Micropartículas biodegradáveis contendo metotrexato para uso parenteral

Texto

(1)MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS E DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE. MICROPARTÍCULAS BIODEGRADÁVEIS CONTENDO METOTREXATO PARA USO PARENTERAL. ALICE RODRIGUES DE OLIVEIRA ARARUNA. NATAL/RN 2015.

(2) ALICE RODRIGUES DE OLIVEIRA ARARUNA. MICROPARTÍCULAS BIODEGRADÁVEIS CONTENDO METOTREXATO PARA USO PARENTERAL. Tese apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para a obtenção do título de Doutor em Ciências da Saúde.. Orientador: Prof. Dr. Arnóbio Antônio da Silva Júnior. Natal, RN 2015.

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(4) ii. MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS E DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE. Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde Prof. Dr. Eryvaldo Sócrates Tabosa do Egito.

(5) iii. ALICE RODRIGUES DE OLIVEIRA ARARUNA. MICROPARTÍCULAS BIODEGRADÁVEIS CONTENDO METOTREXATO PARA USO PARENTERAL Aprovada em: 27/11/16. BANCA EXAMINADORA Presidente da Banca Prof. Dr. Arnóbio Antônio da Silva Júnior – Universidade Federal do Rio Grande do Norte Membros Externos Prof. Dr. Eduardo Pereira de Azevedo – Universidade Potiguar Prof. Dr. Danilo Cesar Galindo Bedor – Universidade Federal do Pernambuco. Membros Internos Profª. Drª. Márcia Rodrigues Pereira – Universidade Federal do Rio Grande do Norte Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha – Universidade Federal do Rio Grande do Norte..

(6) iv. DEDICATÓRIA. Aos meus tão amados pais Eluzivan Rodrigues de Oliveira e Regina de Oliveira e ao meu irmão Rodrigo Rodrigues, que sempre acreditaram, apoiaram e investiram nos meus projetos, ao meu esposo Valdey Araruna que, mesmo com toda a distância física, me acompanhou, acreditou e sonhou junto comigo essa conquista..

(7) v. AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a Deus por ter me fortalecido diante de todas as barreiras, de estar sempre presente nos momentos mais adversos enfrentados ao longo da caminhada e por ter me abençoado com a perseverança e sabedoria necessária para eu chegar até aqui. Aos meus pais Eluzivan e Regina que sempre acreditaram nos meus planos e se fizeram presentes ao longo desses onze anos nos quais fui em busca dos meus sonhos profissionais. Ao meu esposo Valdey Araruna que teve a paciência e compreensão de esperar pelo meu tempo, respeitando minhas escolhas mesmo diante das condições em que elas nos deixavam. Ao meu orientador professor Dr. Arnóbio Antônio da Silva Júnior pelo comprometimento com todas as etapas envolvidas na realização deste trabalho, pela disponibilidade em me orientar e contribuir para minha formação acadêmica. Obrigada por todo o investimento científico que me foi proporcionado, pela confiança em mim depositada durante o tempo em que fiz parte da sua equipe de pesquisa, por repassar suas experiências como docente, orientador e profissional da saúde, por estar sempre preocupado em nos preparar para qualquer desafio. Aos professores Dr. Edson Ito e Dr. Raimundo Fernandes pelas colaborações no exame de qualificação. Aos professores Dr. Arnóbio, Dr. Mateus Fernandes e Dr. Adley Lima que não medem esforços para o crescimento do grupo de pesquisa do Laboratório de Tecnologia e Biotecnologia Farmacêutica (Tecbiofar). Ao programa de pós-graduação em Ciências da Saúde pelo excelente incentivo ao desenvolvimento da pesquisa multidisciplinar e qualidade dos cursos de pós-graduação ofertados. À professora Drª. Yêda Medeiros do Departamento de Engenharia Química da Universidade Federal do Pernambuco (UFPE) cuja colaboração foi de importância imensurável. Aos. integrantes. do. programa. de. pós-graduação. em. Ciências. Farmacêuticas da Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho”.

(8) vi. (Unesp) – Araraquara/SP em especial, à professora Drª. Rosângela Peccinini pela preciosa colaboração na etapa final desse trabalho, e por ter me dado a oportunidade de desvendar a incrível arte da pesquisa pré-clínica. Ao professor Dr. Cleverton Roberto do Departamento de Fisiologia e Patologia da Unesp/SP que me fez acreditar que sempre é possível avançar em novas áreas do conhecimento. Pelo profissionalismo e dedicação ofertados em cada etapa do processo ensino-aprendizagem e pelo tempo disponibilizado à nossa pesquisa. Aos colaboradores do instituto de Química, Física e Centro de Biociências da UFRN que sempre nos recebem e contribuem com nosso trabalho e aprendizado. A todos os laboratórios do curso de Farmácia-UFRN, assim como aos professores. responsáveis. que. trabalham. em. prol. da. ciência. e. do. conhecimento. A todos os alunos e ex-alunos de pós-graduação do Tecbiofar, em especial Karla Samara, Phillipe Mesquita, Izadora de Souza, Lilia Basílio, Polyanne Nunes, Letícia Streck e Ana Maia, pelos incontáveis momentos de descontração, ansiedade, alegrias e desafios vivenciados ao longo desses anos. Aos professores e funcionários do programa de pós-graduação em ciências da saúde que sempre estiveram aptos a exercerem suas atividades de forma a contribuir com o bom andamento do programa. A todos que compõe o quadro de funcionários do departamento de farmácia e análises clínicas e toxicológicas da UFRN, pelo acolhimento ao longo de todos esses anos na jornada vivida da graduação ao doutorado. É com muito carinho e satisfação que agradeço a essa instituição que me proporcionou um ensino de qualidade e marcou o inicio da minha vida profissional. Muito obrigada UFRN. Às agências de fomento CAPES e CNPq pelo suporte financeiro. A todos que contribuíram direta ou indiretamente para concretização deste trabalho, meus mais sinceros agradecimentos..

(9) vii. EPÍGRAFE. “Comece fazendo o que é necessário, depois o que é possível e de repente você estará fazendo o impossível” São Francisco de Assis.

(10) viii. RESUMO O metotrexato (MTX) é um fármaco utilizado na quimioterapia de alguns tipos de câncer, doenças autoimunes e uveítes não inflamatórias. Devido à sua rápida eliminação plasmática, uma estratégia para aumentar sua eficácia consiste no desenvolvimento de sistema de liberação de fármacos (SLFs). O objetivo do presente trabalho foi desenvolver micropartículas biodegradáveis e biocompatíveis a base de ácido poli-(D,L-lático-co-glicólico) (PLGA) para uso parenteral na liberação prolongada do MTX. A fim de garantir micropartículas estéreis e estáveis, o efeito da composição fármaco:polímero e da carga de radiação gama foi avaliado por diferentes técnicas de caracterização físicoquímica e ensaios biológicos. O perfil e o mecanismo de liberação in vitro do fármaco foram avaliados, assim como a atividade biológica em diferentes linhagens celulares. Na sequência, foi escolhido o sistema contendo 27% de MTX para o estudo de liberação in vivo (farmacocinética) e para o ensaio de biodegradação das micropartículas administradas via subcutânea no dorso de ratos Wistar (estudo histopatológico). Os resultados demonstraram que, depois de submetidas ao processo de esterilização por irradiação gama, as micropartículas. mantiveram. as. características. físico-químicas,. o. perfil. prolongado de liberação in vitro, a atividade biológica, assim como o alto teor de fármaco incorporado. Por meio do ensaio farmacocinético foi possível confirmar o perfil de liberação prolongada in vivo das micropartículas, à medida que foi possível quantificar o MTX no plasma dos animais durante um período seis vezes maior do que o do fármaco puro. Além disso, as micropartículas apresentaram menor oscilação quando analisadas na concentração plasmática, demonstrando. o. sucesso. pretendido. como. sistema. biodegradável. e. biocompatível para uso parenteral na liberação prolongada do metotrexato e de outros fármacos. Palavras-Chave: Micropartículas biodegradáveis, metotrexato, ácido poli-(D,Llático-co-glicólico), radiação gama, farmacocinética, liberação prolongada, biocompatibilidade, spray drying..

