Avaliação do potencial antimicrobiano e antiparasitário de oligossacarídeos de quitosana

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

NAYARA SOUSA DA SILVA

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIMICROBIANO E ANTIPARASITÁRIO DE OLIGOSSACARÍDEOS DE QUITOSANA

Natal/RN

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AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIMICROBIANO E ANTIPARASITÁRIO DE OLIGOSSACARÍDEOS DE QUITOSANA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.

Orientador: Prof. Matheus de Freitas Fernandes Pedrosa Co-orientadores: Prof. Marcelo Sousa Silva

Dra. Nathália Kelly Araújo

Natal/RN 2020

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Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS

Silva, Nayara Sousa da.

Avaliação do potencial antimicrobiano e antiparasitário de oligossacarídeos de quitosana / Nayara Sousa da Silva. - 2020. 97f.: il.

Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) -

Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Natal, RN, 2020.

Orientador: Matheus de Freitas Fernandes Pedrosa. Coorientador: Marcelo Sousa Silva.

Coorientadora: Nathália Kelly Araújo.

1. Antibacterianos - Dissertação. 2. Antiparasitário - Dissertação. 3. Quitooligossacarídeos - Dissertação. 4.

Biocompatibilidade - Dissertação. 5. Quitosana - Dissertação. I. Pedrosa, Matheus de Freitas Fernandes. II. Silva, Marcelo Sousa. III. Araújo, Nathália Kelly. IV. Título.

RN/UF/BS-CCS CDU 615.33 Elaborado por ANA CRISTINA DA SILVA LOPES - CRB-15/263

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Nem tudo depende de nós, e isso está tudo bem. Apesar de todas as idas e vindas, oportunidades e desvios, não poderia deixar de agradecer onde cheguei, e como cheguei. Agradeço inicialmente à Deus, essa força que me guia, me protege e me ensina. Dedico este trabalho à minha família, em especial meus pais e minha irmã, por todo o apoio e paciência em todos momentos felizes e os nem tão felizes assim.

À minha segunda família que fiz no laboratório TecBioFar, a qual desde 2014 convivo mais do que a minha família biológica, pelas conversas na copa, os shows

de rock, as viagens, os experimentos, das risadas às lágrimas. Por tudo isso, agradeço em especial, mas não unicamente, à Adriana, Clarinha, Emanuell, Júlia e

Lucas. À todos os outros alunos do laboratório que não nomeei aqui, mas que contribuíram cada um de sua forma, aprendi e cresci com todos vocês. À Alessandra

e toda sua sabedoria e paciência para repetir os experimentos e tirar minhas dúvidas. À Nathália por fazer nascer esse projeto ocasionando a concretização deste momento. Ao professor Matheus Pedrosa, pela confiança de me fazer sua aluna. Aos colaboradores, ao PPgCF, e à UFRN meus sinceros agradecimentos. E

por fim, a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ) pelos recursos financeiros que possibilitaram a execução deste trabalho.

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“Eu posso não ter ido para onde eu pretendia ir, mas acho que acabei terminando onde eu pretendia estar”.

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resistência microbiana e o elevado impacto de doenças tropicais negligenciadas reforça a busca por novas moléculas com potencial antimicrobiano. A quitosana é um copolímero formado de D-glicosamina e N-acetil-glicosamina, obtida pela desacetilação parcial da quitina. A hidrólise da quitosana gera os quitooligossacarídeos (QOS) e monossacarídeos. Os QOS apresentam maior vantagem em relação à quitosana devido a maior solubilidade e menor viscosidade. Aliado a esses parâmetros, pesquisas demonstram o vasto potencial biológico dos QOS com propriedades antimicrobiana, anti-inflamatória, antioxidante e antitumoral. Apesar do conhecimento dos efeitos biológicos dos QOS, a atividade antiparasitária dessas moléculas é pouco estudada. Dessa forma, os objetivos deste estudo foram obter QOS, a partir da hidrólise enzimática da quitosana por quitosanases provenientes de Bacillus toyonensis, caracterizar os oligômeros e avaliar seus efeitos citotóxicos, antimicrobiano e antiparasitário in vitro. A mistura de QOS produzidos por hidrólise enzimática nos tempos de 5 e 10 min de reação foram caracterizados por RMN 1_H_{e ¹³C, uni e bidimensional, e espectrometria de massas. Ambos os oligômeros}

avaliados não demonstraram citotoxicidade sobre células cancerígenas e não cancerígenas até 2 mg/mL. Os QOS revelaram efeito antimicrobiano semelhante a quitosana frente a bactérias e leveduras. No ensaio antiparasitário, os QOS apresentaram inibição de forma tempo-dependente de cerca de 30% e acima de 50% sobre os parasitos Leishmania amazonensis e Trypanosoma cruzi respectivamente. A possibilidade de obtenção de uma molécula de elevado interesse biotecnológico a partir de resíduos da carcinicultura, resultando na diminuição do impacto ecológico, releva a importância do estudo e utilização dos quitooligossacarídeos para obtenção de novos agentes farmacológicos.

Palavras-chaves: Quitooligossacarídeos, antiparasitário, antibacteriano, biocompatibilidade.

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microbial resistance and the high impact of neglected tropical diseases reinforces the search for new molecules with antimicrobial potential. Chitosan is a copolymer formed of D-glucosamine and N-acetyl-glucosamine, obtained by partial deacetylation of chitin. The chitosan hydrolysis generates chitosoligosaccharides (COS) and monosaccharides. COS have a greater advantage over chitosan due to greater solubility and lower viscosity. Allied to these parameters, research demonstrates the vast biological potential of COS with antimicrobial, anti-inflammatory, antioxidant and anti-tumor properties. Despite the knowledge of the biological effects of COS, the antiparasitic activity of these molecules is poorly studied. Thus, the objectives of this study were to obtain COS from the enzymatic hydrolysis of chitosan by chitosanases from Bacillus toyonensis, to characterize the oligomers and to evaluate their cytotoxic, antimicrobial and antiparasitic effects in vitro. The mixture of COS produced by enzymatic hydrolysis in the 5- and 10-min reaction times were characterized by ¹H and ¹³C NMR, uni and bidimensional, and mass spectrometry. Both oligomers evaluated did not demonstrate cytotoxicity on cancer cells and non-cancer cells up to 2 mg / mL. The COS revealed an antimicrobial effect similar to chitosan against bacteria and yeasts. In the antiparasitic assay, the COS showed time-dependent antiparasitic activity on the Trypanosoma cruzi and Leishmania amazonensis with inhibition rates of about 30% and above 50%, respectively. The possibility of obtaining a molecule of high biotechnological interest from shrimp residues, resulting in a decrease in ecological impact, highlights the importance of the study and use of chitooligosaccharides to obtain new pharmacological agents.

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Figura 1 – Ciclo de vida de T. cruzi. ... 19

Figura 2 – Ciclo de vida de Leishmania sp. ... 22

Figura 3 – Estrutura química da quitina e quitosana ... 25

Figura 4 – Fluxograma da produção e caracterização dos QOS ... 33

Quadro 1 – Sequência de DNA do B. toyonensis ... 42

Quadro 2 – Resultados dos testes biológicos para diferenciação entre as espécies B. toyonensis, B. thuringiensis e B. cereus. ... 42

Figura 5 – Espectros de RMN unidimensionais para QOS10 e QOS5. ... 45

Figura 6– Espectros de RMN bidimensionais de QOS10 e QOS5. ... 47

Figura 7 – Cromatograma de CLAE-MS/MS obtido para as frações de QOS10 e quitosana. ... 51

Figura 8 – Cromatografia CLAE MS/MS dos QOS10. ... 52

Figura 9 – A. Espectro de massas MALDI-TOF do QOS5G1 ... 55

Figura 10 – Efeito citotóxico dos QOS5, QOS10 e quitosana. ... 58

Figura 11 - Quantificação de nitrito no sobrenadante da cultura celular de linhagem de células RAW 264.7 após incubação com QOS5 e QOS10 ... 61

Figura 12 – Mapa de calor das porcentagens de inibição do crescimento microbiano ... 62

Tabela 2 – Concentração Inibitória Mínima (CIM) do QOS5, QOS10 e QUI para os diferentes microrganismos ... 64

Figura 13 - Cinética da atividade do QOS5, QOS10 e QUI na concentração da CIM frente a diferentes microrganismos. ... 65

Figura 14 - Efeito dos QOS e quitosana nas formas promastigotas de Leishmania amazonensis em diferentes tempos de incubação ... 69

