UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
Tese
Alterações Moleculares, Físico-Químicas e Fisiológicas em Melões
e Tomates:
Relações com Etileno e Citocininas
Ciane Xavier Gonçalves
CIANE XAVIER GONCALVES
ALTERAÇÕES MOLECULARES, FÍSICO-QUÍMICAS E FISIOLÓGICAS EM MELÕES E TOMATES:
Relações com Etileno e Citocininas
Tese apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Biotecnologia da
Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Biotecnologia.
Orientação: Cesar Valmor Rombaldi, Ph D.
Dados de catalogação na fonte: Ubirajara Buddin Cruz – CRB-10/901 Biblioteca de Ciência & Tecnologia - UFPel
G635a Gonçalves, Ciane Xavier
Alterações moleculares, físico-químicas e fisiológicas
em melões e tomates : relações com etileno e citocininas
/ Ciane Xavier Gonçalves. – 131f. : il. – Tese (Doutorado). Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia.
Universidade Federal de Pelotas. Centro de Desenvolvimento Tecnológico. Pelotas, 2013. –
Orientador Cesar Valmor Rombaldi.
1.Biotecnologia. 2.ACCO. 3.ACCS. 4.Antisene,
5.Melão. 6.Tomate. 7.Cucumis melo. 8.Micro-tom.
Banca examinadora:
Prof. Dr. Cesar Valmor Rombaldi Profa. Dra. Angelita Machado Leitão Profa. Dra. Fabiana Roos Nora Profa. Dra. Luciana Bicca Dode
“Somos todos geniais. Mas se você julgar um peixe por sua capacidade de subir em árvores, ele passará sua vida inteira acreditando ser estúpido.”
Dedico aos meus pais, Breno Machado Gonçalves e Laci Clanir Xavier Gonçalves e ao meu irmão Breno Xavier Gonçalves.
Agradeço... A Deus, pelo dom da vida.
À Universidade Federal de Pelotas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela oportunidade de realização do meu doutorado.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão da bolsa de estudos.
Ao CNPq pelo auxílio financeiro.
Ao orientador prof. Cesar Rombaldi, pelo apoio e compreensão demonstrado durante a execução do trabalho.
Aos amigos e colegas dos Laboratórios de Biotecnologia de Frutas e Hortaliças e, Metabolismo Secundário, pelo apoio prestado durante o curso.
Resumo
Gonçalves, Ciane Xavier. Alterações moleculares, físico-químicas e fisiológicas
em melões e tomates: relações com etileno e citocininas. 2013. 131p. Tese
(Doutorado) - Programa de Pós-graduação em Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
O etileno é o hormônio indutor e acelerador da maturação e senescência de frutos climatéricos, como é o caso de melões Cantaloupe (Cucumis melo var. Cantalupensis, Naud cv. Vedrantais) e de tomates (Licopersicum esculentum L. cv. Micro-Tom). Sabe-se que a redução de produção e/ou a ação desse hormônio prolonga o período de conservação desses frutos. Assim, com o objetivo de reduzir a produção desse hidrocarboneto, foram transformados geneticamente meloeiros com clones da ACC oxidase ‘antisense’, de melão (pMEL1AS, Ayub et al., 1996) e de maçã (pAP4AS, Silva et al., 2004). Como era esperado, em ambos os casos, a produção de etileno foi reduzida, prolongando a vida de prateleira dos frutos em 7 dias. Entretanto, a produção de compostos voláteis também foi afetada. Os melões transgênicos produziram, em média, 70% menos ésteres do que os não transformados (NT), independentemente de terem sido transformados com o pMEL1AS ou pAP4AS. Como a intervenção feita agiu na redução da produção do etileno, emitiu-se a hipótese de que com a suplementação do hormônio, a síntese de aromas seria restaurada. Tal hipótese foi comprovada em melões pMEL1AS, mas não nos pAP4AS. As causas exatas dessa diferença ainda não foram esclerecidas. Acredita-se que pela maior redução da produção de etileno nos frutos pAP4AS, além de ter-se afetado genes diretamente relacionados com as vias metabólicas clássicas do amadurecimento, genes relacionados a outras vias de síntese de hormônios também tenham sido afetados, como é o caso de citocininas ou poliaminas. Pela observação do fenótipo de plantas pAP4AS percebeu-se que essas tiveram maior crescimento vegetativo e brotações laterais. Considerando-se tais observações, lançou-se a hipótese de que com o aumento dos níveis de citocininas poderia interferir nas respostas ao etileno, retardando a evolução normal dos frutos. Em melões pAP4AS comprovou-se haver maiores teores de citocininas, tanto nas raízes quanto nos frutos. Porém, para confirmar que essas alterações são efetivamente consequência de maiores teores de citocininas, fez-se aplicação exógena desse regulador de crescimento. No entanto, não se observaram as respostas esperadas. Então optou-se por testar a aplicação de citocininas noutro modelo vegetal, o
tomateiro cv. Micro-Tom, que também é produtor de frutos climatéricos e que propicia maior facilidade de cultivo e obtenção de maior quantidade de frutos em ambientes protegidos e em áreas com limitação de espaço. Como variáveis moleculares para avaliação dos tratamentos em melões determinou-se o acúmulo de transcritos de genes de HPL, LOX e AAT, além da ACCO e ACCS. Em tomates, foram realizadas análises físico-quimicas. Para melões, ao se quantificar o acúmulo de transcritos de genes da ACC sintase (ACCS), verificou-se que os genes ACCS1 e
ACCS3 apresentaram maiores expressões nos frutos NT, sugerindo que esses têm
forte relação com a evolução da crise climatérica. Por outro lado, o gene ACCS5 foi mais expresso nos frutos pMEL1AS e pAP4AS, indicando que é regulado negativamente pelo etileno. Para as demais variáveis avaliadas (sólidos solúveis totais, coloração, carotenóides, clorofilas, firmeza de polpa) durante o amadurecimento na planta, não houve diferenças marcantes entre pMEL1AS e pAP4AS. Após a colheita e tratamento dos frutos pMEL1AS com etileno, houve desverdeamento da casca, e aumento da produção de ésteres, correlacionado com maiores níveis de transcritos dos genes da HPL, LOX, AAT1, AAT2, AAT3 e AAT4. Nos frutos pAP4AS, os níveis desses transcritos foi significativamente inferior, não tendo-se observado desverdeamento, nem amarelamento, tampouco restauro da síntese de ésteres. Nesses frutos (pAP4AS) foi detectada uma maior concentração de zeatina e zeatina ribose do que nos pMEL1AS e nos NT. Para tomateiros, nos quais fez-se a aplicação de citocininas, houve prolongamento do ciclo vegetativo e retardamento da maturação. Nos frutos provenientes de plantas tratadas verificou-se que a ação do etileno foi regulada, em particular em relação à variação dos principais pigmentos desse fruto (β-caroteno e licopeno). Desse modo, acredita-se que as citocininas possam ser as responsáveis pela menor sensibilidade ao etileno em melões, mas essa hipótese precisa ser testada com maior profundidade. A tentativa de prová-la usando tomateiros como modelo não foi totalmente eficiente.
Abstract
Gonçalves, Ciane Xavier. Molecular alterations, physicochemical and
physiological in melons and tomatoes: relations with ethylene and cytokinin.