(11) ix. ABSTRACT Methotrexate (MTX) is a drug used in the chemotherapy of some kind of cancers, autoimmune diseases and no inflammatory uveitis. Due its rapid plasmatic elimination, a strategy to increase the efficacy concerned in the development of drug delivery system (DDS). The purpose of this study was to develop biodegradable and biocompatible poly-(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) microparticles for parenteral use in the prolonged release of MTX. In order to ensure sterile and stable microparticles, the effect of compositions drug:polymer and of gamma irradiation dose was evaluated by different techniques of physicochemical characterization and the biological assay. It’s was evaluated the profile and release mechanism in vitro of drug, as well as, the activity biological in different cell lines. Then, it was chosen the system containing 27% of MTX to study in vivo release (pharmacokinetic) and assay of biodegradation of. microparticles. after. subcutaneous. administration. in. Wistar. rats. (histopathologic study). The results showed that, after subjected to sterilization by gamma irradiation process, the microparticles maintained physicochemical characteristics, prolonged release profile in vitro, the biological activity, and high drug loading. Through pharmacokinetic assay, it was possible to confirm the in vivo sustained release profile of microparticles once it was possible to quantify the MTX in the plasma of animals for a period six times higher than of the pure drug administration. Furthermore, the microparticles showed lower oscillation plasmatic demonstrating the success of biodegradable and biocompatible systems for parenteral use in the sustained liberation of methotrexate and of other drugs. Keywords: Biodegradable microparticles, metothexate, poly-(D,L-lactideco-glycolide),. gamma. irradiation,. biocompatibility, spray drying.. pharmacokinetic,. sustained. release,.

(12) x. LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AME – Agência de Medicina Europeia ANOVA – Análise de Variância ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária ASC – Área Sob a Curva ASMC – Área Sob o primeiro Momento da Curva CEUA – Comissão de Ética no Uso de Animais Cl – Clearence CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência CLUE – Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência Co60 – Cobalto 60 COBEA – Colégio Brasileiro de Experimentação Animal CQA – Controle de Qualidade Alto CQB – Controle de Qualidade Baixo CQD – Controle de Qualidade Diluído CQM – Controle de Qualidade Médio CV – Coeficiente de Variação D – Dose DHFR – Diidrofolato Redutase FDA – Food and Drug Administration HE – Hematoxilina-Eosina Kel – Constante de Eliminação LD – Limite de Detecção LIQ – Limite Inferior de Quantificação Mo – Micropartículas MRT – Tempo Médio de Permanência MTX – Metotrexato PI – Padrão Interno PLGA – Ácido Poli-(DL-lático-co-glicólico) SLFs – Sistemas de Liberação de Fármacos t1/2 – Meia Vida de Eliminação.

(13) xi. UV-Vis – Ultravioleta-Visível Vd – Volume de distribuição.

(14) xii. LISTA DE FIGURAS Figura 1. Representação esquemática da molécula de metotrexato. Figura 2. Representação do aparelho de Spray drying e do processo de obtenção das micropartículas. Figura 3. Representação esquemática da estrutura do PLGA e seus monômeros ácido glicólico e ácido lático..

(15) xiii. SUMÁRIO 1. Introdução........................................................................................ 15. 2. Justificativa ..................................................................................... 20. 3. Objetivos ......................................................................................... 21. 3.1 Objetivo geral................................................................................... 21. 3.2 Objetivos específicos ..................................................................... 21. 4. Métodos ......................................................................................... 22. 4.1 Validação da metodologia bioanalítica cromatografia líquida de ultra eficiência para ensaio farmacocinético ............................................. 22. 4.1.1 Equipamentos e condições cromatográficas….......................... 22. 4.1.2 Procedimentos de validação ……………………..……………..... 23. 4.2 Estudo farmacocinético para determinação do perfil de liberação in vivo do fármaco a partir das micropartículas ........................................ 26. 4.2.1 Animais ……………………………………………………….…….. 26. 4.2.2 Estudo farmacocinético …........…………………………………... 26. 4.3 Estudo histopatológico de biocompatibilidade e biodegradação in vitro das micropartículas de PLGA contendo metotrexato ...................... 29. 4.4 Análise estatística .................................................................……. 30. 5. Artigos produzidos ……………………………………………....…... 31. 5.1 Artigos relacionados à tese …………………………………………. 31. 5.1.1 HPLC-DAD and UV-Vis Spectrophotometric Methods for Methotrexate Assay in Different Biodegradable Microparticles …….. 5.1.2. Biocompatibility. and. biological. efficacy. of. 32. prolonged. methotrexate release from gamma-irradiated sterilized spray dried microparticles……………………………………………………………….. 47. 5.1.3 Preclinical pharmacokinetics and biocompatibility study after subcutaneous. administration. of. methotrexate-loaded. PLGA. microparticles………………………………………………………………... 92. 5.2 Outras contribuições …………………………………………………... 129. 5.2.1 Publicados ……………………………………………………………. 129. 5.2.2 Submetido …………………………………………………………..... 130.

(16) xiv. 5.2.3 Em edição …………………………………………………………..... 130. 6. Comentários, críticas e sugestões …………………………………... 131. 7. Referências ……………………………………………………………... 133. 8. Anexos……………………………………………………………………. 141.

(17) 15. 1. INTRODUÇÃO O desenvolvimento de novos sistemas de liberação de fármacos (SLFs) vem ganhando muita atenção nos últimos anos. Estes sistemas possuem a capacidade de direcionamento do fármaco ao local de ação por período de tempo prolongado, o que minimiza as limitações de fármacos com rápida eliminação plasmática. A administração de SLFs normalmente requer menor frequência quando comparadas às formas farmacêuticas convencionais, o que aumenta a adesão do paciente ao tratamento e reduz as oscilações na concentração sanguínea do fármaco, evitando níveis subterapêuticos ou tóxicos, garantindo assim maior eficácia terapêutica (1-3). O metotrexato (MTX) (Figura 1) é um análogo do ácido fólico que atua inibindo a atividade da enzima diidrofolato redutade (DHFR) no citosol das células, suprimindo assim os precursores pirimidina e purina, e inibindo a replicação do DNA e a proliferação celular (4). Na terapia antitumoral, é amplamente utilizado no tratamento de leucemia linfoide aguda (5), linfoma não-Hodgkin’s, câncer de cabeça e pescoço, bexiga, osteosarcoma e coriocarcinoma (6-8). Outras aplicações terapêuticas incluem o tratamento de doenças autoimunes como psoríase e artrite reumatoide (9, 10) doença de Crohn’s (11) e uveite não inflamatória resistente a corticosteroides (12). O potencial problema associado ao tratamento com o MTX convencional está no seu tempo de eliminação plasmática (1,5 – 3,5 horas) (13) o que requer repetidas doses para manutenção da concentração plasmática em nível terapêutico levando a desvantagens tais como aumento dos efeitos adversos, flutuação na concentração plasmática e falha no tratamento. Esses inconvenientes podem ser minimizados pelo desenvolvimento dos SLFs capazes de promover a liberação prolongada do fármaco (14). Vários SLFs têm sido desenvolvidos com o objetivo de proporcionar melhores condições terapêuticas do fármaco especificamente nos tecidos atingidos pelo câncer. Estes sistemas de liberação incluem as microemulsões (15, 16), micelas poliméricas (17-19), lipossomas (20-22) e as nano e micropartículas (23-27)..