Figura 15 - Efeito dos QOS e quitosana nas formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi em diferentes tempos de incubação. ... 70

Figura 16 – Ensaio de aglutinação nas formas promastigotas de L. amazonensis e epimastigotas do T. cruzi incubados com os derivados de quitosana. ... 71

Figura 17 – Imagens de MEV dos efeitos dos QOS10 sobre as formas promastigotas de L. amazonensis após incubação por 72 h. ... 73

Figura 18 – Efeito dos QOS10 sobre as formas epimastigotas de T. cruzi após incubação por 144 h. ... 73

Figura 19 – Mapa de composição atômica por MEV/EDS de promastigota de L. amazonensis incubado com QOS10. ... 74

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ATCC: “American Type Culture Collection”

CIM: Concentração Inibitória Mínima

CLAE: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

DTN: Doença Tropical Negligenciada

ESI: Ionização por Eletrospray

GD: Grau de desacetilação

GlcN: Glicosamina

GlcNAc: N-acetil-glicosamina

GP: Grau de polimerização

IC50: Half maximal inhibitory concentration

MS: Espectrometria de Massas

MALDI: Espectrômetro de massas por dessorção/ionização a laser auxiliada por

matriz

NaTFA: Trifluoroacetato de sódio NF-κB: Fator nuclear kappa B

NO: Óxido nítrico

RMN: Ressonância Magnética Nuclear

TOF: Time-of-Flight Mass Spectrometry

QOS: Quitooligossacarídeos

QTOF: Hybrid Quadrupole Orthogonal Time-of-Flight Mass Spectrometry

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2 OBJETIVOS... 15

OBJETIVO GERAL ... 15

OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 15

3 REVISÃO DA LITERATURA ... 16

RESISTÊNCIA MICROBIANA... 16

DOENÇAS TROPICAIS NEGLIGENCIADAS E OS TRIPANOSOMATÍDEOS . 16 3.2.1 Tripanossomíase americana (doença de Chagas) ... 17

3.2.2 Leishmaniose ... 20

3.2.3 Novas alternativas terapêuticas ... 23

QUITINA E QUITOSANA ... 24

QUITOOLIGOSSACARÍDEOS (QOS) ... 26

POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO DOS QOS ... 27

PRODUÇÃO DOS QOS ... 28

4 METODOLOGIA ... 31

CARACTERIZAÇÃO DA QUITOSANA ... 31

MICRORGANISMO PRODUTOR DE QUITOSANASE ... 31

OBTENÇÃO DA QUITOSANASE ... 32

PRODUÇÃO DOS QOS ... 32

CARACTERIZAÇÃO DOS QOS ... 33

4.5.1 Ressonância magnética nuclear ... 33

4.5.2 Espectrometria de massas ... 34

CITOTOXICIDADE DOS QOS ... 36

AVALIAÇÃO DA ATIVAÇÃO DE MACRÓFAGOS PELOS QOS ... 36

ATIVIDADE ANTIMICROBIANA ... 37

4.8.1 Microrganismo e obtenção do inóculo ... 37

4.8.2 Ensaio antimicrobiano in vitro ... 38

ATIVIDADE ANTIPARASITÁRIA ... 38

4.9.1 Efeito dos QOS e QUI na viabilidade do Trypanosoma cruzi ... 38

4.9.2 Efeito dos QOS e QUI na viabilidade do Leishmania amazonensis ... 39

4.9.3 Efeito aglutinador dos QOS e QUI sobre o T. cruzi e L. amazonensis .... 39

4.9.4 Avaliação morfológica dos efeitos dos QOS e QUI por microscopia eletrônica de varredura ... 40

ANÁLISES ESTATÍSTICAS ... 40

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 41

CARACTERIZAÇÃO DA QUITOSANA ... 41

IDENTIFICAÇÃO DO MICROORGANISMO ... 41

OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DOS OLIGÔMEROS ... 42

5.3.1 Análise por Ressonância Magnética Nuclear ... 42

5.3.2 Análise por Espectrometria de Massas ... 50

AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE DOS QOS ... 58

AVALIAÇÃO DA ATIVAÇÃO DE MACRÓFAGOS DOS QOS ... 60

ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DOS QOS ... 62

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Nayara Sousa da Silva 1 INTRODUÇÃO

Nos últimos 30 anos houve um aumento na incidência de surtos de doenças infecciosas, principalmente aquelas causadas por bactérias ou vírus, como a salmonelose, gastroenterite viral, e mais recentemente, COVID-19 (BLOOM; CADARETTE, 2019; SHEREEN et al., 2020; SMITH et al., 2014). Em paralelo ao crescente número de surtos, o avanço da resistência antimicrobiana e as alterações climáticas tornam o cenário mais crítico. O surgimento de superbactérias leva a era pós-antibiótica, onde a resistência bacteriana reduz as opções disponíveis para o tratamento de infecções, não apenas bacteriana, mas como parasitárias (BLOOM; CADARETTE, 2019; O’NEILL, 2016).

Somado a isto, os efeitos das alterações climáticas impactam diretamente nas doenças infecciosas por afetar o patógeno, o hospedeiro ou o vetor e o meio ambiente de transmissão. O aumento da temperatura, por exemplo, poderá levar a expansão geográfica de doenças transmitidas por vetores, como também reduzir imunidade humana (FILHO et al., 2019; WU et al., 2016). Ademais, os movimentos migratórios contínuos também influenciam na transmissão da doença para áreas não endêmicas (CASTELLI; SULIS, 2017). Em vista disso, evidencia-se a importância da busca de novas moléculas eficazes, com baixa toxicidade que auxiliem no tratamento de doenças infecciosas.

Segundo o relatório da Organização Mundial da Saúde, existe mais de um bilhão de pessoas em todo mundo afetadas por doenças tropicais negligenciadas (DTN), prevalentes em países de zona tropicais e subtropicais e atingindo principalmente a população economicamente desprivilegiada. Este grupo de doenças são, em maior parte, parasitoses como a leishmaniose, filariose, doença do sono africana e a doença de Chagas (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2017). No Brasil, estima-se que mais de um milhão de pessoas apresentem a doença de Chagas, sendo considerada uma das quatro maiores causas de morte por doenças parasitárias. No que diz respeito da leishmaniose, entre 2003 e 2018, 300 mil casos de leishmaniose tegumentar e 51 mil casos de leishmaniose visceral foram registrados no país (BRASIL; MINISTÉRIO DA SAÚDE; SAÚDE, 2019). Entre as principais problemáticas dessas doenças estão o limitado arsenal terapêutico, toxicidade e baixa efetividade dos fármacos usuais na

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Nayara Sousa da Silva

forma crônica da doença e pouco avanço nos estudos e aprovação de novas alternativas terapêuticas pelas indústrias farmacêuticas (PINHEIRO et al., 2017).

Neste contexto, a quitina é o segundo polissacarídeo mais abundante na natureza, constituída por moléculas de N-acetil-D-glicosamina unidas por ligações glicosídicas β (1 → 4), sendo encontrada no exoesqueleto de artrópodes e parede celular de fungos (ANNU et al., 2017; NGO et al., 2015). Anualmente, 6 a 8 milhões de toneladas de cascas de caranguejo, lagosta e camarão são desprezados na natureza, que, associada a lenta degradação natural da quitina, resulta em grande acúmulo de resíduos sólidos no meio ambiente (LIAQAT; ELTEM, 2018; YAN; CHEN, 2015). Além da quitina, estes resíduos apresentam alta quantidade de proteínas e minerais e, portanto, podem se tornar produtos com alto valor agregado uma vez processados adequadamente (KANDRA; CHALLA; JYOTHI, 2012). A partir da quitina obtém-se a quitosana por processo de desacetilação parcial. Este copolímero resultante pode ser constituído por diferentes proporções dos monômeros N-acetil-glicosamina (GlcNAc) e D-glicosamina (GlcN) (HAMED; ÖZOGUL; REGENSTEIN, 2016). A quitosana tem amplo uso em diferentes áreas devido a suas propriedades não-tóxica, biodegradável e biocompatível, entretanto, o uso deste polímero na área biomédica é limitado devido sua baixa solubilidade e elevada viscosidade em meios neutros (BELLICH et al., 2016). Como alternativa, a hidrólise da quitosana possibilita a obtenção de moléculas com cadeias poliméricas menores, os quitooligossacarídeos, ou oligômeros de quitosana (QOS), com melhoria nas características funcionais e abrangente uso biológico (YUAN et al., 2019).

