UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE ODONTOLOGIA
INIBIDORES DE PROTEASES: ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E INFLUÊNCIA NA ADESÃO À DENTINA SUBMETIDA A UM BIOFILME CARIGÊNICO
Niterói 2017
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE ODONTOLOGIA
INIBIDORES DE PROTEASES: ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E INFLUÊNCIA NA ADESÃO À DENTINA SUBMETIDA A UM BIOFILME CARIOGÊNICO
RENATO VIEIRA DE PAIVA
Dissertação apresentada à Faculdade de
Odontologia da Universidade Federal Fluminense, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre pelo Programa de Pós-Graduação em Odontologia - Mestrado.
Área de Concentração: Dentística
Orientador: Profa. Dra. Maristela Barbosa Portela Coorientador: Prof. Dr. Glauco Botelho dos Santos
Niterói 2017
DEDICATÓRIA
A Deus por estar ao meu lado em todos os momentos, por me guiar quando tudo parecia perdido, por me dar forças as inúmeras vezes em que pensei em desistir e por ter colocado pessoas maravilhosas em meu caminho.
Aos meus pais, Carlos e Jociléa por toda dedicação, apoio e confiança depositada em mim durante todos esses anos. A vocês que sempre me ensinaram que somente com muito estudo e esforço conseguiria alcançar tudo que almejo na vida. Por batalharem e abdicarem de muitas coisas para que eu chegasse até aqui.
A conquista é para vocês, com vocês e de vocês.
Mesmo que eu escrevesse infinitas páginas ainda não seriam suficientes às palavras de agradecimento por tudo que sempre fizeram e fazem por mim.
Meu sincero Muito Obrigado!
A minha irmã Cristiane, por todo apoio, incentivo e por ver em mim um exemplo de esforço e determinação a ser seguido. Obrigado por estar ao meu lado sempre.
A minha namorada Cássia, por ter entendido os dias de ausência, os excessos de trabalho, as dificuldades enfrentadas e da atenção merecida que, muitas vezes, não pude lhe dar. Por ter me apoiado acima de tudo. Obrigado por me mostrar que nosso amor é forte o suficiente para superar os diversos obstáculos que nos foram impostos durante essa caminhada. Foi muito importante ter você ao meu lado. Amo você para todo sempre.
A toda minha família, que sempre torceu por mim, em especial aos meus avós Joaquín e Nadir e a minha madrinha Joilza, que sempre contribuíram para a minha educação e formação. Fica aqui o meu carinhoso agradecimento e eterna gratidão.
AGRADECIMENTOS
A minha querida Orientadora, Profa. Dra. Maristela Portela, primeiramente por ter me aceitado como seu orientado, sem mesmo me conhecer. Por ter sido muito mais que uma orientadora, ter sido uma mãe, uma amiga, sempre presente, mesmo que nem sempre fisicamente, quando precisei. Alguém que pude contar sempre. Gostaria de agradecer por esses dois anos de convívio e troca de conhecimentos. Aprendi a admirá-la como profissional e, acima de tudo, como pessoa, por ser essa pessoa batalhadora, transparente e ética, que tive o privilégio de conhecer. Obrigado por ter me dado liberdade para expressar minhas ideias e opiniões, por todo apoio recebido durante essa fase, e por todo ensinamento transmitido. Guardarei com imenso carinho e admiração o privilégio do convívio e a sorte por ter sido seu orientado.
Ao meu co-orientador Prof. Dr. Glauco Botelho, por todo apoio, ajuda e incentivo, desde a época da especialização, para que fosse possível a realização deste trabalho em todas as suas etapas.
Ao Prof. Dr. Eduardo Moreira da Silva, primeiramente, pelo ser humano que é. Em segundo, pelos diversos momentos de aprendizado que vivenciei ao longo dessa etapa. Um exemplo de professor que está sempre disposto a dividir e a transmitir seus conhecimentos, fazendo com que tenhamos força e dedicação para aprendermos cada vez mais. Seus ensinamentos são de grande valia para continuarmos firmes nessa trajetória. Uma grande fonte de inspiração para todos os mestrandos e doutorandos. Só tenho que agradecer imensamente pelos momentos vividos, ensinamentos e conselhos, pelas risadas, pela fé no glorioso alvinegro e, por fim, pela
paixão pelo que faz, mesmo depois de muitos anos de trabalho, dando-nos a certeza de que é possível ser um eterno apaixonado pela profissão.
Aos professores da do departamento da dentística, Dra. Laiza Tatiana Poskus, Dr. José Guilherme Antunes Guimarães, Dr. Jaime Noronha Dutra, Dr. Alexandre Barcellos, Dra. Cristiane Mariote Amaral e Alice. Agradeço pelos ensinamentos e aprendizados, pela paciência, pela companhia, pelas conversas e diversos momentos vivenciados durante esta jornada. Vocês são professores exemplares e uma equipe de profissionais exemplares. Muito obrigado por contribuírem para a minha formação. Agradeço pelos ensinamentos e aprendizados, pela paciência, pela companhia, pelas conversas e diversos momentos vivenciados durante esta jornada. Vocês são professores exemplares e uma equipe de profissionais exemplares. Muito obrigado por contribuírem para a minha formação.
A todos os professores do Laboratório de Microbiologia da UFRJ, em especial a minha amiga Adrielle Manguabeira e a professora Rosângela, por toda ajuda necessária para o planejamento e execução dos testes. Muito obrigado!!!
As Professora Dra. Maíra da COOPE/UFRJ, com quem tive o prazer de conhecer e contribuiu muito para o desenvolvimento desta pesquisa.
Ao professor Dr. Renato Bastos Guimarães do Departamento de Física da UFF por toda a ajuda e disponibilidade em contribuir para o desenvolvimento dessa pesquisa.
Aos alunos da Iniciação Científica: Bruno, Juliane e Amanda, que dedicaram bastante tempo e abdicaram seus raros momentos de descanso para que este trabalho pudesse sair da teoria e se tornado realidade. A ajuda de vocês foi fundamental! Meus mais sinceros agradecimentos e o meu querido muito obrigado!!
Aos amigos do Mestrado e Doutorado. Obrigado pelo carinho, amizade e inesquecíveis momentos vividos na UFF. Posso dizer que a companhia de todos foi essencial para tornar os dias mais leves e fazer com que essa época vivenciada fosse mais prazerosa de se viver. Agradeço pelo compartilhamento de conhecimentos e aprendizado.
Ao técnico do LABION-R e amigo José Maria. Com suas eternas fórmulas e “podas” da jovialidade, suas crenças populares, comprovadas cientificamente pelas “teorias mineiras” e imensa fé na água das ditas 3 montanhas enevoadas da sua cidade, encontramos um eterno garoto solidário, sempre disposto a ajudar. Seus relaxantes e afinados assobios ressonam feito notas musicais e tranquilizam tudo ao seu redor. Seus gabaritos são milagrosos e os corpos de prova saem mais perfeitos do que seu corte de barba e cabelo. Com certeza, os momentos vivenciados e escritos nessa jornada laboratorial foram muito mais fáceis, em virtude de toda sua sabedoria e simplicidade. Muito obrigado por tudo. Com certeza, todas as lições ficarão registradas em minha mente e no meu coração.
À Creidinha, que me ajudou em todos os momentos que eu precisei. Sua amizade e atenção foram importantes no cumprimento dessa jornada. Agradeço pelas risadas e momentos vivenciados. Muito obrigado!!
À Crisolene, que me ajudou em todos os momentos que eu precisei. Sempre com uma palavra amiga e lições da vida cotidiana para ensinar. Sua solidariedade contribuiu para o cumprimento dessa jornada. Agradeço pelo convívio e pelos momentos vividos. Muito obrigado!!
À Léia, que me ajudou em todos os momentos que eu precisei. Muito obrigado pelas clássicas e inesquecíveis coletâneas musicais durante a limpeza. Agradeço também pela confiança em deixar, diversas vezes, fechar o departamento. Desculpa
por atrapalhar diversas vezes a faxina do laboratório, em virtude dos ensaios. Sua paciência e compreensão contribuíram para o cumprimento dessa jornada. Muito obrigado pelo convívio e companhia.