2013. 131p. Tese (Doutorado) - Programa de Pós-graduação em Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
Ethylene is the inductor and acceleratorhormone of the maturation and senescence of climacteric fruits, as is the case of Cantaloupe melons (Cucumismelo var. Cantalupensis, Naud cv. Vedrantais) and tomatoes (LicopersicumesculentumL. cv. Micro-Tom). It is known that the reduction of production and/or the action of this hormone prolongs the shelf life of these fruits. Thus, in order to reduce the production of such hydrocarbon, were genetically transformed melon trees with clones of the ACC oxidase 'antisense', of melon (pMEL1AS, Ayubet al., 1996) and of apple (pAP4AS, Silva et al., 2004). As expected, in both cases, the ethylene production was reduced, prolonging shelf life of fruits in 7 days. However, the production of volatile compounds was also affected. The transgenic melons produced, on average, 70% less esters than the WT, independently of having been transformed with pMEL1AS or pAP4AS. As the intervention made acted in the reduction of the production of ethylene. It was emitted the hypothesis that, with the supplementation of the hormone, the synthesis of flavors would be restored. Such fact was proven in pMEL1AS melons, but not in pAP4AS. The exact causes of this difference were not yet made clear. It is believed that because of the greater reduction of the ethylene production in the fruit pAP4AS, besides affecting genes directly related to the ripening classical metabolic pathways, genes related to other pathways of synthesis of hormones have also been affected, as is the case of cytokininsor polyamines. By observation of the phenotype of pAP4AS plants we realized that these had more vegetative growth and lateral sproutings. Considering such observations, it was launched the hypothesis that with the increase of the levels of cytokinins one could interfere in the responses to ethylene, delaying the normal evolution of the fruits. In pAP4AS melons it was proved that there are higher levels of cytokinins, both in the roots and fruits.However, to confirm that these changes are effectively consequence of higher levels of cytokinins, exogenous application of that growth regulators was made. Nevertheless, were not observed any expected responses. So we decided to test the application of cytokinin in another plant model, the tomato tree cv. Micro-Tom, who is also a producer of climacteric fruits and that provides greater ease of
cultivation and obtainment of greater quantity of fruit in protected environments and in areas with limited space. As molecular variables for assessment of the treatments in melons were determined the accumulation of transcript of genes of HPL, LOX and AAT, besides the ACCO and ACCS. In tomatoes, were performed physicochemical analyzes. For melons, when quantifying the accumulation of transcripts of genes of ACC synthase (ACCS), it was found that genes ACCS1 and ACCS3 showed higher expressions in WT fruits, suggesting that they have a strong relation with the evolution of the climacteric crisis. Moreover, the gene ACCS5 was more expressed in fruits pMEL1AS and pAP4AS, indicating that it is negatively regulated by ethylene. For the other variables evaluated (total soluble solids, color, carotenoids, chlorophylls, pulp firmness) during the ripening on the plant, there were no marking differences between pMEL1AS and pAP4AS. After harvesting and treatment of pMEL1AS fruits with ethylene, there was a degreening of the peel and increase of the production of esters, correlated with higher levels of transcripts of the genes of HPL, LOX, AAT1, AAT2, AAT3 and AAT4. In pAP4AS fruits, the levels of these transcripts was significantly lower, not having been observed degreeningor yellowing, nor restoration of the synthesis of esters. In these fruits (pAP4AS) it was detected a higher concentration of zeatin and zeatin ribose than in pMEL1AS and WT. For tomato plants, in which was done application of cytokinins, there was prolongation of the vegetative cycle and delay in the maturation. The fruits from the treated plants also prolonged the maturation cycle, but did not decrease sensitivity to ethylene action. It is believed that cytokinins may be the responsible ones for lower sensitivity to ethylene in melons, but this hypothesis was not confirmed and must be tested with greater profundity. The attempt to prove it using tomato plants as model was not efficient.
Lista de Figuras
Revisão Bibliográfica
Figura 1 Rota de biossíntese do etileno ... 30 Figura 2 Transdução do sinal do etileno ... 35
Artigo 1
Figure 1 Physicochemical and physiological changes in non-transformed (NT) and transformed Cantaloupe melon (Cucumismelo var. Cantalupensis, Naud cv. Vedrantais) using ACCO pMEL1AS and pAP4AS antisense, during ripening on the vine. Ethylene concentration (µl L-1) (A), flesh firmness (N) (B), rind color (-a) (C); rind color( b) (D); rind chlorophyll content (mg 100g-1) (E); rind carotenoid content (mg 100g-1) (F). Vertical bars represent standard error of the mean (n=6). DAA (days after anthesis) ... 73 Figure 2 Physicochemical and physiological changes in non-transformed (NT)
and transformed Cantaloupe melon (Cucumismelo var. Cantalupensis, Naud cv. Vedrantais) using ACCO pMEL1AS and pAP4AS antisense, during postharvest. Ethylene production (nL h-1 g-1) (A), flesh firmness (N) (B), rind color (-a) (C); rind color (b) (D); rind chlorophyll content (mg 100g-1)(E); rind carotenoid content (mg 100g-1) (F); Vertical bars represent standard error of the mean (n=6) ... 74 Figure 3 Relative transcript accumulation of genes associated with ethylene
biosynthesis during ripening on the vine of non-transformed (NT) and transformed melon (Cucumismelovar: Cantalupensis, Naud cv. Vedrantais), using ACCO pMEL1AS and pAP4AS antisense gene. Relative transcript accumulation calculated according to the formula 2 -∆∆ct
. Cm-ACCO (A), Cm-ACCS1(B),Cm-ACSS2(C), Cm-ACCS3(D)and
Cm-ACCS5(E) vertical bars represent standard error of the mean (n=6).
DAA (days after anthesis) ... 75 Figure 4 Relative transcript accumulation of 1-aminocyclopropane-1-carboxylic
oxidase(ACCO), hydroperoxidelyase (HPL), lipoxygenase (LOX), alcohol acyltransferase (ATT1, ATT2, ATT3, ATT4), and (PG1) genes of Cantaloupe melon (Cucumismelo var. Cantalupensis, Naud cv. Vedrantais), non-transformed (NT) and transformed using ACCO pMEL1AS and pAP4AS antisense treated or not with ethylene. Samples were collected at 0, 24, 48, 72, 96 and 120h. Transcript level is described in a 0 to 10 scale. Green color on the left indicates minimal accumulation, black color in the middle represents 5 times the mRNA content compared to green and red color on the right hand corner represents a 10 fold increase in mRNA content compared to the green end of the scale ... 76
Proposta de Artigo 2
Figura 1 Resposta fisiológica à aplicação de citocininas em diferentes dosagens (0,0 g/L; 0,25 g/L; 0,5 g/L; 0,75 g/L; 1,0 g/L) ((6-benzilaminopurina (BAP) + fenilmetilpiranil-aminopurina)) (A). Imagem ilustrativa de tomateiros, cv. Micro-Tom, não tratados com citocinina (B) e tratados com citocinina (C), na concentração de 0,5 g/L ((6-benzilaminopurina (BAP) + fenilmetilpiranil-aminopurina)). Aproximadamente, 60 dias após a semeadura. CDTec-FAEM/UFPel, Pelotas ... 100 Figura 2 Coloração (variáveis L, a*, b* e ângulo Hue) de tomates, cv. Micro Tom, colhidos no estádio de maturação breaker (A) e no estádio vermelho-maduro (B), de plantas com (CC) e sem aplicação de citocinina (SC). Variação de coloração (C, D, E e F), após a colheita dos tomates em estádio breaker, de plantas tratadas ou não com citocininas na pré-colheita e tratadas (+C2H4) ou não com etileno (-C2H4) na pós-colheita,
armazenados 7 dias em temperatura ambiente. Barras verticais indicam o intervalo de confiança a 95%. CDTec-FAEM/UFPel, Pelotas .. ... 101 Figura 3 Firmeza de polpa de tomates, cv. Micro Tom, colhidos no estádio de
maturação vermelho-maduro (A), de plantas sem (SC) e com aplicação de citocinina (CC). Firmeza de polpa (B), após a colheita dos tomates em estádio breaker, de plantas tratadas ou não com citocininas na
pré-colheita e tratadas (+C2H4) ou não com etileno (-C2H4) na pós-colheita,
armazenados 7 dias em temperatura ambiente. Barras verticais indicam o intervalo de confiança a 95%. CDTec-FAEM/UFPel, Pelotas .. ... 102 Figura 4 Teor de carotenóides totais (A), licopeno (B), β-caroteno (C),
