UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS
UNIDADE UNIVERSITÁRIA DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLÓGICAS CURSO DE BACHARELADO EM QUÍMICA INDUSTRIAL
THALITA NÁTALI SALAMÃO SANTOS
VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA ANÁLITICA PARA DOSEAMENTO DO INSUMO FARMACÊUTICO PARACETAMOL DC 90.
ANÁPOLIS-GO NOVEMBRO - 2012
THALITA NÁTALI SALAMÃO SANTOS
VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA ANÁLITICA PARA DOSEAMENTO DO INSUMO FARMACÊUTICO PARACETAMOL DC 90.
Trabalho de Curso submetido ao corpo docente da Coordenação do Curso de Química Industrial da Universidade Estadual de Goiás como parte dos requisitos necessários para a obtenção do título de Bacharel em Química Industrial
Santos,Thalita Nátali Salamão
Validação de metodologia analítica para doseamento do insumo farmacêutico Paracetamol DC 90/Santos, Thalita Nátali Salamão; Goetz, Carolina
Maria-2012 LVII f.
Orientadora: Prof. Ms. Carolina Maria Goetz
TCC(Graduação), Universidade Estadual de Goiás, Unidade Universitária de Ciências Exatas e Tecnológicas, 2012.
1. Validação. 2. Paracetamol DC 90. 3. Espectrofotometria I.Goetz, Carolina Maria.
Dedicatória Dedico este trabalhado a Deus, pela dádiva de vida. A meus queridos Maristela e Rogério, pelo amor incondicional, e pelo apoio que recebi nesta longa jornada. Não teria chegado até aqui sem vocês.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, o maior de todos os pais,companheiro fiel, amigo; Agradeço a minha querida mãe pelo amor e pela confiança depositada nestes quatro anos; Agradeço às minhas grandes paixões, Duda e Rogério;
Agradeço a minha orientadora, Carolina Goetz, pelo auxílio na elaboração deste trabalho; Agradeço a Chefia pela oportunidade cedida para a realização deste trabalho, e pelo tempo dedicado para a concretização do mesmo.
RESUMO
A validação de metodologias analíticas tem se tornado uma necessidade mundial, principalmente nas indústrias farmacêuticas devido a grande competitividade existente. O objetivo do trabalho em questão foi a validação da metodologia analítica utilizada no doseamento do insumo farmacêutico Paracetamol Dc 90 por espectrofotometria. Sendo que a farmacopeia americana 34º edição descreve metodologia analítica para doseamento de insumo farmacêutico paracetamol, com determinação por espectrofotometria. Entretanto fez se necessário a validação do método para o Paracetamol DC 90, pois há mudança dos componentes da matriz. Os parâmetros avaliados na validação desta metodologia analítica para o paracetamol, foram robustez, seletividade, linearidade, intervalo, precisão e exatidão, os quais apresentaram valores dentro do especificado pela legislação vigente.
ABSTRACT
The validation of analytical methods has become a global need, especially in the pharmaceutical industries due to the highly competitive existent. The goal of the work in question was the validation of the analytical methodology used in the determination of pharmaceutical ingredient Paracetamol DC 90 by spectrophotometry. Since the U.S. Pharmacopoeia 34th edition describes analytical methodology for determination of paracetamol pharmaceutical ingredient, with determination by spectrophotometry. However made if necessary validation method for Paracetamol DC 90 because no change matrix components. The parameters for validation of analytical methodology for paracetamol, were robustness, selectivity, linearity, range, precision and accuracy, which showed values within the specified by law.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1-Estrutura molecular do Paracetamol...17
Figura 2-Representação da interferência do Placebo em relação ao Paracetamol...38
Figura 3-Representação da curva de linearidade para o Paracetamol DC 90...40
Figura 4- Representação da dispersão dos resíduos obtidos na Linearidade...42
Figura 5-Representação da dispersão das absorbâncias obtidas para as soluções Padrão na Precisão Inter Dia...47
Figura 6-Representação da dispersão das absorbâncias obtidas para as soluções Amostra na Precisão Inter Dia...47
Figura 7-Representação do Grau de Recuperação do Paracetamol DC 90...49
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Testes necessários para a validação por categoria...24
Tabela 2- Resultados obtidos na avaliação da Conformidade do Sistema...36
Tabela 3- Resultados obtidos no estudo da Seletividade...37
Tabela 4-Resultados obtidos no estudo da Linearidade...39
Tabela 5- Resultados dos resíduos obtidos no estudo da Linearidade...42
Tabela 6-Resultados obtidos na Repetibilidade das soluções Padrão...43
Tabela 7- Resultados obtidos na Repetibilidade das soluções Amostra...45
Tabela 8- Resultados obtidos na Precisão Intermediária das Soluções Padrão...45
Tabela 9- Resultados obtidos na Precisão Intermediária das Soluções Amostra...46
Tabela 10- Resultados obtidos no estudo da Exatidão...48
Tabela 11- Resultados obtidos para o Grau de Recuperação na Exatidão...49
Tabela 12- Resultados obtidos no estudo do Tempo Extração...50
Tabela 13- Resultados obtidos para o Grau de Recuperação no Tempo Extração...51
Tabela 14- Resultados obtidos no estudo Estabilidade da Solução...51
Tabela 15- Resultados obtidos no estudo Estabilidade da Solução...52
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AINEs : agentes anti inflamatórios não esteróides;
ANVISA: Agência Nacional de Vgilância Saitária;
INMETRO: Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Instrumental;
USP: United States Pharmacopeia;
ISO:Organização Internacional para Padronização;
RE 899: Resolução 899 de 23 de Maio de 2003;
IUPAC: União Internacional de Química Pura e Aplicada;
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... .Erro! Indicador não definido.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...Erro! Indicador não definido.
2.1 Paracetamol ... ..Erro! Indicador não definido.
2.2 Caracteristicas Gerais ... Erro! Indicador não definido.
2.3 Espectrofotometria... Erro! Indicador não definido.
2.4 Validação de Metodologias Analíticas ... Erro! Indicador não definido.
3. DESENVOLVIMENTO ... Erro! Indicador não definido.
3.1 Materiais e Métodos ... 32 3.1.1 Vidraria ... 32 3.1.2 Equipamentos...32 3.1.3 Padrão Trabalho. ... 32 3.1.4 Reagentes...32 3.1.5 Metodologia...33 3.1.5.1- Conformidade do Sistema...33 3.1.5.2- Seletividade...34 3.1.5.3- Linearidade...34 3.1.5.4- Intervalo...34 3.1.5.5- Precisão...34 3.1.5.6- Exatidão...35 3.1.5.7- Robustez...35 3.2 RESULTADOS...Erro! Indicador não definido.
3.2.2 Seletividade...37 3.2.3Linearidade...39 3.2.4 Intervalo...43 3.2.5 Precisão...43 3.2.6 Exatidão...48 3.2.7 Robustez...50 5. CONCLUSÃO...53 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...55
1-INTRODUÇÃO
A validação de metodologias analíticas é regulamentada pela Resolução 899 de 29 de Maio de 2003, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA).
A metodologia analitica em estudo é utilizada na quantificação da matéria prima Paracetamol DC 90, utilizada nas industrias farmacêuticas para a produção de medicamentos com atividades antipiréticas e analgésicas.
O Paracetamol é classificado como um agente anti inflamatório não esteróide, AINE sem no entanto apresentar atividade anti inflamatoria significativa, diferentemente dos demais fármacos pertencentes ao grupo.
Sua farmacodinâmica não é completamente elucidada, sendo que tem-se ao menos dois tipos de farmacodinâmica citadas para o paracetamol na literatura, pela inibição das cicloxigenases, e pela associação com canabinóides.
Os fármacos Paracetamol e Paracetamol DC 90, diferenciam-se apenas pelo fato do Paracetamol DC 90 ser um tipo de insumo que possui em sua rota de produção a adição de excipientes que possibilitam apenas sua compressão direta quando adquirido pela indústria farmacêutica.