A todos os meus amigos que a vida me deu. Obrigado pela amizade, apoio e incentivo em diferentes etapas da minha vida. Por toda a torcida, mesmo de longe, para que desse tudo certo. Mais uma vez, vocês foram fundamentais.
Ao Programa de Pós-graduação em Odontologia e a CAPES pela concessão da bolsa.
E a todos aqueles que, de alguma maneira, me incentivaram e colaboraram para que eu chegasse até aqui. Meu mais sincero muito obrigado!
“O que você faz com amor e cuidado tem uma chance de fazer diferença, tanto para você, como para a vida de outras pessoas. Tudo o que se faz sem amor e sem convicção é fadado ao fracasso e à perda de tempo, para você e para os outros” (Wim Wenders).
RESUMO
Paiva R. V. Inibidores de proteases: atividade antimicrobiana e influência na adesão à dentina submetida a um biofilme cariogênico [Dissertação]. Niterói: Universidade Federal Fluminense, Faculdade de Odontologia; 2017.
O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de inibidores de proteases na atividade de biofilme de S. mutans e desempenho da resistência de união, após um biofilme cariogênico. Discos de dentina e palitos de resina-dentina foram obtidos, a partir de molares que foram condicionados com ácido fosfórico apenas (grupo controle - GC) e também pré-tratados com diacetato de clorexidina (GCXD), 1,10-fenantrolina (PHENG); Trans-Epoxissuccinil-L-Leucylamido (4-guanidino) butano (GE-64) e Epigalocatequina-3-galato (GEGCG). A molhabilidade dentinária foi mensurada por goniometria. O desempenho da resistência de união foi avaliado por microtração (μTBS) e expressão da nanoinfiltração (INP%) e (PMP%), antes e após a exposição ao biofilme de S. mutans. A viabilidade celular (MTT) e a produção de ácido láctico pelo biofilme de S mutans foram utilizados para avaliar a atividade antibacteriana dos inibidores de proteases. Os dados foram avaliados através de análises de variância e teste de Tukey HSD para contraste entre as médias (α=0.05). Os quatro inibidores de proteases aumentaram a molhabilidade dentinária (GC <GCXD <GFEN <GE-64 <GEGCG), (p <0,05). O biofilme de S. mutans diminuiu o RμT do GC (p <0,05), onde, quanto aos grupos pré-tratados com os quatro inibidores de proteases, manteve o (SNU%) e (SMP%) após a exposição ao biofilme de S. mutans (p> 0,05). Os quatro inibidores de proteases diminuíram a viabilidade do MTT e a produção de ácido láctico pelo biofilme de S. mutans (p <0,05). Os quatro inibidores de proteases aumentaram a molhabilidade dentinária e preservaram a resistência de união e a expressão da nanoinfiltração após a exposição ao biofilme de S. mutans. A atividade metabólica de
S. mutans e a produção de ácido lático foram reduzidas após tratamento dentinário
com inibidores de proteases.
ABSTRACT
Paiva R. V. Inhibitors of proteases: antimicrobial activity and influence on adhesion to dentin submitted to a cariogenic biofilm. [Dissertation]. Niterói: School of Dentistry, Fluminense Federal University; 2017.
The objective of this study was to evaluate the effect of proteases inhibitors on S.
mutans biofilm acitivity and resin-dentin bond performance after cariogenic biofilm.
Dentin discs and resin-dentin beams are obtained from molars were etched with phosphoric acid only (control group – CTG) also pretreated with chlorhexidine diacetate (CHXDG), 1,10-phenanthroline (PHENG), Trans-Epoxysuccinyl-L-Leucylamido (4-guanidino) butane (E-64G) and Epigallocatechin-3-gallate (EGCGG). The dentin wettability by goniometry. The bonding performance was evaluated by microtensile bond strength (µTBS) and nanoleakage expression (SNU%) and (SMP%) before and after exposition to S. mutans biofilm. The MTT cell viability and lactic acid production by S. mutans biofilm were used to evaluate the antibacterial activity of the proteases inhibitors. The data were treated by ANOVA and Tukey HSD test. The four proteases inhibitors increased the dentin wettability (CTG < CHXDG < PHENG < E-64G < EGCGG), (p < 0.05). The S. mutans biofilm decreased the µTBS of CTG (p < 0.05), whereas for the groups treated with the four proteases inhibitors maintained the (SNU%) and (SMP%) after cariogenic challenge (p > 0.05). The four protease inhibitors decreased the MTT viability and the lactic acid production by S. mutans biofilm (p < 0.05). The four proteases inhibitors increased the dentin wettability and preserve the resin-dentin bond and the nanoleakage expression after cariogenic challenge. The S.
mutans metabolic activity and the lactic acid production were reduced after dentin
treatment with proteases inhibitors.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 11
2. METODOLOGIA ... 13
2.1. Desenho do estudo e materiais ... 13
2.2. Confecção dos corpos de prova ... 14
2.3. Avaliação da nanoinfiltração ... ...16
2.4. Ensaio de microtração.. ... . 18
2.5. Análise do padrão de fratura ... 18
2.6. Medições dos ângulos de contato ……… ... 19
2.7. Avaliação das propriedades antimicrobianas ... 19
2.8. Análise Estatística ... 20
3. ARTIGO PRODUZIDO ... 22
4. CONCLUSÃO ... 44
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 45
1 - INTRODUÇÃO
Um dos principais fatores responsáveis pela durabilidade das restaurações dentárias realizadas com compósitos é a estabilidade da interface de união resina-dentina.1,2 No entanto, mesmo com os recentes avanços dos sistemas adesivos,
muitos estudos laboratoriais e clínicos têm demonstrado que a interface adesiva continua sendo a região mais frágil das restaurações adesivas.2,3
As características da interface adesiva produzida em esmalte e dentina foram profundamente estudadas.3,4 Embora a resistência de união em esmalte pareça ser
efetiva e confiável, o procedimento adesivo em dentina permanece crítico. Sendo assim, a longevidade das restaurações em compósito com áreas marginais em dentina ainda é um desafio.4 Isto se deve à heterogeneidade da dentina, que se
apresenta como uma estrutura complexa, onde 90% da matriz orgânica é composta por colágeno.5,6 Além disso, a degradação das fibrilas de colágeno expostas devido à
incompleta infiltração de monômeros resinosos na dentina recém condicionada pelo ácido fosfórico, tem sido apontada como fator importante no comprometimento da integridade da camada híbrida.7,8
Além disso, o biofilme oral formado na superfície do compósito é capaz de promover sua degradação, através da liberação de enzimas e ácidos levando a maior rugosidade superficial e a uma crescente impregnação de microrganismos.9 Assim,
estes podem invadir a interface, levando a formação de cárie recorrente.10,11 Dessa
forma, alguns estudos utilizam modelos biológicos in vitro, com imersão em biofilme cariogênico, simulando o processo de formação de lesão cariosa, a fim de verificar uma resposta mais real das novas técnicas e materiais restauradores.12,13
A literatura sugere que as enzimas proteolíticas presentes na matriz extracelular da dentina desmineralizada exerçam um importante papel na degradação do colágeno.14,15 Esta degradação das fibrilas de colágeno vem sendo associada ao
ataque enzimático pelas metaloproteinases da matriz (MMPs), sendo que essas endopeptidases estão presentes na dentina e na saliva.16 Evidências científicas
mostram que 23 tipos diferentes de MMPs humanas já foram identificadas17 e,
normalmente, encontram-se na forma latente por intermédio de inibidores teciduais de metaloproteinases (TIMPs)18,19, já relatados sua presença em dentina coronária.20
As MMPs constituem-se em um grupo de enzimas (endopeptidases), que são dependentes de Cálcio e Zinco para manter sua estrutura terciária e seus sítios de ativação, e com a capacidade de degradar os componentes da matriz extracelular e das membranas basais.21,22 Elas estão aprisionadas e inativadas na matriz da dentina
mineralizada e são ativadas pela desmineralização parcial da dentina por ácidos.23 O
colágeno exposto, não atingido pelo sistema adesivo, é então degradado na interface dentina-resina por elas.24 Além da ativação MMPs, o ambiente ácido também é capaz
de ativar um outro grupo de enzimas, as Cisteíno proteases (CPs), que também estão presentes na dentina e no tecido pulpar.25,26 Em ensaios laboratoriais, a presença de
catepsina B (CT-B) foi identificada em dentina sadia e em dentina cariada e foi observado variação de sua atividade em ambos tipos de dentina, sendo maior a expressão de CT-B e outras classes de cisteíno-catepsinas em dentina cariada quando comparada à dentina sadia.27,28
Assim, com base neste fenômeno deletério, justifica-se o esforço de vários estudos em associar aos materiais restauradores, também, substâncias ativas contra a ação hidrolítica e colagenolítica.29,30 Sendo assim, o objetivo deste estudo in vitro foi
avaliar a atividade antimicrobiana e o efeito na adesão à dentina, submetido ao biofilme de S. mutans, de inibidores de cisteíno e metaloproteases. Foram testadas as seguintes hipóteses nulas: (1) o tratamento superficial da dentina com os inibidores de proteases não a molhabilidade da dentina; (2) o tratamento superficial da dentina com os inibidores de proteases não afetaria na microtração e a nanoinfiltração e; (3) os inibidores de proteases não apresentariam atividade antimicrobiana na formação do biofilme de S. mutans.
