michellealvesvicentini

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUIZ DE FORA INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGIA, MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA. Michelle Alves Vicentini. EFEITO MODULATÓRIO DA COINFECÇÃO PELO Mycobacterium bovis NA RESPOSTA IMUNOLÓGICA DE CAMUNDONGOS INFECTADOS COM Strongyloides venezuelensis. JUIZ DE FORA 2008.

(2) 2008. PGCBIO. Michelle Alves Vicentini. ICB/UFJF.

(3) MICHELLE ALVES VICENTINI. EFEITO MODULATÓRIO DA COINFECÇÃO PELO Mycobacterium bovis NA RESPOSTA IMUNOLÓGICA DE CAMUNDONGOS INFECTADOS COM Strongyloides venezuelensis. Dissertação de Mestrado do Curso de Pós-Graduação em Ciências Biológicas para obtenção do Título de Mestre em Ciências Biológicas na área de Imunologia.. Orientadora: Profa. Dra Ana Paula Ferreira. Juiz de Fora 2008.

(4) VICENTINI, M. A. Efeito Modulatório da Coinfecção pelo Mycobacterium bovis na Resposta Imunológica de Camundongos Infectados com Strongyloides venezuelensis, 2008. 65f. Dissertação de Mestrado (Curso de Pós-graduação em Ciências Biológicas) – Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Juiz de Fora..

(5) UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUIZ DE FORA INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGIA, MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA Esta dissertação intitulada:. EFEITO MODULATÓRIO DA COINFECÇÃO PELO Mycobacterium bovis NA RESPOSTA IMUNOLÓGICA DE CAMUNDONGOS INFECTADOS COM Strongyloides venezuelensis. apresentada por:. MICHELLE ALVES VICENTINI. Foi avaliada pela banca examinadora composta pelos seguintes membros: _______________________________________________________________ Profa. Dra. Ana Paula Ferreira – Universidade Federal de Juiz de Fora-MG _______________________________________________________________ Prof. Dr. Sílvio Celso Gonçalves da Costa – Instituto Oswaldo Cruz -FIOCRUZ - RJ _______________________________________________________________ Prof. Dr. Cáudio Galuppo Diniz– Universidade Federal de Juiz de fora-MG _______________________________________________________________ Profa. Dra. Celeste Silva Freitas de Souza- Instituto Oswaldo Cruz - FIOCRUZ - RJ. Dissertação defendida em 5 de Março de 2008.

(6) Esse trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Imunologia, no Departamento de Parasitologia, Microbiologia e Imunologia do Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Juiz de Fora, Juiz de Fora, MG, sob a orientação da Profa. Dra. Ana Paula Ferreira, com o patrocínio financeiro da UFJF e da FAPEMIG..

(7) Posso, tudo posso Naquele que me fortalece Nada e ninguém no mundo vai me fazer desistir Quero, tudo quero, sem medo entregar meus projetos Deixar-me guiar nos caminhos que Deus desejou pra mim e ali estar Vou perseguir tudo aquilo que Deus já escolheu pra mim Vou persistir, e mesmo nas marcas daquela dor Do que ficou, vou me lembrar E realizar o sonho mais lindo que Deus sonhou Em meu lugar estar na espera de um novo que vai chegar Vou persistir, continuar a esperar e crer E mesmo quando a visão se turva e o coração só chora Mas na alma, há certeza da vitória Eu vou sofrendo, mas seguindo enquanto tantos não entendem Vou cantando minha história, profetizando Que eu posso, tudo posso... em Jesus! Música “TUDO POSSO” Celina Borges. “A fé é um modo de já possuir aquilo que se espera, é um meio de conhecer realidades que não se vêm.” (Hebreus, 11:1).

(8) AGRADECIMENTOS. À Deus, pelo dom da vida, por minha saúde, por me dar forças para perseverar, por me ter dado a felicidade de ser filha de meus pais e irmã dos meus irmãos, por ter colocado tantos anjos, no meu caminho, ao longo das estradas que trilhei. Aos meus pais Dorinha e Alceu pelo amor sem medida, doação, e eterno apoio. Aos meus irmãos lindos, Leandro e Eduardo, pelo incentivo, pelas risadas e pelo carinho de sempre. Vocês são pra mim, o lado doce e alegre da vida, com suas risadas fáceis e a forma tão leve de encarar os acontecimentos. A todos vocês, muito obrigada por existirem, por me amar, e pela compreensão por tantas ausências devido às horas dedicadas aos estudos. Mesmo longe eu sempre soube que vocês estariam lá pra mim e por mim, quando eu precisasse. Ao. meu. namorado,. Bruno,. por. tanto. companheirismo,. incentivo,. compreensão, carinho e pela impressionante PACIÊNCIA! Às vezes, eu mesma não me entendia ou suportava! Mas você continuava ao meu lado, me dando forças e me fazendo rir! À minha orientadora, Ana Paula Ferreira, por ter me aceito como orientada, a quase cinco anos atrás, e ter me ensinado tantas e tantas coisas! Muito obrigada por seu exemplo de profissionalismo, carinho, por ir para a bancada comigo nos experimentos e me ensinar com tanta paciência as técnicas de pesquisa. Obrigada principalmente, por tudo aquilo que aprendi com você como ser humano, riquezas e conhecimentos que não estão contidos em nenhum livro ou artigo científico. Ao chefe do laboratório de Imunologia, Henrique Couto Teixeira, pelo apoio no desenvolvimento dessa dissertação. Aos meus tantos amigos do laboratório, que foram tão importantes na minha formação humana e profissional. Obrigada pelos momentos de conversas, descontração, risadas ou lamentações! Aos encontros nas casas de amigos! Ao carinho e simpatia constantes!Com vocês, a vida ficou muito mais colorida! Muito obrigada a todos, que me ajudaram nos experimentos com tanta dedicação: Alyria, Ana Maria, Bianca, Bruno, Caio, Carol, Chico, Cida, Isabelly, Lívia,.

(9) Márcio, Marina, Juliana, “Micheles” Barsante e Rodrigues, Raquel, Suelen...... Esse trabalho tem um pouco de cada um de vocês! À Alyria e Lívia, um agradecimento especial por sua dedicação, ajuda e companheirismo no desenvolvimento desse trabalho. Vocês são maravilhosas, em todos os sentidos! À minha mãe-irmã Ana Maria, presente de Deus em minha vida. Muito obrigada por seu companheirismo, lealdade, carinho e exemplo de superação! Sem você, teria sido muito mais difícil chegar até aqui! Ao meu anjo-amigo Caio, por ter me acolhido desde que cheguei ao laboratório, pela paciência invejável em me explicar tantas vezes a mesma coisa! Pelas tantas vezes em que ficou até tarde no laboratório para me ajudar nos experimentos e por tantas outras coisas que não cabem em palavras.Você foi meu co-orientador não oficial nessa caminhada! À “minha-nossa” doce Maria Aparecida de Souza (Cida), por seu carinho, auxílio e paciência em todos os momentos em que precisei. Eu não consigo encontrar palavras que expressem o quanto você foi importante para a preparação desse trabalho e o quanto é importante pra mim. À Fernanda Moreira de Freitas Soares, por tanto apoio, carinho, profissionalismo e cuidado comigo. Você é mais um dos anjos que Deus colocou em meu caminho! A poucos dias ,um tal anjo, Fábio de Melo, disse que há momentos e palavras que não cabem dentro de nós de tão grandes que o são, mesmo que levem poucos segundos para acontecer. E que de tão grandes e importantes, eles ainda continuarão a soar em nossa alma e coração pelo resto de nossas vidas. Obrigada a todos aqueles que com gestos, palavras ou silêncio, mesmo sem saber, plantaram tais momentos em mim....