β-caroteno/licopeno, fitoeno (E) e luteína+zeaxantina (F) de tomates, cv. Micro Tom, colhidos no estádio de maturação breaker e no estádio vermelho-maduro de plantas sem (SC) e com aplicação de citocinina (CC). Após a colheita dos tomates em estádio breaker, de plantas tratadas ou não com citocininas na pré-colheita e tratadas (+C2H4) ou
não com etileno (-C2H4) na pós-colheita, armazenados 7 dias em
temperatura ambiente. Barras verticais indicam o intervalo de confiança a 95%. CDTec-FAEM/UFPel, Pelotas ... 103 Figura 5 Teor de compostos fenólicos totais (A), capacidade antioxidante (B),
clorofila “a” (C), clorofila “b” (D) e clorofila total (E) de tomates, cv. Micro Tom, colhidos no estádio de maturação breaker e no estádio vermelho-maduro de plantas sem (SC) e com aplicação de citocinina (CC). Após a colheita dos tomates em estádio breaker, de plantas tratadas ou não com citocininas na pré-colheita e tratadas (+C2H4) ou
não com etileno (-C2H4) na pós-colheita, armazenados 7 dias em
temperatura ambiente. Barras verticais indicam o intervalo de confiança a 95%. CDTec-FAEM/UFPel, Pelotas ... 104
Lista de Tabelas Artigo 1
Table 1 Specific primers synthesized for qPCR ... 69 Table 2 Cytokinin (zeatin and zeatin riboside) content (ng g−1 fw) in root, rind
and flesh of non-transformed (UNT) and transformed Cantaloupe melon (Cucumis melo var. Cantalupensis, Naud cv. Vedrantais), using ACCO pMEL1AS and pAP4AS antisense ... 70 Table 3 Table 2. Polyamine content (spermidine and putrescine µg g−1 fw), at
harvest, of the rind and pulp of non-transformed (NT) and transformed Cantaloupe melon (Cucumis melo var. Cantalupensis, Naud cv. Vedrantais), using ACCO pMEL1AS and pAP4AS antisense gene ... 71 Table 4 Table 3. Ester volatile production (ng g-1fw of fruit) by non-transformed
(NT) and transformed (using ACCO pMEL1AS and pAP4AS antisense) Cantaloupe melon (Cucumismelo var. Cantalupensis, Naud cv. Vedrantais), treated with ethylene (with C2H4)and measured 120h after treatment or not treated with ethylene (w/out C2H4) measured immediately after harvest ... 72
Lista de Abreviaturas
AAT Álcool aciltransferase
ACC Ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico ACCO ACC Oxidase
ADH Álcool desidrogenase AVG Amino-etoxi-vinilglicina cDNA DNA complementar
CoA Coenzima A
DAA Dias após antese DAP Dias após polinização DNA Ácido desoxiribulcléico
ER Ethylene Response
ETRs Receptores de etileno
G Gravidade
HPLC High Presure Liquid Chromatography
H Horas
iPA Isopentinil adenina
Ipt Isopentiltransferase
LOX Lipooxigenase
MG Miligramas
Min Minutos
mf Massa fresca
NADPH Nicotinamida-Adenina-Dinucleotídeo-Fosfato- Hidrogenase NT Não transformado
PCR Polymerase Chain Reaction
PG Poligalacturonase PME Pectine Metilesterase RNA Ácido ribocléico RPM Rotações por minuto mRNA RNA mensageiro SAM S Adenosilmetionina
SAMS S Adenosilmetionina sintetase Z Zeatina
ZR Zeatina riboside 1-MCP 1-Metilciclopropeno
Sumário
1 Introdução ... 19
1.1 Hipóteses ... 23
1.1.1 No caso dos melões ... 23
1.1.2 No caso dos tomates ... 23
1.2 Objetivos Gerais ... 24 1.2.1 Objetivos Específicos ... 24 1.2.1.1 Em melões ... 24 1.2.2.2 Em tomates ... 24 1.3 Estrutura da Tese ... 25 2 Revisão Bibliográfica ... 26
2.1 Maturação e Qualidade de Frutos ... 26
2.2 Fithormônios: Hormônios Vegetais na Maturação de Frutos ... 27
2.2.1 Etileno: Biossíntese e Sinalização ... 28
2.2.2 Citocinina: Biossíntese, Sinalização e Transcrição ... 38
3 Pesquisa exploratória visando dar sustentação às hipóteses e à definição das variáveis independentes e dependentes do experimento com melões NT, pMEL1AS e pAP4AS ... 44
3.1 Artigo 1: Ethylene and cytokinin involvement in ripening and ester volatile production in transgenic melons expressing an ACC oxidase antisense ... 44
Abstract ... 45
1 Introduction ... 46
2 Materials and Methods ... 49
2.1 Plant material ... 49 3 Analyses... 50 3.1 Ethylene ... 50 3.2 Firmness ... 50 3.3 Soluble solids ... 51 3.4 Color ... 51 3.5 Titratable acidity ... 51 3.6 Chlorophyll content... 51
3.7 Carotenoid content... 51
3.8 Ester volatiles ... 51
3.9 Cytokinin content ... 52
3.10 Polyamine content... 52
3.11 Transcript accumulation ... 53
3.12 Experimental design and statistical analysis ... 54
4 Results ... 54
4.1 Physicochemical and physiological changes in melon fruit during ripening on the vine ... 54
4.2 Physicochemical and physiological changes in melon fruit during ripening after harvest ... 56
4.3 Transcript accumulation of ethylene biosynthesis genes during ripening on the vine ... 57
4.4 Transcript accumulation of ethylene biosynthesis, ester biosynthesis, and chlorophyll degradation genes in melon after harvest ... 58
5 Discussion ... 59
6 Conclusions ... 62
7 Acknowledgments ... 62
8 References ... 63
4 Pesquisa exploratória visando dar sustentação à hipótese e à definição das variáveis independentes e dependentes do experimento com citocininas em tomates... 77
4.1 Proposta de Artigo 2: “Respostas fisiológicas de tomates, Micro-Tom, tratados com citocininas” ... 77
Resumo ... 78 Abstract ... 79 Introdução ... 80 Material e Métodos ... 82 Material Vegetal ... 82 Tratamentos ... 82 Estudo 1 ... 82 Estudo 2 ... 83 Análises... 84
Coloração ... 84
Firmeza ... 85
Teor de Clorofilas ... 85
Teor de Carotenóides Totais ... 85
Teor de Carotenóides Individuais ... 86
Teor de Compostos Fenólicos Totais ... 87
Teor de Tocoferóis ... 88
Resultados e Discussão ... 88
Agradecimentos ... 93
Literatura Citada ... 94
5 Considerações Finais e Perspectivas ... 105
1 Introdução
A maturação de frutos climatéricos é a fase do desenvolvimento comumente subdividida em três fases: a maturação fisiológica propriamente dita, o amadurecimento e a senescência (YANG; HOFFMAN, 1984; BRANDY, 1987). A maturação fisiológica é a fase em que o fruto adquire a capacidade de amadurecer, como consequência da ativação do sistema de síntese autocatalítica do etileno e desencadeamento da ativação de vias metabólicas relacionadas ao amadurecimento (BURG; BURG, 1962; TAIZ, 2002; CHAVES, 2006; TARANATHAN, 2006). Para frutos climatéricos, a maturação ou maturação fisiológica ocorre no momento em que se inicia a produção autocatalítica de etileno. Nessa fase, os frutos já são sensíveis à ação desse hormônio e podem desenvolver o amadurecimento caso sejam colhidos nessa fase (WILLS, 1998).
Para frutos classificados como não climatéricos, o amadurecimento é considerado um evento independende do etileno. Para que a maturação fisiológica e o amadurecimento de frutos não climatéricos ocorra de modo pleno, há necessidade de se manter os frutos ligados às plantas. A colheita antecipada praticamente interrompe a evolução da maturação fisiológica e o amadurecimento, não havendo a aquisição dos atributos de qualidade sensorial (TAIZ; ZEIGER 2004; LÓPEZ-GÓMEZ et al., 2009).
No entanto, isso não significa que os frutos não sejam sensíveis ao etileno (VENDRELL; PALOMER, 1997; TAIZ; ZEIGER 2004). Por exemplo, ao suplementar-se frutos não climatéricos com essuplementar-se hormônio, há alterações metabólicas significativas, promovendo alterações facilmente perceptíveis como é o caso do desverdeamento de citros, avermelhamento de uvas e morangos, dentre outros (GOLDSCHMIT et al., 1993; SALVEIT, 1999; YAMAUCHI et al., 1997; TSUCHIYA et al., 1999; FINGER; VIEIRA, 2002; ALMEIDA, 2005). Mas, nesses casos não é detectada a ação autocatalítica do etileno, embora o sistema de recepção desse hidrocarboneto esteja presente (FINGER; VIEIRA, 2002; THARANATHAN et al., 2006).
Mesmo com as significativas evoluções científicas e tecnológicas acerca dessa temática, incluindo a existência de mutantes, o sequenciamento do genoma do tomateiro, do meloeiro, da macieira, do pessegueiro e outros, assim como o transcriptoma de vários órgãos, em vários estádios de desenvolvimento e em várias condições de estresse bióticos e abióticos, ainda não foi esclarecido como é regulado o início da maturação seja ela em frutos climatéricos ou não climatéricos (BEN-ARIE; FAUST, 1980; LURIE; BEN-ARIE, 1983; HEYES; TOWNSEND, 1992; HEYES et al., 1997; GIOVANNONI, 2004; SRIVASTAVA; AMEMIYA et al., 2006; AZEVEDO et al.; 2008; SANTOS, 2009; LEE et al., 2010).
Embora o etileno seja amplamente citado como o hormônio indutor de maturação/amadurecimento de frutos climatéricos e senescência de flores, também está demonstrado que esse hormônio atua em outros aspectos de crescimento e desenvolvimento da planta, como é o caso da germinação de sementes, crescimento vegetativo, diferenciação de raízes, floração (indução), abscisão foliar, determinação do sexo (indução de flores femininas), morte celular programada, dentre outros (ABELES et al., 1992; O'NEILL, 1997). O etileno é biologicamente ativo mesmo em pequenas concentrações (≤ 0,002 ppm).