Os QOS apresentam como principal vantagem em relação a quitosana a maior solubilidade em meios neutros e menor viscosidade, associado às suas características de biodegradabilidade, biocompatibilidade e não toxicidade (LIAQAT; ELTEM, 2018). Dentre os diversos potenciais biológicos dos QOS, destaca-se o amplo efeito antimicrobiano dos QOS frente a bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e leveduras (ZHANG et al., 2019). Os QOS consistem em uma interessante alternativa antimicrobiana na saúde humana (LI et al., 2014a; MEI et al., 2015), no manejo animal (THONGSONG et al., 2018; WALSH et al., 2012), na indústria agrícola (COBOS et al., 2015; HE et al., 2018) e alimentícia (CASTILLO et al., 2017; YANG et al., 2017). Ademais, pesquisas com QOS apontam outras atividades biológicas como anti-inflamatória (KUNANUSORNCHAI et al., 2016), antioxidante (EL-SAYED et al., 2017a;

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ISMAIL; EL-SAYED; FAYED, 2020), antitumoral (GU et al., 2017; LUO et al., 2016), antiviral (KARAGOZLU; KARADENIZ; KIM, 2014), bem como vetor gênico (KLAUSNER et al., 2010). Todas estas atividades estão intimamente relacionadas com a composição e as propriedades físico-químicas dos oligômeros, como, por exemplo, a massa molecular, grau de desacetilação (GD) e grau de polimerização (GP). Tais fatores são determinados pelo tipo de quitosana e método de hidrólise empregado (AAM et al., 2010; TIAN et al., 2015). Ainda que a literatura aponte o potencial biológico dos QOS, não há dados suficientes que confirmem a relação estrutura/atividade desses oligômeros. Essa dificuldade está relacionada, em parte, pelas diferentes metodologias de produção dos QOS e a dificuldade de sua caracterização (BELLICH et al., 2016; LI et al., 2016).

Apesar do amplo potencial biológico dos QOS, em especial a atividade antimicrobiana, pouco se sabe sobre a sua atividade antiparasitária. À vista disso, o objetivo deste estudo foi a produção e caracterização dos QOS, através de técnicas analíticas avançadas de ressonância magnética nuclear e espectrometria de massas, e a investigação dos efeitos antimicrobiano dos QOS frente a bactérias, leveduras e parasitos tripanosomatídeos. A possibilidade de transformação de um resíduo da carcinicultura em molécula de interesse biotecnológico faz dos QOS um importante alvo para estudo diante do impacto ecológico, econômico e biomédico.

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Nayara Sousa da Silva 2 OBJETIVOS

OBJETIVO GERAL

Produzir, caracterizar estruturalmente, avaliar a citotoxicidade e o efeito antibacteriano, antifúngico e antiparasitário dos QOS em ensaios in vitro.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

a) Produzir os QOS a partir da hidrólise da quitosana por extrato enzimático obtido do Bacillus toyonensis em cultivo submerso;

b) Caracterizar estruturalmente os QOS por ressonância magnética nuclear e espectrometria de massas;

c) Estimar a citotoxicidade dos QOS em células não cancerígenas (VERO E6 e RAW 264.7) e linhagem cancerígenas (HeLa e HepG2),

d) Avaliar a ativação de macrófagos murinos (RAW 264.7) in vitro após incubação por QOS;

e) Avaliar o efeito antibacteriano e antifúngico dos QOS in vitro;

f) Estudar o potencial antiparasitário dos QOS nas formas epimastigotas de

Trypanosoma cruzi in vitro;

g) Avaliar potencial antiparasitário dos QOS nas formas promastigotas de

Leishmania amazonensis in vitro;

h) Investigar os efeitos morfológicos do QOS10 sobre os parasitos por microscopia eletrônica de varredura.

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3 REVISÃO DA LITERATURA

RESISTÊNCIA MICROBIANA

Um microrganismo é denominado resistente quando é capaz de se adaptar e crescer na presença de um agente antimicrobiano. Esse fenômeno ocorre em fungos, parasitos e, principalmente, em bactérias. A resistência a antimicrobianos é um processo natural nos microrganismos que ocorre há milhares de anos, sendo capaz de se disseminar rapidamente devido a troca genética. Contudo, o uso não racional de antimicrobianos aceleraram a taxa com que a resistência é desenvolvida e disseminada, gerando como consequência a redução das opções terapêuticas para o tratamento das infecções. (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2015).

Inicialmente, o aparecimento de “superbactérias” estava restrito ao ambiente hospitalar, como a Staphylococcus aureus resistente à meticilina. No entanto, microrganismos resistentes à antibióticos também estão presentes em infecções comunitárias. Aliado ao surgimento de cepas resistentes, o uso irracional de antibióticos no tratamento humano, veterinário e agronômico, assim como o lançamento de poucos antibióticos no mercado nas últimas duas décadas, predispõem a humanidade a entrar em uma era pós-antibiótica (O’NEILL, 2016). Segundo O’NEILL, 2016, em 2050, uma pessoa morrerá devido a problemas relacionados a resistência antimicrobiana a cada três segundos.

Em relação às bactérias, o Sistema Global de Vigilância a Resistencia a Antimicrobianos (GLASS), desenvolvido pelas Organização das Nações Unidas elegeram oito patógenos para a vigilância, são eles: Acinetobacter spp., Escherichia

coli, Klebsiella pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Salmonella spp., Shigella spp. Staphylococcus aureus e Streptococcus pneumoniae. Essas bactérias foram

escolhidas devido a elevada taxa de resistência antimicrobiana em infecções nosocomiais e comunitárias (WHO, 2017).

DOENÇAS TROPICAIS NEGLIGENCIADAS E OS TRIPANOSOMATÍDEOS As doenças tropicais negligenciadas (DTN) abrangem um amplo grupo de doenças com prevalência em países tropicais e subtropicais, afetando principalmente populações socialmente marginalizadas e economicamente desfavorecidas, sem

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acesso adequado a água potável, saneamento básico e políticas de acesso à saúde (CHAMI; BUNDY, 2019). Alguns exemplos de DTN são: a esquistossomose, dengue e Chikungunya, filariose, hanseníase, leishmaniose, tripanossomíase africana e doença de Chagas. Estima-se que mais de um bilhão de pessoas estejam infectadas com algum tipo de DTN, acarretando em elevadas taxas de mortalidade e morbidade (MOLYNEUX; SAVIOLI; ENGELS, 2017; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2017).O intensos movimento migratório nos últimos anos promoveu uma mudança no cenário epidemiológico com a presença de certas DTN em áreas não endêmicas, evidenciando assim a importância do estudo dessas doenças (TANOWITZ; WEISS; MONTGOMERY, 2011).

Dentre as DTN destaca-se as parasitoses causadas por Tripanosomatídeos como a doença de Chagas e a leishmaniose, que apresentam como agente etiológico o Trypanosoma cruzi e a Leishmania sp., respectivamente. Taxonomicamente, estes parasitos são classificados na família Trypanosomatidae, ordem Kinetoplastida, (SOUZA; VIDAL, 2017; VOTÝPKA et al., 2015). Na classificação filogenética, o gênero

Trypanosoma e Leishmania estão no supergrupo Excavata, filo Euglenozoa, classe

Kinetoplastida, família Trypanosomatida (CAVALIER-SMITH, 2003; REN; GUPTA, 2017). Na família Trypanosomatidae, os gêneros Trypanosoma e a Leishmania possuem importância médica por sua patogenicidade como antropozoonoses, doenças que primariamente ocorrem em animais, transmitidos aos humanos através de vetores invertebrados hematófagos. O desenvolvimento e preferências de hospedeiro desses parasitos são bastante diversos, variando de acordo com a espécie estudada (LUKEŠ et al., 2018).

3.2.1 Tripanossomíase americana (doença de Chagas)

A doença de Chagas corresponde a uma doença tropical negligenciada que tem como agente etiológico o protozoário T. cruzi. Apresenta elevada incidência e prevalência mundial. Estima-se que em todo mundo existam 6 - 7 milhões de pessoas infectadas pelo parasito e outras 75 milhões em situação de risco de infecção (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2017).

O T. cruzi é um protozoário unicelular da família Trypanosomatidae. Esses parasitos são caracterizados pela presença de flagelos, cinetoplasto justaposto ou

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posterior ao núcleo, de acordo com sua forma evolutiva. (CHAGAS, 1909). São parasitas obrigatórios digenéticos, infectando insetos triatomíneos e diversos mamíferos (ROQUE et al., 2013).