Segundo a ANVISA, metodologias descritas em farmacopeias ou compêndios oficiais devidamente reconhecidos pela mesma são considerados validados.
O Paracetamol apresenta metodologia analítica para sua quantificação por espectrofotometria na região do ultra violeta e visível descrita na Farmacopéia Americana 34º Edição e Farmacopéia Brasileira 5º Edição, entretanto fez-se necessário a validação da metodologia para quando aplicada ao Paracetamol DC 90 visto que existe uma mudança nos componentes da matriz entre os dois fármacos.
Assim para verificar a validade da metodologia analítica quando aplicada ao Paracetamol DC 90 avaliou se os parâmetros: conformidade do sistema, especificidade, linearidade, intervalo, repetibilidade, precisão intermediária, exatidão e robustez.
2 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1- Paracetamol
O paracetamol foi descoberto a partir de seus precussores Acetanilida e Fenacetina, a partir da urina de indivíduos que haviam ingerido Fenacetina e/ou Acetanilida. ( PINHEIRO, 2010)
Depois de isolado foi caracterizado como um composto cristalino branco e de sabor amargo. ( PINHEIRO, 2010)
Entretanto relatos afirmam que apenas em 1899 o paracetamol foi identificado como sendo um metabolito da acetanilida.( PINHEIRO, 2010)
Sendo que em 1873 o Paracetamol foi sintetizado por Harmon Northrop Morse através da redução do p-nitrofenol com o estanho em ácido acético glacial, ficando sem uso medicinal entretanto por algumas décadas. ( PINHEIRO, 2010)
Na década de 50, do século 20 iniciou-se a inserção do produto no mercado, sendo inicialmente vendido pelos laboratórios McNeil como um aliviante da febre infantil, sob o nome comercial de Elixir Tylenol para crianças. (OLIVEIRA, 2009)
Em 1956, o paracetamol começou a ser comercializado sob a forma de tablets de 500 mg, sob a marca comercial Panadol no Reino Unido.(VIANA, 2009)
Atualmente o paracetamol é um dos medicamentos anti-inflamatórios não esteroídes mais utilizados no tratamento da dor e alívio da febre em todo o mundo, ocupando uma posição de destaque dentre os medicamentos analgésicos. ( PINHEIRO, 2010)
É indicado no tratamento sintomático de situações clínicas que requerem analgésicos e/ou antipiréticos, bem como síndromes gripais, hipertermiasinfecciosas, reações hipergénicas da vacinação, cefaléias, enxaquecas, dores de dentes, ouvidos, menstruais, traumáticas, musculares e articulares e como analgésicos antes e após intervenções cirúrgicas. ( PINHEIRO, 2010)
A maior vantagem do paracetamol é não apresentar efeitossecundários graves, sendo muito bem tolerado quando administradonas doses terapêuticas recomendadas. ( PINHEIRO, 2010)
O paracetamol possui absorção rápida, sendo que cerca de 90% é absorvido pelo trato gastrintestinal. (ARMSTRONG ,2009)
O pico de concentração plasmática é atingida em torno de 30 a 60 minutos para adultos e cerca de 30 minutos para crianças.(VIANA, 2009)
A metabolização da droga no organismo ocorre no fígado, sendo que 90% é metabolizado em glicuronídeos e sulfatos. A glicuronidação é um método utilizado pelo organismo para excreção de substâncias indesejáveis ou que não são fontes de energia. (VIANA, 2009 e CRAIG, 2005)
Os glicuronídeos são formados a partir de uma ligação glicosídica entre o ácido glicurônico e a substância em questão. Sendo que sua excreção torna-se facilitada pelo aumento da solubilidade com tal ligação. (OLIVEIRA, 2009 e VIANA, 2009)
A farmacodinâmica do paracetamol, no entanto apresenta controvérsias, e não é ainda bem elucidada, encontra-se na literatura o mecanismo por inibição das cicloxigenases, e associação com canabinóides. (OLIVEIRA, 2009 e VIANA, 2009)
2.2- Caracteristicas Gerais
O insumo farmacêutico em estudo é o paracetamol DC 90, sua diferença com o paracetamol comum é que este já é adquirido pela indústria farmacêutica pré compactado, e passa por compressão direta na indústria sem etapas anteriores.
Possibilitando uma maior praticidade para as indústrias farmacêuticas na etapa produtiva, pois não há gasto de tempo com o processo produtivo, apenas com sua compressão.
Isto ocorre pois o paracetamol DC 90 é constituído dos excipientes, amido de milho, amido pré gelatinizado, ácido esteárico, povidona, amido carboximetil de sódio, hiroxi etil benzoato, hidroxipropil benzoato e água purificada como solvente. (LU’AN, 2011)
O paracetamol, acetominofeno ou N-acetil-p-Aminofenol é um ácido orgânico fraco, com apenas um grupo ionizável em sua molécula, e tem constante de ionização igual a 9,5 a 25 °C. ( FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 2010)
Tem como fórmula molecular, C8H9NO2 e massa molar correspondente a 151,2 g/mol, e formula estrutural conforme o quadro 1. ( FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 2010)
Quadro 1-Fórmula Estrutural do Paracetamol
Fonte: Farmacopéia Brasileira, 2010
A solubilidade do paracetamol é baixa em água fria, é solúvel em metanol, etanol, dicloreto de etileno, acetato de etila, e pouco solúvel em éter e insolúvel em pentano e benzeno. ( FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 2010)
Em solução aquosa saturada apresenta pH em torno de 5,5 e 6,5. ( FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 2010)
2.3- Espectrofotometria
A espectrofotometria é baseada na radiação eletromagnética, uma forma de energia que se propaga como ondas, podendo ser subdividida em regiões de comprimento de onda característico. ( FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 2010)
A radiação eletromagnética pode ainda ser mencionada como sendo um fluxo de partículas denominadas fótons (ou quanta). Cada fóton contém determinada energia cuja magnitude é proporcional à frequência e inversamente proporcional ao comprimento de onda. ( FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 2010)
O comprimento de onda é, geralmente, especificado em nanômetros, nm (10-9 m), e em alguns casos em micrômetros, mm (10-6 m). ( FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 2010)
As moléculas ao absorverem energia, no caso na forma de luz sofrem transições para estados de maior energia ou estado excitado, e a passagem a estados excitados ocorrem em etapas denominadas transições. Estas transições compreendem promoções de elétrons de orbitais moleculares ocupados, geralmente, s e p ligantes e não ligantes, para os orbitais de energia imediatamente superiores, antiligantes p* e s*. ( FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 2010)
Sendo que o estado excitado não é de natureza contínua, ou seja as moléculas tendem a voltar para o estado de menor energia. ( FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 2010)
Na região do ultravioleta e visível as transições são eletrônicas e ocorrem em porções da molécula chamadas de cromóforos. ( FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 2010)
As faixas de comprimento de onda de energia eletromagnética de interesse para a espectrofotometria são: Ultravioleta (190 – 380 nm), Visível (380 – 780 nm) e Infravermelho próximo ( 780 – 2500 nm). ( FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 2010)
A espectrofotometria é fundamentada na lei de Lambert-Beer, que é a base matemática para medidas de absorção de radiação por amostras no estado sólido, líquido ou gasoso, nas regiões ultravioleta, visível e infravermelho do espectro eletromagnético. (HARRIS, 2001)
Compreende o estudo da absorção de luz em meios de diferentes espessuras e concentrações, e estabelece que ao passar luz por um dado meio, a intensidade da luz emitida diminui exponencialmente quando a concentração da substância absorvente aumenta aritmeticamente. (HARRIS, 2001)
A lei de Lambert pode ser descrita através da equação 1 e 2:
A = - log T
(1) Onde:T: intensidade da luz transmitida, ou transmitância
Ou ainda;
A=
ƐLc (2) Onde:Ɛ: Absortividade molar, expressa nas unidades M-1 cm-1
L: caminho óptico geralmente expresso em cm
c: concentração da amostra geralmente expressa em mol/ L ( M ).