2 - METODOLOGIA
2.1 Desenho do Estudo e Materiais
Na Tabela 1 estão descritos os grupos utilizados nos ensaios experimentais e as fórmulas estruturais dos inibidores de proteases no presente estudo.
Tabela 1: Grupos utilizados nos ensaios experimentais e as fórmulas estruturais dos inibidores de proteases.
Grupos Fórmula Estrutural
(GCT) Sem Inibidor
(Apenas Condicionamento com ácido H3PO4 37%)
(GDCLX)
(Condicionamento com ácido H3PO4 37% + Solução de
Diacetato de Clorexidina 320µM)
(GFEN)
(Condicionamento com ácido H3PO4 37% + Solução de
1,10-Fenantrolina 100µM)
(GE-64)
(Condicionamento com ácido H3PO4 37% + solução de
trans
-Epoxissuccinil-leucilamido-
[4- guanidino] butano 10µM) (GEGCG)
(Condicionamento com ácido H3PO4 37% + solução de
Epigalocatequina-3-O-galato 100µM)
Na tabela 2, estão descritos a composição e os fabricantes de todos os materiais comerciais utilizados no presente estudo.
2.2 Confecção dos corpos de prova
Para os ensaios deste estudo, foram confeccionados corpos de prova obtidos a partir de 120 terceiros molares humanos, recém-extraídos e livres de desmineralizações e defeitos de desenvolvimento. Estes dentes foram previamente armazenados por 7 dias em solução aquosa de cloramina a 0,5 % para desinfecção e mantidos em água destilada sob refrigeração até o momento da sua utilização. Os dentes foram incluídos pelas raízes, com resina acrílica, dentro de anéis de PVC. Após a polimerização da resina acrílica, o esmalte coronário foi removido em cortadeira metalográfica (ISOMET 1000, Buehler Ltd, IL, EUA), expondo a camada superficial de dentina. Em seguida, o esmalte periférico foi removido com uma ponta diamantada (3100, KG Sorensen, Curitiba, PR, BR) montada em turbina de alta rotação sob refrigeração. Com o objetivo de padronizar a produção de smear layer, as superfícies de dentina expostas foram desgastadas, sob refrigeração constante, com lixas de carbeto de silício 400 / 60s / 150 rpm e 600 / 60s / 150rpm em politriz (DPU 10, Struers, DEN). Após a remoção do esmalte, os dentes foram analisados em estereomicroscópio (SZ40, Olympus, Tókio, JPN), com aumento de 40x para verificar a total remoção do esmalte. Os dentes foram divididos aleatoriamente em 5 grupos
Tabela 2: Composição dos materiais e fabricantes utilizados no presente estudo.
Material Composição Fabricante
Condicionador Dental Gel
Ácido fosfórico 37% (Dentsply, York, PA, USA) Inibidores de Proteases Diacetato de clorexidina, 1,10-Fenantrolina,
trans-Epoxisuccinil-L-leucilamido[4-guanidino] butano, Epigalocatequina-3-O-gallato (Sigma Aldrich® St. Louis, MO, USA) Adper Single Bond 2
Bis GMA (10-20%), HEMA (5-15%), etanol (25-30%), água (<5%), glicerol 1,3-dimetacrilato
(5-10%), UDMA (5-15%) copolímero de ácido acrílico e ácido itacônico, sílica tratada (-nanoparticulado 10-20%), hexafluorofosfato de difeniliodónio (3M ESPE, St Paul, MN, USA) Filtek Z250
Bis-EMA, Bis-GMA, TEGDMA, UDMA, zircónia / sílica com 0,01 a 3,50µm e médiotamanho 0,6µm e 60% em volume das partículas de
preenchimento
(3M ESPE, St Paul, MN, USA)
(n=6). Nos ensaios de medição do ângulo de contato e na avaliação das propriedades antimicrobianas, foram confeccionados discos de dentina de 1,0 mm de espessura por dente, que receberam o tratamento dentinário, de acordo com a tabela 1. Realizou-se o condicionamento ácido com H3PO4 durante 15s, lavagem com água destilada por
30s, seguido de secagem com papel absorvente. O tratamento da superfície dentinária com os inibidores de proteases foi realizado com o auxílio de um microaplicador por 60s e os excessos foram removidos com papel absorvente.
Para os ensaios de microtração e avaliação da nanoinfiltração, a hibridização da dentina com o adesivo Adapter Single Bond 2 (3M-ESPE- St Paul, EUA) seguiu as recomendações do fabricante. Em seguida, blocos de compósito Filtek Z250 (3M-ESPE- St Paul, EUA), com 5,0 mm de altura, foi construído incrementalmente sobre a superfície dentinária. Cada incremento foi fotoativado com irradiância de 1000 mW/cm2 por 20 segundos (DEMI, Demetron Inc., Danburry, EUA). Durante todo o
processo, a irradiância do aparelho foi aferida com um radiômetro (modelo 100, DemetronInc, Danburry, EUA). Após a confecção do bloco de compósito, os dentes foram armazenados em água destilada, em estufa a 37,0 ºC, durante 24 horas.
Após isto, os dentes foram levados à cortadeira metalográfica (IsoMet 1000, Buëhler, Lake Bluff, IL, EUA) e seccionados serialmente com um disco diamantado dupla face, sob refrigeração, em dois planos perpendiculares à interface adesiva, de modo a obter palitos com aproximadamente 1,0 mm2 de seção transversal. Após o
corte, todos os palitos foram avaliados em estereomicroscópio (SZ40, Olympus, Tókio, JPN), com aumento de 40x, para descartar aqueles com defeitos estruturais (trincas ou bolhas no compósito).
Os palitos obtidos de cada dente, para cada grupo, foram divididos aleatoriamente em dois subgrupos: 1) 24 horas de imersão em água destilada (AD) e 2) submetidos a formação de biofilme de S. mutans por 48 horas ao desafio cariogênico (DC). Os palitos submetidos ao biofilme cariogênico, foram pintados com esmalte (Colorama – CIEIL- SP, BR) deixando 1,0 mm2 livre, em torno, da interface
de união. Em seguida, os espécimes foram fixados em placas de 24 poços (TPP, 24 Zellkultur Festplatte F, ALE). Após esterilização por raios UV durante 30 minutos, o biofilme foi induzido em meio de cultura Brain Heart Infusion (BHI, Difco, Sparks, EUA) suplementado com 1,0 % de sacarose.13
O biofilme maduro foi formado por Streptococcus mutans. A cepa de S. mutans ATCC 25175 (American Type Culture Collection, Fiocruz, Rio de Janeiro, RJ, BR)
utilizada foi cultivada durante 24 horas em BHI líquido a 37 °C em condições de baixa tensão de oxigênio. O inóculo bacteriano foi ajustado para uma densidade óptica (DO) de 0,5 a 550,0 nm de acordo com a escala de McFarland. A suspensão bacteriana foi diluída até 1:100, e, em seguida, 10,0 uL do inóculo foi adicionado em cada poço, juntamente com 2 ml de BHI suplementado com 1,0 % de sacarose. As placas de cultura foram incubadas a 37,0 °C em condições de baixa tensão de oxigênio, durante 48 horas. Durante os 2 dias de formação do biofilme, o meio de cultura foi substituído a cada 24 horas.