Tanto os frutos climatéricos como os frutos não-climatéricos têm a capacidade de produzir esse hormônio, mas apenas nos primeiros ocorre a síntese autocatalítica (STEPANOVA; ECKER, 2000; TAIZ, 2002; THARANATHAN et al., 2006; COLLI; PURGATTO, 2008). Nos frutos não-climatéricos a ação desse hormônio não é autocatalítica, mas há respostas moleculares e fisiológicas. Na uva, por exemplo, o etileno induz a síntese de antocianinas (ASSIS et al., 2012), em tangerinas estimula a síntese de carotenóides (MATSUMOTO et al., 2009), em outros citros promove a degradação de clorofilas (SHIMOKAWA et al., 1978; YAMAUCHI et al., 1997; CASAS; LLACÉR, 1989; MAZZUZ, 1996). Porém, esses processos ainda não estão completamente esclarecidos, mas sabe-se que a aplicação de etileno aumenta a velocidade de degradação de clorofilas, precedida de indução da expressão de genes da Chlase (PURVIS; BARMORE, 1981; GOLDSCHMIDT; HUBERMAN; GOREN, 1993; JABOB-WICK et al., 1999; PORAT et al., 1999). Além disso, demonstrou-se que eventos dependentes e etileno-independentes coexistem em frutos climatéricos e não-climatéricos (LÈLIEVRE et al., 1997). Como exemplo dessa afirmativa é a síntese de carotenóides em frutos (BARRY; GIOVANNONI, 2007). Em melões, a síntese desses componentes na
polpa é um evento etileno-independente, porém na casca é induzida pelo hormônio (GUIS et al., 1997).
Em tomates, está comprovado que a síntese de carotenóides é dependente do etileno (RODRIGO; ZACARIAS, 2007). Mas essa afirmativa é válida somente para o licopeno, já que os teores de α e β-caroteno, luteína e zeatina são independentes da produção e da ação do etileno (BARRY; GIOVANNONI, 2007). Além disso, dentro de uma mesma espécie, as respostas fisiológicas são variáveis. É o caso de melões, dentre os quais há variedades tipicamente climatéricas e outras não climatéricas (LÈLIEVRE et al.,1997; RODRIGUES; ONO, 2001; FINGER; VIEIRA, 2002; BALBOTIN, 2007). Nos melões climatéricos, como é o caso de melões Cantaloupe, o desverdeamento da casca, a formação da zona de abscisão e a síntese de aromas são dependentes de etileno.Por outro lado, melões do grupo
inodorus praticamente não são afetados pela ação do etileno (BAUCHOT et al.,
1998; FLORES et al., 2002).
É com base nos conhecimentos bioquímico-fisiológicos que a maioria dos princípios e métodos de conservação de frutos climatéricos foram desenvolvidos, e estão baseados em estratégias que reduzam a produção e/ou a ação do etileno. No primeiro caso, a redução de produção de etileno, pode ser conseguida através do melhoramento genético, manejo adequado dos frutos, aplicação de inibidores de produção (AVG) ou pela ação (1-MCP) desse hormônio e/ou uso de tecnologias pós-colheita como atmosfera refrigerada, modificada ou controlada (KADER et al., 1989; YAMASHITA et al., 1997; CHEN et al., 2000; BRACKMANN et al., 2001; BOTREL et al., 2001; VILAS BOAS, 2002; BRACKMANN et al., 2004; AGROFRESH, 2007; DREHMER; AMARANTE, 2008; MACIEL et al., 2008; OLIVEIRA 2008; BRACKMANN et al., 2009).
Com o avanço do conhecimento nas temáticas de genômica, bioquímica e fisiologia, os principais eventos relacionados com a maturação/amadurecimento em frutos foram sendo elucidados (LURIE et al., 1996). Um dos primeiros processos estudados foi o da síntese de etileno, cuja via de biossíntese foi descrita por Yang; Hoffman (1984). Com a disponibilidade de clones dos genes envolvidos nessa via de biossíntese foi possível a alteração de genótipos com alterações dessas vias metabólicas. Foram obtidos tomateiros com baixa atividade ACC sintase e baixa atividade ACC oxidase. Em ambos os casos, a produção de etileno e o ciclo de
maturação foram regulados (HAMILTON et al., 1991; AYUB et al., 1996 ; LATCHÉ et al., 1995; PECH, et al., 1995; ROMBALDI et al., 1996).
Em melões, pela transformação genética com o clone da ACCO antisense, os frutos aumentaram o potencial de conservação em 7 dias; porém produziram menos ésteres e não desverdearam a casca, nem formaram zona peduncular de abscisão. Ao aplicar-se etileno, o amadurecimento ocorreu normalmente (BAUCHOT et al., 1998; FLORES et al., 2002), demonstrando que o etileno é fundamental na maturação desse fruto. Paralelamente a esse trabalho, Silva et al. (2004) também inibiram a síntese de ACC oxidase, pela inserção de um clone de ACC oxidase antisense, previamente isolado de maçãs. Como resultado, os melões também apresentaram maior vida de prateleira e menor aromaticidade. No entanto, tornaram-se menos tornaram-sensíveis ao etileno, sugerindo que outros eventos podem estar envolvidos no processo de amadurecimento. As razões exatas desse comportamento não foram desvendadas, mas ficou evidente que, mesmo sob a ação do etileno, não houve o restauro de maturação. Assim, por exemplo, os frutos não formaram a zona peduncular de abscisão, não estimulou-se a produção de compostos voláteis e a casca permaneceu esverdeada. Uma das hipóteses para explicar esse comportamento é de que poderia haver influência de outros hormônios redutores de sensibilidade ao etileno, como é o caso das citocininas e/ou poliaminas. Todavia, poderia haver interferência no sistema de recepção e transdução do sinal etileno. Nesta tese, testou-se a primeira hipótese.
Como modelos de estudo foram utilizados meloeiros e melões (Cucumis
melo L. - var. cantalupensis) e tomateiros e tomates (Lycopersicon esculentum - cv.
Micro-Tom). Doravante, serão utilizadas as expressões melões e tomates. O primeiro modelo foi escolhido por haver disponibilidade de plantas transgênicas com baixa produção de etileno, permitindo a discriminação de eventos etileno-dependentes e etileno-inetileno-dependentes, além do fato de tratar-se de um fruto com elevada síntese de compostos voláteis. A linhagem transgênica pMEL1AS (BALAGUÉ et al., 1993) foi cedida pelo Laboratório de Genômica e Biotecnologia de Frutos - Ensat-Toulouse, para estudo comparativo com uma das linhagens obtidas na UFPel (pAP4AS) (SILVA et al., 2004). O segundo modelo (tomateiros e tomates cv. Micro-Tom) foi escolhido por ser considerado como um sistema modelo para estudar o processo de maturação de frutos climatéricos, bem como para o entendimento da função que o etileno desempenha na maturação desses frutos.
Além disso, têm ciclo relativamente curto, pequeno porte, e boa disponibilidade de informações genômicas e metabolômicas (SCOTT; HARBAUGH, 1989; TANKSLEY, 1993; MEISSNER et al., 1997; PRATTY et al., 1997; EYAL; LEVY, 2002; MARTI et al., 2006; PIRELLO, 2008;TOMATO GENOME CONSORTIUM, 2012).
1.1 Hipóteses
De acordo com o que foi mencionado no referencial teórico precedente, bem como pelo conhecimento obtido acerca de estudos com melões pAP4AS pelo grupo de pesquisa, as hipóteses emitidas para o presente estudo foram as seguintes:
1.1.1 No caso dos melões
a) a redução da produção de compostos voláteis em melões com baixa produção de etileno (pMEL1AS e pAP4AS) se deve à redução da expressão de genes da via de biossíntese de ésteres;
b) a não restauração da produção de compostos voláteis em melões transgênicos pAP4AS está relacionada com os maiores teores de citocininas e/ou poliaminas, reduzindo as respostas à ação do etileno exógeno;
c) a aplicação de citocininas em melões não transformados e em melões pMEL1AS deveria mimetizar o comportamento dos melões pAP4AS.
1.1.2 No caso dos tomates
a) ao se aumentarem os níveis de citocininas, pela aplicação exógena desse regulador de crescimento, se pode interferir nas respostas ao etileno, retardando a evolução da maturação dos frutos.
1.2 Objetivos Gerais
Considerando-se a contextualização da temática da pesquisa, o objetivo geral é desenvolver estudos em pré e pós-colheita de melões e tomates, buscando, com a associação de técnicas de biologia molecular e fisiologia melhor conhecer os mecanismos da maturação e da preservação da qualidade na pós-colheita.