(10) RESUMO As parasitoses intestinais representam um importante problema médico-sanitário, tendo em vista o grande número de pessoas acometidas e as inúmeras alterações orgânicas que podem provocar no hospedeiro. Infecções provocadas por Strongyloides venezuelensis apresentam uma resposta imune local tanto nos pulmões quanto no intestino, predominantemente do tipo Th2, caracterizada pela produção das citocinas IL-4, IL-5, IL-13 e IL-10, resultando em eosinofilia, aumento da produção de muco, mastocitose e altas concentrações de IgE. Por outro lado, infecções provocadas por micobactérias estimulam uma imunidade predominantemente do tipo Th1 caracterizada pela produção de IFN-γ, IL-12, TNF-α e óxido nítrico. A tuberculose, causada pelo patógeno intracelular Mycobacterium tuberculosis, é uma das doenças infecciosas mais importantes, sendo responsável por aproximadamente 2,9 milhões de óbitos e 8 milhões de novos casos por ano. Ainda são escassos os trabalhos envolvendo co-infecções, e devido às complexas relações existentes entre parasitos e entre eles e seu hospedeiro, faz-se necessário observações criteriosas. No presente trabalho avaliou-se o efeito modulatório que o Mycobacterium bovis virulento exerce sobre a resposta imune de camundongos coinfectados com S. venezuelensis. Os resultados demonstraram que o perfil de resposta imune durante a infecção por S. venezuelensis parece ser diretamente influenciado pela presença do M. bovis, uma vez que o perfil de resposta Th2, específico ao verme, esteve diminuído nos animais co-infectados. Tal diminuição pôde ser constatada pelo aumento do número de ovos e vermes nos animais coinfectados quando comparado com os animais infectados somente com S. venezuelensis; assim como a diminuição dos níveis de IgE específica à larva L3 do verme detectada em diferentes pontos da infecção; diminuição dos níveis de IL-10 produzida por células de baço estimuladas in vitro com antígeno da larva L3 do verme; diminuição dos níveis de IL-4, IL-5 e IL-13 no intestino; diminuição da expressão de CD80, CD86 e CD25 em células de baço e linfonodo e aumento da expressão de CD28 em células de linfonodos mesentéricos. Em conjunto, esses resultados sugerem que a infecção por M. bovis, e a conseqüente ativação do perfil de resposta imune do tipo Th1, foi capaz de modular o desenvolvimento do perfil de resposta imune do tipo Th2 contra S. venezuelensis nos animais co-infectados, deixando-os mais susceptíveis à infecção com S. venezuelensis. Esse trabalho é o primeiro a avaliar os mecanismos imunoregulatórios envolvidos na co-infecção S. venezuelensis versus M. bovis. Palavras-chave: Co-infecção; Strongyloides venezuelensis; Mycobacterium bovis; imumodulação, moléculas co-estimulatórias..

(11) ABSTRACT The intestinal parasites are a major medical-health problem, in view of the large number of people involved and the numerous organizational changes which may result in the host. Infections caused by Strongyloides venezuelensis have a local immune response in both lungs as in the intestine, predominantly from the Th2 type, characterized by the production of cytokines IL-4, IL-5, IL-13 and IL-10, resulting in eosinophilia, increased production of mucus, mastocytosis and high levels of IgE. In addition, infections caused by mycobacteria stimulate predominantly an Th1-type immune response characterized by the production of IFN-α, IL-12, TNF-γ and nitric oxide. Tuberculosis, caused by intracellular pathogen Mycobacterium tuberculosis, is one of the most important infectious diseases, accounting for approximately 2.9 million deaths and 8 million new cases per year. Are still scarce papers involving coinfections, and because of the complex relationship between parasites and between them and their host, it is necessary criterious evaluations. This study evaluated the modulatory effect that the virulent Mycobacterium bovis has on the immune response of mice co-infected with S. venezuelensis. The results showed that the profile of immune response during infection with S. venezuelensis seems to be directly influenced by the presence of M. bovis, because the profile of Th2 response, specific to the worm, was reduced in co-infected animals. This decline could be observed by increasing the number of eggs and worms in animals co-infected when compared with animals infected only with S. venezuelensis, as well as decreased levels of IgE specific to the L3 larvae of the worm detected at different points of infection, decreased levels of IL-10 produced by spleen cells stimulated in vitro with L3 larvae antigen; decreased levels of IL-4, IL-5 and IL-13 in the intestine, reducing the expression of CD80, CD86 and CD25 cells in the spleen and lymph nodes and increased expression of CD28 cells in mesenteric lymph nodes. Together, these results suggest that infection with M. bovis, and the consequent activation of the profile of Th1-type immune response, was able to modulate the development of the profile of Th2 type of immune response against S. venezuelensis in co-infected animals, leaving them more susceptible to infection with S. venezuelensis. This work is the first to evaluate the mechanisms involved in imunoregulatory mechanisms involved in co-infection S. venezuelensis versus M. bovis. Key words: Co-infection; Strongyloides venezuelensis; Mycobacterium bovis; imunomodulation, co-stimulatory molecules..

(12) LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ABTS. - Ethylbenzothiazoline sulfonic acid. AgL3. - Antígeno da larva L3 de S. venezuelensis. AP. - Aprotinina. APC. - Células Apresentadoras de Antígenos. BCG. - Bacillus Calmette-Guerin. BSA. - Albumina bovina. C. - Animais do grupo Controle. CBR. - Centro de Biologia da Reprodução. CD4. - Receptor de linfócitos T. CD4. - Receptor de linfócitos T. CD8. - Receptor de linfócitos T. CD25. - Molécula co-estimulatória/imunomodulatória. CD28. - Molécula co-estimulatória. CD80. - Molécula co-estimulatória. CD86. - Molécula co-estimulatória. CFU. - Unidades formadoras de colônias. COIN. - Animais Co-infectados. CTAB. - Trimetil ammonium bromide. CTLA-4. - Molécula co-estimulatória. D.P.I. - Dias após a infecção. EDTA. -Ácido Etilenodiaminotetracético. EPO. -Peroxidase de eosinófilos. FoxP3. - Marcador molecular de céluals T regulatórias. HBSS. - Solução Salina Balanceada de Hanks.

(13) HE. - Hematoxilina - Eosina. HTAB. - Hexadecyltrimethylammonium Bromide. IFN-γ. - Interferon gama. IgE. - Imunoglobulina E. IL-10. - Interleucina 10. IL-13. - Interleucina 13. IL-4. - Interleucina 4. IL-5. - Interleucina 5. IL-9. - Interleucina 9. iNOS. - Enzima envolvida na síntese induzida de óxido nítrico. MB. - Animais infectados por Mycobacterium bovis. MPO. - Mieloperoxidase. NaEDTA. - Ácido Etilenodiaminotetracético de Sódio. NK. - Natural Killer. NO. - Óxido Nítrico. OPD. - O-Phenylenediamine. PBMC. - Células mononucleares do sangue periférico. PBS. - Salina tamponada com fosfatos. PBST. - Salina tamponada com fosfatos saponada (Tween). PCR. - Reação da Cadeia da Polimerase. PMSF. - Metil Sulfonil Fluoride. PPD. - Proteína Purificada Derivada. SDS. - Sodium dodecil sulfate. SV. - Animais infectados por Strongyloides venezuelensis. TCR. - Receptor de linfócitos T.

(14) TH. - Linfócito T Helper. TLRs. - Toll-like (receptores celulares). TMB. - Tetrametilbenzidina. TNF-α. -TNF alfa. TREG. - Células T regulatórias.

(15) LISTA DE TABELAS. Tabela 1. Número de ovos e vermes de S. venezuelensis de camundongos infectados com S. venezuelensis (SV) e coinfectados com M. bovis virulento (COIN)......................................................................................29. Tabela 2. Níveis de IgE do soro de camundongos BALB/c infectados com S. venezuelensis (grupo SV) e coinfectados com M. bovis virulento (grupo COIN)......................................................................................................31. Tabela 3. Níveis de citocinas em sobrenadante de cultura de células do baço estimuladas in vitro com antígeno da larva L3 de S. venezuelensis.....33.

(16) LISTA DE FIGURAS. Figura 1. Mecanismo de ativação e diferenciação dos linfócitos Th0 em Th1 ou Th2 via apresentação do antígeno associado às proteínas do MHC......4. Figura 2. Mecanismo de ativação de linfócitos T via interação das moléculas coestimulatórias/imunomodulatórias, presentes na supefície das APCs e dos linfócitos T.....................................................................................7. Figura 3. Ciclo vida de S. venezuelensis...............................................................10. Figura 4. Desenho experimental das infecçõe realizadas.....................................23. Figura 5. Níveis de citocinas (A) IL-4; (B) IL-5; (C) IL-13, em macerado de intestino de animais infectados apenas com S. venezuelensis (SV) ou co-infectados com M. bovis (COIN) por ELISA, 7º e 10º d.p.i. com S. venezuelensis.......................................................................................34. Figura 6. Níveis da peroxidase de eosinófilos (EPO) - figuras A e B - no intestino de camundongos BALB/c no 7º e 10º dias após a infecção com S. venezuelensis (4 e 7 dias após a infecção com M. bovis, respectivamente ).................................................................................36. Figura 7. Porcentagem de marcadores celulares em células de baço de camundongos BALB/c: (A) 7 d.p.i. com S. venezuelensis (4 d.pi. com M. bovis); (B) 10 d.p.i. com S. venezuelensis (7 d.p.i. com M. bovis).....................................................................................................40. Figura 8. Porcentagem de marcadores celulares em células de linfonodos mesentéricos de camundongos BALB/c: (A) 7 d.p.i. com S. venezuelensis (4 d.pi. com M. bovis); (B) 10 d.p.i. com S. venezuelensis (7 d.p.i. com M. bovis)...........................................................................42.