Este protocolo baseou-se no resultado de um estudo anterior13, com objetivo
de estabelecer um período em que as amostrar puderam ser mantidas imersas no meio contendo S. mutans, sem causar elevadas taxas de desmineralização em dentina, o que tornaria inviável a realização do teste de microtração, pois levaria a incidência de falhas coesivas na dentina.
2.3. Avaliação da Nanoinfiltração
Quatro palitos de cada dente, por condição experimental, foram reservados para este teste. Dois foram submetidos à solução amoniacal de nitrato de prata e os outros dois foram submetidos à técnica de pigmentação com metanamina de prata, com a finalidade de observar a qualidade da interface de união. Portanto, duas técnicas foram utilizadas para esse teste:
1) Nitrato de prata amoniacal: Os palitos selecionados receberam aplicação de uma camada de esmalte escuro para unhas a 1,0 mm da interface adesiva em ambas extremidades. Em seguida, foram imersos individualmente em solução aquosa de nitrato de prata amoniacal (AgNO3) 50,0 % em peso (pH = 7,0) (Synth, Diadema,
SP, BRA) e foram mantidos em ambiente escuro durante 24 horas. Ao término do período de armazenamento, cada espécime foi lavado em água destilada e imerso em solução reveladora (Kodak, Rochester, NY, EUA) sob luz fluorescente, por 8 horas, para que houvesse precipitação dos íons metálicos de prata ao longo dos defeitos da interface de união. As superfícies a serem avaliadas foram polidas com lixas de carbeto de silício nas granulações 600, 1200 e 4000 durante 3 minutos cada. Os espécimes foram então limpos em uma cuba ultrassônica durante 10 minutos
(Ultrassom 750 USC – Quimis, Diadema, SP, BRA) e secos em dissecador (Quimis, Diadema, SP, BRA) contendo sílica gel azul por 48 horas.
2) Metanamina de Prata: Os palitos selecionados receberam aplicação de uma camada de esmalte escuro para unhas a 1,0 mm da interface adesiva em ambas extremidades. Em seguida, foram preparadas duas soluções (A e B) na hora de uso. Primeiramente, para a obtenção da solução A foram misturados 2,0 mL de solução bórax a 3,0 % (Merck, Jacarepaguá, RJ, BRA), com 25,0 mL de água deionizada. Para a solução B; 0,2 g de cristais de nitrato de prata (Synth, Diadema, São Paulo, SP, BRA) foram dissolvidos em 2,0 mL de água destilada obtendo, assim, solução aquosa de nitrato de prata amoniacal 10.0 % em peso (pH 7,0). Em seguida, desta solução foram retirados 1,75 mL os quais foram misturados com 25,0 mL de solução de urotropina (Reagen, Colombo, PR, BRA) ou, também denominada de metenamina, a 3,0 % formando, finalmente, a solução B. Obtidas as soluções A e B, estas foram misturadas adicionando-se a primeira sobre a segunda. O volume final (± 50,0 mL) foi filtrado através de papel absorvente. Os palitos foram imersos individualmente nesta solução por 90 minutos em estufa à 37 °C. Após este período, cada espécime foi lavado em água destilada por 3 minutos e, em seguida, imersos em solução de tiossulfato de sódio a 2,0 % (JT Baker Chemical Co. Phillipsburg, NJ, EUA) durante 5 minutos para que houvesse redução dos íons de prata e pigmentação ao longo das fibras colágenas não-mineralizadas. As superfícies a serem avaliadas foram polidas com lixas de carbeto de silício nas granulações 600, 1200 e 4000 durante 3 minutos cada. Os espécimes foram então limpos em uma cuba ultrassônica durante 10 minutos (Ultrassom 750 USC – Quimis, Diadema, SP, BRA) e secos em dissecador (Quimis, Diadema, SP, BRA) contendo sílica gel azul por 48 horas.
As interfaces de união foram analisadas em um microscópio eletrônico de varredura (Phenom ProX, Phenom-World BV, Eindhoven, HOL), operando no modo baixo vácuo com elétrons retroespalhados. Foram adquiridas três imagens em regiões elétron-densas: uma na região central e as demais a 0,3 mm da extremidade, com um aumento de 2000 x e 15 Kv de tensão. Em seguida, foi realizada a espectroscopia de energia dispersiva de Rx (EDS - Phenom ProX, Phenom-World BV, Eindhoven, HOL), para registro da porcentagem em peso da prata. Somente os nanoespaços preenchidos por grão de prata e fibrilas colágenas coradas pela metenamina de prata foram consideradas. Uma média foi calculada para cada palito, sendo utilizada para a análise estatística.
2.4 Ensaio de microtração
Os palitos restantes tiveram suas faces dimensionadas com auxílio de um paquímetro digital (MPI/E-101, Mytutoyo, Tokyo, JPN) para o cálculo da área de seção transversal destes. Posteriormente, foram fixados com adesivo à base de cianoacrilato (Superbonder Gel, 3M, São Paulo, BRA) e submetidos ao ensaio de microtração, com velocidade de deslocamento de 1,0 mm/min em uma máquina de ensaios mecânicos universal (DL 2000, EMIC, São José dos Pinhais, São Paulo, BRA). A força registrada no momento da fratura foi dividida pela área aderida, a fim de se obter os valores de resistência de união em MPa (MN/m2).
Uma média foi calculada com os valores de resistência de união apresentados pelos palitos obtidos para cada dente, de modo que o dente foi considerado a unidade experimental para o teste estatístico.
Após o teste de microtração, todos os palitos foram avaliados em estereomicroscópio (SZ40, Olympus, Tokyo, JPN) para avaliação do padrão de falha, que foi classificada como adesiva (falha nas interfaces adesivas), coesiva (falhas ocorrendo no corpo da dentina ou do compósito) ou mista (conjunção de falha adesiva e coesiva dentro de uma mesma área).
2.5 Análise do padrão de fratura
Palitos apresentando diferentes padrões de falha e com valores de resistência de união próximos a média dos seus grupos foram analisados através de MEV. Os palitos foram montados em porta amostra com redução de carga e observados em MEV (Phenom ProX, Phenom-World, Eindhoven, HOL) operando em modo de elétrons retroespalhados, em ambiente de baixo vácuo. As imagens foram obtidas com ampliações de 270x e 2000x.
2.6 Medições dos ângulos de contato
Foram utilizados 30 terceiros molares e foram confeccionados espécimes, conforme dito no item 2.2. Os ângulos de contato das superfícies dos discos de dentina e o adesivo foram avaliados, imediatamente, após as condições experimentais, através do ganiômetro (Modelo 200, Ramé-hart Instrument Company, Netcong, EUA). Sobre a superfície dentinária, foi aplicado o volume de 2,0 µL do adesivo Adper Single Bond 2 (3M ESPE, St. Paul, MN, EUA), com auxílio de uma seringa de 1,0 mL, seguida da medição do ângulo de contato. Trinta medidas, com um intervalo de 1 segundo entre elas. Com base nos dados obtidos para o líquido, o software Ramé-Hart calculou o ângulo de contato dos grupos.
2.7 Avaliação das propriedades antimicrobianas
Foram utilizados 60 terceiros molares e foram confeccionados espécimes, conforme dito no item 2.2. Após esta etapa, os discos foram esterilizados com óxido de etileno (Bioxxi, Sterilization Services, Rio de Janeiro, RJ, BRA). As soluções de inibidores de proteases foram aplicadas na superfície dentinária com o auxílio de um microaplicador estéril. Toda esta etapa foi realizada dentro de uma câmara de fluxo laminar (ambiente estéril).
Os discos de dentina esterilizados e previamente tratados foram colocados em placas de 24 poços (TPP, 24 ZellkulturFestplatte, SUI), com a superfície de tratamento voltada para cima. Foram adicionados em cada poço 2,0 mL de meio de cultura Brain Heart Infusion (BHI, Difco, Sparks, EUA) suplementado com 2,0 % de sacarose.