(18) 16. Em relação ao MTX, diferentes SLFs têm sido propostos, como por exemplo, sistemas lipossomais contendo MTX (28) para administração pulmonar, MTX ligado a micelas poliméricas (29) e nanogéis de quitosana contendo MTX para aumentar a concentração do fármaco em nível cerebral (30). Em todos esses trabalhos foram confirmada, ora melhora no desempenho farmacocinético, ora diminuição dos efeitos adversos, o que confirmam as vantagens inerentes ao desenvolvimento de sistemas de liberação.. Figura 1. Representação esquemática da molécula do metotrexato. Entre os SLFs desenvolvidos para ação prolongada, as nano e as micropartículas (Mo) têm sido bastante utilizadas devido às diversas vantagens apresentadas tais como flexibilidade de dose de acordo com as necessidades clínicas, uso de várias vias de administração e possiblidade de controle da velocidade de liberação de acordo com o tamanho de partículas, composição ou tipo de polímero utilizado (23, 27-31). Vale ressaltar, no entanto, que as micropartículas garantem maior teor de fármaco incorporado no sistema quando comparadas às nanopartículas, o que representa um critério a ser considerado de acordo com a dose de fármaco necessária para efetuar um tratamento. As Mo são partículas sólidas com diâmetro entre 1 a 1000 µm, constituídas por uma estrutura polimérica que pode se apresentar em duas formas dimensionais: as microcápsulas, na qual um fármaco sólido, líquido ou gasoso pode estar encapsulado (sistema reservatório) no interior da barreira polimérica; e as microesferas em que o fármaco pode está adsorvido, disperso ou quimicamente ligado na matriz polimérica (32-34)..

(19) 17. Entre os diferentes métodos de preparação de Mo, a secagem por atomização em aparelho de “spray dryer” (spray drying) (Figura 2) está consolidado como método de microencapsulação por ser um método de única etapa, garantir produção contínua, fácil adaptação para escala industrial, alta eficiência de encapsulação, forma esférica, uniformidade na taxa de liberação do fármaco e total evaporação do solvente orgânico (35-38). Além disso, este método garante a produção de micropartículas pequenas na faixa de 1-5 µm, garantindo o seu uso parenteral e pulmonar, além de outras vias nas quais o tamanho de partículas é um fator limitante.. Figura 2. Representação do aparelho de Spray drying e do processo de obtenção das micropartículas (39). A microencapsulação por spray drying consiste na dispersão do material em uma solução ou dispersão polimérica, a qual é atomizada e entra em contato com uma corrente de ar aquecido na câmara de secagem. Em seguida ocorre evaporação do solvente e formação das partículas, as quais são separadas do gás de secagem por dispositivo adequando e recolhidas no coletor (39,40). A. escolha. do. material. de. revestimento. (polímero). decide. as. características físico-químicas das micropartículas resultantes. É ideal que o.

(20) 18. material polimérico seja biocompatível, biodegradável, não tóxico, de fácil acesso e baixo custo (40). Nesse contexto, o ácido poli-(DL-lático-co-glicólico) (PLGA) (Figura 3) tem seu uso consolidado, o qual já é aprovado pelo Food and Drug Administration (FDA) e Agência de Medicina Europeia (AME) para concepção de SLFs de uso parenteral. Uma vez que seus dois monômeros (ácido lático e ácido glicólico) são metabolizados pelo corpo via ciclo de Krebs, seus produtos de degradação são compatíveis causando o mínimo de toxicidade sistêmica (41-43).. Figura 3. Representação esquemática da estrutura do PLGA e seus monômeros ácido lático e ácido glicólico. A liberação do fármaco da matriz de micropartículas geralmente é associada a um efeito “burst” inicial caracterizado pela liberação do fármaco presente na superfície da partícula, seguida pela liberação sustentada proveniente da degradação do polímero e consequente liberação do fármaco encapsulado (44). Dessa forma, o desenho experimental da cinética de liberação desejada para o fármaco requer o conhecimento das propriedades físico-químicas do sistema que, consequentemente, determina o tipo e mecanismo de liberação. A investigação dessas propriedades envolve um trabalho multidisciplinar, sendo necessário acessar diversas áreas tais como as ciências farmacêuticas, médicas, biológicas, físicas, químicas e de materiais. Uma vez caracterizado e identificado o mecanismo de liberação, é importante.

(21) 19. seguir para os estudos farmacocinéticos in vivo e identificar as adequações necessárias para aplicação clínica (45). Alguns sistemas de liberação controlada utilizando PLGA já estão disponívies para o tratamento do câncer. Alguns exemplos desses sistemas disponíveis no mercado são: o Zoladex®, que consiste em um implante de PLGA contendo gosserrelina, um análogo sintético da LHRH (Hormônio Liberador do Horônio Luteinizante) utilizado no tratamento do câncer de próstata; o Lupron Depot® (acetato de leuprorida), Suprecur® MP (acetato de buserelina), Decapeptyl® e Trelstar Tm depot (pamoato de triptorelina) também desenvolvidos para tratamento de câncer de próstata (46); e Depocyte ®, sistema polimérico para liberação controlada da citarabina no tratamento de leucemias. Alguns trabalhos realizados por nosso grupo de pesquisa a base de micropartículas de PLGA obtidas por “spray drying” também apresentaram resultados promissores em relação à biocompatibilidade e sucesso na liberação prolongada intra-ocular do ciprofloxacino (31,47) e da triancinolona (31,48).. Esses. outros. trabalhos. permitiram. avaliar. o. potencial. das. micropartículas biodegradáveis produzidas por “spray drying” também para a liberação prolongada do metotrexato (26,27). Esses resultados estabeleceram uma base científica importante para o desenvolvimento de um sistema microparticulado contendo metotrexato para proporcionar a liberação de doses eficazes do fármaco por período de tempo prolongado, levando assim à diminuição dos efeitos adversos e aumento da eficácia terapêutica do fármaco..

(22) 20. 2. JUSTIFICATIVA Entre os principais fatores limitantes no tratamento farmacológico de algumas doenças, principalmente os tumores sólidos, está a necessidade de se alcançar. e. manter. concentrações. eficazes. e. seguras. do. fármaco. especificamente nos tecidos afetados. Esse fato levou à extensa busca do desenvolvimento de sistemas de liberação para quimioterápicos existentes no mercado. (15,16,49,50). que. permitam. maior. eficácia. e. presença. da. concentração do fármaco por tempo prolongado. Alguns quimioterápicos, como o metotrexato, possuem meia vida de eliminação reduzida o que requer administração de doses repetidas e/ou elevadas. O uso de sistemas de liberação prolongada pode minimizar essas limitações maximizando a eficácia do tratamento e diminuindo os efeitos adversos. Diante disso, tem-se que o desenvolvimento de micropartículas biodegradáveis de PLGA para liberação prolongada do metotrexato, vem a ser um estudo de extrema relevância para o tratamento quimioterápico de diversos tumores sólidos..