Podendo-se verificar que a absorbância é uma grandeza adimensional. (HARRIS, 2001) É importante mencionar que Ɛ corresponde a coeficiente de proporcionalidade entre a absorbância e o produto L.c. Sendo que quanto maior a absortividade molar maior a absorbância. (HARRIS, 2001)
A lei de Lambert Beer é aplicável para a maioria das substâncias quando a radiação incidente é monocromática, e as soluções em estudo são diluídas (pois em altas concentrações as moléculas do soluto ficam muito próximas uma das outras, e suas propriedades bem como a absortividade molar, sofrem ligeiras modificações). (HARRIS, 2001)
2.4- Validação de Metodologias Analíticas
A necessidade de demonstrar a confiabilidade dos resultados analíticos obtidos no controle de qualidade das indústrias farmacêuticas está sendo cada vez mais exigida e reconhecida. Dados analíticos não confiáveis podem ter efeitos desastrosos durante o processo.
Sendo que a competitividade encontrada atualmente no mercado farmacêutico, tem feito as indústrias buscarem cada vez mais a garantia na qualidade dos procedimentos desenvolvidos e executados.
No contexto internacional a metrologia em química se encontra em crescimento acelerado, podendo-se admitir que com o passar dos anos não haverá mais espaço para produtos sem qualidade assegurada. (INMETRO, 2011)
A qualidade assegurada exige que os resultados laboratoriais que sustentam os dados relatados para esses produtos tenham sua rastreabilidade a padrões internacionais garantida através do uso de materiais ou técnicas de referência reconhecida, em todos os laboratórios de ensaio, sejam eles de indústrias, centros de pesquisas, universidades ou órgãos de controle e de fiscalização.( INMETRO, 2011)
Assim para garantir que o método analítico gere resultados confiáveis, o método deve passar por um processo denominado de validação.
Existem diferentes definições para o termo, a farmacopeia americana cita a seguinte:
“A validação de métodos assegura, a credibilidade e confiabilidade destes durante o uso rotineiro, sendo algumas vezes mencionado como o processo que fornece uma evidência documentada de que o método, realiza aquilo para o qual é indicado para fazer” (USP 34ª Edição).
A validação é a confirmação obtida a partir de exames laboratoriais, que o método em estudo atende as exigências pela qual foi desenvolvido.
A validação do método analítico deve ser documentada, sendo que os documentos devem ser claros, objetivos e completos. ( INMETRO, 2011)
Validação é a confirmação através de exames e apresentação de evidência objetiva de que os requisitos específicos relativos a uma dada utilização são cumpridos.(INMETRO, 2011)
A validação permite demonstrar que um dado método analítico é adequado para o uso pretendido.
Segundo a RE 899, a validação de métodos analíticos deve garantir por meio de estudos experimentais, que o método atenda as exigências das aplicações analíticas, assegurando a
confiabilidade dos resultados. Deve apresentar especificidade, linearidade, intervalo, precisão, sensibilidade, limite de quantificação e exatidão adequados a análise. (ANVISA, 2003)
No âmbito geral, a validação é subdividida em três tipos:
Validação Prospectiva:
É o modelo ideal de validação, onde a metodologia é validada antes do lançamento do produto.
Neste estudo, ocorre a transferência de conhecimento acumulado durante fase de desenvolvimento do produto por parte da área do desenvolvimento para a árae da produção. (VIEIRA, 2001)
Deve conter: documentos relativos, equipamentos utilizados no processo, informações detalhadas sobre as áreas envolvidas, informações relativas aos sistemas e a reunião de todos os dados acumulados durante a fase de desenvolvimento. (VIEIRA, 2001)
Validação retrospectiva
É realizada a partir da análise cuidadosa de dados gerados no passado e que compõem o histórico do processo. Não é um modelo de validação recomendado, entretanto tendo em vista a realidade industrial atual, em que processos de fabricação não são submetidos a um estudo completo de validação, este tipo de validação pode fornecer informações significativas e promover melhorias e redução erros. (VIEIRA, 2001)
Validação Concorrente
É realizada durante o processo corrente e normal de produção. Sendo estabelecido por evidências documentadas de que o processo cumpre os fins para o qual foi desenvolvido, baseadas em dados gerados. (VIEIRA, 2001)
A documentação necessária para o registro de validação do tipo prospectiva, de um método analítico inclui plano mestre, protocolo, planilha de dados e relatório. (BASSANI, 2002)
O Plano Mestre de validação é o documento estratégico, é constituído de um cronograma de atividades e responsabilidades pelo desempenho das tarefas inclusive elaboração, revisão e aprovação dos documentos. (BASSANI, 2002)
O objetivo do plano mestre é garantir que as práticas de validação sejam realizadas com eficiência e consistência na organização a fim de atender os requisitos das normas e aspectos legais. (BASSANI, 2002)
O protocolo consta geralmente de uma série de testes validados de controle em processos e testes de controle de liberação para assegurar que o produto esteja dentro das especificações. (VIEIRA, 2001)
No relatório deve se evidenciar os resultados obtidos , bem como os critérios de aceitação e a declaração da validade do método. (BASSANI, 2002)
Métodos normalizados como os de compêndios oficiais, não precisam ser validados desde que não sejam alterados significativamente, e sejam devidamente reconhecidos pela ANVISA. (ANVISA, 2003)
Para o caso de transferência de metodologias da matriz para suas subsidiárias no Brasil, e/ou das empresas nacionais para centro de estudos de equivalência farmacêutica, a metodologia será considerada validada desde que sejam avaliados os paramêtros de precisão, especificidade e linearidade. (ANVISA, 2003)
Métodos analíticos devem ser revalidados, no caso de mudanças na síntese da substância ativa, mudanças na composição do produto acabado, ou mudanças no procedimento analítico. (ANVISA, 2003)
No Brasil os órgãos que regulamentam a validação de metodologias analíticas são a ANVISA ( Agência Nacional de Vigilância Sanitária) e o INMETRO (Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Instrumental). ( INMETRO, 2011 e ANVISA, 2003)
Com o intuito de assegurar a qualidade dos resultados obtidos, todos os equipamentos utilizados no processo de validação devem estar devidamente calibrados, bem como os analistas devem ser adequadamente treinados. (ANVISA, 2003)
Os testes são classificados em 4 categorias, de acordo com a RE 899, sendo que os parâmetros analíticos requeridos são baseados no objetivo de cada método, com o intuito de assegurar que os experimentos sejam limitados apenas para o que realmente é necessário. (ANVISA, 2003)
Categoria I: Testes quantitativos para a determinação do princípio ativo em produtos farmacêuticos ou matérias primas.
Categoria II: Testes quantitativos ou ensaio limite para a determinação de impurezas e produtos de degradação em produtos farmacêuticos ou matérias primas.
Categoria III: Testes de desempenho, bem como dissolução ou liberação de ativo.
Categoria IV: Testes de identificação.