O T. cruzi tem como hospedeiro intermediário os insetos hematófagos da subfamília Triatominae, família Reduviidae, ordem Hemiptera. No Brasil, 13 espécies apresentam importância epidemiológica, dentre elas a Panstrongylus megistus,

Rhodnius prolixus e Triatoma brasiliensis, popularmente conhecidos como barbeiros

(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2019). A infecção do triatomíneo com o T. cruzi ocorre com a ingestão das formas tripomastigotas, durante o repasto sanguíneo de mamíferos contaminados (Figura 1). As formas tripomastigotas, provenientes da corrente sanguínea, transformam-se em epimastigotas, formas flageladas com capacidade de multiplicação por divisão binária. Ao seguirem para a porção posterior do intestino, transformam-se em formas tripomastigotas metacíclicos, formas infectantes para os hospedeiros vertebrados (ÁLVAREZ-HERNÁNDEZ et al., 2016; PÉREZ-MOLINA; MOLINA, 2018).

A infecção do hospedeiro vertebrado ocorre pelas formas tripomastigotas metacíclicas eliminadas nas fezes dos triatomíneos após o repasto sanguíneo. As formas tripomastigotas são formas alongadas, flageladas, sem capacidade de multiplicação, capazes de infectar todos os tipos celulares do hospedeiro, exceto as hemácias. No meio intracelular ocorre a transformação em formas amastigotas, formas circulares ausentes de flagelo. As formas amastigotas são resistentes aos mecanismos de morte intracelular, saem do vacúolo parasitóforo, e multiplicam-se por divisão binária no citoplasma. Em seguida, diferenciam-se em tripomastigotas causando lise celular. Os tripomastigotas são então levados para diferentes tecidos através da circulação sistêmica e linfática, onde irão infectar outras células, ou serão ingeridos pelos triatomíneos prosseguindo com o ciclo invertebrado (PARIDAH et al., 2016).

Além da infecção vetorial, pelo contato direto com as fezes dos triatomíneos, a doença de Chagas também pode ser transmitida independente do vetor através de transfusão sanguínea e transmissão congênita (COURA, 2015). Estas últimas são as principais formas de transmissão em áreas não endêmicas. Devido aos movimentos migratórios (ALBAJAR-VIÑAS; JANNIN, 2011; TANOWITZ; WEISS; MONTGOMERY,

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2011). Atualmente, a transmissão oral por meio do consumo de comidas com insetos contaminados tornou-se a principal forma de transmissão no Brasil (BRENIÈRE; VILLACIS; AZNAR, 2017; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2019)

Figura 1 – Ciclo de vida de T. cruzi.

Fonte: (MILES, 2017) Adaptado.

Do ponto de vista clínico, a doença de Chagas exibe uma fase aguda e uma fase crônica. A fase aguda ocorre alguns dias após a inoculação do protozoário, em alguns pacientes é possível observar o “chagoma” de inoculação ou o sinal de Romanã, região de entrada do parasito. Nesta fase é observado altos níveis de parasitemia, entretanto, a maior parte dos casos são assintomáticos ou apresentam sintomas leves. A fase aguda tem duração de 4–8 semanas que, quando não tratado, pode evoluir para a fase crônica (PÉREZ-MOLINA; MOLINA, 2018).

A fase crônica da doença pode ocorrer de forma indeterminada com ausência de sintomas, porém com positividade nos métodos sorológicos. Em alguns pacientes ocorre as formas determinadas ou sintomáticas, são elas: a cardíaca, digestiva ou

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cardiodigestiva. Os sintomas desta fase aparecem 10 a 30 anos após a fase aguda, devido a presença de parasitos alojados em tecidos musculares cardíaco e digestivo (ÁLVAREZ-HERNÁNDEZ et al., 2016). A forma cardíaca é a mais frequente das formas determinadas. O intenso infiltrado inflamatório gerado pelo combate das formas parasitárias no coração pela resposta imune acarreta danos ao tecido cardíaco ocasionando arritmias e insuficiência cardíaca (BONNEY et al., 2019). Enquanto que na forma digestiva, menos comum, há a dilatação do cólon e/ou esófago provocando disfagia e intensa constipação (PÉREZ-MOLINA; MOLINA, 2018).

Devida atenção deve ser dada nos casos de pacientes crônicos com imunossupressão associada ao HIV, nos quais podem ocorrer a reagudização da doença, apresentando elevada mortalidade. (PÉREZ-MOLINA; MOLINA, 2018; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2017). O tratamento da doença de Chagas baseia-se na administração dos antiparasitários Benznidazol ou Nifurtimox. Embora apresentem elevada eficácia na fase aguda, o uso desses fármacos na fase crônica é questionável em consequência dos elevados efeitos adversos, que ocorrem em 53 % e 85% dos casos para o uso de Benznidazol e Nifurtimox respectivamente, que contribuem na interrupção do tratamento pelo paciente. Ademais, há pouca comprovação científica da eficácia dessas drogas em pacientes na fase crônica (CONITEC; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2018).

3.2.2 Leishmaniose

A leishmaniose é uma doença parasitária cujos agentes etiológicos são protozoários do gênero Leishmania. Essa doença é endêmica em 98 países, dentre os países pan-americanos, o Brasil apresenta o maior número de casos desta doença(PAHO/WHO, 2018). A leishmaniose é primariamente uma zoonose característica de ambientes rurais, entretanto nos últimos anos vem se expandido para áreas mais urbanas, tornando-se um grave problema de saúde pública (ANVERSA et al., 2018).

Leishmania spp. são protozoários digenéticos com uma parte do seu ciclo de

vida ocorrendo nos insetos flebotomíneos e outra no hospedeiro mamífero. Morfologicamente, apresenta duas formas evolutivas a forma promastigota, alongada com a presença de cinetoplasto anterior ao núcleo conectada no corpo basal, de onde

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também surge o flagelo do protozoário e a forma amastigota, circular, intracelular e sem flagelo (SUNTER; GULL, 2017). No Novo Mundo (Américas), a leishmania é transmitido aos mamíferos pelos flebotomíneos do gênero Lutzomyia, um díptero da família Psychodidae (SILVA; ANDREOTTI; HONER, 2007).

A infecção dos flebotomíneos com a Leishmania spp. ocorre durante o repasto sanguíneo com a ingestão de macrófagos parasitados com as formas amastigotas (Figura 2). No intestino médio, as formas amastigotas se diferenciam em promastigotas, que se multiplicam no epitélio intestinal. Em seguida, os parasitos migram para a probóscide do flebotomíneo tornando-se promastigotas metacíclicos, que são regurgitadas durante um novo repasto sanguíneo, infectando o hospedeiro vertebrado. No hospedeiro vertebrado, as formas promastigotas infectam os macrófagos, sem ativa-los. No vacúolo parasitóforo, as formas promastigotas transformando-se em formas amastigotas que se multiplicam por divisão binária. Após diversas multiplicações, as formas amastigotas rompem o macrófago e infectam outras células fagocíticas mononucleadas em diversos tecidos (BATES, 2007; BURZA; CROFT; BOELAERT, 2018).

Diferentemente da doença de Chagas, a leishmaniose pode ser causada por mais de 20 espécies de Leishmania provocando manifestações patológicas diversas, as quais podem ser categorizadas como leishmaniose tegumentar e leishmaniose visceral (BURZA; CROFT; BOELAERT, 2018). No Brasil, as espécies L. amazonensis,

L. brasiliensis e L. guyanensis são responsáveis pela leishmaniose tegumentar,

enquanto a forma visceral da doença é ocasionada L. infantum. Segundo dados do Sistema de Informação de Agravos de Notificação (SINAN), em 2018 houve 17.119 casos de leishmaniose tegumentar e 3.376 casos de leishmaniose visceral no Brasil (BRASIL, 2019; PAN AMERICAN HEALTH ORGANIZATION, 2017).

A leishmaniose visceral (calazar) é a forma mais grave da doença com letalidade relacionada a danos hepáticos, esplênicos e distúrbios hematológicos. Essa doença tem importância tanto na área médica como veterinária, uma vez que os cães também são infectados e atuam como importante reservatório para o parasito. (GOMES; BALBINO MIGUEL, 2016).

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Figura 2 – Ciclo de vida de Leishmania sp.

Fonte: (BURZA; CROFT; BOELAERT, 2018) Adaptado.