1.2.1 Objetivos Específicos
1.2.1.1 Em melões
a) estudar as causas mais prováveis da redução da produção de ésteres em melões pMEL1AS e pAP4AS;
b) estudar as causas do não restabelecimento completo da maturação de melões pAP4AS, mesmo sob a ação do etileno. Para tanto foram utilizados melões transgênicos e não transgênicos conhecidos pela significativa diferença no que tange à produção de compostos voláteis, buscando caracterizar o acúmulo de transcritos de genes da via de biossíntese do etileno, assim como o de genes relacionados com a síntese de ésteres, correlacionando-os à produção e à ação do etileno, assim como à síntese de ésteres;
c) avaliar o efeito da aplicação de citocininas em melões.
1.2.2.2 Em tomates
a) estudar as consequências da aplicação de citocinina no ciclo vegetativo e na maturação. Para isso foram utilizados tomateiros Micro-Tom, buscando-se avaliar um conjunto de respostas decorrentes da aplicação de citocininas, principalmente no que se refere à maturação e à ação do etileno.
1.3 Estrutura da Tese
A tese está estruturada contendo a introdução, referencial teórico geral, a revisão bibliográfica, um artigo científico referente às alterações fisiológicas e moleculares em melões transformados e não transformados geneticamente (artigo já submetido à revista Posthavest Biology na Technology, ISSN: 0925-5214), um artigo científico referente às alterações fisiológicas em tomates com aplicação exógena de citocinina (ainda não submetido), as considerações finais, e as referências bibliográficas.
Os artigos resultantes dos experimentos realizados são intitulados:
Artigo 1: “Ethylene and cytokinin involvement in ripening and ester volatile
production in genetically modified melons expressing an ACC oxidase antisense”. O artigo foi submetido em 14/08/2012.
Artigo 2: “Respostas fisiológicas de tomates, Micro-Tom, tratados com
citocininas”.
O texto foi redigido seguindo a sequência lógica de artigos científicos, para publicação, mas ainda não foi submetido à apreciação de revistas científicas, pretende-se submeter para a revista Horticulture, Environment, and Biotechnology (HEB).
2 Revisão Bibliográfica
2.1 Maturação e Qualidade de Frutos
Embora o conceito de qualidade dependa de cada etapa da produção de frutos, de modo geral é tido como o conjunto de atributos que atendam ao máximo,
às exigências do consumidor. No caso de frutos, a qualidade é atribuída a quesitos como preço, aparência (tamanho, formato, cor, brilho), textura (maciez, suculência), sabor, palatabilidade, além de propriedades nutritivas, funcionais e de segurança (ROMOJARO; RIQUELME, 1994; LIMA et al., 2002; GUTIERREZ, 2005; ROMBALDI et al., 2007).
Sob o ponto de vista fisiológico, as intervenções se fazem em propriedades relacionadas ao ciclo vegetativo e de produção, com ênfase à maturação/amadurecimento. É nesse estádio que os frutos atingem a máxima qualidade organoléptica, ou seja, tornam-se maiores, mais doces, menos ácidos, menos amargos, menos adstringentes, mais coloridos e mais aromáticos. Ao se tratar a temática de crescimento e desenvolvimento, é comum classificarem-se as fases de evolução em a) crescimento: predomínio da divisão celular; b) maturação fisiológica propriamente dita: período em que ocorre a aquisição da aptidão para amadurecer; c) amadurecimento: período no qual o fruto se torna apto para o consumo; e, d) senescência (YANG; HOFFMAN, 1984; BRANDY, 1987; DIAS, 2001; VILAS BOAS et al., 2001; AMABIS; MARTHO, 2002; GIOVANNONI, 2004; CARVALHO et al., 2011).
A maturação evolui de modo altamente diferenciado entre frutos de espécies diferentes, assim como em frutos da mesma espécie, fato que permite significativos avanços na compreensão do metabolismo do etileno, da respiração e das principais alterações durante a maturação (GIOVANNONI et al., 1989; HAMILTON et al., 1990; OELLER et al., 1991; FRAY; GRIERSON, 1993, AYUB et al., 1996; KLANN et al.,1996).
Há frutos que mesmo quando colhidos no início da fase de maturação são capazes de evoluir essa fase e a de amadurecimento de modo similar àquela
quando o ciclo se completa na planta. É o caso de melões do grupo Cantaloupe, da maioria das variedades comerciais de maçã, pêra, kiwi e tomate. Em outras espécies, os frutos só conseguem desenvolver a maturação/amadurecimento adequado se todas as fases ocorrerem na planta. É o caso da uva, citros, melancia, dentre outros (KADER, 1992; WILLS et al., 1998; KLUGE et al., 2002; CEAGESP, 2003). Noutros casos, o comportamento é variado. Por exemplo, para algumas variedades de pêra, como é o caso da Passe Crassane, a maturação/amadurecimento só ocorre normalmente se os frutos forem colhidos e tratados com etileno ou moléculas com ação de etileno (ethrel ou polipropileno) ou armazenadas por dois meses (LÈLIEVRE et al., 1997).
Os frutos climatéricos são conhecidos pela indução da maturação associada à elevação da síntese e da produção de etileno e alteração do ciclo de respostas autocatalíticas associadas a esse hormônio (MUNASQUE et al., 1990). Em contrapartida os frutos não climatéricos que normalmente produzem menos etileno, não ativam o mecanismo autocalítico e, por conseguinte, não desenvolvem o amadurecimento normal se colhidos em estádios menos avançados de maturação (GOLDSCHMIDT, 1997; VENDRELL; PALOMER, 1997).
2.2 Fitormônios: Hormônios Vegetais na Maturação de Frutas
Fitohormônios são reguladores-chave para o crescimento e desenvolvimento. São eles que regulam a velocidade de crescimento das partes individuais e integram com essas partes para produzir a forma que é reconhecida como uma planta (BLEASDALE, 1977). Esses hormônios têm a função de determinar se as características fenotípicas, ou seja, se a planta é anã ou não, se as folhas envelhecem e caem, se as gemas laterais se desenvolvem, dentre outras alterações. Assim, os hormônios influenciam todas as fases do crescimento vegetal, estando presentes nesses tecidos em concentrações muito baixas, mas seu efeito é frequentemente, notado. Existem grupos de reguladores de crescimento com ação hormonal, de uso comercial, ou seja, fitormônios sintéticos, os quais são classificados em categorias, dependendo da estrutura e efeito. Não são encontrados naturalmente, mas exercem sobre as plantas uma ação semelhante a dos hormônios, causando respostas fisiológicas e influenciando o desenvolvimento das plantas (PAROUSSI et al., 2002).
Os fitormônios promovem respostas específicas em plantas especificas (PAROUSSI et al., 2002; JALEEL et al., 2007a; JALEEL et al., 2007b). Os reguladores vegetais são classificados em seis fitormônios clássicos: etileno (ET), citocininas (CK), auxinas (AX), giberelinas (GA), ácido abscísico (ABA), ácido metil jasmônico (JÁ), ácido salicílico (AS) e os brassinosteróides (BR) (PELEG; BLUMWALD, 2011). Todos esses hormônios vegetais têm interação com a maturação. Porém o etileno é o mais conhecido e citado, por ser o hormônio regulador da maturação climatérica. A seguir serão descritos os dois fithormônios que fizeram parte dos experiementos realizados na presente tese: etileno e citocinas.
2.2.1 Etileno: Biossíntese e Sinalização
É amplamente conhecido, há praticamente um século, que tecidos vegetais produzem etileno (GANE, 1934). Deste então, muitos trabalhos demonstraram a implicação deste regulador de crescimento em numerosas fases do desenvolvimento das plantas. Esse hormônio atua em níveis moleculares e fisiológicos, na indução da expressão de numerosos genes através de uma cadeia de transdução de sinais (MATTOO; SUTTLE, 1991; ABELES, et al., 1992; PECH et al., 1992; KENDE , 1993; THEOLOGIS, 1993; PECH, 1994).
A maioria das alterações fisiológicas da maturação que ocorre em frutos climatéricos é influenciada, direta ou indiretamente, pelo etileno. Praticamente todas as partes dos vegetais superiores produzem etileno em algum momento da sua ontogenia (MATTOO; SUTTLE, 1991; ABELES et al., 1992; TAIZ; ZEIGER, 2009). Mas, este hormônio vegetal atua em vários processos do desenvolvimento vegetal como germinação de sementes, expansão e diferenciação celular, quebra de dormência de gemas e sementes, formação de raízes, florescimento, maturação e amadurecimento (desenvolvimento da cor, amolecimento e produção de aromas), senescência de folhas, flores e frutos, além da abscisão de flores, folhas e frutos, podendo promover diferentes respostas dependendo do estágio de desenvolvimento, das condições ambientais, da espécie ou mesmo da cultivar (MATTOO; SUTTLE, 1991; ABELES et al, 1992; LÈLIEVRE et al., 1997; RODRIGUES; ONO, 2001; SCHALLER, 2003; BALBOTIN, 2007). É importante mencionar que quando se inibe a produção ou a ação ou a percepção do etileno em
frutos climatéricos, se retarda o ciclo vegetativo, a maturação e se aumenta a vida de prateleira (LURIE, 2008).