A RE 899 estabelece por categorias, os ensaios necessários para a validação sendo que variam de acordo com a finalidade pretendida, e estão expressos na Tabela 1. (ANVISA, 2003)
Tabela 1 – Testes necessários para a validação por categoria
Parametros (testes Categoria I Categoria II Categoria III Categoria IV Quantitativo Ensaio Limite
Especificidade Sim Sim Sim * Sim
Linearidade Sim Sim Não * Não
Intervalo Sim Sim * * Não
Precisão Repetibilidade
Sim Sim Não Sim Não
Intermediária ** ** Não ** Não
Limite de
Detecção
Não Não Sim * Não
Limite de
quantificação
Não Sim Não * Não
Exatidão Sim Sim * * Não
Robustez Sim Sim Sim Não Não
* Pode ser necessário, dependendo da natureza do teste específico
** Se houver comprovação da reprodutibilidade não é necessário a comprovação da Precisão.
Estes parâmetros analíticos são comumente conhecidos como figuras de mérito, parâmetros de desempenho e características de desempenho. (INMETRO, 2011 e BASSANI, 2002)
Conformidade do Sistema
Antes de iniciar a validação de metodologias é imprescindível verificar a conformidade do sistema, a fim de avaliar se os resultados gerados pelo equipamento apresentam confiabilidade aceitável. (ANVISA, 2003)
É alcançada com experimentos de “system suitability”, que pode ser definido como um conjunto de testes para garantir que o equipamento utilizado está apto a gerar resultados de exatidão e precisão aceitáveis. (ANVISA, 2003)
Seletividade
Representa a capacidade do método em medir exatamente um composto em presença de outros componentes, como produtos de degradação, impurezas e componentes da matriz. (ANVISA, 2003)
A seletividade deve ser o primeiro parâmetro avaliado durante um processo de validação, e deve ser continuamente realizado a fim de verificar a possível existência de produtos de degradação. (ANVISA, 2003)
A seletividade pode ser determinada de várias maneiras, como pela análise comparativa dos resultados obtidos de amostras e amostras contaminadas com quantidades conhecidas de excipientes ou impurezas, a fim de demonstrar que os resultados obtidos não sofrem interferência destes materiais. (ANVISA, 2003)
Ou ainda pelo método de adição padrão, porém este método é recomendado apenas quando não é possível obter a matriz isenta da substância de interesse. Neste caso é feito uma curva analítica com a adição da substância de interesse na amostra e comparada com uma curva analítica sem a presença da matriz. (ANVISA, 2003 e RIBANI,et al., 2004)
Caso as duas curvas obtidas sejam paralelas pode-se afirmar que não há interferência significativa da matriz na determinação da substância de interesse. Para tanto o método é denominado seletivo. (ANVISA, 2003 e RIBANI,et al., 2004)
Linearidade
Demonstra a capacidade do método em fornecer resultados que são diretamente proporcionais a concentração do analito, dentro de uma faixa de aplicação. (ANVISA, 2003)
Faixa de aplicação corresponde ao valor superior e inferior de concentração, que conseguem ser determinados pelo método com exatidão e precisão. (RIBANI,et al., 2004)
RE 899 recomenda uma faixa de aplicação de no mínimo 5 concentrações diferentes. Sendo que recomenda-se um intervalo de 80% a 120% para matérias primas e produtos farmacêuticos, de até 120% do limite máximo especificado para determinação de impurezas e de 70 a 130% para uniformidade de conteúdo. (ANVISA, 2003)
Especifica-se que os pontos da curva devem estar compreendidos dentro da faixa de concentração de interesse, devendo compreender 0-150% ou ainda 50-150% do valor esperado. (VIEIRA, 2001 e BASSANI, 2002)
A relação entre a concentração e absorbância pode ser expressa por uma equação de reta chamada de curva analítica. Matematicamente a estimativa dos coeficientes de uma curva analítica pode ser determinada pelo modelo matemático conhecido por Regressão Linear. (HARRIS, 2001)
Regressão linear é uma metodologia estatística que usa a relação entre duas ou mais variáveis de tal forma que uma das variáveis pode ser predita a partir da outra. (HARRIS, 2001)
O objetivo da regressão linear é avaliar uma possível dependência da variável y em relação a x. (HARRIS, 2001)
O coeficiente de determinação R2 é uma estimativa da proporção da variabilidade de uma variável que é explicada pela variabilidade de outra variável. (HARRIS, 2001)
Quanto mais próximo de 1, maior o ajuste do modelo sendo que R2 depende do número de estimações n, e tende a diminuir a medida que n aumenta. (HARRIS, 2001)
A ANVISA recomenda um coeficiente de correlação linear igual a 0.99, enquanto que o INMETRO igual a 0.90. ( INMETRO, 2011 e BASSANI, 2002)
Toda e qualquer análise instrumental pode ser expressa por uma equação de reta simples, e a mesma só é válida dentro de uma determinado intervalo de concentração ( ou faixa linear dinâmica ). (HARRIS, 2001)
A construção desta curva analítica pode ser feita com as concentraçaões utilizadas no eixo x, e as respostas obtidas pelo equipamento no eixo y. A reta obtida deve apresentar-se linear sob toda a faixa horizontal. (RIBANI,et al., 2004)
A quantificação da amostra durante um processo de validação pode ser realizado pelo método padronização externa, padronização interna, superposição de matriz ou adição padrão. (RIBANI,et al., 2004)
-Padronização Interna
Consiste na preparação de soluções padrão de concentração conhecida, adicionando-se a estas a mesma quantidade de um composto denominado de padrão interno. (RIBANI,et al., 2004)
Analisa-se também a amostra contaminada com o padrão interno. Após a obtenção dos resultados, constrói-se um gráfico relacionando a resposta gerada pelo equipamento, com suas respectivas concentrações. (RIBANI,et al., 2004)
Através da razão das áreas obtidas ( para o caso de utilizar Cromatografia Líquida de Alta Eficiência ), ou da razão das absorbâncias obtidas ( para o caso de Espectrofotometria no Ultra violeta e Visível ), é possível determinar a concentração da substância de interesse na solução. (RIBANI,et al., 2004)
É importante ressaltar que padrão interno é um composto com características estruturais semelhantes ao analito, não deve reagir com a substância ou componentes da matriz, e é adicionado para facilitar a determinação do analito. (ANVISA, 2003)
-Padronização Externa
O método de padronização externa baseia-se na comparação da resposta gerada pelo equipamento dada pela substância de interesse com a resposta gerada por concentrações conhecidas do padrão da substância de interesse. (RIBANI,et al., 2004)
Sendo que as amostras são preparadas em várias concentraçaões, um gráfico é então construído a partir das respostas obtidas e das suas respectivas concentrações. (RIBANI,et al., 2004)
Pela equação da curva obtida, é possível calcular a quantidade da substância de interesse na amostra. Este método é sensível a erros sistemáticos, devendo ser realizado ao fim de cada análise. (RIBANI,et al., 2004)
É recomendado quando as chances de erro sistemático proveniente da matriz for nula. (RIBANI,et al., 2004)
-Superposição de Matriz
É conhecido como matrix-matched, consiste na adição do padrão da substância em diversas concentrações, em uma solução contendo a matriz da substância de interesse, isenta da mesma. (RIBANI,et al., 2004)
O gráfico é construído a partir das coordenadas, concentrações e resposta gerada pelo equipamento. Este método pode ser utilizado para calibração, padronização interna e padronização externa. Sendo que para casos em que a matriz pode interferir na resposta gerada pela substância de interesse, ou quando a mesma não encontra-se disponível sem a substância química de interesse, recomenda-se o método de adição padrão. (RIBANI,et al., 2004)
-Adição Padrão
Trata-se de um método trabalhoso, sendo utilizado quando a amostra é muito complexa.
Consiste na adição de quantidades conhecidas da substância de interesse que está sendo analisada a quantidades conhecidas da amostra.
Constrói-se uma curva analítica relacionando as quantidades da substância adicionada à amostra com as respectivas absorbâncias obtidas.
Não existe regras pré estabelecidas para o tipo de método que deve ser usado na quantificação, entretanto os requisitos para a escolha do tipo de método de quantificação são: melhor exatidão possível, alto nível de precisão, menor tempo possível e menor uso de anostras.(BASSANI, 2002 e RIBANI,et al., 2004)
Assim o método de quantificação ideal dependerá da amostra específica, do número de amostras, da complexidade da matriz, e da disponibilidade de padrões. (BASSANI, 2002 e RIBANI,et al., 2004)
Intervalo
O intervalo especificado é a faixa entre os limites de quantificação superior e inferior de um método analítico. Sendo que em geral deriva do estudo da linearidade e depende do tipo de aplicação pretendida para o método. ( ANVISA, 2003)
O intervalo é estabelecido após a confirmação da exatidão, precisão e linearidade do método, quando aplicados a amostras contendo quantidades de substância dentro do ntervalo especificado. ( ANVISA, 2003)
Precisão
A precisão representa a dispersão dos resultados entre ensaios independentes repetidos de uma mesma amostra. ( ANVISA, 2003)
É avaliado a partir da estimativa do desvio padrão absoluto, ou coeficiente de variação, e é considerada em três níveis. ( ANVISA, 2003)
-Repetibilidade ou Precisão Intra Corrida.