(17) Sumário. 1. INTRODUÇÃO 1.1a ASPECTOS GERAIS DOS HELMINTOS.................................................................................1 1.1b ASPECTOS GERAIS DA RESPOSTA IMUNOLÓGICA A HELMINTOS................................2 1.2 - PARTICIPAÇÃO DAS MOLÉCULAS CO-ESTIMULATÓRIAS /IMUNOMODULATÓRIAS NAS INFECÇÕES POR PARASITOS GASTROINTESTINAIS................................................................6 1.3 CARACTERÍSTICAS GERAIS DA INFECÇÃO COM O Strongyloides venezuelensis .............9 1.4 CARACTERÍSTICAS GERAIS DA RESPOSTA IMUNOLÓGICA À INFECÇÃO COM Mycobacterium ...............................................................................................................................12 . 1.5 CARACTERÍSTICAS GERAIS DA INFECÇÃO COM Mycobacterium bovis...........................15 1.6 PARTICIPAÇÃO DAS MOLÉCULAS CO-ESTIMULATÓRIAS/ IMUNOMODULATÓRIAS NAS INFECÇÕES POR MICOBACTÉRIAS............................................................................................17 1.7 Mycobacterium E COINFECÇÕES.........................................................................................18. 2. OBJETIVOS 2.1 OBJETIVOS GERAIS...............................................................................................................20 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.....................................................................................................20. 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1 ANIMAIS...................................................................................................................................21 3.2 INFECÇÃO E ACOMPANHAMENTO DA INFECÇÃO COM S. venezuelensis........................21 3.3 DETERMINAÇÃO DA INFECÇÃO PELO S. venezuelensis E ANÁLISE DA EVOLUÇÃO DA INFECÇÃO......................................................................................................................................22 3.4 CO-INFECÇÃO.........................................................................................................................22 3.5 OBTENÇÃO DO ANTÍGENO de S. venezuelensis...................................................................24 3.6 OBTENÇÃO DE SORO PARA DOSAGEM DE IgE ESPECÍFICA AO ANTÍGENO DA LARVA L3 DE S. venezuelensis .................................................................................................................24 3.7 CULTURA DE CÉLULAS..........................................................................................................24.

(18) 3.8 OBTENÇÃO DE SOBRENADANTE DE MACERADO DE INTESTINO....................................25 3.9 DOSAGEM DE CITOCINAS POR ELISA...................................................................................25 3.10 DOSAGEM DE IGE ESPECÍFICA POR ELISA........................................................................26 3.11 DETERMINAÇÃO DA PEROXIDASE (EPO) .........................................................................26 3.12 EXPRESSÃO DE MOLÉCULAS CO-ESTIMULATÓRIAS/. IMUNOMODULATÓRIAS POR. CITOMETRIA DE FLUXO...............................................................................................................26 3.13 ANÁLISE ESTATÍSTICA.........................................................................................................27. 4. RESULTADOS 4.1 NÚMERO DE OVOS E VERMES DE S. venezuelensis...........................................................28 4.2 NÍVEIS DE IgE NO SORO... ....................................................................................................30 4.3 PRODUÇÃO DE CITOCINAS...................................................................................................32 4.4 NÍVEIS DE EPO NO INTESTINO NO 7º E 10º D.P.I. COM S. venezuelensis.........................35 4.5 EXPRESSÃO DE MOLÉCULAS CO-ESTIMULATÓRIAS /IMUNOMODULATÓRIAS EM CÉLULAS ESPLÊNICAS................................................................................................................37 4.6 EXPRESSÃO DE MOLÉCULAS CO-ESTIMULATÓRIAS/ IMUNOMODULATÓRIAS EM CÉLULAS DE LINFONODOS MESENTÉRICOS..........................................................................40. 5. DISCUSSÃO................................................................................................................................43 6. CONCLUSÕES...........................................................................................................................50 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................................53.

(19) 1. 1INTRODUÇÃO. 1.1a ASPECTOS GERAIS DOS HELMINTOS Os helmintos constituem um grupo numeroso, com três filos: Platyhelminthes, Aschelminthes e Acanthocephala, incluindo espécies de vida livre e espécies parasitas.. As. ocorrências. no. homem. são. muito. comuns. (especialmente. representantes dos filos Platyhelminthes e Aschelminthes) e tais infecções, em geral, resultam em danos para o hospedeiro, os quais se manifestam de formas variadas (NEVES et al., 2003). Os representantes do filo Platyhelminthes, são achatados dorso-ventralmente, acelomados, com ou sem tubo digestivo, sem ânus, sem aparelho respiratório e circulatório, estando distribuídos nas classes: Turbelária, Trematoda e Cestoda. A classe Turbelária só apresenta indivíduos de vida livre. Na classe Trematoda encontra-se o Shistosoma mansoni, importante parasito humano e na Cestoda, as espécies Taenia solium e Taenia saginata (causadoras da teníase e cisticercose em humanos). No filo Aschelminthes, a classe que apresenta o maior número de espécies capazes de parasitar o homem, é a classe Nematoda. Os nematódeos, são pseudocelomados, apresentam um corpo cilíndrico e alongado, tubo digestivo completo, sexos separados e são revestidos por uma cutícula altamente resistente. No desenvolvimento pós-embrionário, o nematóide passa por cinco estágios e na passagem de um estágio para outro ocorre uma troca de cutícula. O primeiro estágio (o embrião que se foram dentro do ovo) é a larva L1, passando pelas fases de L2, L3 (geralmente o estágio infectante), L4 e L5 (verme adulto). Há nematóides de vida livre e parasitas, sendo que os últimos apresentam gêneros de grande importância para a saúde humana, como Ascaris, Ancylostoma, Enterobius, Necator, Onchocerca, Strongyloides, Trichuris e Wuchereria (NEVES et al., 2003) ..

(20) 2. 1.1b ASPECTOS GERAIS DA RESPOSTA IMUNOLÓGICA A HELMINTOS. As parasitoses intestinais representam um importante problema médicosanitário, tendo em vista o grande número de pessoas acometidas e as inúmeras alterações orgânicas que podem provocar no hospedeiro (ENOBE, 2005). Especialmente, aquelas provocadas por helmintos, tendem a se tornar crônicas (ONAH e NAWA, 2000), sendo que essa cronicidade parece estar relacionada com a fragilidade da imunidade natural do hospedeiro e a capacidade dos parasitos em resistir aos processos de eliminação estimulados por sua presença (ENOBE, 2005). Os nematódeos dos gêneros Ascaris, Ancylostoma, Necator, Strongyloides e Trichuris infectam aproximadamente um bilhão de pessoas no mundo, resultando em um milhão de mortes devido a essas infecções (FINKELMAN et al., 1997 apud ONAH e NAWA, 2000). As espécies mais prevalentes no ser humano são o Ascaris lumbricoides, com 1.472 milhões de pessoas infectadas, seguido por 1.298 milhões de indivíduos infectados com cestóides e 1.049 milhões de indivíduos com Trichuris trichiura (CROMPTON, 1999; O’LORCANN e HOLLAND, 2000; NEGRÃO-CORRÊA e TEIXEIRA, 2006). Outro importante nematódeo que infecta humanos é o Strongyloides stercoralis, o qual aflige entre 30 e 100 milhões de pessoas em 70 países, (SIDDIQUI e BERK, 2003; NEGRÃO-CORRÊA e TEIXEIRA, 2006). Estimase que um quarto da população mundial apresenta infecções causadas por espécies de nematóides gastrointestinais, sendo que essas infecções são prevalentes particularmente, em países tropicais e subtropicais, nos quais vinte e seis espécies de helmintos são capazes de infectar seres humanos (NEGRÃO-CORRÊA, 2001; GAUSE, 2003). Crianças com infecções helmínticas apresentam um quadro de anemia, acompanhado de baixo crescimento e atraso no desenvolvimento cognitivo (COOPER e BRUNDY, 1988 apud ONAH e NAWA, 2000). Além de parasitar seres humanos, os helmintos podem parasitar outros animais, como por exemplo, os.