O precursor primário de síntese de etileno é o aminoácido metionina (Figura 1), e como intermediário S-adenosilmetionina (SAM) e como precursor imediato o ácido aminociclopropano carboxílico (ACC) (CASTRO et al., 2002). É importante mencionar que a ACC sintase foi identificada pela primeira vez em maturação de tomates (BOLLER et al., 1979; YU et al., 1979). No início da maturação dos frutos, a expressão de genes ACC sintase é ativada, resultando no aumento da produção de ACC. Geralmente é a atividade da enzima ACC sintase que determina a taxa de biossíntese de etileno e esse é um dos mecanismos utilizados pelas plantas para controlar a produção de ACC. Além de ACC, a ACC sintase também produz metiltioadenosina (MTA), reciclada no Ciclo de Yang, para regeneração da metionina, assegurando que altas taxas de síntese de etileno possam ser mantidas mesmo quando os níveis de metionina são baixos. A ACC oxidase em condições aeróbicas converte a ACC em etileno (BLEECKER; KENDE, 2000; ALEXANDER; GRIERSON, 2002; TAIZ; ZEIGER, 2004; CASTRO; KLUGE; PERES, 2005; PRASANNA et al., 2007; CARA; GIOVANNONI, 2008; LIN et al., 2009; BAPAT et al., 2010). Por outro lado, há maior produção de etileno pela reciclagem da metionina durante o climatérico através do Ciclo de Yang (CASTRO; KLUGE; PERES, 2005). A reciclagem de ACC também pode contribuir para um aumento na produção de etileno, mas este evento parece atuar mais como um ponto de regulação desse hormônio.
Figura 1. Via de biossíntese do etileno. O acúmulo de transcritos da
enzimas ACCS e ACCO, assim como o etileno e poliaminas, foram objeto de estudo desse trabalho. Fonte: Adaptado de Silva (2000), a partir de Mathooko (1996)1.
Diferentes ações como estresses (ataque de patógenos e danos mecânicos) e aplicação de etileno ou propileno podem alterar a transcrição de genes ACC sintase, ativando ou inibindo a transcrição (MATTOO; SUTTLE, 1991; ABELES et al., 1992; ROMANO et al., 1995; O'DONNELL et al., 1996; PENNINCKX et al., 1998; BLEECKER; KENDE, 2000; O'DONNELL et al., 2003; ARGUESO et al., 2007). A ação de outros hormônios vegetais também pode alterar a expressão de diferentes genes de ACC sintase (YANG; HOFFMAN, 1984; TAIZ; ZEIGER, 2004; TSUCHISAKA; THEOLOGIS, 2004; DUGARDEYN; VAN DER STRAETEN, 2008). Durante a maturação/amadurecimento de frutos, o etileno modula vários processos metabólicos, coordenando a expressão gênica que atua no aumento da taxa respiratória, na degradação de clorofila e na síntese de carotenóides e, na interconversão de açúcares, no aumento na atividade de enzimas que degradam a parede celular bem como na produção autocatalítica de etileno (GRAY et al., 1992).
O etileno regula diversas respostas em nível transcricional, e sua via de sinalização ativa fatores de transcrição específicos que controlam diferentes respostas. Esta via de sinalização é parcialmente conhecida. Existem três
Figura 1. Via de biossíntese do etileno. O acúmulo de transcritos da enzimas ACCS e ACCO, assim
como o etileno e poliaminas, foram objeto de estudo desse trabalho. Fonte: Adaptado de Silva (2000), a partir de Mathooko (1996)1. METIONINA AdoMet sintetase ACC Sintases Adenosina (AdoMet ou SAM) ACC ETILENO ACC Oxidases Poliaminas
importantes etapas que retratam as alterações fenotípicas que ocorrem em frutos em resposta à ação do etileno: a) percepção do hormônio; b) transdução do sinal através das entidades reguladoras da expressão gênica; c) expressão de genes e a síntese de proteínas sensíveis ao sinal recebido do etileno (CARA; GIOVANNONI, 2008).
Após a síntese, ocorre a percepção do etileno, levando à transdução de sinal até o núcleo (BLEECKER, 1999; CHEN et al., 2002; SCHALLER; KIEBER, 2002; GAO et al., 2003; GREFEN et al., 2008; BISSON et al., 2009). Muitos componentes da via de sinalização, que ligam a percepção do hormônio através de receptores do retículo endoplasmático, foram clonados e caracterizados (KENDRICK; CHANG, 2008).
O processo de percepção ocorre através de uma cascata de sinalização, incluindo reguladores positivos e negativos (CTR, EIN2, EIN3) (HUA; MEYEROWITZ, 1998; WANG et al., 2003; QU et al., 2007; LIU et al., 2010). Os receptores de etileno (ETRs), em A. thaliana, são cinco (ETR1, ETR2, ERS1, ERS2, EIN4), pertencentes à mesma família e estão localizados na membrana do retículo endoplasmático. Os ETRs são funcionalmente redundantes, embora tenham algumas funções distintas. Esses receptores têm semelhança com o receptor de procariotos, proteína Histidine Kinase (BINDER et al., 2012). Em A. thaliana a subfamília de receptores I (ETR1 e ERS1) têm papel preponderante no controle de respostas ao etileno (HUA; MEYEROWITZ, 1998; QU et al., 2007). Estudos genéticos indicam que a autofosforilação da Histidine tem função nas respostas ao etileno (WANG et al., 2003; HALL et al., 2012). Estudos recentes também sugerem que a ligação do etileno pelo receptor de etileno de A. thaliana (ETR1) estimula a auto-atividade da Histidine Kinase (HALL et al., 2012), enquanto uma análise bioquímica de ETR1, in vitro, indica que a ligação de etileno inibe tal atividade (VOET-VAN-VORMIZEELE; GROTH, 2008).
Um dos reguladores negativos as respostas do etileno, a proteína Histidine
Kinase (CTR1) a Raf-like MAPKKK, se liga e atua a jusante dos receptores do
etileno (KIEBER et al., 1993; CLARK et al., 1998; GAO et al., 2003; HUANG et al, 2003; ZHONG et al., 2008). Com a perda da função do CTR1 há respostas constitutivas ao etileno. Sabe-se que na ausência da percepção de etileno, os receptores de etileno ETR1 e ETR2 tendem a reprimir as respostas através da
ativação de CTR1 (CLARK et al.; 1998; HUANG et al.; 2003; ZHONG; CHANG, 2012).
Após a ligação do etileno com os receptores, o CTR1 fica inativado e a cascata de sinalização é iniciada (KIEBER et al., 1993; BLEECKER; KENDE, 2000).
EIN2, um regulador de respostas positivas ao etileno, está localizado a jusante do CTR1 e, com a sua função/atuação, ocorre a insensibilidade completa ao etileno (ALONSO et al., 1999).
Mesmo desempenhando função indispensável na resposta ao etileno, não se sabe como EIN2 é ativado em nível bioquímico, nem como EIN2 retransmite o sinal de etileno a proteínas a jusante. Em A. thaliana o EIN2 interage com os cinco receptores de etileno (QIAO et al., 2009; BISSON; GROTH 2010). ETR1 é um dos receptores do etileno em A. thaliana; esse receptor é dependente de um componente adicional a montante, chamado RTE1 (em tomate também é identificado com gene verde-maduro) (BARRY; GIOVANNONI 2006; RESNICK et al. 2006).
A perda de RTE1 resulta num fenótipo semelhante ao do mutante ETR1 (RESNICK et al., 2006; ZHOU et al.; 2007). Porém, a proteína ETR1 está presente em níveis normais quando RTE1 está ausente (RESNICK et al.; 2008).
Os homólogos RTE1, além de serem encontrados em plantas, também estão presentes em animais. RTE1 e ETR1, codificam uma proteína membranar, localizada no reticulo endoplasmatico e no complexo Golgi (DONG et al., 2008), e podem associar-se fisicamente com ETR1 (DONG et al. 2010). Ainda não se conhece a função molecular de RTE1, mas existem evidências que a relacionam com o transporte de cobre (RESNICK et al., 2000). Apenas ETR1 e os receptores de etileno não são dependentes de outros RTE1, apesar de todos os receptores estarem na mesma proteína. A sinalização do receptor do complexo etileno-CTR1(CONSTITUTIVA TRIPLE RESPONSE 1) em associação com a proteína
Histidine Kinase com os receptores CTR1 de etileno, é um CTR1 - proteína Histidine Kinase serina/treonina, com sequência semelhante para a família da proteína Kinase-Raf. Estudos bioquímicos, in vitro, demosntraram que a Kinase de A. thaliana, domínio CTR1, tem atividade de proteína kinase serina/treonina intrínseca,
semelhantes a Raf-1 em propriedades enzimáticas em resíduos conservados do domínio cinase de interromper esta atividade e conferir fenótipos constitutivos de
etileno-resposta, além disso, CTR1 exibe autofosforilação intermolecular (HUANG et al. 2003).