RE 899 recomenda a determinação da repetibilidade em no mínimo nove determinações, com três concentrações (baixa, média e alta comtemplando o intervalo linear do método) ,com três réplicas cada ou o mínimo de seis determinações a 100% da concentração teste ( ANVISA, 2003)
-Precisão Intermediária ou Precisão Inter Corrida
É determinada pela concordância dos resultados obtidos no mesmo laboratório mas em dias diferentes com analistas diferentes, e quando cabível com equipamentos diferentes. ( ANVISA, 2003)
-Reprodutibilidade
É determinada pela concordância dos resultados obtidos em laboratórios diferentes, não sendo obrigatório para a concessão do registro. ( ANVISA, 2003)
Não admite-se desvio padrão maior que 5%, sendo que o valor máximo aceitável deve ser definido de acordo com a metodologia empregada, concentração do analito na amostra, tipo de matriz e a finalidade do método. ( ANVISA, 2003)
Limite de Detecção
É a menor quantidade do analito presente em uma amostra que pode ser detectada, porém não necessariamente quantificado segundo a RE 899.( ANVISA, 2003)
O limite de detecção é estabelecido por meio da análise de soluções de concentrações conhecidas e decrescentes, até o menor nível detectado.( ANVISA, 2003)
Limite de Quantificação
É a menor quantidade do analito em uma amostra que pode ser determinada com precisão e exatidão sob as condições experimentais estabelecidas. ( ANVISA, 2003)
Exatidão
A exatidão do método deve ser determinada após o estabelecimento da linearidade, intervalo linear e da especificidade. ( ANVISA, 2003)
Expressa a proximidade dos resultados obtidos pelo método em estudo em relação ao valor verdadeiro, sendo verificada por no mínimo nove determinações comtemplando a faixa linear
do método, ou seja três concentrações baixa, média e alta, com três réplicas cada.( ANVISA, 2003)
A exatidão é avaliada pela relação entre a concentração média determinada experimentalmente e a concentração teórica correspondente. ( ANVISA, 2003)
Sendo que para concentrações de analito menores ou igual a 0.1 mg/ml, admite-se como intervalo aceitável valores entre 95 % a 105 %.( ANVISA, 2003)
Robustez
A robustez de uma metodologia analítica representa a capacidade do mesmo em resistir a pequenas e deliberadas variações dos parâmetros analíticos. Sendo que tais variações devem ser controladas durante o uso rotineiro do método. (ANVISA, 2003)
A ANVISA estabelece os fatores que devem ser considerados na determinação da robustez do método analítico da seguinte forma:
- Preparo das Amostras: deve-se avaliar a estabilidade das soluções analíticas envolvidas, e o tempo de extração adequado.
- Espectrofotometria: deve-se avaliar variação do pH na solução, temperatura, e diferentes fabricantes de solventes.
- Cromatografia Líquida de Alta Eficiência: deve-se avaliar a variação do pH da fase móvel, variação na composição da fase móvel, uso de diferentes lotes de colunas ou diferentes fabricantes de coluna, temperatura e fluxo da fase móvel.
- Cromatografia Gasosa: deve-se avaliar diferentes lotes ou fabricantes de colunas, temperatura e velocidade do gás de arraste. (ANVISA, 2003)
3- DESENVOLVIMENTO 3.1- Materiais e Métodos
A metodologia em estudo foi validada no período de 01/10/12 a 10/11/12 no Laboratório físico químico do departamento de Controle de Qualidade de uma Indústria Farmacêutica do DAIA (Distrito Agroindustrial de Anápolis) em Anápolis-Go.
3.1.1-Vidrarias: - Pipeta volumétrica de 5 ml; - Bureta graduada de 50 ml; - Proveta de 50 e 10 ml; - Balão volumétrico de 250 e 100 ml; - Espátula; 3.1.2-Equipamentos
- Balança Analítica. Marca: Toledo Modelo: AR2140;
- Espectrofotômetro. Marca: Varian. Modelo: Cary Bio 50;
- Banho de ultrassom. Marca: UNIQUE. Modelo: USC 1450;
3.1.3- Padrão de Trabalho:
- Padrão de referência Paracetamol com potência de 99.64%; 3.1.4-Reagentes:
- Água ultra pura ;
3.1.5-Metodologia:
Pesar exatamente 40 mg de paracetamol padrão e transferir para balão volumétrico de 250 ml, adicionando 50 ml de hidróxido de sódio 0,4%, e em seguida adicionar 150 ml de água.
A solução deve ser levada ao banho de ultrassom durante 15 minutos, completando o balão com água. ( 0,16mg/ml ).
Pipetar volumetricamente 5 ml da solução anteriormente preparada para balão volumétrico de 100 ml, adicionando se em seguida 10 ml de hidróxido de sódio 0,4%, e completar o volume com água ( 0,0080mg/ml ).
A solução branco deve ser preparada com 10 ml de hidróxido de sódio 0,4% para balão volumétrico de 100 ml, e o volume deve ser completado com água.
O mesmo procedimento realizado no preparo da solução padrão, deve ser realizado no preparo da solução amostra, entretanto após a primeira diluição a solução amostra deve ser filtrada em filtro do tipo faixa preta, descartando os primeiros 50 ml do filtrado antes da pipetagem.
Ler as soluções preparadas em espectrofotômetro UV-Visível no comprimento de onda de 257 nm, corrigindo a leitura pelo branco.
A seguir tem-se o procedimento utilizado para a execução do estudo de cada parâmetro
3.1.5.1-Conformidade do Sistema
Preparou-se uma solução padrão a 100%, conforme anteriormente descrito e realizou-se a leitura desta solução 5 vezes em espectrofotômetro UV-Visível no comprimento de onda de 257 nm.
Sendo que o intervalo para a realização das análises compreendeu três dias de estudo, assim cada dia de análise, antes do início dos testes, realizou-se a conformidade do sistema.
3.1.5.2- Seletividade
Preparou-se uma solução padrão na concentração de 0.0080mg/ml, conforme anteriormente descrito.
Preparou-se uma solução amostra na concentração de 0.0080mg/ml, conforme anteriormente descrito.
Preparou-se ainda uma solução amostra contaminada com placebo, pesando se 40 mg da amostra e 40 mg de placebo, as diluições foram realizadas conforme já descrito anteriormente.
3.1.5.3-Linearidade
Para a linearidade, preparou-se inicialmente uma solução mãe de concentração 0.16mg/ml.
Solução Mãe: Pesou-se exatamente 40 mg do padrão de paracetamol para balão volumétrico de 250 ml, adicionou-se 50 ml de solução NaOH 0,4% e completou o volume com água.
A solubilização foi realizada em banho ultrassom por 15 minutos.
A partir da solução mãe realizou-se diluições com 4.0 ml, 4.5 ml, 5.0 ml, 5.5 ml e 6.0 ml, para balão volumétrico de 100 ml, a fim de obter as respectivas concentrações de 0.0064 mg/ml ( 80% ), 0.0072 mg/ml ( 90% ), 0.008 mg/ml ( 100% ), 0.0088mg/ml ( 110% ) e 0.0096mg/ml ( 120 % ). As leituras foram realizadas em triplicata.
3.1.5.4- Intervalo
Utilizou se as soluções preparadas no estudo da linearidade, precisão e exatidão, para o estudo do intervalo.
3.1.5.5-Precisão Repetibilidade
Preparou-se 6 soluções amostra de concentração a 100%, e realizou-se a leitura em triplicata para cada amostra preparada.
Preparou-se 1 solução padrão de concentração a 100%, e realizou-se a leitura em seis vezes.
Precisão Intermediária
Foi realizada por outro analista, dois dias após a execução da repetibilidade, onde preparou-se 6 soluções amostra de concentração a 100%, e realizou-se a leitura em triplicata para cada amostra preparada.