(23) 21. 3. OBJETIVOS 3.1 Objetivo Geral Obtenção, pelo método spray drying, de um sistema microparticulado, biodegradável e biocompatível para liberação prolongada do metotrexato para uso parenteral. 3.2 Objetivos Específicos . Preparar micropartículas de PLGA contendo metotrexato pela técnica de secagem por aspersão – spray drying;. . Desenvolvimento. e. validação. de. metodologias. analíticas. por. Cromatografia Líquida de alta Eficiência (CLAE) e Espectrofotometria Ultravioleta – Visível (UV- Vis); . Estudo do efeito da carga de radiação gama e da composição fármaco:polímero na estabilidade, características estruturais do sistema e liberação in vitro do fármaco a partir das micropartículas de PLGA;. . Estudo da biocompatibilidade e atividade biológica in vitro dos sistemas microparticulados em diferentes linhagens celulares (tumoral e não tumoral);. . Desenvolvimento e validação da metodologia bioanalítica empregando Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência (CLUE) para análise quantitativa do metotrexato em amostras biológicas;. . Estudo do perfil de liberação in vivo do fármaco a partir das micropartículas de PLGA contendo metotrexato após administração subcutânea em ratos Wistar;. . Estudo histopatológico de biocompatibilidade e biodegradação das micropartículas de PLGA contendo metotrexato após administração subcutânea em ratos Wistar..

(24) 22. 4. MÉTODOS As metodologias utilizadas na obtenção das micropartículas de PLGA contendo metotrexato, caracterização físico-química antes e após submissão ao processo de irradiação gama e estudos de biocompatibilidade e atividade biológica estão descritas no artigo “Biocompatibility and biological efficacy of prolonged methotrexate release from gamma irradiated sterilized spray dried microparticles” – seção 5.1.2. Para os ensaios de teor de fármaco e liberação in vitro foram validadas as metodologias Cromatografia Líquida de Alta Eficiência e Espectrofotometria UV-Visível. Esta parte experimental foi publicada com o título: HPLC-DAD and UV-Vis Spectrophotometric Methods for Methotrexate Assay in Different Biodegradable Microparticles, J. Braz. Chem. Soc., Vol. 26, No. 4, 649-659, 2015 (http://dx.doi.org/10.5935/0103-5053.20150022).. 4.1 Validação da metodologia bioanalítica Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência para ensaio farmacocinético 4.1.1 Equipamentos e condições cromatográficas As análises foram conduzidas utilizando um Waters® Acquity CLUE equipado com bomba quaternária e detector UV-Visível. Um método isocrático foi desenvolvido usando coluna analítica CSHTM C18, com carga de carbono 15%, dimensões 2,1 mm x 100 mm e diâmetro de partícula de 1,7 µm, Acquity, protegida com pré-coluna CSHTM C18 e mantidas a 60 ºC durante as análises. A fase móvel foi água ácida (ácido fórmico) 0,2%:metanol (JT Backer) (85:15, v/v). Os componentes da fase móvel foram previamente filtrados em membranas 0,22 µm x 47 mm (Millipore – Merk), seguidos de desgaseificação em banho de ultra-som (Ultrasonic Cleaner – Odontobrás) por 15 minutos. O fluxo selecionado foi de 0,3 mL/min e 1 µL da amostra foi injetada no sistema cromatográfico . A razão entre a área do analito e do padrão interno (PI – 4’para-aminoacetofenona) foi usada para a construção da curva de calibração.

(25) 23. e quantificação da amostra na matriz biológica (plasma de ratos) utilizando detector UV-visível. 4.1.2 Procedimentos de validação A validação da metodologia empregando o CLUE para posterior aplicação nos estudos farmacocinéticos do MTX envolveu os procedimentos necessários para garantir, por meio de estudos experimentais, que o método atendesse às exigências das aplicações analíticas assegurando confiabilidade dos resultados segundo as normas estabelecidas pela ANVISA [51] e a RDC nº 27, de 17 de dezembro de 2012 [52]. Para tanto, o método desenvolvido deve apresentar especificidade, linearidade, limite inferior de quantificação (LIQ), precisão e exatidão intra e intercorridas, efeito residual, recuperação e ensaios de estabilidade. Curva de calibração Para construção da curva de calibração foram preparadas soluções estoques do MTX e do PI (Aldrich, Sigma) na concentração de 100 μg/mL em solução de ácido acético 5% e acetonitrila PA (JK Backer) respectivamente. Diferentes alíquotas da solução de MTX foram transferidas para microtubos de 1 mL onde adicionou-se 5 μL de PI e o volume foi completado com matriz biológica (plasma) a fim de obter soluções com concentração na faixa de 0,078 – 2,5 μg/mL. 50 μL de cada amostra foi desproteinizada pela adição de 50 μL da solução de ácido perclórico 10% (Merk), agitadas em vórtex por 30 segundos e centrifugadas sob refrigeração a 14000 G por 10 minutos. Após ultra centrifugação (Thermo Scientific), o sobrenadante foi filtrado em membrana 0,22 µm x 13 mm (Allcrom) em vial “maximum recovery” e injetado no sistema CLUE equilibrado em triplicata. A curva de calibração e equação de regressão linear foi obtida pela razão da área determinada para o MTX pela área do PI versus a concentração do MTX (regressão pelo método dos míninos quadrados). Especificidade.

(26) 24. Este parâmetro foi analisado comparando os cromatogramas obtidos da matriz biológica com aqueles obtidos da matriz biológica adicionada de fármaco e padrão interno. A resposta de picos interferentes no tempo de retenção do fármaco deve ser inferior a 20% da resposta do LIQ e, no caso do padrão interno, inferior a 5% da concentração utilizada. Linearidade O método é considerado linear até a maior concentração analisada apresentar coeficiente de variação (CV) menor que 15%. O coeficiente de correlação linear deve ser igual ou superior a 0,98. A linearidade foi observada a partir do coeficiente de correlação (r) obtido da curva analítica. Limite Inferior de Quantificação (LIQ) Este ensaio foi realizado analisando cinco amostras de concentrações decrescentes do analito até o menor nível quantificável com precisão e exatidão dentro da especificação. Precisão e exatidão A precisão intracorrida (determinada em uma mesma corrida) e intercorrida (determinada em três corridas diferentes) foi investigada avaliando o coeficiente de variação de cinco replicadas obtido em cinco níveis de diferentes concentrações do analito: LIQ (0,078 µg/mL), CQB - Controle de Qualidade Baixo (0,156 µg/mL), CQM - Controle de Qualidade Médio (1,25 µg/mL), CQD – Controle de Qualidade Diluído 10 µg/mL (o qual foi diluído para 1 µg/mL) e CQA – Controle de Qualidade Alto (2 µg/mL). Os critérios de aceitação não admitem valores superiores a 15% (quinze por cento), exceto para o LIQ, o qual se admite valores menores ou iguais a 20%. A exatidão foi calculada de acordo com os resultados obtidos entre a razão da concentração analítica pela concentração teórica, multiplicada por 100. Recuperação.

(27) 25. A eficiência do procedimento de extração selecionado para o analito e PI foi observada pelo o cálculo da recuperação, comparando-se os resultados analíticos de amostras extraídas a partir de três concentrações (baixa, média e alta) do padrão extraído e não extraído, tanto para o analito quanto para o PI. Efeito Residual O Efeito residual representa o aparecimento ou aumento do sinal do analito ou PI causado por contaminação proveniente de amostras analisadas anteriormente. Para avaliação desse parâmetro, foi injetado três vezes a mesma amostra branco, sendo uma antes e duas logo após a injeção de uma amostra processada a 2,5 µg/mL. Como critério de aceitação, as respostas de picos interferentes no tempo de retenção do analito e do PI devem ser inferiores a 20% da resposta do analito nas amostras processadas do LIQ e inferiores a 5% da resposta do PI respectivamente. Estabilidade A estabilidade do analito na matriz biológica foi avaliada em triplicata para as amostras CQB e CQA por meio dos seguintes estudos: Estabilidade após ciclos de congelamento e descongelamento – As amostras foram armazenadas à – 20 ºC e mantidas por doze horas sendo posteriormente descongeladas à temperatura ambiente. O ciclo gelo/desgelo foi realizado três vezes; Estabilidade de curta duração – As amostras foram preparadas e analisadas após permanecerem a temperatura ambiente por tempo superior ao que as amostras são mantidas durante tempo de análise. Estabilidade de longa duração – As amostras foram preparadas e analisadas após serem armazenadas por período de 30 dias garantindo a excelência do intervalo de tempo compreendido entre a coleta da primeira amostra em estudo e análise da última. Estabilidade pós-processamento – As amostras foram preparadas e mantidas sob as mesmas condições de análise das amostras em estudos no.