A CTR1 está localizada na membrana do retículo endoplasmático devido a sua associação com os receptores de etileno (CLARK et al., 1998; GAO et al., 2003; ZHONG et al., 2008). Acredita-se que os receptores de etileno são ativados por CTR1; com essa interação, e membrana pode também colocar CTR1 em contato com outros elementos reguladores. CTR1 de A. thaliana pode ter uma associação mais fraca com a subfamília II do receptor ETR2 quando comparada com a subfamília I desses receptores (CANCEL; LARSEN, 2002), porém experiementos in
vivo, demonstram que CTR1 interage com todos membros da família de receptores
de etileno (GAO et al., 2003). Recentemente a estrutura cristalina do domínio CTR1 Kinase mostra que este, possui uma interface do dímero alostérico, sugerindo que a oligomerização de dímeros do domínio CTR1 Kinase (MAYERHOFER et al., 2012).
Na sequência de respostas ao etileno, ocorre a regulação da expressão de genes-alvo por fatores de transcrição, denominados de fatores de resposta ao etileno (“Ethylene Response Factor” - ERFs) que, posteriormente, serão responsáveis por mudanças nas vias biossintéticas (BLEECKER; KENDE 2000; ADAMS-PHILLIPS et al., 2004; CARA; GIOVANNONI, 2008; STEPANOVA; ALONSO 2009; BAPAT et al., 2010). Tais fatores de transcrição são proteínas que possuem sequências específicas que interagem com regiões promotoras de genes alvos e modulam a síntese de mRNA através de RNA polimerases. VOM ENDT et al., 2002; ZAHA, 2003).
O processo de regulação da expressão gênica culmina com respostas bioquímico-fisiológicas, decorrentes das modificações na parede celular, do aumento de compostos voláteis e do balanço entre ácidos e açúcares (ALEXANDER; GRIERSON, 2002; GIOVANNONI, 2004; PRASANNA et al., 2007; CARA; GIOVANNONI, 2008).
Com relação às proteínas sinalizadoras e dos fatores de transcrição em vegetais, tem-se a existência de proteínas ativadas em situação de estresse biótico e abiótico, como as MITOGEN-ACTIVATED PROTEIN KINASE (MAPK) e família de fatores de transcrição MYB (myeloblastosis transcription factors). As proteínas MYB podem ser classificadas em 3 subfamílias, de acordo com o número de domínios MYB presentes: R1, R2 e R3 (STRACK et al., 2001).
A família de fatores de transcrição MYB têm função na síntese de fenilpropanóides, sendo considerada a maior família de fatores de transcrição (MATSUOKA et al., 2002; MAZZUCOTELLI et al., 2008). Em A. thaliana foram identificados geneticamente muitos componentes da via de sinalização e de transdução de sinal de etileno, a partir de receptores da membrana para ativadores nucleares, como os reguladores. Na ausência de ETR1 o etileno e outros receptores inibem a sinalização de hormônios, ativando o CTR1, regulador negativo (MAPKKK Raf-like putativo), nos complexos do reticulo endoplasmatico (Kieber et al., 1993; Hua; Meyerowitz, 1998; Gao et al., 2003; Wang et al., 2003).
Em seguida EIN e o fator-chave para a transcrição é degradado através do reconhecimento especifico caixa-F das proteínas EBF1/2 nos complexos ligase E3 (CHAO et al, 1997; POTUSCHAK et al., 2003). As evidências de que a atividade de MAPK estão relacionadas com a via de resposta ao etileno surgiram em experimento com A. thaliana, onde uma proteína com semelhanças a um MAPK foi ativada por tratamento exógeno com etileno (NOVIKOVA et al., 2000). Estudos também mostraram que esta afirmativa é verdadeira pois o hormônio etileno (sob a forma de ACC) tem a capacidade de ativar, in vitro, a MAPKK e duas MAPKs (SIMK e MMK3) (DESIKAN ET al., 2001; ASAI ET AL., 2002; OUAKED et al., 2003; MENKE ET AL., 2004; DOZCI et al., 2007; BUSH; KRYSAN, 2007; TAKAHASHI et al., 2007; CHO ET AL., 2008; REN et al., 2008).
Figura 2. Transdução do sinal do etileno. Etileno e recebido pelos receptores e a rota de
sinalização e bloqueada. A jusante proteínas CTR1-like também atuam como reguladores negativos enquanto EIN2 controla a sinalização e resposta ao etileno positivamente. No núcleo a proteína EIL reconhece ERES no promotor de genes de senescência e amadurecimento incluindo ERFs, queem contrapartida podem se ligar a GCC-box no promotor de genes de resposta ao etileno. Fonte: Adaptado de Bapat et al. (2010)2.
A maturação/amadurecimento de frutos tem recebido bastante atenção devido à ampla gama de processos metabólicos e mudanças significativas que ocorrem antes e depois desse evento. Em frutos climatéricos, incluindo a maioria dos genótipos de tomates e alguns melões, o etileno é conhecido por induzir a maturação, sendo essencial para a realização do processo de maturação/amadurecimento em todas as fases (ABELES et al., 1992;. HIWASA et al., 2003). No que tange à produção desse hormônio, dois sistemas (Sistema 1 e Sistema 2) foram definidos (MCMURCHIE et al., 1972). O Sistema 1 representa o etileno basal em frutos verdes e tecidos vegetativos. O Sistema 2 representa o
grande aumento na produção de etileno associada com a
maturação/amadurecimento de frutos e senescência das flores, sendo regulado
2
Figura 2. Transdução do sinal do etileno. Etileno e recebido pelos receptores e a rota de sinalização e bloqueada. A jusante proteínas CTR1-like também atuam como reguladores negativos enquanto EIN2 controla a sinalização e resposta ao etileno positivamente. No núcleo a proteína EIL reconhece ERES no promotor de genes de senescência e amadurecimento incluindo ERFs, que em contrapartida podem se ligar a GCC-box no promotor de genes de resposta ao etileno. Fonte: Adaptado de Bapat et al. (2010)2.
de forma autocatalítica (OETIKER; YANG, 1995; LELIÈVRE et al., 1998; NAKATSUKA et al., 1998; INABA, 2007).
Em frutos climatéricos, quando ocorre a aplicação exógena de etileno há estímulo do Sistema 2, resultando na maturação do fruto. Como mencionado anteriormente, o passo limitante para a velocidade na biossíntese da principal via do etileno em plantas é a produção de 1-aminociclopropano-1-carboxílico (ACC), a reação catalisada pela ACC sintase, a qual é seguida pela conversão de ACC para etileno pelo ACC oxidase (OETIKER; YANG, 1995; BLEECKER; KENDE, 2000). O Sistema 1 está envolvido na expressão de LeACS1A, que é etileno independente, e LeACS6, que é regulada por um sistema de feedback negativo (NAKATSUKA et al., 1998; BARRY et al., 2000). Em contraste, o sistema 2 é regulado pela LeACS2 e LeACS4, ambos controlados por uma forma de feedback positivo. Os caminhos fisiológicos e moleculares que atuam no início da transição a partir do Sistema 1 para o Sistema 2, para síntese de etileno no início da maturação/amadurecimento permanecem desconhecidos (BARRY; GIOVANNONI, 2007; CARA; GIOVANNONI, 2008). Teoricamente, uma das explicações seria que os efeitos cumulativos do Sistema 1, mesmo com nível baixo, atingem certo limite, e induzem o Sistema 2 (KLEE, 2004). Outra explicação é a de que há uma alteração na sensibilidade do fruto ao etileno, ou seja, frutos podem se tornar mais sensíveis a um sistema com baixo nível de etileno. Evidências, indicam que a transição da fase do Sistema 1 para o Sistema 2 é causada por uma alteração na sensibilidade ao etileno, devido à exposição contínua do fruto ao Sistema 1 (BARRY et al., 2000). O envolvimento da transição da fase do Sistema 1 é suportada pela observação de que o tratamento de um fruto imaturo com etileno durante curto período de tempo não induz imediatamente ao sistema de 2, porém encurta o período anterior, o início do Sistema 2 (YANG, 1987). Estudos apontam que o encurtamento do período de maturação pela aplicação de etileno está relacionado ao nível da proteína receptora de etileno, visto que a exposição de etileno provoca uma redução de proteína receptora de etileno, ou seja, o etileno regula negativamente a expressão de gene correspondente à proteína receptora desse hormônio (KEVANY et al., 2007). Mutantes de A. thaliana têm sido utilizados para entender a via de sinalização de etileno (ALEXANDER; GRIERSON, 2002; KLEE, 2004; KENDRICK; CHANG, 2008). Resumindo, o etileno é percebido pelos receptores de RESISTÊNCIA AO ETILENO 1 (ETR1) e por proteínas relacionadas (CHANG et al., 1993; HUA et al., 1998). O
sinal de etileno é transduzido para ETILENO INSENSITIVE 3 (EIN3) através RESPOSTA CONSTITUTIVA TRIPLE 1 (CTR1) (KIEBER et al., 1993) e ETILENO INSENSITIVE 2 (EIN2) (ALONSO et al., 1999). EIN3 é um fator de transcrição que desempenha um papel crucial na regulação da expressão de genes de resposta ao etileno (CHAO et al., 1997; SOLANO et al., 1998). Estudos recentes revelaram que, na ausência de etileno, a proteína EIN3 é rapidamente degradada através de ubiquitina mediada por duas proteínas da caixa-F (EBF1 e EBF2). Proteína EIN3 é estabilizada pelo etileno (GUO; ECKER, 2003; POTUSCHAK et al., 2003; GAGNE et al., 2004). Em tomate, a redução da expressão de genes LeEIL, através da tecnologia antisense tem modulado respostas ao etileno, como epinastia das folhas, senescência das flores e maturação/amadurecimento dos frutos, funcionando de maneira redundante (TIEMAN et al., 2001). Também em tomates, o silenciamento gênico, induzido por vírus, de genes LeEIL tem causado amadurecimento com deficiência nos fenótipos (FU et al., 2005).