A cepa de S. mutans ATCC 25175 (American Type Culture Collection, Fiocruz, Rio de Janeiro, RJ, BRA) utilizada foi cultivada durante 24 horas em BHI a 37,0 °C em condições de baixa tensão de oxigênio. O inóculo bacteriano foi ajustado para uma densidade óptica (DO) de 0,5 a 550,0 nm de acordo com a escala de McFarland. A suspensão bacteriana foi diluída até 1: 100, e, em seguida, 10,0 uL do inóculo foi adicionado em cada poço. As placas de cultura de 24 poços foram incubadas a 37,0
°C em condições de baixa tensão de oxigênio, durante 48 horas. Durante os 2 dias de formação do biofilme, o meio de cultura foi substituído a cada 24 horas.
Os blocos de dentina com biofilme de S. mutans de 48 horas foram lavados com solução tampão fostato (pH 7.2) estéril (PBS) e depois transferidos para a nova placa de 24 poços. Os blocos foram então lavados uma vez com água cisteína peptona estéril (CPW) e uma alíquota de 1,0 ml de água peptonada estéril (BPW) suplementada com 0,2 % de sacarose foi adicionada a cada poço. As placas foram incubadas em condições de baixa tensão de oxigênio a 37,0 ºC durante 3 horas. Após este período, os sobrenadantes foram armazenados para análise de lactato utilizando um método enzimático.31 Resumidamente, a reação enzimática a que os
sobrenadantes foram submetidos foi medida utilizando um leitor de microplacas, com um comprimento de onda de 340nm. Os valores obtidos foram interpretados usando uma curva padrão preparada com um padrão de ácido láctico.31
A viabilidade celular dos biofilmes de S. mutans sobre os blocos foi analisada pelo ensaio de redução do brometo de metilotiazolilobrometo de tetrazólioazul (MTT, Sigma Aldrich, St. Louis, EUA). A reação que utiliza o MTT trata-se de um ensaio colorimétrico que mede a redução enzimática de MTT, um tetrazol amarelo, a formazan de coloração púrpura. Portanto, 1,0 mL de MTT estéril (1,0 mg / ml em PBS) foi adicionado a cada poço e incubou-se a 37°C em condições de baixa tensão de oxigênio durante 1 hora.Depois, os discos foram transferidos para uma nova placa de 24 poços, 1,0 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) foi adicionado a cada poço e as placas foram incubadas durante 20 minutos à temperatura ambiente, protegidas da luz e com agitação suave. As suspensões de DMSO foram submetidas um leitor de microplacas com comprimento de onda de 540,0 nm. Uma absorbância maior é indicativa de uma concentração maior de formazan, o que, por sua vez, indica uma maior atividade metabólica do biofilme.32
2.8 Análise Estatística
A análise estatística foi realizada com o software Statgraphics Centurion 16.1 Software (Manugistics, Rockville, MD, USA). Inicialmente foram aplicados os testes de Shapiro-Wilk e Levene para verificação da normalidade das distribuições e da
homocedasticidade das variâncias. Em função dos resultados, os dados de análise referente ao ângulo de contato, MTT e produção de ácido lático foram analisadas utilizando o teste de análise de variância de um fator. Os dados de análise referente a microtração e nanoinfiltração foram analisados utilizando o teste de análise de variância de dois fatores. O teste de Tukey HSD foi realizado para contraste das médias para ambas as análises. Todas as análises foram realizadas a um nível de significância de α = 0,05.
3 - ARTIGO PRODUZIDO (Será submetido ao periódico Journal of Dentistry)
Can protease inhibitors stabilize the adhesive interface after cariogenic challenge and exhibit antimicrobial activity?
Renato Vieira de Paivaa/ Juliane Cuccinelob/ Amanda Vaz dos Reisc/ Glauco Botelho
dos Santosd/ Marcela Rocha de Oliveira Carrilhoe/ Eduardo Moreira da Silvaf/ Maristela
Barbosa Portelag
a DDS, MSc student, Analytical Laboratory of Restorative Biomaterials, School of
Dentistry, Federal Fluminense University, Niterói, Rio de Janeiro, Brazil. (Idea, performed the experiments in partial fulfilment of requirements for a degree, wrote the manuscript).
b Undergraduate student, Analytical Laboratory of Restorative Biomaterials, School of
Dentistry, Federal Fluminense University, Niterói, Rio de Janeiro, Brazil. (Performed a certain test).
c Undergraduate student, Analytical Laboratory of Restorative Biomaterials, School of
Dentistry, Federal Fluminense University, Niterói, Rio de Janeiro, Brazil. (Performed a certain test).
d DDS, MSc, PhD, Adjunct Professor, Analytical Laboratory of Restorative
Biomaterials, School of Dentistry, Federal Fluminense University, Niterói, Rio de Janeiro, Brazil. (Idea, hypothesis, experimental design, wrote and proofread manuscript).
e DDS, MSc, PhD, Professor of Bandeirantes University of São Paulo (UNIBAN), São
Paulo, Brazil. (Proteases experimental, design and wrote)
f DDS, MSc, PhD, Associate Professor, Analytical Laboratory of Restorative
Biomaterials, School of Dentistry, Federal Fluminense University, Niterói, Rio de Janeiro, Brazil. (Idea, hypothesis, experimental design, statistical analysis wrote and proofread manuscript).
g DDS, MSc, PhD, Adjunct Professor, Analytical Laboratory of Restorative
Biomaterials, School of Dentistry, Federal Fluminense University, Niterói, Rio de Janeiro, Brazil. (Coordinator of the project, study idea and design idea, hypothesis, experimental design, wrote and proofread manuscript).
*Corresponding author: Dra. Maristela Barbosa Portela– Universidade Federal Fluminense / Faculdade de Odontologia – Rua Mário Santos Braga, nº 30 - Campus Valonguinho, Centro, Niterói, RJ, Brazil - CEP 24020-140 - Phone: +55 21 2629- 9832 - Fax: +55 21 2622-5739 - e-mail: mbportela@hotmail.com
Abstract
Objective: Evaluate the effect of proteases inhibitors on S. mutans biofilm activity and resin-dentin bond performance after cariogenic challenge.
Materials and Methods: Dentin discs and resin-dentin beams are obtained from molars were etched with phosphoric acid only (control group – CTG) and also pretreated with chlorhexidine diacetate (CHXDG), 1,10-phenanthroline (PHENG), Trans-Epoxysuccinyl-L-Leucylamido (4-guanidino) butane (E-64G) and Epigallocatechin-3-gallate (EGCGG). The dentin wettability by goniometry. The bonding performance was evaluated by microtensile bond strength (µTBS) and nanoleakage expression (SNU%) and (SMP%) before and after exposition to S.
mutans biofilm. The MTT cell viability and lactic acid production by S mutans biofilm
were used to evaluate the antibacterial activity of the proteases inhibitors. The data were treated by ANOVA and Tukey HSD test.
Results: The four proteases inhibitors increased the dentin wettability (CTG < CXDG < PHENG < E-64G < EGCGG), (p < 0.05). The S. mutans biofilm decreased the µTBS of CTG (p < 0.05), whereas for the groups treated with the four proteases inhibitors maintained the (SNU%) and (SMP%) after cariogenic challenge (p > 0.05). The four protease inhibitors decreased the MTT viability and the lactic acid production by S.
mutans biofilm (p < 0.05). The four proteases inhibitors increased the dentin wettability
and preserve the resin-dentin bond and the nanoleakage expression after cariogenic challenge.
Conclusion: The S. mutans metabolic activity and the lactic acid production were reduced after dentin treatment with proteases inhibitors.
Clinical Significance: The use of the proteases inhibitors after acid etching and before dentin hybridization could be used as a new strategy to improve the resin-dentin bond performance and to reduce the viability of S. mutans biofilm.