A forma tegumentar da leishmaniose pode se apresentar como cutânea, mucocutânea ou difusa. A forma cutânea caracteriza-se, pela presença de lesão única semelhante a úlcera com as bordas elevadas e com centro necrótico, no local da inoculação do protozoário pelo vetor. Na forma mucocutânea as lesões ocorrem na mucosa, acarretando deformidades permanentes. Enquanto na forma difusa, as lesões nodulares múltiplas são distribuídas por todo tegumento. O desenvolvimento do tipo de forma tegumentar é dependente da espécie de Leishmania inoculada e do tipo da resposta imune produzida pelo hospedeiro (GABRIEL et al., 2019; GONTIJO; DE CARVALHO, 2003). Nos casos de co-infecção leishmaniose/HIV ocorre um agravamento e desenvolvimento de formas atípicas da clínica, uma vez que ambas as doenças compartilham mecanismos patológicos envolvendo células de defesa. (BURZA; CROFT; BOELAERT, 2018).

O tratamento de primeira linha para todos os casos de leishmaniose é o antimoniato de metilglucamina. Entretanto, este fármaco apresenta elevada cardio, nefro e hepatotoxicidade, seu uso é limitado nos pacientes idosos portadores de cardiopatias, nefropatias e hepatopatias, e gestantes. Ressalta-se também que nos

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últimos anos, vem sido registrado ocorrência de resistência do parasita aos fármacos convencionais. Desta forma, a busca de alternativas terapêuticas eficazes e menos tóxicas para o tratamento da leishmaniose é de suma importância (ANVERSA et al., 2018; GONTIJO, 2003).

3.2.3 Novas alternativas terapêuticas

A pesquisa e desenvolvimento de antibióticos é um processo custoso e pouco atrativo para as indústrias farmacêuticas (ÅRDAL et al., 2019). À vista disso, a Organização Mundial da Saúde criou o Plano Global sobre Resistência Antimicrobiana, com o objetivo de listar estratégias para o combate a resistência antimicrobiana. São essas: aumentar a conscientização da população acerca da resistência antimicrobiana, fortalecer os conhecimentos por meio de vigilância e pesquisa, aumentar medidas de saneamento, higiene para a prevenção de infecções, realizar uso racional de antimicrobianos na saúde humana e animal e por fim, aumentar investimentos em novos medicamentos, ferramentas de diagnóstico e vacinas (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2015).

Os tratamentos atuais disponíveis contra a doença de Chagas e leishmaniose são notoriamente retratados como tóxicos e ineficientes durante as fases crônica destas doenças. Enfatizando a importância da pesquisa de novas drogas que possam auxiliar no tratamento dessas DTN. (BERMUDEZ et al., 2016; ZULFIQAR; SHELPER; AVERY, 2017). Entretanto, a pesquisa de novas moléculas enfrenta dificuldades como o baixo investimento do setor público, desinteresse do setor farmacêutico e falta de dados epidemiológicos precisos, além da dificuldade de distribuição dos medicamentos nas regiões endêmicas com áreas de difícil acesso (FIELD et al., 2017; PINHEIRO et al., 2017; ZULFIQAR; SHELPER; AVERY, 2017).

No início da década passada, iniciativas globais como o “Roadmap on

Neglected Tropical Diseases”, “The London Declaration on Neglected Tropical Diseases” e “Drugs for Neglected Diseases initiative (DNDi)” (CHATELAIN; IOSET,

2011; SAVIOLI; DAUMIERE, 2012; UNITING TO COMBAT NEGLECTED TROPICAL DISEASE, 2012) traçaram planos e metas para o controle e erradicação de DTNs. Uma das medidas adotadas, é a pesquisa de terapias alternativas para o controle dessas doenças.

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A cerca das estratégias empregadas para a busca de novos tratamentos contra a doença de Chagas destacam-se o reposicionamento de drogas terapêuticas, como a Benidipina e a Clofazimina, anti-hipertensivo e antibiótico, respectivamente, que demonstraram capacidade de reduzir a carga parasitária em modelos in vivo (SBARAGLINI et al., 2016). Bem como a associação de fármacos, com finalidade de alcançar sinergismo, como observado com a combinação do Benznidazol e o Alopurinol (MAZZETI et al., 2019). Embora o elevado custo e tempo necessários, a pesquisa de novas moléculas é a principal estratégia na identificação de novos tratamentos para a doença de Chagas (RIBEIRO et al., 2020). Cabe enfatizar também a utilização de abordagens como modelagem molecular de fármacos e estudos de ligação com proteínas alvo promissoras, tais como as enzimas trans-sialidase e a nitroredutase tipo 1 (CRISTOVÃO-SILVA et al., 2019).

No tocante da busca de novos tratamentos para Leishmaniose, técnicas de proteômicas e genômica buscam compreender o metabolismo celular da Leishmania

spp. e identificar alvos terapêuticos (DE MENEZES et al., 2015). Ademais, a

verifica-se também a investigação de compostos naturais como protótipos de drogas contra leishmaniose (JESUS et al., 2017), bem como a associação desses compostos com potencial antileishmanial à sistemas de entrega, como nanopartículas e lipossomas, que aumentam o seu potencial terapêutico ao passo que diminuem a toxicidade (DAS et al., 2017). Alterações químicas em classes de moléculas como as chalconas, salicilamidas e almiramidas, a partir de estudos de estrutura-atividade, permite a produção de estruturas potentes com baixa toxicidade. Destaca-se também testes com candidatos a vacinas contra leishmaniose (BLANCO; NASCIMENTO-JÚNIOR, 2017).

QUITINA E QUITOSANA

A quitina (Figura 3) é um polissacarídeo estrutural presente no exoesqueleto de artrópodes e na parede celular de fungos e leveduras, sendo descrita pela primeira vez em 1811. É o segundo biopolímero mais abundante na natureza, ficando atrás apenas da celulose. Quimicamente, a única diferença entre a quitina e a celulose é a presença do grupo acetamida no carbono 2 da quitina, fazendo deste um polímero linear de β-(1-4)-N-acetil-D-glicosamina (ANNU et al., 2017). Esse polímero apresenta três formas polimorfas de acordo com a orientação de suas microfibrilas, α, β e γ,

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sendo a primeira a variante mais abundante na natureza (KUMAR et al., 2018; RINAUDO, 2006). A quitina possui uma massa molecular entre 30-3000 kDa e grau de acetilação superior a 90%, desta forma a quitina é insolúvel em água e na maioria dos solventes orgânicos (HAMED; ÖZOGUL; REGENSTEIN, 2016; MOURYA; INAMDAR; CHOUDHARI, 2011). A obtenção da quitina a nível industrial ocorre principalmente a partir da extração deste polímero do exoesqueleto de crustáceos. Tal processo é realizado através de desmineralização com ácidos fortes para a remoção de minerais, como o carbonato de cálcio, desproteinização alcalina ou enzimática, para a remoção de proteínas, e descolorização com peróxido de hidrogênio para remoção dos pigmentos (ANNU et al., 2017).

Figura 3 – Estrutura química da quitina e quitosana

Fonte: Autoria própria

Através da desacetilação parcial da quitina é obtida a quitosana (Figura 1), um copolímero com massa molecular variável de 50-2000 kDa e grau de desacetilação entre 80-90 % (KNAUL et al., 1998; MOURYA; INAMDAR; CHOUDHARI, 2011). A quitosana é tipicamente caracterizada por suas propriedades biocompatível, biodegradável e não tóxica, implicando na ampla utilização da quitosana em diferentes áreas, como médica, cosmética agrícola (NGO et al., 2015). Na área médica, a quitosana já demonstrou diversos efeitos como antimicrobiano (HOSSEINNEJAD; JAFARI, 2016), antidiabético e anti-inflamatório (KERCH, 2015), além do uso em cicatrização de tecidos (SHARMA et al., 2018) e carreador de fármacos (RODRIGUES et al., 2012).

Os efeitos biológicos da quitosana são conferidos pela natureza estrutural do polímero, que apresenta três grupos funcionais nas posições C-2, C-3 e C-6 são eles: grupamento amino/acetamino e hidroxilas primárias ou secundárias (Figura 1). Quando em meio ácido, com pH inferior a seu pKa de 6,3, os grupos aminas são

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protonados e a quitosana torna-se policátion (ZHANG et al., 2010), realizando assim interações eletrostáticas com diferentes superfícies negativas, como a parede bacteriana (HOSSEINNEJAD; JAFARI, 2016). A quitosana e a quitina demonstraram resultados positivos em modelo de leishmaniose cutânea in vivo, pela capacidade de imunomodulação desses polímeros (HOSEINI et al., 2016). Recentemente, um estudo explorou o efeito antileishmanial da quitosana e seus derivados (RIEZK et al., 2020). Contudo, a quitosana apresenta restrições no seu uso devido sua limitada solubilidade, sendo solúvel apenas em soluções ácidas, e elevada viscosidade. Desta forma, modificações estruturais no polímero, como a adição de grupos hidrofílicos ou grupos que aumentem a absorção in vivo da quitosana tem sido relatado na literatura (MOURYA; INAMDAR, 2008). Outra opção de modificação é a hidrólise da quitosana, produzindo os oligômeros de quitosana, ou quitooligossacarídeos (QOS).