(21) 3. bovinos, provocando grandes perdas econômicas. Calcula-se que 1,7 bilhões sejam gastos anualmente no controle destas parasitoses em animais (LAWRENCE, 2003). Apesar da. alta. prevalência. e. morbidade. crônica. produzidas. pelos. nematódeos, os mecanismos envolvidos na imunopatologia e na imunoproteção contra esses parasitos, ainda não estão completamente esclarecidos (LAWRENCE, 2003). As infecções helmínticas têm como características marcantes, a capacidade de persistência do parasito no hospedeiro e ciclo de vida complexo, de modo que as interpretações das interações parasito-hospedeiro tornam-se bastante complexas (WILKES et al., 2004; MAIZELS et al., 1993 apud ENOBE, 2005). Dentre as inúmeras células de defesa do hospedeiro, destacam-se os linfócitos auxiliares TCD4, os quais podem se diferenciar em dois grupos, linfócito T auxiliar 1 (LTh1) e T auxiliar 2 (LTh2), que participam no controle das diversas infecções que podem afetar o organismo dos seres vivos. A ativação e diferenciação de células T dependem de dois sinais. Primeiramente, é necessário que haja o contato entre as células apresentadoras de antígenos profissionais (APCs maduras e ativadas) e as células T imaturas (linfócitos Th0) com o reconhecimento de peptídeos associados ao complexo de histocompatibilidade principal (MHC). O segundo sinal, necessita da interação entre moléculas co-estimulatórias presentes na superfície de células APCs e da produção de citocinas por essas células (BLUESTONE, 2006). Na presença de antígenos proteicos, as APCs (células dendríticas, macrófagos, neutrófilos ou linfócitos B) são capazes de endocitá-los e convertê-los em peptídeos, os quais serão apresentados em sua superfície celular associados à proteínas do MHC. As moléculas de MHC associadas à peptídeos, interagem com os receptores de membrana dos linfócitos T (TCR), estimulando a ocorrência de cascatas metabólicas intracelulares que levarão à diferenciação do linfócito Th0, em Th1 ou Th2. A diferenciação celular nos subtipos Th1 ou Th2, é direcionada a partir da natureza do antígeno apresentado (origem extra ou intracelular), aos tipos de moléculas co-estimulatórias presentes na superfície da APC e do linfócito T (moléculas estimulatórias ou imunomodulatórias) e às citocinas presentes no contexto da apresentação (produzidas pela APC e/ou por outras células do sistema imunológico). Cada subtipo de linfócito T será capaz de produzir alguns tipos de citocinas, as quais estimularão o desenvolvimento de distintos padrões de respostas imunológicas. Antígenos de natureza intracelular, como vírus e micobactérias,.

(22) 4. normalmente estimulam a diferenciação dos linfócitos Th0 em linfócitos Th1, com produção de citocinas como IFN-γ, IL-12, TNF-α e de substâncias derivadas do oxigênio, como o óxido nítrico (NO), levando ao desenvolvimento de uma resposta imunológica do tipo celular (KAUFMAN 1999, NORTH e JUNG, 2004). Já os antígenos de natureza extracelular, como alérgenos e helmintos gastrointestinais normalmente estimulam a diferenciação dos linfócitos Th0 em linfócitos Th2, com o desenvolvimento de uma resposta imunológica do tipo humoral, caracterizada pela produção de citocinas como IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13, resultando na diferenciação de linfócitos B em plasmócitos secretores de altos níveis de anticorpos (NEGRÃO-CORRÊA, et al., 2003). Apesar de ambas as células Th1 e Th2 serem capazes de colaborar com os linfócitos B, elas estimulam a produção de anticorpos de diferentes subtipos (FIGURA 1). Por exemplo, as células Th1 induzem a produção de IgG2a, enquanto subpopulações Th2 induzem IgG1 (Stevens et al., 1988).. FIGURA 1-Mecanismo de ativação e diferenciação dos linfócitos Th0 em Th1 ou Th2, via apresentação do antígeno associado às proteínas do MHC, com conseqüente produção de citocinas típicas de cada perfil de resposta imunológica. Modificado de ABBAS e LICHTMAN, 2005.. Além das subpopulações de linfócitos Th1 e Th2, têm sido identificados outros tipos de linfócitos T (como linfócitos Th3 e linfócitos T CD25+) com papel imunomodulatório, os quais são importantes fontes de citocinas como a IL-10 e TGF-.

(23) 5. β (xerox do Sílvio e colocar outra referencia). Tais linfócitos têm sido associados a fenômenos de imunosupressão (ANDERSON et a.l, 2007). É importante salientar que as citocinas produzidas pelos padrões de resposta Th1 e Th2 têm a capacidade de inibir o desenvolvimento de uma resposta de natureza contrária à qual lhe deu origem. Em relação à essa inibição, dois pesquisadores do instituto Pasteur, Philippe Kourilsky e Paolo Truffa-Bach (2001), estabeleceram o conceito de campo de citocina, que ficou definido como sendo uma área onde se encontra uma determinada concentração de várias citocinas. A intensidade do campo dependeria da intensidade de síntese, consumo e difusão de cada componente neste espaço. Dentro deste quadro, uma célula dendrítica estimulada por um determinado antígeno produz citocinas do perfil Th1, assim como IL-12 levará uma célula Th0 não sensibilizada a produzir uma determinada citocina de forma concordante com o padrão já determinado, gerando um campo elementar de resposta Th1. Novas células Th0 chegando ao local amplificariam o campo, podendo ocorrer migrações para outro local. Dessa forma a polarização poderia ocorrer pela produção de uma citocina que inibisse a produção de outras; como exemplo, a produção de IFN-γ inibiria a proliferação de linfócitos Th2 e consequentemente das citocinas correlatas (Kourilsky e Truffa-Bach ,2001). Nas infecções intestinais induzidas por nematóides, geralmente ocorre predominância da resposta imunológica do tipo Th2, com a produção de elevados níveis das imunoglobulinas IgG1 e IgE em camundongos (IgG4 e IgE em humanos), eosinofilia, mastocitose intestinal e hiperplasia de células caliciformes (FINKELMAN et al., 1997). Essas respostas são controladas principalmente pelas citocinas IL-4, IL-13, IL5, IL-3, IL-9 e IL-10 (NEGRÃO-CORRÊA, 2001; SILVEIRA et al., 2002). Respostas imunológicas do tipo Th2 induzidas por nematóides, têm sido associadas à proteção do hospedeiro na maior parte dos modelos experimentais utilizados (FINKELMAN et al., 1997; ONAH e NAWA, 2000; LAWRENCE, 2003), assim como em alguns estudos de infecções por nematóides em humanos, como nas estrongiloidíases (PORTO et al., 2001). Assim, a resistência às infecções por nematóides intestinais, está geralmente associada ao padrão de resposta imunológica Th2, enquanto a resposta Th1 se associa à susceptibilidade à infecção (HELMBY et al., 2001; LAWRENCE, 2003). Na infecção helmíntica com Trichuris trichiura em camundongos, o bloqueio da resposta Th2 com anticorpos anti-IL-4 ou.