(28) 26. tempo superior compreendido entre o término de preparo das amostras e o final da corrida analítica mais longa. 4.2 Estudo farmacocinético para determinação do perfil de liberação in vivo do fármaco a partir das micropartículas 4.2.1 Animais Ratos machos adultos (112 animais) da espécie Rattus novergicus, da raça Wistar, pesando cerca de 200 e 250g, da mesma linhagem, obtidos do Biotério de Central de Botucatu – SP foram separados, randomicamente, para os estudos de avaliação do perfil farmacocinético e estudo de biodegradação. Os animais foram alojados em caixas plásticas de polipropileno, com tampa de metal medindo 40 x 50 x 20 cm, por um período não inferior a cinco dias antes de serem colocados nas diferentes situações experimentais e mantidos em sala sob climatização e exaustão do ar, num ciclo de 12 horas de claro/escuro. Água e ração (Labina® - Purina) foram oferecidas ad libitum durante todo o procedimento experimental. O projeto de pesquisa foi submetido na Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (CEUA – UNESP) e aprovado sob Protocolo nº 44/2014. A metodologia empregada obedeceu às diretrizes do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e normas descritas na Lei nº 11.794/2008 (República Federativa do Brasil). 4.2.2 Estudo farmacocinético Cálculo do número amostral para o estudo farmacocinético Durante a etapa de planejamento, é importante definir o número de animais necessários para obter resultados conclusivos baseados no poder do teste desejado (geralmente, 80%). Para responder a essa questão, a metodologia comumente utilizada está em escolher o número amostral adequado por meio do cálculo da função do poder do teste que pode ser obtido.

(29) 27. pela estimativa do coeficiente de variação presente na literatura ou de um estudo piloto [53]. Para o estudo do perfil farmacocinético, o cálculo do número amostral foi realizado de acordo com a seguinte equação, selecionando o parâmetro de maior variabilidade de um trabalho na literatura de Singh e Udupa [54] o qual apresenta perfil similar ao deste estudo:. N  [t (a,2n  2)  t ((1  b) / 2,2n  2)]2 .(CV / 20) 2. Eq.1. Onde: a = nível de significância; b = poder do teste; e CV = coeficiente de variação. Parâmetro: Tempo Médio de Permanência - MRT (das micropartículas de PLGA contendo metotrexato) CV = 13,10% N usado no estudo = 40 N ≥ [t(a,2n-2) + t(1-b)/2, 2n-2)]2 x (CV/20)2 N ≥ [t(0,05;78) + t(1-0,8/2; 78)]2 x (13,10/20)2 N ≥ [ 2,000 + 1,671]2 x 0,43 N ≥ 13,476 x 0,43 N ≥ 5,79 Aproximando o valor para 6 e fazendo a iteração: N ≥ [t(0,05; 10) + t(1-0,8/2; 10)]2 x (13,10/20)2 N ≥ [ 2,228 + 1,812]2 x 0,43 N ≥ 16,32 x 0,43 N ≥ 7,02 De acordo com o cálculo amostral o valor de n deverá ser maior ou igual a 8 para apresentar um nível de confiança maior que 80%. Uma vez que serão necessários dois grupos, o número amostral para o estudo farmacocinético totalizam 16 animais. Administração do fármaco e do sistema estudado O estudo farmacocinético foi dividido em dois grupos. O grupo 1 recebeu a injeção subcutânea de MTX na dose de 5 mg/kg dispersas em 1,2 mL.

(30) 28. solução de pluronic P68 (BASF) 10%. O grupo 2 recebeu as micropartículas de PLGA contendo MTX com dose correspondente a 10 mg/kg do fármaco utilizando o mesmo veículo e procedimento de administração. Determinação do fármaco no plasma Em períodos de tempo de quatro horas e meia (com intervalo de meia hora) para o fármaco e de vinte quatro horas (com intervalo de uma hora) para o sistema, foram coletados 100 µL de sangue misto pela calda do animal em microtubo heparinizado, centrifugado a 2100 G durante 5 minutos. Após separação, o plasma foi imediatamente congelado a – 20 ºC para posterior determinação da concentração de fármaco por CLUE seguindo os mesmos parâmetros de análise preconizados durante o processo de validação do método assim como o mesmo método de extração da amostra (precipitação proteica com ácido perclórico a 10%). Parâmetros farmacocinéticos Durante o presente estudo foi aplicado, para o fármaco isolado, o modelo fisiológico na análise das curvas de concentração atingida no plasma versus tempo. A área sob a curva (ASC∞) foi calculada utilizando o método dos trapézios e extrapolada para o infinito com auxílio das seguintes equações: n  C1  C(i l )  ASC 0t    .(t (i l )  ti ) 2 i l  . n  C1  C(i l )  C ASC 0inf    .(t(i l )  ti )  n 2 i l   kel. Eq.2. Eq.3. Onde: Cn= concentração identificada no último ponto do gráfico de concentração vs. tempo. Kel= Constante de eliminação.

(31) 29. A área sob o primeiro momento da curva (ASMC∞) foi calculada utilizando o método dos trapézios e extrapolada para o infinito com auxílio das equações abaixo: n l  t i .Ci  ti l .C(i l )  C t .C ASMC 0inf    .(t (i l )  ti )  n2  n n 2 kel i l   kel. Eq. 4. O MRT do fármaco foi calculado com auxílio da equação 5.. MRT . ASMC0inf ASC0inf. Eq.5. A constante de eliminação (kel) do fármaco foi estimada como a inclinação obtida pela regressão linear da concentração atingida nos líquidos plasmáticos versus tempo. A meia vida eliminação (t1/2) foi calculada pela relação ln2/kel, enquanto o clearance (Cl) foi determinado pela relação D/ASC0∞ onde D representa a dose administrada. O volume de distribuição (Vd) do fármaco será calculado com o auxílio da equação Vd = Cl/Kel 4.3 Estudo histopatológico de biocompatibilidade e biodegradação in vivo das micropartículas de PLGA contendo metotrexato A avaliação histológica da pele dos animais, na região onde foi administrado o fármaco e as micropartículas, foi realizada após remoção da mesma para o estudo hispotatológico e de biodegradação. Os animais foram dividicos em quatro grupos (grupo MTX; grupo Mo 27% m/m; grupo Mo PLGA isenta de MTX e grupo Pluronic P-68 10%). Cada grupo foi composto de 24 animais divididos em quatro tempo de análises (3, 30, 60 e 90 dias n = 6 animais/tempo). O grupo Pluronic P-68 foi considerado grupo controle devido ter sido usado como veículo na administração de todas as amostras nos diferentes grupos. Os tecidos dos animais foram coletados ao final de cada tempo de estudo, após eutanásia dos mesmos por exposição ao CO 2. As amostras.

(32) 30. removidas foram fixadas em formol (10%v/v) seguido de processamento para imersão em parafina. Para o estudo histológico, foram retirados cortes de 5 µm dos blocos de parafina contendo o tecido dos animais, seguido de coloração pelo método de hematoxilina-eosina (HE). As análises histológicas foram realizadas usando microscópio Leica® modelo DM 2500. Nessa fase do estudo, as seguindes alterações foram consideradas: Inflamação – aguda, crônica ou mista; Intensidade – ausente (0), leve (1), moderado (2), forte (3); Preservação dos anexos cutâneos; Integridade do tecido muscular e presença de material exógeno (Mo PLGA). 4.4 Análise estatística Os resultados foram representados como média ± desvio padrão e coeficiente de variação (%). As análises estatísticas foram realizadas usando o software GraphPad Prism versão 5,0. Inicialmente, foi realizado teste de normalidade seguido de teste t-Student para comparação de dois grupos. Comparações de múltiplos grupos e múltiplas comparações foram realizadas pela Análise de Variância (ANOVA), seguidas de Tukey-Kramer. Foram considerados como significativamente diferentes os valores com p ˂ 0,05..