Como mencionado anteriromente, é amplamente conhecido que para que ocorra a maturação/amadurecimento de frutos climatéricos faz-se necessário a presença de etileno, fato comprovado com a utilização de tomate como sistema modelo (YANG, 1985; TUCKER; BRADY, 1987). Molecularmente esse afirmativa foi observada pela primeira vez através de análise etileno-induzível, relacionada com o amadurecimento e expressão de genes em tomate (LINCOLN et al., 1987; MAUNDERS et al., 1987).
Os avanços fisiológicos acerca da maturação/amadurecimento foram evoluindo a partir da obtenção de plantas transgênicas onde se inibe HMG-CoA, poligalacturonase redutase (PG), pectinametilesterase, ACC sintase, ACC oxidase, fitoeno sintase receptor de etileno (GRAY, et al., 1994). Assim, foi demonstrado que PG é necessária para o amadurecimento, pois está relacionada com a despolimerização da pectina e suscetibilidade de patógenos, porém tem pouco efeito sobre a amolecimento do fruto (SMITH, et al., 1988; GIOVANNONI, et al., 1989; KRAMER , et al., 1990). A inibição da ACC sintase ocasionou a redução de fitoeno pela reduzida biossíntese de carotenóides e, consequentemente, redução da pigmentação dos frutos e das flores (FRAY; GRIERSON, 1993). Redução do efeito autocatalítico do etileno pode ocorrer através da inibição do amadurecimento, pelas enzimas ACC sintase e ACC oxidase em sentido antisense (HAMILTON et al., 1990; OELLER et al., 1991).
2.2.2 Citocinina: Biossíntese e Sinalização e Transcrição
A primeira citocinina natural foi isolada do endosperma do milho, denominada trans-zeatina, em 1961 (MILLER, 1961; LETHAM, 1973). Sua nomenclatura está relacionada à ação dessa substância durante a citocinese (COLL et al., 2001). As citocininas são hormônios que ocorrem naturalmente, são biologicamente ativas e representam uma classe heterogénea de derivados da adenina com um pequeno substituinte na posição N6, como é o caso da maioria das citocininas como a zeatina e a isopenteniladenina que têm o grupo isopentenil nesta posição. No entanto, pode haver um substituinte aromático, como na cinetina que é N6-benziladenina. Mais de 25 diferentes citocininas têm sido isoladas a partir de plantas. Derivados sintéticos da feniluréia como o tidiazuron também exibem atividade de citocinina (SKOOG et al., 1967; SAKAKIBARA, 2006; HIROSE et al., 2008).
Esse hormônio (citocinina) controla e regula uma ampla gama de aspectos fisiológicos no crescimento e desenvolvimento vegetal como divisão e expansão celular, diferenciação plastidial, ativam o fluxo de metabólitos e a formação de brotos e calos em cultura de células, favorecem a dominância apical e mobilização de nutrientes, a germinação das sementes, a modelação vascular e atividade cambial, a iniciação e crescimento do caule, o retardamento da senescência foliar, a morfogênese da parte aérea e das raízes, regulação do desenvolvimento das sementes, maturação dos cloroplastos, formação e atividade dos meristemas apicais, ruptura da dominância apical, indução do florescimento e indução de partenocarpia em frutos (MOK, 1994; ARTECA, 1995 COLL et al., 2001; RAVEN et al., 2001; KAKIMOTO, 2003; DAVIES, 2004; RIEFLER et al., 2006; TAIZ; ZEIGER, 2006; KARAKAWA et al., 2007; MATSUMOTO-KITANO et al., 2008; WERNER, 2009; ROMANOV, 2012). Além de participar do desenvolvimento de organelas, atividade enzimática, abertura estomática, desenvolvimento de frutos e hidrólise de reservas de sementes, nutrição de plantas, resistência de plantas a fatores adversos, afetam o tamanho de grãos de cereais e alteram a sensibilidade ao etileno (SALISBURY; ROSS, 1994; VOGEL, et al., 1997; VOGEL et al., 1998; DAVIES, 2004; CHOI et al., 2011; SPADAFORA et al. 2012).
O principal local de biossíntese de citocininas são as raízes, de onde vão, via xilema, por diferentes órgãos da planta. Porém, a síntese também pode ocorrer
em outras partes da planta (SCHMÜLLING, 2004; SAKAKIBARA, 2006; HIROSE et al., 2008; ARGUESO et al., 2009; WERNER; SCHULLING, 2009; BARTRINA et al., 2011). Também possuem papel importante no desenvolvimento do aparelho fotossintético, pois são moléculas atuantes no desenvolvimento dos cloroplastos, regulando vias biológicas na recepção da luz, além de terem influência no transporte de elétrons, acúmulo de clorofila e síntese da enzima ribulose 1,5-difosfato carboxilase (rubisco) (NYITRAI, 1997). Estudos indicam que as citocininas ativam a síntese de proteínas codificadoras do cloroplasto por genomas nuclear e de plastídeo, aumentando a produção de pigmentos fotossintéticos e estimulando a diferenciação dos cloroplastos estruturais (BUSCHMANN; LICHTENTHALER, 1977; LERBS et al., 1984; AXELOS et al., 1987; RESKI et al., 1991; KASTEN et al., 1992; KUNESTSOV et al., 1994; KUNESTSOV et al., 1998; KUNESTSOV et al., 1999; KUBO e KAKIMOTO, 2000). Técnicas moleculares, genéticas, bioquímicas e abordagens genômicas têm auxiliado na descoberta das diversas funções que as citocininas desempenham como é o caso da sinalização em células, induzindo a divisão celular, diferenciação, nodulação, transição para imunidade, floração, estresse e senescência (MOK; MOK, 2001; SAKAKIBARA et al., 2006; WALTERS; MCROBERTS, 2006; MULLER; SHEE, 2007; ARGUESO et al., 2009; WERNER; SCHMULLING, 2009; ARGUESO et al., 2010; PERILLI et al., 2010; BISHOPP et al., 2011; CHOI et al., 2011; MULLER, 2011; HEYL et al., 2012). Importante comentar que as citocininas e as auxinas são hormônios necessários para o crescimento e desenvolvimento das plantas, diferindo dos demais hormônios vegetais e agentes de sinalização, pois esses parecem agir apenas como reguladores dos processos específicos do desenvolvimento (TAIZ; ZEIGER, 2011). Recentemente foi demonstrado que a aplicação de citocininas e compostos a ela relacionados, são capazes de agir como anti-tumorais e inibidores de processos neurodegenerativos em células animais (GOLD-VON et al., 2009; ROMANOV, 2009; KOLYACHKINA et al., 2011).
Existe uma grande diversidade específica de padrões que atuam na expressão e estão envolvidos no metabolismo e na biossíntese de citocinina, como, isopentenyltransferase (IPT), citocinina nucleosídeo 5-Monofosfato phosphoribohydrolase (LOG), e citocinina de degradação - citocinina oxidase /desidrogenase (CKX) (WERNER et al., 2003; MIYAWAKI et al., 2004; HIROSE et al., 2008; KUROHA et al., 2009). Na maioria das espécies, a biossíntese de