(24) 6. com a administração de IL-12 (citocina típica do padrão Th1), promove a cronicidade da infecção, enquanto que a administração de IL-4 (citocina típica do padrão Th2) induz a expulsão do parasito. A infecção experimental com Trichuris muris, também relacionou a resistência à infecção com o padrão de resposta imunológica Th2 e a susceptibilidade com a resposta Th1 (HELMBY et al., 2001; LAWRENCE, 2003).. 1.2. -. PARTICIPAÇÃO. /IMUNOMODULATÓRIAS. DAS. NAS. MOLÉCULAS INFECÇÕES. CO-ESTIMULATÓRIAS POR. PARASITOS. GASTROINTESTINAIS. Há muitos estudos que apontam a importância das moléculas coestimulatórias/imunomodulatórias nas mais variadas infecções por patógenos gastrointestinais. As moléculas co-estimulatórias, como CD28, presentes na superfície de linfócitos T, interagem com as co-estimulatórias CD80/CD86, expressas sobre APCs profissionais e participam da diferenciação e da amplificação das respostas imunológicas dos tipos Th1 e Th2 (GREENWALD et al., 1999; SOOS et al., 1999). A presença das moléculas co-estimulatórias, CD80 e CD28, pode ter um importante papel na geração de células T citotóxicas para o reconhecimento de antígenos específicos e para a produção e manutenção de células T CD4 de memória. A interação de CD28 com CD80/CD86 tem um papel central no sinal coestimulatório para a proliferação e ativação de células T primárias, para a produção de proteínas anti - apoptóticas e de citocinas, como a IL-2 e para evitar a anergia clonal. Porém, CD86 apresenta maior capacidade de ativar células Th2 e aumentar a produção de suas citocinas, como por exemplo, IL-4, do que CD80, que é menos eficiente na ativação destas células (NAKAJIMA et al., 1996; MUELLER, 2000; WANG, 2000; EKKENS et al., 2002). Essas moléculas CD80/CD86 também podem se ligar à molécula CTLA-4, presente na membrana dos linfócitos T, e neste caso, promovem um sinal negativo com baixa ativação de células T (NAKAJIMA et al., 1996; GREEWALD et al., 1999; WANG et al., 2006; FIGURA 2)..

(25) 7. A. B. FIGURA 2 - Mecanismo de ativação de linfócitos T via interação das moléculas coestimulatórias/imunomodulatórias, presentes na supefície das APCs e dos linfócitos T. Em A está representado a interação das moléculas CD28, presente na superfície do linfócito T e B7(CD80 ou CD86), presente na superfície da APC, com conseqüente ativação do linfócito T. Em B: representação da inibição da ativação do linfócito T, pela utilização de proteína homóloga à molécula de CTLA-4 (CTLA-4-Ig), a qual se liga às molécula B7(CD80 ou CD86) impedindo sua interação com o CD28, na superfície do linfócito T. Modificado de ALEGRE e FALLARINO, 2006.. A molécula CTLA-4 é estruturalmente homóloga à molécula CD28, sendo expressa em altos níveis após 48-72 horas de ativação das células T, funcionando também como receptora para moléculas CD80 e CD86 (LU et al., 1999). Acredita-se que a CTLA-4 atua na inibição da produção de IL-2 e na progressão do ciclo celular, podendo ainda, mediar a apoptose induzida por antígenos específicos, e dependendo do nível de sua expressão e da intensidade da sinalização do TCR, pode alterar o perfil da resposta imunológica. Por exemplo, o bloqueio de CTLA-4 com a utilização de CTLA-4 ligante (anticorpo que se liga à molécula de CTLA-4 impedindo sua interação com CD80 e CD86) pode resultar em um aumento da secreção de citocinas Th2 (STEEL e NUTMAN, 2003). Além de contribuir para a regulação negativa para antígenos específicos, esta molécula pode alterar também, o balanço de Th1 e Th2 (STEEL e NUTMAN, 2003). O papel de CTLA-4 em infecções parasitárias tem sido recentemente estudado em modelos murinos. Esta molécula parece ter um papel na hiperatividade de células T e na produção de IL-4 em infecções por nematóides gastrointestinais. Além disso, nas infecções filariais, pode contribuir para a regulação de antígeno específico na resposta celular, podendo também interferir no tempo de exposição do hospedeiro ao verme, no desenvolvimento das microfilárias e no contato do parasito com o antígeno (MCCOY, 1997; STEEL e NUTMAN, 2003). Na infecção experimental com o nematóide Nippostrongylus brasiliensis, a resposta imunológica é mediada por células Th2, caracterizada pela produção de citocinas IL-4 e IL-5,.

(26) 8. resultando ainda, em eosinofilia, mastocitose e produção de IgE. Nesta infecção, o bloqueio de CTLA-4 com o anticorpo monoclonal anti CTLA-4, resultou na intensificação da resposta imunológica, com o aumento da produção de IL-4 e IL-5, reduzindo também o número de vermes adultos no intestino, a postura de ovos e a fecundidade destes vermes (MCCOY, 1997). Outro modelo experimental utilizado para o estudo do papel da CTLA-4 em infecções helmínticas é a infecção de camundongos com o nematóide Helignossomoides polygyrus.. A resposta. imunológica a este parasito é restrita à região entérica, sendo caracterizada pela elevação de IgE, eosinófilos, IL-3, IL-4, IL-5 e IL-9. Neste modelo, a administração de CTLA-4 Ig em cada estágio da infecção, inibiu o desenvolvimento de células B e T e a eosinofilia, e ainda, diminuiu os níveis de IgE no soro (LU et al., 1994). CTLA-4 Ig é uma proteína homóloga à CTLA-4, que se liga com alta afinidade às moléculas de CD80 e CD86, impedindo a interação dessas moléculas com a molécula de CD28, com a consequente geração de um sinal negativo no processo de interação da APC com o linfócito T. Steel e Nutman (2003) analisaram o papel da CTLA-4 no modelo experimental com Brugia malayi, e observaram que a expressão desta molécula induziu baixa regulação da resposta inflamatória, aumentando a debilidade da doença, e ainda, preveniu ou evitou a eliminação do parasito, alterando o perfil de citocinas e a ativação de células Th1 e Th2. Na infecção experimental de camundongos com o nematóide H. polygyrus, tanto CD80 quanto CD86, pode iniciar uma resposta Th2, porém, somente CD86 é necessária na progressão desta resposta (GREENWALD et al., 1999). Estudos usando CD80/CD86 mostram que interações desse tipo são necessárias para o desenvolvimento da resposta imunológica primária contra H. polygyrus, incluindo o aumento de células T CD4, IL-4, IgG1 e IgE, e ainda, que a elevação de antígenos específicos pode ser inibida durante a resposta de memória, quando a interação CD80 ou CD86 for interrompida no início da infecção deste parasito. Além disso, ressalta-se a importância de estudos futuros para a determinação de mecanismos funcionais da molécula CD86 na resposta imunológica, incluindo o papel individual de CTLA-4 na regulação de células T efetoras na resposta Th2 (GREENWALD et al., 1999; EKKENS et al., 2002)..

(27) 9. 1.3 CARACTERÍSTICAS GERAIS DA INFECÇÃO COM O Strongyloides venezuelensis. Strongyloides venezuelensis (BRUMPT, 1934) é um nematódeo encontrado em diferentes partes do mundo, parasitando diversos roedores como, por exemplo, ratos, camundongos e hamster, e tem sido recentemente utilizado para vários propósitos e protocolos de pesquisas para os estudos de biologia, imunologia, morfologia, características bioquímicas, mecanismos de expulsão de vermes e atividade nematicida, facilitando também a análise de mecanismos imunológicos durante a migração larval e a fase de infecção intestinal (ATTAMIMI, 2002; MATSUDA et al., 2003). Desse modo, um modelo experimental bastante utilizado para se estudar os inúmeros aspectos de imunoproteção e imunorregulação durante as infecções gastrointestinais é a infecção de roedores com S. venezuelensis, o qual apresenta o ciclo de vida bastante similar ao do nematóide Strongyloides stercoralis, um. parasita humano. que. apresenta. grande disseminação em. indivíduos. imunossuprimidos, podenso levar à morte (NEVES et al,. 2003). Na infecção experimental com camundongos, as larvas de S. venezuelensis penetram através da pele, migram para o pulmão, atingem as vias aéreas superiores, sendo posteriormente deglutidas. Então, se fixam na mucosa duodenal, onde atingem a idade adulta e são espontaneamente eliminados após um período de 10 a 14 dias da infecção (FIGURA 3)..

(28) 10. FIGURA 3- Ciclo vida de S. venezuelensis. Modificado de www.dpd.cdc.gov/dpdx.. Em ratos, a eliminação do verme adulto é um pouco mais demorada, ocorrendo após 5 semanas da infecção pela via subcutânea. (TAKAMURE, 1995; NEGRÃO-CORRÊA et al., 2004). A migração do S. venezuelensis em ratos aparece em vários órgãos internos, incluindo o fígado, sangue que circula no coração, pulmão e intestino delgado, sendo que as larvas quando inoculadas por via oral no estômago aparecem no fígado vinte minutos após a infecção. No coração, as larvas foram observadas após quarenta e cinco minutos da infecção; no pulmão puderam ser vistas após 3 horas da infecção; na traquéia foram observadas em um período de 3 a 72 horas depois da infecção e no intestino delgado, apareceram após cento e vinte horas da infecção (MATSUDA et al., 2003). Em infecção de ratos Wistar com S. venezuelensis pela via subcutânea, as larvas apareceram no pulmão após quarenta e cinco horas da infecção e no intestino, após sessenta horas da infecção (TAKAMURE, 1995). Nesta rota migratória as larvas induzem eosinofilia, produção de muco, aumento da concentração de IgE e hiperresponsividade das vias aéreas (MARUYAMA et al., 2000; SILVEIRA et al., 2002; NEGRÃO-CORRÊA et al., 2004)..