INTRODUCTION
One of the main factors responsible for the durability of composite restorations is the stability of the resin-dentin bond interface.1,2 However, even with
recent advances in adhesive systems, many laboratory studies and clinical trials have shown that the adhesive interface remains the region most fragile of the adhesive restorations.2,3
The characteristics of the adhesive interface produced in enamel and dentin were deeply studied.3,4 Although the bond strength obtained on enamel surface
seems to be effective and reliable, the dentin adhesive procedure remains critical. Hence, the longevity of composite restorations with dentin marginal areas is still a challenge.4 This different behavior can be related to the heterogeneity of dentin, a
complex structure, where ~30 vol% of the organic matrix, which 90% is composed of collagen.5,6 Although that organic matrix has a very important role on the hybrid
layer formation, the degradation of the exposed collagen fibrils, due to incomplete infiltration of resin monomers in the demineralized dentin, has been proposed as one of the major reasons of long-term damage on the hybrid layer.7,8
In addition, the oral biofilm formed on the surface of the composite is able promote the degradation through the release of enzymes and acids leading to greater surface roughness and an increased impregnation of the micro-organisms.9
Hence, these can invade the interface and leading to the formation of recurrent caries.10,11 In this way, some studies using biological models in vitro, with immersion
in biofilm, simulating the cariogenic challenger and the process of formation of the carious lesion, order to check an answer more real of new techniques and of the restorative materials.12,13
The literature suggests that the proteolytic enzymes present in the extracellular matrix of the demineralized dentin to exert an important role in the degradation of collagen.14,15 This degradation of fibrils of collagen has been related
to an enzymatic attack by the matrix metalloproteinases (MMPs), which are present in dentin and saliva.16 Scientific evidence shows that 23 different types of MMPs in
tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) 18,19 and their presence in coronal
dentin has already been reported. 20
The MMPs are constituted by a group of enzymes (endopeptidases), dependent of Ca++ and Zn++ to maintain their tertiary structure and their activation sites, with the ability to degrade components of the extracellular matrix and basal membranes.21,22 They are trapped and inactivated in the matrix of mineralized
dentin, being activated by the partial dentin demineralization by acids23, which
exposes collagen and leads to the degradation of the dentin-resin interface.24 In
addition to the activation of MMPs, the acid environment is also able to activate another group of enzymes, the cysteine proteases (CPs), which are also present in dentin and in the pulp tissue.25,26 In laboratory tests, the presence of cysteine
cathepsin B (CT-B) was identified in healthy dentin and infected dentin, and has been observed the variation of its activity in both types of dentin, with a higher expression of CT-B and other classes of cysteine cathepsins in infected dentin compared to healthy dentin.27,28
Based this deleterious phenomenon, is justified the effort of several studies associate the restorative materials, also, active substances against the hydrolytic and collagenolytic actions29,30. Therefore, the purpose of the present study was to
evaluate the antimicrobial activity and the effect on dentin adhesion, after S. mutans biofilm exposition of proteases inhibitors. The null hypotheses tested were: (1) dentin surface treatment with proteases inhibitors not dentin wettability; (2) surface treatment of dentin with proteases inhibitors would not affect microtensile and nanoleakage; (3) proteases inhibitors would not exhibit antimicrobial activity in the formation of S. mutans biofilm.
MATERIALS AND METHODS
Experimental Design
The groups and the structural formulas of the protease inhibitors in the present study are described in Table 1.
The manufactures of all commercial materials used in the present study are shown in table 2.
Table 1: Groups used in experimental assays and structural formulas of proteases inhibitors.
Groups Structural Formula
(GCT) No Inhibitor
(37% phosphoric acid only)
(GCLXD) (37% phosphoric acid + Chlorexidine diacetate solution
320µM)
(GPHEN)
(37% phosphoric acid + 1,10-Phenanthroline solution 100µM)
(GE-64)
(37% phosphoric acid + trans- Epoxysuccinyl-L-leucylamido[4-guanidino] butane solution 10µM)
(GEGCG)
(37% phosphoric acid + Epigallocatechin-3-O-gallate
Table 2: Composition and manufactures of the materials used in the present study.
Material Composition Manufacturer
Dental Gel Conditioner Phosphoric acid 37% (Dentsply, York,
PA, USA) Proteases
Inhibitors
Chlorexidine diacetate, 1,10-Phenanthroline, trans-Epoxysuccinyl-L-leucylamido[4-guanidino] butane, Epigallocatechin-3-O-gallate
(Sigma Aldrich® St. Louis, MO, USA) Adper Single Bond 2
BisGMA (10-20%), HEMA (5-15%), ethanol (25-30%), water (<5%), glycerol 1,3-dimethacrylate (5-10%), (UDMA) Copolymer of acrylic acid and
itaconic acid, silica-silicate (10-20% nanoparticulate), diphenyliodonium hexafluorophosphate (3M ESPE, St Paul, MN, USA) Filtek Z250
Bis-EMA, Bis-GMA, TEGDMA, UDMA, Bis-EMA, Bis-GMA, TEGDMA, UDMA, zirconia / silica with 0.01 to 3.50 μm and medium size 0.6μm and
60% by volume of the fill particles
(3M ESPE, St Paul, MN, USA)
Specimens Preparation
For this study, specimens obtained from 120 human molars (Ethical Committee Approval HUAP CAAE 64108117.5.0000.5243) recently extracted and free from demineralization and developmental defects, were prepared. These teeth were previously stored for 7 days in 0.5 wt% aqueous chloramine solution for disinfection and kept in distilled water under refrigeration until the time of their use. The teeth were included by the roots, with acrylic resin, inside PVC rings. After polymerization of the acrylic resin, the coronary enamel was removed in a metallographic cutter (ISOMET 1000, Buehler Ltd, IL, USA), exposing the superficial layer of dentin. Then, the marginal enamel was removed with a diamond tip (3100, KG Sorensen, Curitiba, PR, BR) mounted on a high-speed turbine under refrigeration. For standardize the smear layer production, the exposed dentin surfaces were subjected to constant cooling with 400 / 60s / 150rpm silicon carbide and 600 / 60s / 150rpm silicon carbide (DPU 10, Struers, DEN). After the removal enamel, the teeth were analysed in a stereomicroscope (SZ40, Olympus, Tokyo, JPN), with an increase of 40x to verify total removal of enamel. After etching with H3PO4 37% for 15s, washing with distilled water for 30s and
drying with absorbent paper, the teeth were randomly divided into 5 groups (n = 6). Surface treatment with protease inhibitors was performed with the aid of a microapplicator for 60s and the excesses were removed with absorbent paper. For contact angle measurement and antimicrobial activity, 1.0 mm depth dentin discs were
prepared per tooth, which received the dentin treatment according to table 1. For microtensile and nanoleakage, dentin hybridization with Adapter Single Bond 2 adhesive (3M-ESPE, St Paul, USA) followed the manufacturer's recommendations. Subsequently, Filtek Z250 composite (3M-ESPE-St. Paul, USA) blocks, 5.0mm high, were constructed incrementally on the dentin surface. Each increment was photoactivated with irradiance of 1000 mW / cm2 for 20s (DEMI, Demetron Inc.,
Danburry, USA). During the process, the irradiance of the apparatus was measured with a radiometer (model 100, DemetronInc, Danburry, USA). After the composite block was made, the teeth were stored in distilled water in an oven at 37.0 ºC for 24 hours.
After this, the teeth were taken to the metallographic cutter (IsoMet 1000, Buëhler, Lake Bluff, IL, USA) and serially sectioned with a double-sided diamond disc under refrigeration, in two planes perpendicular to the adhesive interface, obtained sticks with approximately 1.0 mm2 cross section. After the cut, all sticks were evaluated
in a stereomicroscope (SZ40, Olympus, Tokyo, JPN), with a 40x magnification, to discard those with structural defects (cracks or blisters in the composite).