QUITOOLIGOSSACARÍDEOS (QOS)

Os QOS são produtos da hidrólise da quitosana e são estruturalmente semelhantes ao polímero de origem. Esses se diferenciam da quitosana por apresentar inferior grau de polimerização e massa molecular, e consequentemente, maior solubilidade em pH neutro, menor viscosidade e maior absorção pelos tecidos (CHAE; JANG; NAH, 2005; PHIL et al., 2018). Os oligômeros são moléculas formadas por poucas unidades monoméricas, de forma que as propriedades desses variam significativamente com a remoção de um outra unidade monomérica, diferentemente dos polímeros (NAKA, 2014). De maneira geral, não existe consenso entre os autores no que diz respeito aos limites que diferencie os QOS de quitosana de baixa massa molecular. A falta de parâmetro de grau de polimerização que diferencia os QOS de quitosana de baixa massa molecular foi relatado anteriormente, sendo considerado QOS os polímeros com massa molecular até 10 kDa. (KIM; RAJAPAKSE, 2005). Alguns estudos conceituam como QOS cadeias com massa molecular inferior a 5 kDa ou grau de polimerização de 1 a 6 unidades monoméricas (MA et al., 2015; WU; WU; TSAI, 2015). Enquanto que outros autores, classificam os QOS como moléculas menores que 3,9 kDa e grau de polimerização inferior a 20 unidades monoméricas (HUSAIN et al., 2019).

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Assim como a quitosana, os QOS são moléculas biocompatíveis, biodegradáveis e não tóxicas. Os QOS possuem elevado potencial para serem utilizados nas áreas agrícola (DZUNG; KHANH; DZUNG, 2011), na indústria alimentícia (VELA GUROVIC et al., 2015), como polímero para revestimento de embalagens (CASTILLO et al., 2017), na área biomédica como curativo de feridas teciduais (SANDRI et al., 2017), como carreador de fármacos e vetor gênico (KLAUSNER et al., 2010; LIANG et al., 2012). Apresentam também diferentes propriedades biológicas, dentre elas, efeito antimicrobiano (SÁNCHEZ et al., 2017), antiparasitário (SHIN; KIL; PARK, 2006), antitumoral (MATTAVEEWONG et al., 2016), anti-inflamatório (AZUMA et al., 2015), antioxidante (YANG et al., 2017) e efeitos benéficos na doença de Alzheimer (DAI et al., 2018). Embora o mecanismo de ação dos QOS não esteja totalmente elucidado, acredita-se que a sua atividade está intimamente correlacionada com suas características estruturais como o grau de polimerização e grau de desacetilação (CHAE; JANG; NAH, 2005; TIAN et al., 2015).

POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO DOS QOS

Entre as inúmeras aplicações biotecnológicas da quitosana e dos QOS, destacam-se aqui as atividades antitumoral, antimicrobiana e antiparasitária.

Na década de 1970, foi descrita pela primeira vez a atividade anticâncer da quitina e quitosana (MUZZARELLI, 1977). Desde então, numerosas publicações investigam os efeitos anticâncer da quitosana e seus derivados. Os QOS demonstraram atividade anticâncer em diferentes linhagens celulares tais como células de câncer colorretal (MATTAVEEWONG et al., 2016), câncer cervical (DE ASSIS; MELO-SILVEIRA; DE OLIVEIRA, 2012), câncer pulmonar (HAN et al., 2016) e hepatoma in vivo (ZOU et al., 2019). O mecanismos de ação sugeridos para esta atividade baseia-se na supressão do fator NF-κB e dos mediadores inflamatórios, e na redução da expressão de metaloproteínases, como MMP-9 e MMP-2, desfavorecendo o processo de metástase (HONG; NGO; KIM, 2016; LUO et al., 2014; MATTAVEEWONG et al., 2016). Também é atribuído aos QOS um efeito imunomodulador (MAEDA; KIMURA, 2004; XING et al., 2017) e antiangiogênico (WU et al., 2010, 2012).

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Acerca da atividade antimicrobiana da quitosana e seus oligossacarídeos, sabe-se esta é relacionada às características estruturais do oligômero, pH da solução e tipo de microrganismo utilizado (KONG et al., 2010; PARK et al., 2004). Desta forma, há discordâncias sobre o efeito antimicrobiano dos QOS comparado ao polímero originário, a quitosana. Sendo relatado o efeito superior dos oligômeros (BENHABILES et al., 2012), enquanto que outros artigos descrevem sobre o efeito superior da quitosana (LAOKULDILOK et al., 2017; NO et al., 2002). No que diz respeito ao tipo de bactéria, considera-se que a melhor resposta dos oligômeros seja frente a bactérias Gram-negativas, devido a interação dos oligômeros catiônicos com a carga negativa superficial da bactéria (LAOKULDILOK et al., 2017; LIN; LIN; CHEN, 2009; SÁNCHEZ et al., 2017).

Sobre a atividade antiparasitária, a literatura é escassa quanto os efeitos dos QOS em parasitos. A ação direta dos oligômeros foi avaliada sobre o protozoário

Trichomonas vaginalis após incubação com QOS com grau de polimerização de 2 a 8

unidades e diferentes graus de acetilação. Os oligômeros produziram danos morfológicos no citoplasma e danos degenerativos em organelas citoplasmáticas, também foi observado diminuição do movimento flagelar e da membrana ondulante (SHIN; KIL; PARK, 2006). QOS também foram empregrados na funcionalização de nanopartículas com ácido ursólico com atividade antileishmania in vitro e in vivo (DAS et al., 2017).

Dentro deste contexto, os QOS estão inclusos no grupo de moléculas com potencial biotecnológico e terapêutico a ser investigado. A necessidade de novos compostos e terapias alternativas efetivas na atual era de resistência antimicrobiana, bem como novas moléculas para o tratamento de doenças negligenciadas aliadas a baixa toxicidade fundamenta a investigação dos efeitos biológicos dos QOS.

PRODUÇÃO DOS QOS

Para a produção de QOS é necessário a escolha de um processo que reduza o tamanho molecular da quitosana sem alterar sua estrutura química (MOURYA; INAMDAR; CHOUDHARI, 2011). Por possuir ligações glicosídicas, a quitosana é passível de hidrólise física, química ou enzimática (KIM; RAJAPAKSE, 2005; LI et al., 2016). As características estruturais dos oligômeros gerados, como a massa

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molecular, grau de desacetilação e grau de polimerização, estão relacionadas com o tipo de método de hidrólise e o tipo de quitosana escolhida. Na hidrólise química, ácidos e reagentes oxidantes são utilizados para clivar o polímero. Apesar de ser um dos métodos mais utilizados, o método químico apresenta a inconveniência da geração resíduos poluentes e elevada produção de unidades monoméricas com pouca formação de QOS. Por outro lado, os métodos físicos como micro-ondas, radiação γ e ultrasonicação, não geram poluentes e produzem maior proporção de QOS. Contudo, os métodos físicos são complexos e consomem energia de forma excessiva (LING et al., 2018).

As enzimas, por sua vez, são macromoléculas que possuem atividade de catalisar reações químicas apresentando elevada especificidade para um determinado substrato (ROBINSON, 2015). A hidrólise enzimática da quitosana pode ocorrer por enzimas β-glicosidases, que são capazes de hidrolisar as ligações glicosídicas β – (1→4). Na utilização da hidrólise enzimática, a especificidade da enzima pela quitosana também influencia no padrão dos QOS gerados (AAM et al., 2010; TIAN et al., 2015). Dentre as β-glicosidases, é possível a utilização de enzimas não específicas para a quitosana, tais como a papaína (PAN et al., 2016), lipases (LEE; XIA; ZHANG, 2008), e lisozimas (ZIMOCH-KORZYCKA; GARDRAT; CASTELLAN, 2015).