(29) 11. Eosinófilos podem infiltrar na camada do intestino delgado do hospedeiro e atacar o S. venezuelensis na fase adulta, podendo ainda, serem efetores contras as infecções crônicas provocadas por nematóides (EL-MALKY et al., 2003). A expulsão do S. venezuelensis do intestino também é acompanhada por eosinofilia, mastocitose, aumento do número de células caliciformes na mucosa intestinal, com aumento da produção de muco por essas células, e pela predominância das citocinas IL-4, IL-5 e IL-10 (KHAN et al., 1993; CARA et al., 2000; NEGRÃOCORRÊA, 2004;). Há evidências que o mecanismo responsável pela eliminação intestinal de S. venezuelensis seja dependente do receptor de IL-4 (IL-4R) e de ativação da molécula transdutora de sinal e ativadora de transcrição (STAT6) (ONAH e NAWA, 2000; FINKELMAN et al., 2004). É possível que a ativação do IL4R/STAT6 cause danos aos parasitos, pela indução da liberação de sulfato-glicanos por mastócitos e/ou células caliciformes, os quais impediriam a aderência do verme na mucosa intestinal (NEGRÃO-CORRÊA e TEIXEIRA, 2006). Investigações sobre uma possível participação de resposta Th1 na infecção do S. venezulensis utilizando-se camundongos deficientes em IL-12, os quais não produzem IFN-γ, demonstraram que tais animais conseguiram eliminar os vermes adultos de forma similar aos animais normais (NEGRÃO-CORRÊA e TEIXEIRA, 2006). Apesar da resposta Th2 parecer ser dominante na conferência de proteção ao S. venezuelensis, é necessário a investigação de um maior número de parâmetros que ajudem a esclarecer a dinâmica da infecção..

(30) 12. 1.4 CARACTERÍSTICAS GERAIS DA RESPOSTA IMUNOLÓGICA À INFECÇÃO COM Mycobacterium. A tuberculose é uma doença infecciosa e contagiosa causada pelos bacilos da família Mycobacteriaceae, Mycobacterium tuberculosis ou Mycobacterium bovis, de evolução normalmente crônica e progressiva, acometendo em especial os pulmões. É uma das doenças infecciosas de maior impacto mundial, sendo responsável por aproximadamente 2 milhões de óbitos e 9 milhões de novos casos por ano (WHO, 2007). China, Indonésia, Bangladesh e Paquistão contribuem com mais da metade de casos novos no mundo. No Brasil, o número de casos novos está próximo dos 100.000/ano (TEIXEIRA, ABRAMO E MUNK, 2007). M. tuberculosis tem o homem como único reservatório e M. bovis, que causa a tuberculose bovina, quando transmitida à espécie humana torna-se muito virulenta, principalmente. em. pessoas. com. imunodeficiência. (BENENSON,. 1992).. A. transmissão da doença é predominantemente por via aérea. O contágio pode ser direto, através de finas gotículas de secreção oronasal (contendo os bacilos que são eliminados pela pessoa contaminada durante a tosse, o espirro e a fala), que ficam em suspensão no ar e são inaladas por pessoas suscetíveis à infecção. Estas gotículas, contendo as bactérias, chegam até os bronquíolos e os alvéolos, dando início ao processo infeccioso. A transmissão também pode ser feita por contato oral com os bacilos (VERONESI, 1991). Da infecção ao aparecimento da lesão primária decorrem cerca de 6 a 12 semanas. O risco da tuberculose pulmonar progressiva ou extrapulmonar é maior dentro de 1 a 2 anos após a infecção inicial, podendo persistir durante toda a vida sob a forma latente. A infecção inicial passa, em geral, despercebida na maioria dos casos; porém, pode evoluir para as diferentes formas de tuberculose, como a pulmonar ou mesmo extrapulmonar, causando lesões, principalmente, nas meninges, cérebro, intestino, coração, ossos, traquéia e fígado (VERONESI, 1991). Conforme a gravidade das lesões, a sintomatologia é caracterizada por febre, tosse, expectoração, inapetência, emagrecimento, dores torácicas e hemoptises. Em outras localizações, estas manifestações são variáveis, em decorrência da área do corpo afetada. O diagnóstico é geralmente estabelecido pelos exames clínico, laboratorial e radiológico, pela pesquisa do agente infeccioso no escarro e em outros.

(31) 13. materiais biológicos. A prevenção e o controle são feitos com medidas de higiene geral e com a aplicação da vacina BCG (BENENSON, 1992). O limite entre proteção e doença está diretamente relacionado com o grau de imunidade mediada por células, isto é, por macrófagos, principalmente através da produção de TNF-α, IL-12 e óxido nítrico (NO), linfócitos Th1 e linfócitos CD8+, através da produção de IFN-γ (KAUFMANN E LADEL, 1994; ERB et al, 1998; THOMPSON-SNIPES et al., 1998; KAUFMAN, 1999). Assim, macrófagos e células dendríticas uma vez infectados pelo Mycobacterium tuberculosis produzem altas concentrações de TNF-α e IL-12 (HENDERSON et al., 1997; KIM et al., 1999). Apesar dos grandes avanços nos estudos da resposta imunológica na tuberculose, os mecanismos envolvidos na doença ativa ainda permanecem obscuros. A resposta imunológica na tuberculose é na maioria das vezes caracterizada por uma imunossupressão ativa, particularmente na doença severa, observando-se diminuição de IL-2 e IFN-γ, além de anergia específica para a proteína purificada derivada do Mycobacterium bovis (PPD) (GOLDFELD, 2004; DELGADO et al., 2002) sendo também observado um aumento de IL-10 (GOLDFELD, 2004) de TGF-β (GREEN et al.,2003) e de IL-4 (MAERTEN, 2005) . Assim, as citocinas representam um componente de extrema importância na defesa contra as micobactérias, podendo atuar tanto nas funções reguladoras quanto nas funções efetoras da resposta imunológica a esses patógenos (NORTH E JUNG, 2004; TEIXEIRA, ABRAMO, MUNK, 2007). Vários trabalhos mostraram que o M. tuberculosis induz a produção de citocinas com um perfil predominantemente Th1, sendo esta ativação importante no controle da infecção, visto que, a produção de IFN-γ e TNF-α promovem a produção da enzima iNOS-2 que é responsável pelas altos níveis de óxido nítrico (NO) produzidos por macrófagos infectados com o M. tuberculosis (COOPER et al., 2002). A IL-12 promove a produção de IFN-γ em células natural killer (NK) e a expansão de células do perfil Th1 antígeno específicas. Essas células Th1 são fontes de IL-2 e IFN-γ na resposta imunológica adquirida, sendo recrutadas para o controle de infecção na fase crônica, uma vez que são capazes de atuar sobre células T e macrófagos (TEIXEIRA, ABRAMO, MUNK, 2007). Entretanto, se por um lado o IFN-γ, TNF-α e NO são importantes na ativação dos macrófagos, estas mesmas citocinas induzem a formação de granulomas que.

