 5% ou 10% de trealose (Sigma-Aldrich) sob agitação manual (Figura 18E). Posteriormente, a suspensão lipossomal foi sonicada em sonda de ultrassom (Q125/ probe CL18, Qsonica) a 125W/20kHz (Figura 18F), sob banho de gelo, para obtenção de vesículas unilamelares pequenas (Figura 18G). As amostras foram acondicionadas para em tubos criogênicos com capacidade de 5 mL e mantidos a 8 °C até o seguimento das análises.

Foram preparadas 5 formulações que diferiram entre si na quantidade de fármaco utilizado (3 mg a 10 mg), proporção fármaco/lipídio, parâmetros relacionados ao número de rotações por minuto (80 ou 100 rpm), tempo (30 ou 40 min) e temperatura (37 ou 39 ºC) de rotaevaporação, e parâmetros relacionados à sonicação: tempo (1 a 5 min), amplitude (20 ou 60 %) e ciclos on/off (combinações 1 a 5 seg) (Tabela1).

Tabela 1 - Diferentes combinações metodológicas utilizadas no desenvolvimento das formulações de lipossomas

de ENSJ39. Formulações COMPOSIÇÃO PARÂMETROS Fármaco (mg)* Proporção fármaco:lipídio (M) Proporção PC:CHOL:OCTA Rotaevaporação Sonicação T (°C) V (rpm) t (min) A (%) t (min) C (on/off) 1 10 1:15,88 7:2:1 37 100 40 20 1 1seg/ 1seg 2 5 1:34,17 7:2:1 37 100 30 20 1 1seg/ 1seg 3 3 1:57 7:2:1 39 100 30 60 2 5seg / 2seg 4 10 1:19,80 6:2:2 39 100 30 60 2 5seg / 2seg 5 6 1:28,48 7:2:1 39 80 30 60 5 5seg / 2seg

*A formulação de LBR não continha fármaco. Legenda – T: temperatura; V: velocidade; t: tempo; A: amplitude; C: ciclo. Fonte: Próprio autor (2020).

Figura 18 - Etapas do preparo das nanopartículas de lipossoma LE39 e LBR. Dissolução dos constituintes lipídicos e do fármaco em solvente orgânico (A), transferência para balão de fundo redondo (B1:LE39 e B2:LBR) e rotoevaporação (C), obtenção do filme lipídico (D1:LE39 e D2:LBR) e sua hidratação em solução PBS/trealose (E1:LE39 e E2:LBR), sonicação (F) e obtenção das nanossistemas unilamelares LE39 e LBR.

Fonte: Próprio autor (2020).

As combinações dos parâmetros utilizados nas formulações tiveram como referencial outras preparações lipossômicas descritas na literatura que se dedicaram a avaliação e obtenção de lipossomas estáveis; dentre eles os trabalhos de Oliveira (2017), Cavalcanti et al. (2011b) e Andrade et al. (2004).

4.2.2 Caracterização dos lipossomas

Instituições parceiras auxiliaram na execução de alguns ensaios pertinentes a caracterização dos lipossomas desenvolvidos. A avaliação do tamanho de partícula, potencial zeta, índice de polidispersão (PDI) e análise termogravimétrica (TGA) ocorreram no Laboratório de Química Medicinal da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA) do Ceará. A avaliação morfológica das nanopartículas por Microscopia de Força Atômica (AFM) foi realizada no Laboratório de Biotecnologia e Biodiversidade o Grupo de Pesquisa em Biodiversidade e Biotecnologia da Universidade Federal do Delta do Parnaíba (UFDPar) no Piauí. A eficiência de encapsulação foi realizada no Laboratório de Farmacotécnica com apoio metodológico do Grupo de Pesquisa em Nanotecnologia (GPNANO), ambos da UFC.

4.2.2.1 Tamanho de partícula, potencial zeta e PDI

As análises das formulações das nanopartículas de LE39 e LBR em suspensão foram feitas utilizando o princípio de espalhamento dinâmico de luz, onde a fonte de luz (laser de 10mW, He-Ne com comprimento de onda de 633 nm) estava posicionada em ângulo fixo de 90º. A mensuração foi obtida com o uso do aparelho ZetaSizer 3000HSA (Malvern,UK), onde no interior da célula eletroforética foram injetadas as amostras, previamente diluídas 1:100 em água ultrapurificada. A mesma análise foi realizada com as formulações após processo de liofilização por 72 h (Micromodulyo freeze dryer, Thermo), previamente mantidas por 24 h a -80°C.

A avaliação do diâmetro médio das nanopartículas também foi realizada por Microscopia de Força Atômica (AFM) (modelo TT, EUA). Essa técnica está descrita a seguir.

4.2.2.2 Análise morfológica das partículas por AFM

As amostras de LE39 e LBR foram diluídas em proporção de 1:10, em água ultrapurificada estéril, e deixadas em banho de ultrassom por 15 minutos. Posteriormente, foi retirada alíquota de 10 µL de cada amostra e depositada em superfície de mica, em seguida foi deixada por 15 minutos em estufa a 36 ºC, para a secagem e realização da análise.

O equipamento utilizado para a análise foi o TT-AFM (AFM Workshop - EUA), microscópio de força atômica, no modo contato intermitente, utilizando cantilever de silício da

TED PELLA (TAP300-G10) em frequência de amplitude de aproximadamente 238kHz. O

4.2.2.3 Estudos de interação química

Análises térmicas foram realizadas para avaliação de possíveis interações químicas. Para isso, foi utilizada 10 mg tanto da substância livre (ENSJ39) como dos lipossomas (LE39 e LBR) previamente liofilizados.