Preparou-se 1 solução padrão de concentração a 100%, e realizou-se a leitura seis vezes.
3.1.5.6-Exatidão
Preparou-se uma solução padrão na concentração de 0.0080mg/ml, conforme anteriormente descrito.
Preparou-se ainda três soluções contendo 4 mg de placebo e 32mg, 40mg e 48mg de analito, afim de obter as concentrações respectivamente em 80%, 100% e 120%. As leituras foram realizadas em triplicata.
3.1.5.7 -Robustez
Estabilidade da solução.
Preparou-se uma solução amostra e uma solução padrão de paracetamol, ambas a 100%, sendo que avaliou-se a estabilidade da solução mediante sua leitura nos tempos 0, 3 horas, 6 horas, 9 horas, 12 horas e 24 horas. Sendo que as leituras foram registradas em triplicata cada.
Tempo de Extração.
Preparou-se uma solução amostra e uma solução padrão a 100% para cada tempo de extração em análise, sendo que os tempos em estudo foram 5, 15 e 30 minutos. As leituras foram realizadas em triplicata.
3.2- RESULTADOS
3.2.1-Conformidade do Sistema
Os resultados obtidos para a conformidade do sistema inter-dia estão descritos na Tabela 2.
Tabela 2- Resultados obtidos na avaliação Conformidade do Sistema
Solução Absorbâncias Obtidas
Padrao 1º Dia 0.5810 Padrao 1º Dia 0.5819 Padrao 1º Dia 0.5849 Padrao 1º Dia 0.5825 Padrao 1º Dia 0.5861 Padrao 2º Dia 0.5838 Padrao 2º Dia 0.5843 Padrao 2º Dia 0.5873 Padrao 2º Dia 0.5855 Padrao 2º Dia 0.5876 Padrao 3º Dia 0.5724 Padrao 3º Dia 0.5721 Padrao 3º Dia 0.5731 Padrao 3º Dia 0.5725 Padrão 3º Dia 0.5764
Fonte: Thalita Nátali
Os resultados obtidos na Tabela 2 foram analisados em relação ao desvio padrão relativo, representado pela equação 3 e desvio padrão representado pela equação 4.
(3)
Onde;
DPR: Desvio Padrão Relativo
DP: Desvio Padrão
CMD: Concentração Média determinada
Onde;
n-1: número de observações a: valores das observações
ā: média dos valores das observações.
Obteve-se desvio padrão relativo, ou coeficiente de variação de 1.00 % demonstrando assim que o equipamento utilizado nesta validação fornece resultados confiáveis.
Ou seja as absorbâncias obtidas apresentam desvio em relação a média na proporção de 0.5833 ±0.005823.
Tal valor para o desvio padrão relativo, fornece nos evidências que o aparelho utilizado na metodologia em estudo fornece resultados confiáveis, com pouca variação entre os ensaios realizados.
Podendo ser, portanto utilizado na validação da metodologia analítica
3.2.2-Seletividade
Os valores obtidos experimentalmente estão descritos na tabela 3.
Tabela 3- Resultados obtidos no estudo da Seletividade
Solução Absorbância Amostra 1 0.5157 Amostra 2 0.5160 Amostra 3 0.5180 Amostra + Placebo 1 0.5148 Amostra + Placebo 2 0.5147 Amostra + Placebo 3 0.5147
Fonte: Thalita Nátali
Tendo em vista que o Paracetamol DC 90 é um insumo farmacêutico pré compactado, com diversos excipientes em sua composição, é relevante a análise da presença de possíveis
interferentes que absorvam luz no mesmo comprimento de onda que a substância química de interesse.
Assim a seletividade da metodologia em questão foi avaliada em termos do grau de interferência da matriz do Paracetamol DC 90.
O grau de interferência gerado pelo placebo foi realizado conforme a equação 5
(5)
Onde:
Rp: resposta gerada referente ao placebo.
Ra: Resposta gerada referente ao analito.
O grau de interferência obtido foi de 0.37%, valor correspondente a uma absorbância de -0.0019. O quadro 2 representa a proporção entre a absorção referente ao placebo e ao composto paracetamol propriamente dito.
Quadro 2- Representação da interferência do placebo em relação a amostra.
Fonte: Thalita Nátali
Sendo que 1 corresponde a absorbância correspondente ao paracetamol, enquanto 2 corresponde a absorbância dos componentes da matriz.
1 2
Tal resultado negativo é reflexo da não absorção de luz dos componentes da matriz no comprimento de onda de 257 nm.
Tendo que a absorbância obtida para os componentes da matriz é -0.0019, a transmitância correspondente a esta absorbância é 0.9956, ou seja 99.56% da luz emitida é transmitida sem absorção.
Portanto os excipientes do paracetamol não absorvem luz no comprimento de onda especifico de 257 nm. Desta forma praticamente toda luz emitida sobre a célula é transmitida, pelos componentes da matriz sem ser absorvida.
Para comprovar tal afirmação foi realizado uma varredura de uma solução placebo a 100% no espectro de 800 a 200 nm.
Os máximos de absorção encontrados correspondem aos comprimentos de onda em 655 nm e 350 nm, suas respectivas absorbâncias obtidas foram 0.002 e 0.007. No comprimento de onda de 257 nm obteve se uma absorbância de 0.000, confirmando assim que toda luz emitida na solução placebo é transmitida sem ser absorvida.
3.2.3-Linearidade
Os valores obtidos experimentalmente estão descritos na tabela 4 a seguir.
Tabela 4- Referente aos resultados obtidos no estudo da Linearidade.
Resposta Equipamento Solução 80% Solução 90% Solução 100% Solução 110% Solução 120% Absorbância 1 0.4568 0.5098 0.5697 0.6121 0.6804 Absorbância 2 0.4597 0.5077 0.5674 0.6163 0.6808 Absorbância 3 0.4605 0.5099 0.5706 0.6167 0.6798
Fonte: Thalita Nátali
A linearidade entre absorbância e concentração foi determinada pelo método dos mínimos quadrados.
O quadro 3 representa uma curva de calibração com os resultados obtidos, sendo que a concentração em mg/ml encontra se no eixo x e suas respectivas absorbâncias no eixo y.
Quadro 3 – Curva de Linearidade para Paracetamol DC 90
Fonte: Thalita Nátali
Pela análise gráfica é possível analisar a existência da correlação linear, sendo que apresentam correlação linear positiva, onde os pontos obtidos possuem uma tendência a formar uma reta ascendente.
Entretanto a correlação linear entre as variáveis só pode ser confirmada mediante o cálculo do coeficiente de correlação de Pearson.
O coeficiente de correlação de Pearson é determinado pela equação 6:
(6)
Onde;
r: Coeficiente de correlação de Pearson
0,4000 0,4500 0,5000 0,5500 0,6000 0,6500 0,7000 0,0060 0,0070 0,0080 0,0090 0,0100 A bs orbânc ia Concentração mg/ml
n: número de pontos experimentais.
Pelo quadro 3 verifica-se que as soluções apresentam boa correlação linear entre as absorbâncias e suas respectivas concentrações, indicando que o coeficiente de linearidade é adequado.
Desta forma ao substituirmos na equação acima descrita, temos que:
r = 0,9987
O coeficiente de Pearson obtido apresenta valor dentro da especificação exigida pela ANVISA, que estabelece coeficiente linear de no mínimo 0.99, enquanto que o INMETRO estabelece coeficiente linear de 0.90.
Entretanto após a determinação do coeficiente de correlação faz-se necessário a determinação da melhor reta que passa pelos dados experimentais através do método dos mínimos quadrados, ou regressão linear.
Desta forma, tendo uma dada reta qualquer pode ser expressa pela equação
y = a + bx
(7) Onde;Y: variável dependente é lançada graficamente em função de x.
X: variável independente.
a: coeficiente linear da reta.
b: coeficiente angular da reta.
Sendo que ‘b’ e ‘a’ podem ser definidos pelas equações 7 e 8 respectivamente.