(32) 14. acabam levando a uma destruição do tecido pulmonar, não implicando necessariamente na destruição da bactéria (COOPER et al., 2002). Mutações afetando a expressão de receptores para IFN-γ e IL-12 tem sido associadas com infecções disseminadas por micobactérias do ambiente e M. bovisBCG (SALGAME, 2005) e crianças com deficiência nos níveis dessas citocinas se mostram mais susceptíveis a infecções micobacterianas (TALAAT et al., 2006). Apesar do perfil de citocinas Th1 ser caracterizado na infecção por micobactérias, sabe-se que a IL-4, IL-10 e outros marcadores de ativação de linfócitos Th2 podem ser identificados em pacientes com tuberculose (JUNG et al., 2005).. Portanto,. acredita-se que a resposta imunológica observada na infecção pelo M. tuberculosis não possa ser interpretada apenas levando-se em conta a regulação dos subtipos de linfócitos Th1 e Th2. Os eventos relacionados à resposta inata do hospedeiro iniciam-se com a entrada do M. tuberculosis no pulmão, onde macrófagos e células dendríticas rapidamente são invadidos pela micobactéria, sendo que o receptor 2 para quimiocina (CCR2) tem um importante papel no recrutamento destas células para o pulmão infectado (SALGAME, 2005; OLLEROS et al., 2005). Os neutrófilos são as primeiras células inflamatórias a chegarem ao sítio da infecção e de multiplicação do bacilo, acompanhadas das células NK e macrófagos (TEIXEIRA, ABRAMO, MUNK, 2007). Apesar. dos. mecanismos. micobacterias. não. estarem. de. resposta. totalmente. imunológica. esclarecidos,. inata. alguns. contra. trabalhos. as têm. demonstrado que os receptores do tipo “Toll-like” (TLRs) são importantes no reconhecimento dos antígenos do Mycobacterium e na ativação de macrófagos e células dendríticas (QUESNIAUX et al., 2004). Os receptores celulares TLR2 e TLR4 estão envolvidos principalmente no reconhecimento da micobactéria íntegra e também dos componentes desta, como as lipoarabinomananas, lipomanas, e a lipoproteína de 19 kDa (QUESNIAUX et al., 2004). A importância dos TLRs no controle. da. infecção. causada. pelo. Mycobacterium. foi. demonstrada. em. camundongos deficientes do fator 88 de diferenciação mielóide (MyD88), que mostraram maior susceptibilidade a infecção com o M. tuberculosis. Apesar desses animais terem morrido rapidamente em conseqüência da infecção, ainda assim, foram capazes de gerar uma resposta Th1 específica para o M. tuberculosis, o que.

(33) 15. demonstra um envolvimento do MyD88 na regulação da infecção (FREMOND et al., 2004).. 1.5 CARACTERÍSTICAS GERAIS DA INFECÇÃO COM Mycobacterium bovis. A infecção por M. bovis quando transmitida ao homem, acontece em geral, pela ingestão do leite de vaca contaminado, o que tem se tornado muito raro em muitos países, devido à vacinação dos animais e à pasteurização do leite (BENENSON, 1992). Em 1889 Theobald Suit isola o M. bovis e em 1902, Ravenel obteve a 1ª prova definitiva da transmissão da tuberculose bovina ao homem (FELDMAN, 1955). Em 1938, Torres e Pacheco informaram sobre o isolamento do bacilo do tipo bovino de lesões humanas, tratando-se da primeira publicação na literatura médica nacional sobre o assunto. No homem, o órgão preferencial do bacilo é o pulmão, ocorrendo uma evolução da doença muito semelhante àquela provocada pelo M. tuberculosis . Indiscutivelmente, a ingestão de leite cru contaminado, constitui uma das principais formas de infecção humana pelo bacilo bovino. O risco para a Saúde Pública de se contrair o agente pela ingestão de produtos cárneos contaminados torna-se menor, devido a baixa incidência do agente em tecidos musculares e do hábito de não se comer carne crua no Brasil. Porém, tal risco não deve ser ignorado, quando se leva em consideração o grande número de abates clandestinos, ou mesmo o abate de animais descartados de rebanhos positivos em matadouros municipais, que não atendem as normas de inspeção exigidos pelo rigor da lei. Trabalhos realizados na Nigéria incriminam a ingestão de carne contaminada como responsável por cerca de 45% dos casos de tuberculose em humanos causada pelo M. bovis (GRIFFIN, 1995). Quando a contaminação se dá por ingestão, pode ocorrer uma infecção inicial das amígdalas, prosseguindo então para as cadeias de linfonodos cervicais. A lesão inicial não passa de uma amigdalite; entretanto lesões supurativas podem ocorrer nas cadeias cervicais, afetando linfonodos préauriculares, tonsilares e supraclaviculares, com posterior envolvimento da pele sobrejacente. Tais lesões, são comumente conhecidas como "scrofulodermia" ou "lupus vulgaris" (FELDMAN, 1955). A localização óssea e articular também é comum nos casos extra-pulmonares, provocando lesões ósseas localizadas e artrite. Em.

(34) 16. crianças, é comum se encontrar acometimento intestinal. As formas gênito-urinárias são menos freqüentes (GRANGE E YATES, 1994). Quanto ao acometimento pulmonar, resultados obtidos de estudos experimentais demonstram que cinco, e provavelmente um único bacilo, são capazes de produzir lesões pulmonares quando atingem as vias aéreas inferiores, principalmente os alvéolos, por inalação de aerossóis (CHAUSSÉ, 1913 apud MORRIS, 1994). A maior ocorrência da forma pulmonar da tuberculose bovina, em indivíduos da área rural, pode ser explicada por tais resultados, sendo considerada principalmente uma doença ocupacional (GRANGE E YATES, 1994). Médicos-veterinários e trabalhadores de frigoríficos, que mantém um contato direto com o animal, também estão sujeitos a infecção pelo bacilo bovino devido a inalação de aerossóis. Outra forma de manifestação da tuberculose bovina em humanos é o acometimento cutâneo. A contaminação se dá pelo contato direto com carcaças contaminadas e as classes mais acometidas são os magarefes, auxiliares de inspeção e médicos-veterinários. Tais lesões, na maioria das vezes, são pouco extensas e regressivas, manifestando-se na forma de pequenas pápulas, semelhantes a verrugas, sendo conhecidas como "butcher’s wart", ou verruga do magarefe (GRANGE E YATES, 1994). Tal benignidade da tuberculose cutânea, talvez se deva à resistência que os adultos possuem ao bacilo e não à menor virulência do mesmo. A contaminação pode ocorrer na infância e permanecer silenciosa, porém em algum momento da fase adulta podem ocorrer manifestações dos sintomas. Na Alemanha, 09 de 70 pacientes com tuberculose por M. bovis manifestaram a doença após 1961, ano no qual todo o rebanho daquele país foi considerado livre de tuberculose (SALFELDER et al.,1983 apud GRANGE E YATES, 1994). No Brasil, a escassez de trabalhos epidemiológicos recentes em humanos, que realizam tipagem do agente causador da tuberculose, associadas a possibilidade de uma infecção primária silenciosa, que pode sofrer reativação em momento oportuno como ocorre por exemplo em pacientes com HIV (Síndrome da Imunodeficiência Adquirida), impedem que se tenha uma idéia da real situação do progresso da doença (MORRIS, 1994). Devido às semelhanças na evolução da doença causada pelo M. bovis em relação ao M. tuberculosis e pela menor virulência do primeiro em relação ao segundo na manipulação laboratorial, utilizou-se nesse trabalho a cepa selvagem de.

(35) 17. M. bovis (ATCC 19274). A cepa utilizada nesse estudo foi adquirida no Instituto Nacional de Controle de Qualidade e Saúde (INQS-FIOCRUZ-RJ).. 1.6. PARTICIPAÇÃO. DAS. MOLÉCULAS. CO-ESTIMULATÓRIAS/. IMUNOMODULATÓRIAS NAS INFECÇÕES POR MICOBACTÉRIAS. A expressão das moléculas co-estimulatórias CD80/CD86 na superfície de macrófagos e células dendríticas, é desencadeada pelo reconhecimento dos TLRs, moléculas específicas derivadas do M. tuberculosis. A célula T regulatória CD25+ (linfócito TCD4+ CD25+) tem um importante papel na imunopatologia de diversos patógenos (WALSH; SMITH e FALLON, 2007). Existe alguma evidência de que as células T regulatórias (TREGs) desempenham um importante papel na regulação da resposta imunológica do hospedeiro contra o M. tuberculosis, como já demonstrado para outras infecções (BELKAID E ROUSE, 2005). Recentemente, alguns trabalhos têm mostrado o envolvimento das TREGs na tuberculose humana (RIBEIRORODRIGUES et al., 2006; GUYOT-REVOL et al., 2006). Ribeiro-Rodrigues e colaboradores (2006) mostraram que há um aumento da freqüência de células T expressando CD4+CD25+ durante a fase ativa da doença. Estes autores mostraram ainda que células TREGs foram observadas envolvendo os pulmões dos pacientes com tuberculose. Parece que há uma correlação direta na expressão do marcador CD25+ e a expressão de RNA mensageiro de FoxP3 em células mononucleares de sangue periférico de pacientes com tuberculose. Além disso, foi observado um aumento de IFN-γ in vitro quando as células CD4+CD25+ foram depletadas, além de mostrar que pacientes com a forma extra pulmonar da doença apresentaram maior expressão de FoxP3 do que os pacientes com a forma pulmonar (GUYOT-REVOL et al., 2006)..