The sticks obtained from each tooth for each group were randomly divided into two subgroups: 1) 24 hours of immersion in distilled water (AD) and 2) submitted of S.
mutans biofilm for 48 hours at the cariogenic challenge (DC). The sticks submitted to
the cariogenic biofilm were painted with enamel (Colorama - CIEIL - SP, BR) leaving 1.0 mm2 free, around the union interface. The specimens were then fixed in 24-well
plates (TPP, 24 Zellkultur Festplatte F, ALE). After sterilization by UV rays for 30 minutes, the biofilm was induced in Brain Heart Infusion (BHI, Difco, Sparks, USA) culture medium supplemented with 1.0% sucrose.13
The mature biofilm was formed by Streptococcus mutans. The strain of S.
mutans ATCC 25175 (American Type Culture Collection, Fiocruz, Rio de Janeiro, RJ,
BR) used was grown for 24 hours in liquid BHI at 37°C under low oxygen tension conditions. The bacterial inoculum was adjusted to an optical density (OD) of 0.5 to
550.0 nm according to the McFarland scale. The bacterial suspension was diluted to 1: 100, and then 10.0 µl of the inoculum was added to each well along with 2 ml of BHI supplemented with 1.0wt% sucrose. Culture plates were incubated at 37°C under low oxygen tension conditions for 48 hours. During the 2 days of biofilm formation, the culture medium was replaced every 24 hours.
This protocol was based on the results of a previous study13, aiming to establish
a period in which the samples could be kept immersed in the medium containing S.
mutans, without causing high rates of demineralization in dentin, which would make it
impossible to perform the test because it would lead to the incidence of cohesive failures in the dentin.13
Nanoleakage Test
For nanoleakage, four beams received up to 1.0 mm from the adhesive interfaces, and the beams were individually immersed in 50.0 wt% ammonia-AgNO3 tracer solution (pH = 7.0) (Synth, Diadema, São Paulo, SP, BRA) in a dark environment for 24 hours. Each beam was rinsed in distilled water and immersed for 8 hours in photodeveloping solution (Kodak, Rochester, NY, USA) under a fluorescent light to reduce silver íons into metallic silver grains along the bonding interface. Afterwards, the stained beams were wet polished with 600-, 1200- and 4000-grit SiC papers, ultrasonically cleaned for 5 minutes in distilled water and dried for 48 hours in a desiccator with blue silica gel at 37.0 °C. Thereafter, two sticks were then individually immersed in 10.0 wt% silver methanamine pigmentary solution (pH 7.0) for 90 minutes in stove at 37.0 ° C. After this period, they were washed in distilled water for 3 minutes and then immersed in 2 wt% sodium thiosulfate solution for 5 minutes to reduce silver
ions and pigmentation along of the non-mineralized collagen fibers. Afterwards, the stained beams were wet polished with 600-, 1200- and 4000-grit SiC papers, ultrasonically (Ultrassom, Quimis, Diadema, SP, BRA) cleaned for 5 minutes in distilled water and dried for 48 hours in a desiccator (Quimis, Diadema, SP, BRA) with blue silica gel at 37.0 °C.
The resin-dentin interfaces were analyzed under SEM (Phenom ProX, Phenom-World, Eindhoven, NED) operating in backscattered mode, at an accelerating voltage of 15 kV. Three images were taken from each beam: one central, and two from both end points (right and left sides) with a magnification of 2000 x. The silver nitrate uptake (SNU%) and the silver methanamine pigmentation (SMP%) were recorded as a percentage of the total area observed, using an energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) detector.
Microtensile Bond Strength and Failure Mode
The beams had their cross-sectional areas measured with a digital caliper (MPI / E-101, Mytutoyo, Tokyo, JPN), were individually fixed to a microtensile device (ODMT03d, Odeme Biothecnology, Joaçaba, SC, BRA) with cyanoacrylate glue Superbonder Gel, 3M, São Paulo, BRA) and loaded under universal testing machine (EMIC DL 2000, São José dos Pinhais, SP, BRA) at a crosshead speed of 1.0 mm / min until failure occurred (Figure 1). The μTBS (MPa) was obtained by dividing the load at failure (N) by the cross-sectional area (mm2).
One means was calculated with the bond strength values presented by the beams obtained for each tooth, so that the tooth was considered the experimental unit for the statistical test.
Failure modes of all beams were evaluated at 40x magnification (SZ61TR Olympus, Tokyo, JPN) and were classified as adhesive (A), cohesive in dentin (CD), cohesive in composite (CR), or mixed (M). Representative beams for each failure mode of each group, with the value of µTBS close to the mean of that group were viewed using scanning electron microscopy (SEM). The dentin sides of each beam were mounted in a charge-reduction sample holder and viewed under SEM (Phenom ProX, Phenom-World, Eindhoven, NED), operating in backscattered mode, 15 Kv, in a low vacuum environment. The SEM images were taken at the magnification of 270x and 2000x.
Contact Angle Measuraments
In the dentin surface, 2.0 μL volume of the Adper Single Bond 2 adhesive system (3M ESPE, St. Paul, MN, USA) was applied with a pre-adjusted 1.0 mL syringe on the dentin surface, followed by the measurement of the contact angle between the dentin surface and the liquid drop. Thirty measurements with an interval of 1s were performed with the goniometer (Model 200, Ramé-Hart Instrument Company, Netcong, USA). Based on the data obtained for the liquid (DA), the Ramé-Hart software calculated the contact angle of the determined groups.
Antibacterial activity of Proteases Inhibitors
Dentin disks were sterilized with ethylene oxide (Bioxxi, Sterilization Services, Rio de Janeiro, RJ, BRA) and the protease inhibitor solutions were applied to the dentin
surface with the aid of the sterile microapplicator. This entire step was performed inside a laminar flow chamber (sterile environment).
The sterilized and pre-treated dentin disks were placed in 24-well plates (TPP, 24 Zellkultur Festplatte, SWZ), with the treatment surface facing upwards. 2.0 mL of Brain Heart Infusion culture medium (BHI, Difco, Sparks, USA) supplemented with 2 wt% sucrose was added to each well. The strain of S. mutans ATCC 25175 (American Type Culture Collection, Fiocruz, Rio de Janeiro, RJ, BRA) used was cultured for 24 hours in BHI at 37.0 ° C under low oxygen tension conditions. The bacterial inoculum was adjusted for optical density (OD) of 0.5 to 550.0 nm in accord with the McFarland scale. The bacterial suspension was diluted to 1: 100, and then 10.0 uL of the inoculum was added to each well. The 24-well culture plates were incubated at 37 ºC under low oxygen tension conditions for 48 hours. Over the 2 days of biofilm formation, the culture medium was replaced every 24 hours.
After the 48 hours immersed in the S. mutans biofilm, the dentin disks were washed with sterile phosphate buffer solution (pH 7.2) (PBS) and then transferred to the new 24-well plate. The blocks were then washed once with sterile cysteine peptone water (CPW) and a 1.0 mL aliquot of sterile peptone water (BPW) supplemented with 0.2 wt% sucrose was added to each well. The plates were incubated under low oxygen tension conditions at 37.0 ° C for 3 hours. After this time, the supernatants were stored for lactate analysis using an enzymatic method.31 Briefly, the enzymatic reaction to
which the supernatants were subjected was measured using a microplate reader, with a wavelength of 340.0 nm. The values obtained were interpreted using a standard curve prepared with a lactic acid standard.31
The cell viability of the S. mutans biofilms on the disks was analysed by the tetrazolium azide (MTT, Sigma Aldrich, St. Louis, USA) reduction of the methyl
tetrazolylbromide bromide assay. The reaction using MTT is a colorimetric assay that measured the enzymatic reduction of MTT, a yellow tetrazole, the purple color formazan. Therefore, 1.0 mL of sterile MTT (1.0 mg / ml in PBS) was added to each well and incubated at 37.0 ºC under low oxygen tension conditions for 1 hour. The discs were then transferred to a new 24-well plate, 1.0 mL of the dimethylsulfoxide (DMSO) was added to each well and the plates were incubated for 20 minutes at room temperature, protected from light and with gentle agitation. The DMSO suspensions were subjected to a microplate reader with wavelength of 540.0 nm. A higher absorbance is indicative of a higher concentration of formazan, which, in turn, indicates a higher metabolic activity of the biofilm.32
Statistical Analysis
Statistical analysis was performed using Statgraphics Centurion Software 16.1 Software (Manugistics, Rockville, MD, USA). Initially the Shapiro-Wilk and Levene tests were applied to verify the normality of the distributions and the homoscedasticity of the variances. Based on the results, the analysed data regarded the evaluation of the dentin surface, contact angle, MTT and lactic acid production were analysed using the one-way analysis of variance (ANOVA). The analysis data for bond strength and nanoinfiltration were analyzed using the two-way ANOVA. The Tukey HSD test was performed to contrast the means for both analyzes. Regression analysis was used to investigate the correlation between the bond strength and the contact angle, the correlation between silver nitrate penetration and silver methanamine pigmentation and the correlation between cell viability and lactic acid production. All analyzes were performed at significance level of α = 0.05.