(8)
a = x
méd- y
méd (9) A equação da reta obtida é y = 68.502.x + 0.018, o coeficiente linear da reta é + 0.018 e o coeficiente angular da reta é 68.502.Dessa forma a relação linear confirma que as absorbâncias obtidas são diretamente proporcionais a concentração.
É possível verificar se algum ponto de concentração desvia da linearidade da curva por meio do cálculo dos resíduos entre os valores medidos e os valores calculados a partir da equação da curva.
Os resíduos obtidos estão expressos na Tabela 5.
Tabela 5-Demostração dos resíduos obtidos na Linearidade
Concentração (mg/ml) Absorbância Prevista Resíduos Resíduos (%)
0.0064 0.4564 0.0026 0.5697
0.0072 0.5386 -0.0021 -0.4108
0.0080 0.5660 0.0032 0.5654
0.0088 0.6208 -0.0058 -0.9343
0.0096 0.6756 0.0047 0.6957
Fonte: Thalita Natali
Abaixo tem-se o quadro 4, representando a dispersão dos resíduos obtidos no estudo da linearidade.
Quadro 4- Representação dos resíduos obtidos na Linearidade
Fonte: Thalita Nátali
A partir do quadro 4 é possível observar que os resíduos obtidos no estudo da linearidade, estão de acordo sendo que os valores obtidos tendem a zero.
-2,000 -1,500 -1,000 -0,500 0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 70 80 90 100 110 120 130
Além de que a ordem aleatória na distribuição dos resíduos indica uma linearidade adequada, conforme demonstra o quadro 4.
3.2.4-Intervalo
De acordo com as faixas pesquisadas para a linearidade, precisão e exatidão, determinou-se a faixa de aplicação do método analítico de doseamento dentro do intervalo compreendido entre 80.0% e 120%, ou seja nas concentrações de 0.0064mg/ml a 0.0096 mg/ml para Paracetamol DC 90. Visto que nesta faixa de aplicação o método em estudo apresentou se linear, preciso e exato.
3.2.5- Precisão Repetibilidade
Nas tabelas 6 e 7 a seguir encontram-se demonstrados as absorbâncias obtidas.
Tabela 6-Resultados obtidos na Repetibilidade Solução Padrão
Solução Absorbâncias Obtidas
Padrão 1 0.5838 Padrão 2 0.5848 Padrão 3 0.5879 Padrão 4 0.5843 Padrão 5 0.5842 Padrão 6 0.5855
Tabela 7-Resultados obtidos na Repetibilidade Solução Amostra
Solução Amostra Leituras Absorbâncias
Obtidas Amostra 1 Leitura 1 0.5273 Leitura 2 0.5286 Leitura 3 0.5276 Amostra 2 Leitura 1 0.5286 Leitura 2 0.5233 Leitura 3 0.5243 Amostra 3 Leitura 1 0.5204 Leitura 2 0.5233 Leitura 3 0.5223 Amostra 4 Leitura 1 0.5217 Leitura 2 0.5221 Leitura 3 0.5225 Amostra 5 Leitura 1 0.5238 Leitura 2 0.5237 Leitura 3 0.5246 Amostra 6 Leitura 1 0.5224 Leitura 2 0.5280 Leitura 3 0.5222
Fonte: Thalita Nátali
Na avaliação da repetibilidade da metodologia obteve-se um desvio padrão relativo de 0.26% para solução padrão e 0.49% para as soluções amostra, observando-se a proximidade dos resultados obtidos dentro de uma série de amostragens múltiplas de uma mesma amostra.
Tendo em vista que a ANVISA estima valores permitidos para o desvio padrão relativo não superiores a 5%, pode-se afirmar que a metodologia em questão apresenta boa concordância entre os resultados dentro de um curto período de tempo, com o mesmo analista e instrumentação.
Precisão Intermediária.
Nas Tabelas 8 e 9 a seguir encontram-se as absorbâncias obtidas, perante a análise de outro analista, após dois dias da execução da repetitividade, entretanto com o mesmo equipamento.
Tabela 8- Resultados obtidos na Precisão Intermediária Solução Padrão
Solução Absorbâncias Obtidas
Padrão 1 0.5699 Padrão 2 0.5712 Padrão 3 0.5700 Padrão 4 0.5723 Padrão 5 0.5725 Padrão 6 0.5731
Tabela 9- Resultados obtidos na Precisão Intermediária Solução Amostra
Solução Amostra Leituras Absorbâncias
Obtidas Amostra 1 Leitura 1 0.5162 Leitura 2 0.5166 Leitura 3 0.5160 Amostra 2 Leitura 1 0.5145 Leitura 2 0.5142 Leitura 3 0.5042 Amostra 3 Leitura 1 0.5140 Leitura 2 0.5136 Leitura 3 0.5149 Amostra 4 Leitura 1 0.5151 Leitura 2 0.5133 Leitura 3 0.5141 Amostra 5 Leitura 1 0.5118 Leitura 2 0.5091 Leitura 3 0.5103 Amostra 6 Leitura 1 0.5150 Leitura 2 0.5150 Leitura 3 0.5124
Fonte: Thalita Nátali
A precisão foi expressa em termos do desvio padrão relativo ou coeficiente de variação.
Obteve-se 1.21% de desvio padrão relativo para a solução amostra, e 1.25% para a solução padrão.
A metodologia em estudo, portanto apresenta resultados para precisão dentro do limite aceitável, (máximo 5.0%). Sendo que pode-se atribuir as variações encontradas na análise, à erros aleatórios.
Os erros aleatórios se manifestam na forma de pequenas variações durante as medições. São produzidos por fatores sobre os quais, o analista não tem controle, diferentemente dos erros sistemáticos que podem ser evitados ou cujas magnitudes podem ser determinadas.
Os erros sistemáticos mais frequentes são os devido a equipamentos, reagentes e erros inerentes ao método empregado.
Abaixo tem-se os quadros 5 e 6 representando a dispersão dos resultados obtidos para soluções amostra e padrão na Precisão Inter-Dia.
Quadro 5- Representação da dispersão das absorbâncias obtidas da solução Padrão de Paracetamol ( Precisão Inter-Dia )
Fonte: Thalita Nátali
0,5680 0,5730 0,5780 0,5830 0,5880 95,00 100,00 105,00 A bs orbânc ia Concentração %
Quadro 6- Representação da dispersão das absorbâncias obtidas da solução Amostra de Paracetamol ( Precisão Inter-Dia )
Fonte: Thalita Nátali
Os resultados experimentais obtidos apresentam concordância, com pequena dispersão de valores conforme demonstra os quadros 5 e 6, sendo que as dispersões apresentadas estão dentro do limite de especificação.
Confirmando-se assim a precisão da metodologia analítica, ou seja a metodologia é válida quando aplicada sobre diferentes analistas e dias diferentes.
0,5090 0,5140 0,5190 0,5240 0,5290 95,00% 100,00% 105,00% A bs orbânc ia Concentração %
3.2.6- Exatidão
Os valores obtidos referentes ao estudo da exatidão encontram-se na tabela 10.
Tabela 10- Resultados obtidos no estudo da exatidão
Solução Absorbância Padrão 1 0.5879 Padrão 2 0.5875 Padrão 3 0.5859 Padrão 80% + Placebo 1 0.4673 Padrão 80% + Placebo 2 0.4685 Padrão 80% + Placebo 3 0.4679 Padrão 100% + Placebo 1 0.5722 Padrão 100% + Placebo 2 0.5786 Padrão 100% + Placebo 3 0.5778 Padrão 120% + Placebo 1 0.6978 Padrão 120% + Placebo 2 0.6993 Padrão 120% + Placebo 3 0.6973
Fonte: Thalita Nátali
Os resultados obtidos na Tabela 10 foram avaliados em relação ao grau de recuperação, os quais estão descritos na Tabela 11 e estão representados no quadro 7.