(33) 31. 5. ARTIGOS PRODUZIDOS 5.1. Artigos relacionados à Tese 5.1.1 O artigo HPLC-DAD and UV-Vis Spectrophotometric Methods for Methotrexate Assay in Different Biodegradable Microparticles foi publicado no periódico Journal of Brazilizan Chemical Society, v.26, p. 649 – 659, 2015, Qualis B2 da CAPES para área Medicina II. 5.1.2 O artigo Biocompatibility and Biological Efficacy of Prolonged Released Methorexate from Gamma irradiated Sterilized Spray Dried Microparticles será submetido para publicação no periódico Journal of Controlled Release, Qualis AI para Medicina II. 5.1.3 O artigo Preclinical Pharmacokinetics and Biocompatibility Study After. Subcutaneous. Microparticles. será. Administration submetido. para. Biomaterialia, Qualis AI para Medicina II.. of. Methotrexate-loaded. publicação. no. periódico. PLGA Acta.

(34) 32. 5.1.1. Article http://dx.doi.org/10.5935/0103 -5053.20150022 J. Braz. Chem. Soc., Vol. 26, No. 4, 649-659, 2015. Sociedade Brasileira de Química Printed in Brazil - ©2015. HPLC-DAD and UV-Vis Spectrophotometric Methods for Methotrexate Assay in Different Biodegradable Microparticles. Alice R. Oliveira, Lilia B. Caland, Edilene G. Oliveira, Eryvaldo S. T. Egito, Matheus F. F. Pedrosa and Arnóbio A. Silva Júnior*. Departamento de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 59072-570 Natal-RN, Brazil. The challenge of the present work concerned the development and validation of high performance liquid chromatography (HPLC) and UV-Vis spectrophotometric methods for quantitation of methotrexate (MTX) loaded on biodegradable microparticles, composed of copolymers with different solubilities such as chitosan and poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA). The linearity of the analytical curves for MTX were > 0.999 (r2) and the limits of detection (LOD) were 0.014 µg mL-1 and 0.060 µg mL-1 for HPLC and UV-Vis spectrophotometric method, respectively. In addition, both methods were specifi robust, and accurate with a recovery between 89.5% and 105.5%. The method showed precision with relative standard deviations lower than 3.39% for HPLC and 2.90% for UV-Vis spectrophotometry. Statistical analysis revealed that both methods provide equivalent results, and also can be used for quality control of MTX-loaded in drug delivery systems.. Keywords: HPLC-DAD, UV-Vis spectrophotometry, validation, methotrexate, biodegradable microparticles.

(35) 33. Introduction Methotrexate (MTX) (2S)-2-[[4-[(2,4-diaminopteridin6-yl)methylmethylamino]benzoyl]amino]pentanedioic acid (Figure 1a) is a well-known anticancer drug used in the chemotherapy of several malignant diseases, such as acute lymphocytic leukemia, osteosarcoma, breast and bladder cancers, and also several lymphomas and carcinomas.1-3 In addition, MTX is an analog of the folic acid that can be used at lower doses as anti-inflammatory and immunosuppressant drug, mainly for the treatment of psoriasis and steroid-refractory uveitis.4,5 However, some physicochemical and pharmacokinetic properties limit its therapeutic success. Due to its rapid renal clearance (t1/2 = 1.5-3.5 h), the short time of drug exposure in the target tissue, high and repeated doses are required for treatment and may cause severe side effects such as bone marrow depression, ulcerative colitis, hepatotoxicity, and nephrotoxicity.6-8 One strategy to minimize the clinical limitations presented by MTX concerns in the development of drug delivery systems, such as micro and nanoparticles.9,10 In fact, micro and nanoparticles have been used to prolong the release of different kinds of drugs, including antimicrobial, chemotherapy, and anti-inflammaty agents. 11-15 Polymeric microparticles are solid particles with a diameter range of 1 to 1000 µm, constituted by a polymeric network structured in two dimensional forms. The microcapsules, in which a solid, liquid, or gaseous drugs core is encapsulated into a polymeric barrier, are quite different from microspheres which drugs may be absorbed, dispersed, or chemically bonded in a polymeric matrix.11,12,16,17 Among the plethora of polymers used to produce microparticles, chitosan (CH) (Figure 1b), and poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) (Figure 1c) are the most applied copolymers used for this purpose. CH is a natural hydrophilic and water soluble polysaccharide copolymer composed of randomly distributed -(1-4)-linked D-glucosamine (deacetylated unit) and N-acetyl-D-glucosamine (acetylated unit), which is widely used in the food industry. This copolymer is obtained mainly by treatment of the shrimp and other crustacean shells with aqueous solution of sodium hydroxide. On the other hand, PLGA is a synthetic hydrophobic and water insoluble copolymer of lactic and glycolic acid, which has been used since the 70’s as suture for wounds. This copolymer is also approved by the Food and Drug Administration (FDA) for the development of parenteral drug delivery systems in the pharmaceutical industry.. *e-mail: arnobiosilva@gmail.com.

(36) 34. Several advantages concerning both biocompatible and biodegradable polymeric microparticles for prolonging the drug delivery have been well established in previous studies. 18-24 However, the evaluation of the drug content inside such kind of drug delivery systems became a challenge for researchers. Specifically for MTX loaded on microparticles, an optimization of the analytical technique became mandatory.. Figure 1. Schematic representation of the chemical structure of MTX (a), CH (b) and PLGA with their possible monomers (glycolic and lactic acid) (c).. Different methods have been described for MTX quantification. However, most of those methods were developed for bioanalytical purposes. For biological fluids Nagulu et al.25 developed a simple and fast method for determination of MTX using high performance liquid chromatography (HPLC) with UV-Vis spectrometry and liquid-liquid extraction. However, a satisfactory quantifive limit for routine monitoring of the drug in serum only was achieved after the administration of high doses. Turci et al.,26 described an HPLC method using mass spectrometry detection and solid phase extraction (SPE). Although more complex, this method revealed to be more sensitive and, moreover, able to quantify trace levels of MTX in human urine. Zhu et al.,27 developed an ion chromatography method with highly sensitive electrochemical detection and rapid execution, enabling commercial MTX quantification in biological samples. Suzuki et al.,28 applied the immunoassay of MTX by capillary electrophoresis and although the use of a sophisticated apparatus, they were able to detect the drug at the pg (picogram) range. Hence, as it can be observed, all the reported methods were validated for the analysis of MTX on specific matrices. The United States Pharmacopoeia (USP) as well as the Portuguese Pharmacopoeia established an assay for MTX in tablets by HPLC.29,30 However, the Brazilian Pharmacopoeia did not describe such analytical procedure.31 During drug formulation development, sensitive and simple analytical methods such as HPLC and UV-Vis spectrophotometry should be well validated in order to assess drug loading as well as possible interaction among their components.32-36 HPLC methods are widely employed in quality control for assessment of drugs because of their sensitivity, repeatability, and specific . On the other hand, the use of spectroscopic techniques can be considered direct, fast, simple, and a less expensive alternative.37,38 The aim of this study was to develop, validate, and compare two analytical methods to quantify MTX. The final goal was to optimize a method not only with high sensitivity and specifi , but also with high precision and accuracy at low concentration of MTX. The method was conceived to be applied to different drug-loaded microparticles composed of water soluble (CH) or water insoluble (PLGA) copolymers.. Experimental Chemicals and reagents. Methotrexate was purchased from DEG (São Paulo, Brazil); Chitosan from Sigma (Saint Louis, USA), and D,L-PLGA 50:50 from Birmingham (Birmingham, USA). Acetic acid and hydrochloric acid were from Synth (Diadema, Brazil), methanol was J.T. Baker (Phillipsburg, USA), ammonium acetate.