Enzimas com especificidade para a quitosana, as quitosanases, são ideais para a hidrólise desse polímero, uma vez que apresentam alta eficiência catalítica para seu substrato específico. As quitosanases são produzidas por uma diversidade de organismos, como bactérias (PECHSRICHUANG et al., 2018), fungos (CHEN; XIA; YU, 2005) e plantas (EL-SAYED et al., 2012). Essas podem exibir dois padrões de hidrólise as endoquitosanases hidrolisam a quitosana de forma randômica, gerando QOS como produto final, e as exoquitosanases que hidrolisam as ligações pela região não redutora do polímero, gerando oligômeros e monômeros.

A hidrólise gerada pelas quitosanases ocorre entre as ligações de GlcN-GlcN ou GlcNAc-GlcN, sendo estas enzimas também classificadas em subclasses de acordo com a especificidade de seu substrato (LING et al., 2018). Logo, cada enzima apresentará um perfil de hidrólise seletivo, e consequentemente, geração de oligômeros com características estruturais e atividades biológicas diferentes

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(LAOKULDILOK et al., 2017; LIN; LIN; CHEN, 2009). A hidrólise enzimática consiste na metodologia preferível para obtenção de QOS por ser um método eco-friendly, ocorrendo em condições brandas de temperatura e pH e de fácil controle sob os oligômeros produzidos (KUMAR et al., 2018; LING et al., 2018)

Nosso grupo de pesquisa isolou, em uma região de dunas na cidade de Natal/RN e identificaram um bacilo produtor de quitosanase, classificado previamente como Bacillus cereus (ARAÚJO et al., 2016). O Bacillus toyonensis é uma variante da espécie Bacillus cereus, que caracteriza um grupo de bactérias bacilares, Gram-positivas formadoras de esporos, presentes amplamente na natureza que podem ser patogênicas ou não (LIU et al., 2015). As espécies deste grupo apresentam elevada similaridade genética, muitas vezes sendo de difícil diferenciação, ainda que através de metodologias moleculares (JACKMAN et al., 2004).

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4 METODOLOGIA

CARACTERIZAÇÃO DA QUITOSANA

Quitosana de baixa massa molecular foi obtida comercialmente (Sigma Aldrich). Para comprovar os valores de massa molecular e grau de acetilação rotulados, a quitosana foi caracterizada quanto ao teor real de massa, a massa molecular e grau de desacetilação.

A determinação do teor real de massa foi realizada em um analisador de umidade por infravermelho (DOS SANTOS et al., 2009). A massa molecular foi determinada a partir da caracterização viscosimétrica da quitosana em um viscosímetro Cannon-Fenske Routine. Após determinar a viscosidade intrínseca (η), utilizando a equação empírica de Mark-Houwink-Sakurada ([η] = kMva), foi possível

relacionar a viscosidade intrínseca à massa molecular do polímero. O grau de desacetilação foi avaliado pelo método condutivimétrico (DO NASCIMENTO et al., 2017). Para os ensaios biológicos, a quitosana (QUI) foi diluída em ácido clorídrico 0,1 N e pH corrigido para 6,2.

MICRORGANISMO PRODUTOR DE QUITOSANASE

A produção da enzima quitosanase ocorreu através do cultivo de bactérias do gênero Bacillus, previamente isolado no solo de dunas na cidade de Natal, Rio Grande do Norte (ARAÚJO et al., 2016). O microrganismo foi gentilmente cedido pelo Laboratório de Engenharia Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Até o momento do uso, a cepa foi mantida em glicerol 10% (- 20 ºC). Para a confirmação da identificação da espécie, amostras puras da bactéria foram cultivadas em meio nutriente em tubos inclinados e enviados para depósito em coleção de culturas microbianas da Fundação André Tosello (Campinas, SP). Como protocolo da fundação, foi realizado o sequenciamento genético do 16s rRNA em sequenciador ABI 3500 Genetic Analyzer (Life Technologies), sequência consenso gerada no BioEdite analisadas no GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/) via MEGABLAST. Para a diferenciação das espécies B. toyonensis, B. thuringiensis e B. cereus foram utilizados os ensaios bioquímicos de consumo de manose, crescimento microbiano em cloreto de sódio a 5% e identificação de cristais de toxinas patogênicas. O estudo possui autorização pelo Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do

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Conhecimento Tradicional Associado (SISGEN) sob o número de cadastro: AD8AE98 efetuado em novembro/2018.

OBTENÇÃO DA QUITOSANASE

A quitosanase foi obtida por cultivo submerso da bactéria Bacillus toyonensis (CCT 7899), seguindo a metodologia descrita por Araújo e colaboradores (ARAÚJO et al., 2016). Colônias de B. toyonensis, cultivadas por 24 horas em placas contendo meio ágar nutriente, foram adicionadas a erlenmeyers (capacidade de 250 mL), contendo 50 mL de meio líquido. O meio líquido era constituído por peptona (6,0 g/L), sulfato de magnésio (0,5 g/L), fosfato de potássio dibásico (1,0 g/L) e quitosana (1,0 g/L). Para a produção do inóculo, o cultivo em meio líquido foi realizado em incubador rotativo, 120 rpm, 30 °C por 24 horas. Para a produção enzimática, o inóculo foi adicionado a erlenmeyers contendo meios líquidos estéreis, de mesma constituição, em uma proporção de 10% (v/v) e incubados a 30°C a 120 rpm por 48 h. Por fim, os caldos foram coletados e centrifugados a 3000 rpm a 4°C por 20 min para a retirada das células. A partir do sobrenadante coletado, a atividade enzimática foi determinada através da quantificação de açúcares redutores pelo método do ácido dinitrosalicílico (MILLER, 1959). A dosagem de proteínas também foi realizada através do método do ácido bicinconínico seguindo instruções do fabricante (ThermoFisher Scientific). A partir da concentração de proteínas e a atividade enzimática, pôde-se determinar o volume necessário de extrato para a produção dos QOS conforme descrito a seguir.

PRODUÇÃO DOS QOS

Para hidrólise da quitosana, volume equivalente a 2,5 mg do extrato enzimático foi adicionado ao substrato composto de 5 mL de quitosana a 1% em ácido clorídrico 0,1N (pH 6,0). A hidrólise enzimática ocorreu em banho maria a 55°C por 5 min e 10 min (ARAÚJO et al., 2016). Sendo denominado QOS5 as amostras obtidas com tempo de hidrólise de 5 minutos e QOS10 aquelas obtidas com 10 minutos. Decorrido o tempo de hidrólise, a reação foi interrompida por aquecimento em água fervente durante 10 min. Posteriormente, a mistura foi centrifugada a 4200 rpm por 20 min e sobrenadante coletado. Os QOS foram precipitados pela adição de álcool absoluto ao sobrenadante, na proporção 1:1 (v/v) por 12 h a 4°C. Após uma nova centrifugação

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nas mesmas condições anteriores, o precipitado (QOS) foi recolhido e liofilizados (XU et al., 2010). O rendimento foi calculado através da relação de massa entre os QOS gerados e a quitosana utilizada. Para os testes de performance os QOS foram diluídos em água acidificada e pH corrigido para 6,0 ± 0,5. A produção e caracterização dos QOS foi realizada seguindo a sequência fluxograma descrita na figura 4.

Figura 4 – Fluxograma da produção e caracterização dos QOS

Fonte: Autoria própria

CARACTERIZAÇÃO DOS QOS

4.5.1 Ressonância magnética nuclear

A mistura de oligômeros foi caracterizada inicialmente utilizando a espectroscopia de ressonância magnética nuclear - RMN (AVANCE III HD NMR SPECT 300 mhz, BRUKER), equipada com campo magnético de 7,0T, que opera nas frequências de 300,13 e 75,47 MHz para hidrogênio (1_{H) e carbono (}13_C),

respectivamente. Os experimentos foram realizados no Laboratório de Ressonância Magnética Nuclear da Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

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As amostras foram dissolvidas em alíquotas de 0,5 mL de água deuterada (D2O)

(Cambridge Isotope Laboratories). Os deslocamentos químicos (δ) foram expressos em partes por milhão (ppm) e referenciados pela porção não deuterada do solvente. As multiplicidades dos sinais de hidrogênio nos espectros de RMN 1_{H foram indicadas}

segundo a convenção: simpleto (s), dupleto (d), duplo dupleto (dd), tripleto (t), quarteto (q) e multipleto (m). Nos experimentos unidimensionais de 1_{H e de} 13_{C foram}

estabelecidos os seguintes valores para os parâmetros de aquisição: larguras espectrais de 24 e 260 ppm, intervalo para relaxação de 1s e largura de pulso de 90º de 9,60 μs (0 dB) e 10,90 μs (-3 dB) para 1_{H e}13_{C, respectivamente. A técnica DEPTq}

(Distortionless Enhancement by Polarization Transfer) foi aplicada seguindo os seguintes parâmetros: ângulos de mutação de 135°, CH e CH3 com amplitudes em

oposição aos C e CH2, descrito segundo a convenção: C (carbono não hidrogenado),

CH (carbono metínico), CH2 (carbono metilênico ou matilidênico) e CH3 (carbono

metílico). Os experimentos bidimensionais de correlação homonuclear (COSY) e heteronuclear (HSQC e HMBC) foram realizados no espectrômetro em sonda multinuclear de 5 mm, com detecção inversa, empregando-se gradiente de campo, posicionado no eixo z e magnitude de 10 A. Os valores de J utilizados para os experimentos pertinentes foram 1_J_H,C_{= 145,}n_J_H,C _{= 7, onde n ≥ 2. O grau de}

desacetilação dos oligômeros foi determinada através da equação (1), onde A1 corresponde a área média dos sinais referente aos prótons do anel da hexose C2-C6

(δ 3-6 ppm) e A2 corresponde a área média do sinal referente aos prótons da metila (-CH3) da unidade GlcNAc (δ 2 ppm).