RESULTS
The microtensile bond strength (µTBS) means for all groups is present in Table 3. The factors “immersion condition” and “dentin pre-treatment” were significant (p < 0.05). When each factor was analysed separately, for the factor "immersion condition", the means of the CTG DW (35.49 ± 4.3 MPa) decreased when compared with CTG CC (35.49 ± 4.3 MPa), due to the microbial activity (p < 0.05). For the "dentin pre-treatment”, there wasn't observed statistical difference between before and after of the cariogenic challenge (p > 0.05) and they were demonstrated highest µTBS values compared with the CTG (p < 0.05). None of the groups presented premature failure during beams preparation or during the µTBS test.
Table 3 – Means values (±SD) of Microtensile (µTBS); Nanoleakage (SNU%) and (SMP%):
Groups Microtensile (MPa) Nanoleakage (SNU%) Nanoleakage (SMP%)
24h DW 48h CC 24h DW 48h CC 24h DW 48h CC
CTG 35.44±(4.3)B,b
25.99±(4.7)A,a 1.46±(0.31)B,b 2.27±(0.44)A,a 1.45±(0.40)B,b 1.88±(0.21)A,a
CHXDG 36.66±(3.6)B,b 36.01±(4.2)B,b 1.17±(0.26)B,b 1.24±(0.21)B,b 0.84±(0.25)C,c 0.86±(0.32)C,c PHENG 40.38±(5.1)C,c 39.64±(5.8)C,c 0.71±(0.13)C,c 0.83±(0.17)C,c 0.71±(0.11)C,c 0.82±(0.15)C,c E-64G 40.28±(4.7)C,c 39.36±(5.6)C,c 0.73±(0.12)C,c 0.81±(0.20)C,c 0.73±(0.12)C,c 0.80±(0.24)C,c EGCGG 40.83±(3.8)C,c 40.37±(4.4)C,c 0.60±(0.10)C,c 0.78±(0.16)C,c 0.62±(0.16)C,c 0.76±(0.28)C,c
Note: In each column, means followed by different uppercase letters are statistically different (Tukey ́s HSD, p < 0.05). In each row, means followed by different lowercase letters are statistically different (Tukey ́s HSD, p < 0.05).
Figure 1 – (A) and (B) Failure modes distribution and representative SEM micrographs of different patterns of failure among the experimental conditions. There was no difference in the type of failure in the groups that received the pre-treatment. In the other hand, the CTG CC showed predominantly cohesive failures in dentin, derived from the microbial activity. (C) Representative SEM of a cohesive failure from the CTG DW. Showing the remaining dentin (B,B'); Representative SEM of mixed failure from the EGCGG DW (C,C’). Showing part of the surface covered with resin composite and the dentin surface with dentinal tubules remaining tags; Representative SEM of a cohesive failure from the CTG CC. The irregular texture clearly shows that the specimen fractured completely in dentin (D,D’); Representative SEM of a mixed failure from EGCGG CC. Showing part of the adhesive layer and dentinal tubules filled with adhesive (pointers) (E,E'). A: adhesive, D: dentin and RC: resin composite.
For the means values of the groups for nanoleakage (table 3), the measured of the silver nitrate uptake (SNU%) decreased when the CG CC (2.27 ± 0.44) compared with CG DW (1.46 ± 0.31) (p < 0.05). In addition, there were not observed significant differences for the silver nitrate uptake before and after cariogenic challenge for the groups with protease inhibitors pre-treatment. For the silver methanamine pigmentation (SNP%), the means of the CG CC (1.88 ± 0.21) decreased when
compared with CG DW (1.45 ± 0.40) (p < 0.05). In addition, all groups with protease inhibitors pre-treatment there no statistical differences were found for the silver methanamine pigmentation before and after cariogenic challenge (p > 0.05) and demonstrated reduction of the pigmentation compared with the GC in both situations. (p < 0.05).
Figure 2 – Representative SEM micrographs of the silver nitrate uptake (A) and the silver methanamine pigmentation (B) in the adhesive interfaces treatment of the proteases inhibitor in the dentin surface. A thin and interrupted silver deposit (pointers) can be seen in the groups CHXDG (b,b’), PHENG (c,c’), E-64G (d,d’) and EGCGG (e,e’) before and after cariogenic challenge. Contrarily, a dense layer of silver grains (pointer) is clear along the hybrid layer of the CTG (a,a’). AL: adhesive layer, D: dentin, RC: resin composite.
The measurement of the contact with the respective proteases inhibitors for all groups (Figure 3). This analysis showed that the conditioned dentin surface pre-treated with protease inhibitor solutions caused a decrease the contact angle between the dentin surface and the dental adhesive droplet. This fact could increase the permeability of the dentin substrate and led to a probable improvement in the wet ability of the adhesive system tested. (p < 0.05).
Figure 3 – (A) Means values (±SD) of the contact angle. For averages, uppercase letters indicate significant differences (Tukey HSD, p < 0.05); (B) Representative images of to the groups (A- CG; B- CHXG; C- PHENG; D- E-64G; E- EGCgG), indicated a decrease the contact angle (black) between the dentin surface and a drop of the dental adhesive (Black hands).
Quantitative results for S. mutans biofilms (metabolic activity and lactic acid production) on resin disks surfaces are exhibited in Figure 12. The factor "treatment" was influenced statistically in the biofilm production (p < 0.05). All the groups pre-treatment with protease inhibitor in dentin surface decreased the metabolic activity of
S. mutans biofilms compared with CG (p < 0.05). The similar trends were observed for
the lactic acid production (p < 0.05).
Figure 4. Means values (±SD) for S. mutans biofilms on types of treatment disk surfaces: MTT (Metabolic activity and Lactic Acid production). Bars with the same number of asterisks are statistically similar (p > 0.05).
Discussion
The purpose of the present study was to pre-treatment the dentin surface with protease inhibitors (CHXD, PHEN, E-64 and EGCG. In addition, Single Bond 2 was the commercial adhesive chosen for the research because it is well documented in the literature.
The present study used chlorhexidine diacetate at a concentration of 320µM (0.2%) as pre-treatment and didn’t negatively influence the bond strength and the nanolekeage. This result corroborated with studies that used the same protocol, used chlorhexidine.5,6,8 Regarded the results of the pre-treated groups with PHEN, E-64 and
EGCG also didn’t negatively influence the stability of the adhesion strength and maintenance of the hybrid layer before and after a cariogenic challenge.
In the present study, was observed that all dentin surfaces treated with protease inhibitors exhibited significantly better adhesive flow. In addition, corroborated with the study by (Perdigão et al.,1994)33 that observed that chlorhexidine could have increase
the free energy of the dentin surface resulted in greater wettability. Therefore, the null hypothesis (1) was rejected.
In according with the results of the bond strength of the present study, higher values were observed after the pre-treatment of the demineralised dentin with the protease inhibitors (EGCG, CHXD, PHEN and E-64), leaded to the belief that due to chemical interactions with the collagen represented by the hydrogen bonds positively influenced the stability of the hybrid layer, even after the cariogenic challenge. Therefore, the null hypothesis (2) was partially rejected. In general, they maintained bond strength at equal level, in the case of CHXD, in according with the study by (Stanislawczuk et al., 2014)34 or higher, in the case of E-64, corroborated the study by
(Yang et al., 2013)35 and the EGCG, ratified with the results found in the study by (Du
et al., 2012)36, compared to the CTG. In the case of PHEN, there was no study
previously reported in the literature.
After the cariogenic challenge, the CHXDG maintained the stability of the bond strength. This result corroborated with the study by (Montagner et al., 2016)12. On the
other hand, the control group had the bond strength decrease, compared to the other groups. These results were in according with the results showed by (Carvalho et al., 2013)13. This study demonstrated that after the cariogenic challenge, the bond strength