A Análise Termogravimétrica (TGA) foi executada através do equipamento STA6000 (PerkinElmer precisely), utilizando a variação de temperatura de 25-240°C (taxa de aquecimento de 10 ºC/min), em atmosfera de azoto (vazão de gás 50 mL/min).

Para a varredura de Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC), foi utilizado o equipamento DSC-60 (Shimadzu) nas mesmas condições do TGA, excetuando a faixa de temperatura, cuja a temperatura máxima da varredura eleita no DSC foi 10°C inferior à de degradação evidenciada previamente no TGA.

4.2.2.4 Eficiência de encapsulação

A avaliação da eficiência de encapsulação visou determinar a porcentagem do composto encapsulado no sistema de liberação.

Incialmente foi preparada a curva padrão da ENJ39, a partir de uma solução estoque de 0,2 mg/mL em acetonitrila (Sigma-Aldrich), submetida a agitação em vortex por 30 minutos. Com esse estoque foram preparados, em triplicata, soluções diluídas nas concentrações de 2, 5, 10, 15, 30 e 50 µg/mL, e os dados de absorbância foram obtidos por espectrofotômetro UV (Genesys 10S UV-VIS, Thermo Scientific), no comprimento de onda previamente determinado, de 256 nm. Os dados foram plotados no Excel (Microsoft Office) e resultaram na equação da reta e no coeficiente de correlação da curva padrão.

Após o preparo da curva analítica padrão, seguiu-se para análise das amostras de LE39 e LBR. Nessa etapa, as amostras, previamente liofilizadas por 72 h, foram ressuspendidas em PBS em momento imediatamente anterior a análise.

O primeiro momento consistiu na quantificação total dos lipossomas. As amostras de LE39 e de LBR foram diluídas 1:10 em acetonitrila, seguida de agitação em vortex por 1 min e banho ultrassônico por 10 min. Posteriormente, as amostras foram filtradas em filtro PTFE (0,22 µm). O procedimento experimental foi realizado em triplicata.

No segundo momento, para a quantificação do lipossoma purificado, a amostra de LE39 foi preliminarmente filtrada em filtro PVDF (0,22 µm) a fim de separar o composto não encapsulado. Posteriormente, a amostra foi diluída em acetonitrila, na proporção1:10 e, em seguida, sofreu agitação em vortex por 1min e sonicação em banho ultrassônico por 10min. O mesmo foi feito com a amostra de LBR. As amostras foram, em seguida, filtradas em filtro PTFE (0,22 µm). O procedimento experimental foi realizado em triplicata.

Ao final, todas as amostras foram analisadas em espectrofotômetro a 256 nm e a acetonitrila foi usada como branco do aparelho. As absorbâncias do lipossoma contendo o composto encapsulado foram subtraídas de seus respectivos brancos (absorbância LE39 purificado – absorbância LBR purificado; absorbância LE39 total – absorbância LBR total) e o resultado foi usado na equação da reta da curva padrão da ENSJ39 para determinação da concentração. A eficiência de encapsulação foi determinada pela fórmula:

EE% = _Concentração de ENSJ39 purificado (µg/mL)_ x 100 Concentração de ENSJ39 total (µg/mL)

Além da utilização do espetro de absorção direto, foi realizada a derivação de primeira ordem, com Δλ=3nm, em combinação com aplicação de suavização (smoothing) com filtro de Savitzky-Golay, ambos obtidos através do software SpectroWSM. No espectro de absorção da primeira derivada (dA/dλ) ocorre anulação no ponto referente ao comprimento de onda máxima do espectro de absorção de ordem zero, é negativo onde a absorção decresce e é positiva onde a absorção aumenta (DONATO et al., 2010; GARCIA, 2004; PASCOAL et al., 2003).

A técnica escolhida para análise da derivada foi a do ponto de anulação, também conhecida por zero crossing. Nessa técnica, mede-se o valor absoluto da amplitude de absorção de um componente da mistura no comprimento de onda do ponto de anulação do outro componente, a fim de eliminar possíveis interferências (WATSON, 2013).

4.2.2.5 Avaliação da estabilidade

Foi realizado o teste de estabilidade acelerada que simula as condições de estresse a que as formulações são submetidas, mimetizando os processos a partir de sua fabricação, transporte e armazenamento.

Para isso, após 24 h da preparação, as formulações foram centrifugadas a 6000 rpm, em uma temperatura de 4 °C por 1 hora para simular a passagem acelerada do tempo e, no tocante as simulações de condições de transporte, as formulações foram submetidas a agitação mecânica por 48 horas a 37 °C em shaker. Esses ensaios foram feitos de acordo com Anchiêta- Junior et al. (2014) e Moreno et al. (2014).

Além dessas análises, foi observada a estabilidade a longo prazo para inferir a durabilidade das formulações em suspensão. Com essa finalidade, foram avaliados aspectos macroscópicos, como homogeneidade, cor, formação de precipitado, presença de cristais ou agregados lipídicos das formulações mantidas sob temperatura ambiente e refrigeração (8ºC) uma vez por mês, durante 4 meses. Após esse período, a formulação foi reavaliada com relação ao tamanho de partícula, potencial zeta e PDI por meio do aparelho ZetaSize 3000HSA (Malvern,UK), conforme metodologia anteriormente descrita.