(37) 35. and sodium hydroxide were from Qhemis (Jundiaí, Brazil). All reagents were of analytical grade. Ultrapure water (18.2 Mcm-1) was produced in a Millipore Direct- Q™ system (Billerica, USA). Equipment, instrumental and chromatographic conditions. Analyses were conducted using an HPLC Thermo Scientific Surveyor PLUS (Miami, USA) equipped with a degasser, a Surveyor PLUS pump, and a UV-Vis spectrophotometric detector with Surveyor photodiodes selected at 303 nm. An isocratic method was developed for separation using Hypersil BDS C18, 250 × 4.6 mm i.d. chromatography column with a pre-column (Hypersil BDS C18) both obtained from Thermo Scientifi A fl w rate of 1 mL min−1 and a sample injection volume of 25 µL were used during all analyses. A freshly prepared mobile phase was fi through a 0.45 µm Tefl membrane and cellulose acetate membrane from Sartorius and degassed prior to use. The UV-Vis spectrophotometric method was developed using two UV-Vis spectrophotometers: a Libra S32 from Biochrom® (Cambridge, United Kingdom) and an Evolution 60S from Thermo Scientifi ® (Miami, USA). All absorbance measurements were taken in a 1 cm of path-length cuvette at room temperature, at wavelengths between 190 and 400 nm using 0.1 mol L-1 acetic acid solution as a blank. Optimization of mobile phase. Three different ratios (25:75, 30:70, and 35:65 v/v) of methanol:ammonium acetate buffer 0.05 mol L, pH 6.0, were evaluated using the following parameters: number of theoretical plates (N), peak resolution (R), and retention time (t). The N was defined according to the United States Pharmacopeia (USP), which was calculated by the equation (1): N = 16 (t/w)2 (1) 1. where, t is the retention time of the substance and w is the width of the peak at base. The R was defined (USP) according to the separation of two components in a mixture, in which R = 2(t2 – t1)/w2+w1, where t2 an t1 were the retention time of the two components, and w2 and w1 were the corresponding width at the bases of the peaks. In this work, a solution containing MTX and the 4-aminoacetophenone was used as internal standard (IS), which was prepared in acetic acid 0.1 mol L-1.. Preparation of MTX-loaded biodegradable microparticles. MTX-loaded PLGA microparticles were prepared at different drug/polymer ratios (9.0, 18.0, and 27.0 wt.%). In the case of the hydrophobic copolymer PLGA, while suitable amounts of drug were dissolved in an aqueous acetic acid solution (1 wt.%), the copolymer was dissolved in acetone. The mixture was mixed and dried in a mini spray-dryer Buchi-191 equipped with a 0.7 mm nozzle, an inlet temperature of 80 °C and, an outlet temperature of about 60 °C with air flow of 600 NL h-1. On the other hand, for the hydrophilic copolymer (MTX-loaded CH microparticles), MTX and chitosan were dissolved in a 0.1 mol L-1 acetic acid solution, which was dried in a mini spray-dryer Buchi-191 with a 0.7 mm nozzle, an inlet temperature of 140 °C, and an outlet temperature of 90 °C with air fl w of 500 NL h-1; a spray feed rate of 3 mL min-1; and an aspirator efficiency of approximately 90%. For all samples, microparticles were collected and stored under vacuum at room temperature. Validation procedure. The analytical method was validated in agreement with the ICH (International Conference on the Harmonization of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use, 1996) and ANVISA (National Health Surveillance Agency, 2003) using the following analytical parameters: specificity, linearity, range, detection and quantifi limits, precision, robustness, and accuracy..

(38) 36. Specificity. This parameter was calculated by comparing areas under the curve and retention times (for the HPLC method) or plots of absorbance scanned at a range of 190 to 400 nm (for the UV-Vis spectrophotometric method) of drug solution containing different matrix components (Chitosan or PLGA). Standard curves. An MTX stock solution at 500 µg mL-1 was produced in an acetic acid solution (1:10, v/v). Different aliquots of this solution were transferred to volumetric flasks and the final volume was completed with acetic acid 0.1 mol L-1 to obtain solutions at different concentrations (0.5-16.0 µg mL-1). All samples were filtered with Maxcrom OEM nylon membrane 0.22 µm and injected into the HPLC system in triplicate. The same samples were also analyzed by UV-Vis spectrophotometry at 303 nm. An analytical curve was generated by plotting the different concentration points and the area under the curve or the absorbance for HPLC or UV-Vis spectrophotometric method, respectively. Linearity. The linearity was assessed by using the correlation coefficient from the (straight line) analytical curve fitted from MTX analytical data in the chosen concentration range (0.5-16.0 µg mL-1). Each point was analyzed three times. Peak areas (response) or absorbance values against MTX concentration were plotted and a linear least-squares regression analysis was conducted to determine the slope (IC), the intercept, and the standard deviation of the intercept (DPa). Limit of detection and limit of quantitation. The limit of detection (LOD) and the limit of quantitation (LOQ) were calculated based on the standard deviation response and the slope of the analytical curves, according to the equations (2) and (3) as follows: LOD = (DPa × 3)/IC (2) LOQ = (DPa × 10)/IC (3) Precision. The intraday and interday precision tests were estimated by calculating the relative standard deviation (RSD) of the analyses of MTX solutions at five different concentrations (2.0, 4.0, 8.0, 12.0, and 14.0 µg mL-1) in triplicate. The analyses were carried out on the same day for the intraday precision, and on fi e different days, at intervals of at least two days, for the interday precision. The results were submitted to one-way analysis of variance (ANOVA) and Student t-test at a significance level of 0.05 (p < 0.05). Accuracy. The accuracy was evaluated by the standard addition method, in which solutions containing the matrix components (CH or PLGA), named ‘placebo’, were added to different amounts of MTX standard solution to attain five different drug concentrations (2.0, 4.0, 8.0, 12.0, and 14.0 µg mL-1). Accuracy was calculated, in triplicate, as the mean of five tests at each level using the relationship described in the Equation 4. Accuracy = [mean experimental concentration/ Theorical concentration] x 100. (4) Apparent robustness. The precision variation involved in several of this study’s analytical parameters, such as different days, different instruments, and different laboratories, was described in previous sections. Additionally, the effect of the pH of the analytical solutions on the accuracy and precision was.