Tabela 11-Resultados obtidos para o grau de recuperação
Solução Grau de Recuperação Padrão 80% + Placebo 99.68% Padrão 100% + Placebo 98.14% Padrão 120% + Placebo 99.09%
Fonte: Thalita Nátali
Sendo que o grau de recuperação foi determinado pela equação 10.
Quadro 7- Representação referente ao Grau de Recuperação obtido para Paracetamol DC 90
Fonte: Thalita Nátali
Conforme descrito na Tabela 11 a quantidade de substância de interesse presente no material teste que é extraída e possível de quantificação dentro do intervalo de concentração de 80% a 120% apresenta valores dentro do especificado, garantindo que a metodologia em questão é exata. 94 96 98 100 102 104 106 75,0 80,0 85,0 90,0 95,0 100,0 105,0 110,0 115,0 120,0 125,0 V a lo r E n c o n trad o ( %) Valor de Referência (%)
3.2.7- Robustez Tempo de Extração
Os valores obtidos experimentalmente estão descritos na Tabela 12 a seguir.
Tabela 12- Resultados obtidos para análise do tempo de extração
Solução Absorbância em T = 5 min Absorbância em T = 15 min Absorbância em T = 30 min Padrão 1 0.5737 0.5645 0.5703 Padrão 2 0.5750 0.5684 0.5792 Padrão 3 0.5704 0.5665 0.5789 Amostra 1 0.5366 0.5216 0.5293 Amostra 2 0.5323 0.5224 0.5287 Amostra 3 0.5303 0.5216 0.5291
Fonte: Thalita Nátali
O tempo de extração foi avaliado pelo desvio padrão relativo e grau de recuperação das soluções amostra em relação as soluções padrão em cada tempo de estudo.
É importante ressaltar que a concentração teórica da solução padrão a 100% corresponde a 0.0080mg/ml, entretanto a concentração experimental corresponde a uma amostra a 90%, fazendo-se assim necessário a correção da concentração do padrão para da amostra.
Os resultados obtidos na Tabela 12 foram avaliados em relação ao grau de recuperação e desvio padrão relativo, e estão expressos na Tabela 13.
Tabela 13- Resultados obtidos para Grau de Recuperação
Solução Desvio Padrão Relativo Grau de Recuperação
Amostra T= 05 min 0.60% 101.99%
Amostra T= 15 min 0.09% 102.36%
Amostra T= 30 min 0.06% 102.03%
Fonte: Thalita Nátali
Conforme descrito na Tabela 13 para todos os tempos em questão obteve-se um grau de recuperação dentro do especificado, ( 95% a 105%), ou seja desde o tempo 5 minutos até o
tempo de 30 minutos ocorreu uma extração eficiente da substância de interesse em relação a sua matriz.
O desvio padrão relativo encontra-se dentro do especificado ( ±2.0% ), sendo que os desvios encontrados em relação a média podem estar associados a erros aleatórios, inerentes ao processo.
Na escolha do tempo de extração deve ter como critério a praticidade do método analítico, entretanto optou-se pela escolha do tempo de extração de 15 minutos para a execução das análises, a fim de garantir a completa solubilização das soluções.
Estabilidade da Solução
Os valores obtidos experimentalmente estão descritos na Tabela 14 e 15.
Tabela 14-Resultados obtidos no estudo da estabilidade solução
Solução Absorbância T = 0 hrs Absorbância em T = 3 hrs Absorbância em T = 6 hrs Padrão 1 0.5726 0.5745 0.5769 Padrão 2 0.5765 0.5777 0.5781 Padrão 3 0.5781 0.5779 0.5782 Amostra 1 0.5126 0.5142 0.5197 Amostra 2 0.5134 0.5166 0.5170 Amostra 3 0.5119 0.5149 0.5164
Fonte: Thalita Nátali
Tabela 15- Resultados obtidos no estudo da estabilidade solução
Solução Absorbância em T = 9hrs Absorbância em T = 12 hrs Absorbância em T = 24 hrs Padrão1 0.5745 0.5768 0.5760 Padrão2 0.5766 0.5787 0.5792 Padrão3 0.5885 0.5797 0.5794 Amostra1 0.5195 0.5200 0.5193 Amostra2 0.5200 0.5191 0.5154 Amostra3 0.5219 0.5227 0.5147
Utilizou-se como critério para avaliação da estabilidade das soluções analíticas a variação das mesmas em relação ao tempo inicial, pela equação 10:
(10)
Onde;
T2: Resposta gerada no tempo posterior.
T1: Resposta gerada no tempo inicial.
100: Fator de porcentagem.
Os resultados da variação obtida para os diferentes tempos em questão estão descritos na Tabela 16.
Tabela 16- Resultados obtidos referente às variações obtidas para os tempos em análise.
Variação Tempo 0 hrs Tempo 3 hrs Tempo 6 hrs Tempo 9 hrs Tempo 12 hrs Tempo 24 hrs Padrão 0% 0.17% 0.28% 0.73% 0.47% 0.43% Amostra 0% 0.51% 0.99% 1.54% 1.56% 0.76%
Fonte: Thalita Nátali
O Quadro 8 representa as variações obtidas para as absorbâncias, dentro do limites de aceitação.
Quadro 8- Representação das variações obtidas no estudo da estabilidade das soluções.
Fonte: Thalita Nátali
O intervalo de variação das absorbâncias para solução padrão foi de 0.5745 a 0.5885, e para solução amostra 0.5119 a 0.5227.
A variação média para as soluções padrão foi 0.35% e para as soluções amostra 0.89%
Sendo que pela análise do quadro 8, foi possível verificar que as soluções amostra apresentaram maior variação que as soluções padrão, as quais não apresentaram variação maior que 0.50%.
Sendo que para as soluções amostra após o tempo de 6 horas, os resultados apresentaram maior variação, entretanto houve um declínio nesta variação no tempo de 24 horas.
A variação encontrada pode ser atribuída a erros aleatórios durante o processo de leitura das soluções, bem como ao fato de que a variação na temperatura do laboratório onde executou-se as análises durante o dia pode ter interferido nos resultados obtidos.
Portanto a metodologia apresentou-se robusta, tendo em vista que solução analítica estável pode ser compreendida como aquela que não sofre variação maior do que o intervalo compreendido entre a leitura no tempo inicial e ±2.0
Limite Superior Limite Inferior -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5 0 3 6 9 12 15 18 21 24 Var iaç ão (% ) Tempo (horas) Amostra Padrão
Sendo que a solução de hidróxido de sódio 0.01M possui estabilidade analítica confiável, até tempo de estocagem referente a 24 horas.
4- CONCLUSÃO
Devido a alta competitividade no mercado farmacêutico, o uso de metodologias validadas para a quantificação de fármacos, faz-se necessária para a garantia da qualidade, e para a garantia da eficiência da metodologia utilizada.
A metodologia para quantificação do composto Paracetamol DC 90 por espectrofotometria na região do ultra-violeta, em estudo apresentou especificidade, linearidade, intervalo, precisão, robustez e exatidão adequados a análise.
Embora a epectrofotmetria não seja muito utilizada quando faz se necessário a quantificação de um composto em presença de outos ( devido a possibilidade de não quantificar os compostos separadamente, sendo que para tais casos é indicado utilizar cromatografia líquida de alta eficiência, ou cromatografia gasosa, onde os compostos são nitidamente quantificados separadamente através dos picos cromatográficos), para o caso do Paracetamol DC 90 a metodologia é considerada válida, pois os excipientes que constituem o insumo farmacêutico não apresentam absorção significativa no comprimentode onda utilizado pela metodologia e portanto não interferem significativamente na absorção de luz da substância química de interesse.
O método portanto atende as exigências das aplicações analíticas, assegurando a obtenção de resultados confiáveis, e de credibilidade para o uso rotineiro.
Sendo portanto uma metodologia prática, e barata devido ao baixo custo com reagente, pois no caso utiliza-se apenas hidróxido de sódio e água ultra pura, além da praticidade encontrada na obtenção dos resultados devido ao pouco tempo gasto para realização da análise.
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