(36) 18. 1.7 Mycobacterium E COINFECÇÕES A interação entre infecções helmínticas e micobacterianas em modelos experimentais tem sido pouco estudada. Animais C57BL/6 infectados com o M. bovis-BCG apresentaram aumento na produção de IFN-γ por células esplênicas somente após 3 semanas de infecção, não sendo observado produção de IL-4 (TEIXEIRA et al., 1995). Foi verificado, em camundongos BALB/c, que o perfil de resposta Th1 induzido pela imunização com o PPD é modificado para Th2, com aumento na produção de IL-4 e IL-5, quando os animais são previamente infectados com a filária Brugia malayi. No entanto, quando a imunização de animais foi feita simultaneamente com helmintos e antígenos micobacterianos não houve modulação de resposta Th2, sendo a resposta ao PPD predominantemente do tipo Th1 (PEARLMAN et al., 1993). Embora a infecção com helmintos possa influenciar o perfil Th1/ Th2 de citocinas, a influência da resposta Th2 sobre a proteção contra infecções por micobactérias ainda não está clara. Utilizando infecções experimentais com N. brasiliensis (por via intraperitoneal) e BCG (via intranasal), observou-se que linfócitos T de linfonodos de camundongos co-infectados produziram menos IFN-γ in vitro, que os infectados somente com BCG, reduzindo os níveis da resposta Th1, sem afetar a eliminação do BCG, verificado através da contagem de unidades formadoras de colônias (CFU) nos pulmões (ERB, et al., 2002). Camundongos da linhagem C57Bl/6, quando infectados com BCG e injetados simultaneamente com extrato de Ascaris suum, apresentaram um grande aumento dos níveis de TNF-α e NADPH diaphorase no estágio inicial da infecção ao BCG, sendo que isto levou a uma diminuição de CFU no baço destes animais (FERREIRA et al., 1999). Diversos autores têm destacado o efeito das infecções por helmintos na modulação da resposta imunológica frente à imunização pelo BCG. Foi demonstrado que crianças nascidas de mães com infecções helmínticas, tiveram alteração da resposta à primeira dose da vacina BCG. Linfócitos T destas crianças produziram 10 vezes menos IFN-γ, em resposta ao PPD, quando comparadas às crianças de mães sem infecções helmínticas (MALHOTRA et al., 1999). Foi demonstrado que infecções parasitárias intestinais que induzem um perfil de resposta do tipo Th2 podem modular a resposta Th1 induzida pela revacinação com o BCG (FERREIRA.

(37) 19. et al., 2002). Os autores avaliaram a produção de IFN-γ e IL-10 por células de sangue periférico de 14 adolescentes, entre 12 e 15 anos de idade, que receberam a segunda dose da vacina BCG. Sete desses indivíduos apresentavam diagnóstico positivo para parasitoses intestinais. O perfil das citocinas produzidas pelas células dos indivíduos vacinados, sem infecções helmínticas, mostrou um aumento da produção de IFN-γ, quando comparado com o grupo infectado/vacinado, havendo aumento significativo da produção de IL-10 no grupo com parasitoses intestinais (FERREIRA et al., 2002). Apesar do possível impacto que a alta prevalência de helmintos na população humana pode exercer na eficácia da vacinação ou do tratamento contra tuberculose e outras infecções de perfil Th1, poucos estudos têm sido realizados neste campo. Estes resultados em conjunto sugerem que o tratamento anti-helmíntico poderia aumentar a eficácia da vacina BCG, o que causaria um grande impacto nos países tropicais e subtropicais, onde a tuberculose e as parasitoses intestinais representam um grave problema de saúde pública Em contraste, alguns autores sugerem também que a vacinação com o BCG pode diminuir a incidência, prevalência e a intensidade da infecção pelo Necator americanus em humanos, assim como induzir alguma proteção em ratos infectados com o Schistosoma mansoni (BARRETO et al., 2000; SOULSBY, 1987; ELIAS et al., 2005). Diante dos impactos causados pelos helmintos e dos mecanismos complexos que. envolvem. tais. infecções,. é. imprescindível. a. utilização. de. modelos. experimentais, que permitam o esclarecimento das diversas infecções que podem afetar a população humana. A partir desses estudos pode-se esclarecer a forma de interferência dos parasitos sobre o organismo, permitido a busca de soluções no controle, tratamento e na prevenção dessas infecções. É de extrema importância se estabelecer novos modelos experimentais para o estudo de co-infecções que apresentam o perfil Th1xTh2, para um melhor entendimento dos mecanismos de resposta imunológica envolvidos no controle das infecções. Nesse sentido, o presente trabalho, foi o primeiro a investigar os mecanismos imunológicos envolvidos na co-infecção por S. venezuelensis e Mycobacterium bovis..

(38) 20. 2 OBJETIVOS 2.1 OBJETIVOS GERAIS. Avaliar a influência da coinfecção por Mycobacterium bovis selvagem na resposta imunológica de camundongos BALB/c co-infectados com Strongyloides venezuelensis.. 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS. • Avaliar o índice de infectividade do S. venezuelensis através da contagem do número de vermes no intestino e do número de ovos nas fezes dos animais infectados; • Avaliar os níveis de IgE específica ao antígeno da larva L3 de S. venezuelensis no soro dos animais infectados nos 7º e 10º dias após infecção pelo S. venezuelensis e 4º e 7 º dias após a infecção pelo M. bovis selvagem; • Avaliar a produção das citocinas IFN-γ e IL-10 em culturas de células de baço e de IL-4, IL5 e IL-13 no intestino de animais co-infectados 7º e 10º dias após a infecção com S. venezuelensis, 4º e 7º dias após a infecção com M. bovis selvagem; • Quantificar os níveis de EPO no intestino dos animais co-infectados. • Avaliar a expressão de moléculas co-estimulatórias/imunomodulatórias (CD80, CD86, CD28, CTLA-4 e CD25) em células do baço e de linfonodos mesentéricos dos animais infectados, através de citometria de fluxo;.

(39) 21. 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 ANIMAIS. Foram. utilizados. camundongos. machos. da. linhagem. BALB/c,. com. aproximadamente 6-8 semanas de idade, provenientes do Biotério do Centro de Biologia da Reprodução (CBR-UFJF) e mantidos no setor de manutenção e experimentação do Laboratório de Imunologia do ICB-UFJF. Os camundongos foram acondicionados em gaiolas-padrão, exceto aqueles infectados com M. bovis selvagem, os quais foram acondicionados em micro-isoladores. Os animais foram mantidos em estantes climatizadas, sendo alimentados exclusivamente com ração apropriada e água, sendo utilizados 4 a 5 animais por grupo: grupo controle não infectado (grupo CONTROLE); grupo infectado somente com S. venezuelensis (grupo SV) e grupo co-infectado com S. venezuelensis e M. bovis (grupo COIN). Este trabalho foi submetido ao Comitê de Ética na Experimentação Animal da Universidade Federal de Juiz de Fora, protocolado pelo número 034/2006 .. 3.2. INFECÇÃO. E. ACOMPANHAMENTO. DA. INFECÇÃO. COM. S.. venezuelensis. Para verificar se os animais obtidos apresentavam alguma parasitose intestinal por helmintos, foi realizado em todos os indivíduos, o teste de “swab” anal . Independente do resultado do teste, todos os animais foram tratados com antihelmínticos, contra cestóides e nematóides, e após o período de eliminação residual dos anti-helmínticos, os animais foram infectados com S. venezuelensis. S. venezuelensis utilizado nos experimentos foi isolado de Rattus norvegicus e é mantido no Departamento de Parasitologia da Universidade Federal de Minas Gerais através de passagens em ratos Wistar. As larvas filariformes infectivas (larvas L3) foram obtidas através de fezes de ratos infectados tendo sido cultivadas em carvão vegetal. As culturas foram deixadas de 48 -72 horas a 28 °C e as larvas infectivas, coletadas e concentradas através da técnica de Baermann-Moraes, conforme.