(39) 37. investigated. In the HPLC method, the robustness of the technique was checked by changing the pH of the mobile phase by 0.1 units. In the UV-Vis spectrophotometer method, the pH of the analytical solutions was measured (pH = 1.9) and adjusted to lower and higher levels (pH = 1.4 and pH = 2.4) using 0.1 mol L-1 HCl and 0.1 mol L-1NaOH, respectively. The analytical quantitations were performed at fi e different concentrations (2.0, 4.0, 8.0, 12.0, and 14.0 µg mL-1) for each pH value. The robustness was observed and reported as RDS from different analyses. In addition, the experimental data were subjected to ANOVA (significance level p < 0.05).. Performance of HLPC and UV-Vis spectrophotometric methods for MTX quantitation in biodegradable microparticles. Sufficient amount of MTX-loaded biodegradable (PLGA) microparticles, equivalent to 25 mg of pure drug, was taken as sample, and then dissolved in an aqueous acetic acid solution (10 wt.%). This stock solution (500 µg mL-1) was diluted into volumetric fl and the fi volume was completed with 0.1 mol L-1 acetic acid to achieve the sample solutions with a theoretical concentration of 8 µg mL-1. All samples were filtered in 0.22 µm membranes and the analytical quantifications were performed using the same procedure described for the analytical curves. The drug concentration was calculated using the equation generated from the analytical curves. Statistics. The RSD was calculated as RSD = 100 x (sd/mean). For comparisons among the analytical results, the experimental data were subjected to ANOVA and the Student’s t-test. A p value < 0.05 was required for significance.. Results and Discussion In this work, prior to the validation procedure, an optimization of the mobile phase was carried out to obtain better chromatographic separation of the studied compounds. Table 1 summarize the results obtained for the optimization of the mobile phase. The increment of methanol in the mobile phase led to decrease the retention time for both the MTX and the IS, which contributed to reducing analysis time. However, the number of theoretical plates and the peak resolution also decreased. The number of theoretical plates (TP) is a measure of the column effi y and the plate number is a measure of the system’s capability for resolving a single peak. Therefore, empirical criteria functions have been developed to assay peak pairs. Due to its simplicity, the resolution (R) is perhaps the most popular of the empirical criteria functions.39 Based on the investigated chromatographic symmetry and resolution parameters the 25:75 (v/v) methanol:ammonium acetate buffer ratio enabled a rapid and suitable analysis time providing a quite satisfactory separation of the MTX. By using the selected mobile phase, the retention time for MTX was about 7 min. This value was lower than that obtained for the solvent systems previously proposed in other studies, which reported a retention time for the MTX higher than 10 min.40,41 Consequently, the optimization of the analysis time in our study represented another positive feature. Validation. The specificity study was carried out in order to estimate and predict possible interferences of the matrix components during the analysis of MTX content by UV-Vis spectrophotometric and HPLC methods. For the UV-Vis spectrophotometric method, any change in the absorbance intensity and any bathochromic or hypsochromic shift were investigated. On the other hand, for HPLC any change in the retention time of the drug was evaluate..

(40) 38. Table 1. Results obtained by testing the different ratios of the mobile phase (methanol: ammonium acetate, v/v) Mobile phasea. t1. W1. TP1. t2. W2. TP2. R. 25:75. 7.6. 1.10. 853.46. 11.9. 1.39. 1643.7. 56. 30:70. 5.7. 0.71. 747.66. 9.4. 0.99. 1443.2. 46.9. 35:65. 4.9. 0.64. 620.01. 7.8. 1.09. 893.0. 23.6. Different ratios of methanol: ammonium acetate buffer, 0.05 mol L , pH 6.0; t = retention time; W = peak width; TP = number of theoretical plates; R = Resolution; 1: data for the first analyte (MTX), 2: corresponding to the second analyte (IS). a. -1. In addition, this assay can predict any interaction among the components of the formulation and the drug, which could impeach a good analytical quantitation of the drug loaded into the delivery system.34-36 The UV-Vis spectrophotometric analyses revealed no interference of PLGA (Figure 2a) or CH (Figure 2b). The components of the matrix exhibited no absorbance at the selected wavelength (303 nm). Additionally, no bathochromic or hypsochromic shift was observed in the UV-Vis spectrophotometric scanning plot in the presence of both studied copolymers, which demonstrates the specifi of method. As occurred for the UV-Vis spectrophotometric method, signals of matrices PLGA/CH or impurities that might interfere with quantitation of the drug were not observed for the HPLC method (Figure 2c and 2d). The retention time of the drug remained about 7 minutes in the presence of both PLGA and CH. However, slight differences occurred due to the sample preparation procedure, which was adapted to the solubility property of each copolymer used to produce the referred biodegradable microparticles. In order to avoid any precipitation of copolymers during analysis, the samples were diluted in an aqueous acetic acid solution (in the case of samples containing PLGA) or in the mobile phase (in the case of samples containing CH), which were properly fi prior to injection on the HPLC apparatus. The specificity of an analytical method describes its ability to measure the drug content in the presence of impurities, excipients, degradation products, or matrix components. 31-33 The overall results revealed that the specificity was well established for the two selected methods used in this study. Concerning the HPLC profi a well-resolved and eluted symmetric peak with retention time in approximately 7 min was observed by using this method. Aiming to evaluate the linearity, the standard curve for MTX was constructed by plotting the peak area vs. concentration over the concentration range of 0.5 to 16 µg mL-1. The linearity results revealed that the drug concentration was directly proportional within the specifi concentration interval.32,33 This adequate linearity was demonstrated by the correlation coefficient (r = 0.99999) (Table 2). HPLC is a routinely used analytical method for assessing not only drug concentration, but also the stability of a compound in food, cosmetic, and pharmaceutical products. However, the time of analysis is a main concern to any development of a method. In this work a methanol:ammonium acetate buffer at a ratio of 25:75 (v/v) was used in order to achieve a satisfactory analysis time by HPLC. On the other hand, UV-Vis spectrophotometry is a fast technique that involves simple instrumentation when compared to the HPLC. Hurtato et al.,42 reported that the use of the UV-Vis spectrophotometric method allowed a rapid and low-cost quantitation of levofl without any time-consuming sample preparation, unlike the HPLC method. Thus, in the case of MTX in this work, the same sample preparation procedure produced a linear correlation (r = 0.9998) among MTX concentrations ranging from 0.5 to 16 µg mL-1. Moreover, both methods exhibit low standard error of intercept and correlation coefficient values within the limits established by the ICH (1996) and ANVISA (2003) (r > 0.99). Therefore, the linearity of both the HPLC and the UV-Vis spectrophotometric methods was ensured under the described experimental conditions. Sensitivity is another relevant and sought analytical parameter in drug analysis. Sometimes to evaluate this parameter, the use of HPLC method is fundamental, essentially for the stability studies or the determination of drugs in biological fluids.43-45 However, in this study, limits of detection and quantification were generated based on the HPLC and UV-Vis spectrophotometric analytical curves. The values of LOD and LOQ were found between 0.014 and 0.047 µg mL-1, respectively, for.

(41) 39. the HPLC method, while for the UV-Vis spectrophotometric method these values remained about 0.060 and 0.201 µg mL-1, respectively. Such results clearly reveal that both methods are reliable to evaluate. MTX concentration at the linearity study range. Skibinska et al.,40 suggested a HPLC method for the quantitation of MTX and 7hydroxymethotrexate (7-OH MTX) in children with acute lymphoblastic leukemia. Despite the lowest resolution found among MTX and 7-OH MTX and low concentration range (0.025-0.8 µg mL-1), the method was linear, which provided a LOQ of about 0.025 µg mL-1. In addition, Begas et al.,41 developed a highly sensitive HPLC method for the monitoring of MTX in osteosarcoma patients. In this study, they also found a linear concentration range from 0.011 to 2.27 µg mL-1, which provided a LOQ of 0.005 µg mL-1.. Figure 2. UV-Vis spectrophotometric scanning plots for MTX solution (8 µg mL-1) in absence and presence of PLGA (a) or CH (b) and their respective chromatograms (c) and (d).. Recently, Daniel et al.,46 suggested a HPLC procedure using fluorometric detection for itraconazole quantitation in poly lactic-co-glycolic acid nanoparticles, plasma and tissue which linear concentration ranged from 0.01 µg mL–1 to 10 µg mL–1. However, a LOQ of 0.459 µg mL–1 was observed. When the linear concentration range was changed from 0.01 to 0.02 µg mL–1, the LOQ decreased to 0.008 µg mL–1. Compared to the aforementioned methods, the HPLC method discussed in the present study revealed to be suitable for drug loading and stability studies of different biodegradable microparticles.