𝐷𝐷(%) = [1 − (6 𝑥 𝐴2 3 𝑥 𝐴1⁄ )]𝑥100 (1)

4.5.2 Espectrometria de massas

Previamente a análise por espectrometria de massas, QOS5 e QOS10 foram submetidos a uma cromatografia de gel permeação para a remoção da quitosana não hidrolisada. A concentração de 10 mg/mL das amostras foi injetada em uma coluna Hiprep 16/60 Sephacryl S-100 HR, utilizando um sistema AKTÄ start acoplado a um leitor de absorbância UV a 280 nm (GE Healthcare Bio-science). Tampão acetato de sódio 0,1 M em pH 6,0 foi utilizado como eluente da corrida e o fluxo ajustado para 1 mL/min. As frações coletadas de cada amostra foram agrupadas em três grupos, de

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acordo com o tempo de eluição, e seguidas para a análise no espectrômetro de massas.

As amostras foram analisandas utilizando dois tipos de técnicas de espectrometria de massas. QOS5 foram analisados em um espectrômetro de massas por dessorção/ionização a laser auxiliada por matriz e analisador por tempo de voo, MALDI-TOF/TOF (UltraflexTOF/TOF, Bruker Daltonics). As amostras foram diluídas em TA30 (0,1 % Ácido Tricloroacético: Acetonitrila 7:3) na concentração de 10 mg/mL e misturadas a matriz de ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB) 20 mg/mL na proporção 1:1. Em seguida, as misturas foram aplicadas nas placas do MALDI. O espectro foi adquirido a uma faixa de massa carga m/z de 600-5000 Da com 30% de intensidade de laser, os parâmetros do equipamento foram ajustados para: fonte de íon 1 – 25 kV, fonte de íon 2 – 22,45 kV, refletor – 26,60 kV e refletor 2 13,30 kV, frequência de 1000 V e acumulação de 1000 espectros/disparo.

Ao passo que QOS10 e quitosana foram analisados em um sistema CLAE-MS/MS. As amostras foram diluídas em fase móvel para preparação de solução com contração de 1 mg/mL e filtradas em filtro de PTFE (0,22um). As amostras foram analisadas por CLAE-MS/MS no modo positivo com fragmentação no modo automático. A CLAE foi realizada em cromatógrafo líquido de alta eficiência (marca Shimadzu® modelo 20A) equipado com detector DAD, bomba binária, forno e injetor automático e o espectrômetro de massas (Bruker Daltonics® modelo micrOTOF™Q II) com fonte de ionização eletrospray (ESI) e analisador QTOF. A fase móvel era constituída por ácido fórmico 0,1% (A) e ácido fórmico em acetonitrila (0,1%, B), eluida de forma gradiente. O fluxo utilizado foi 1 mL/min, coluna LUNA com fase estacionária fenil-hexil 250 x 4.6 mm x 5 µm (Phenomenex®) a temperatura do forno 30 °C e volume de injeção 40 µL. Durante os 10 minutos iniciais, o gradiente da fase móvel foi de 2 % B. De 10 a 30 minutos houve um aumento de 2 % para 100 %B, em seguida, de 30 a 35 minutos 100 % B, de 35 a 40 minutos retorno para 2 % B, e finalmente manutenção em 2 % B durante os 5 minutos finais. A faixa de aquisição do detector de DAD foi 190 a 600 nm. No espectrômetro de massas, a temperatura gás de secagem foi de 220°C com fluxo 9 L/min e pressão 4,5 bar. A voltagem do capilar foi de 3,5 KV. A análise de MS foi realizada no modo varredura para íons com m/z entre 50 e 1500 e MS/MS no modo automático com energia de colisão variando para cada

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íon. O reagente Trifluoroacetato de sódio foi utilizado como calibrante interno e externo.

CITOTOXICIDADE DOS QOS

A citotoxicidade dos QOS5, QOS10 e QUI foi avaliada sobre linhagens celulares de epitélio renal de macaco verde africano (VERO E6, ATCC CRL-1586), macrófagos murinos (RAW 264.7, ATCC TIB-71), células de adenocarcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL-2) e carcinoma hepatocelular humano (HepG2; ATCC HB8065). As células foram cultivadas em placas de 96 poços em meio DMEM (Dulbecco’s

Modified Eagle’s Medium) suplementado com 10% de soro fetal bovino e incubadas a

37°C em atmosfera de 5% de CO2 até confluência. Concentrações decrescentes de

QOS5 e QOS10 e Quitosana (2 – 0,625 mg/mL) foram adicionadas às células e incubadas por 24 h nas mesmas condições descritas anteriormente. Posteriormente, o meio foi substituído por 100 µL de 3-[4,5-dimethyl-thiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) na concentração de 2 mg/mL (Sigma, St Louis,

EUA) e as placas incubadas por mais 4 h. Etanol 96% foi utilizado para dissolver os cristais de formazan, a absorbância foi mensurada em leitor de microplacas a 570 nm (Epoch, BioTek Instruments, Winooski, VT, USA). Células incubadas na ausência das amostras foram utilizadas como controle positivo de viabilidade. O resultado da viabilidade celular foi expresso em porcentagem de redução do MTT (MOSMANN, 1983).

AVALIAÇÃO DA ATIVAÇÃO DE MACRÓFAGOS PELOS QOS

O potencial imunomodulador dos QOS foi avaliado pela quantificação de nitrito no sobrenadante da cultura de macrófagos murinos (RAW 264.7). Em uma placa de 24 poços, macrófagos murinos (3x105_{células/ poço) foram cultivados a 37 ºC,}

atmosfera a 5% de CO2 em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino

por 24 h. Em seguida, o meio foi substituído por 500 µL de QOS5 ou QOS10 em diferentes concentrações (2 – 0,125 mg/mL) na presença ou ausência de 2 µg/mL/poço de lipopolissacarídeo - LPS (Sigma, St Louis, EUA). Em seguida, as amostras foram e incubadas nas condições descritas anteriormente por 24 h. O sobrenadante da cultura celular foi então coletado para dosagem indireta do óxido

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nítrico através da quantificação do nitrito utilizando o reagente de Griess (DA SILVA BARBOSA et al., 2019; GREEN et al., 1982). Em uma placa de 96 poços, 100 µL da mistura de sulfanilamida 1% (p/v), ácido fosfórico 5% (v/v), cloridrato de N-(l-naftil) etilenodiamina 0,1% e água destilada (reagente de Griess na proporção de 1:1:1:1) foram adicionados a 100 µL do sobrenadante celular de macrófagos murinos tratados com QOS5 ou QOS10. A absorbância foi mensurada a 540 nm em um leitor de microplacas (Epoch Biotek, Winooski, EUA). Macrófagos murinos incubados com meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino na presença e ausência de LPS foram utilizados como controle negativo e positivo de estimulação celular, respectivamente. O resultado foi expresso como o percentual de nitrito, comparado com o controle positivo. O nitrito de sódio (1,25 - 30 μM) foi utilizado como controle do ensaio.

ATIVIDADE ANTIMICROBIANA

4.8.1 Microrganismo e obtenção do inóculo

No ensaio antimicrobiano in vitro foram utilizados os seguintes microrganismos: cepas Gram-negativas de Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) e Klebsiella pneumoniae (ATCC 10031), cepas Gram-positivas de

Staphylococcus aureus (ATCC 29213) Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228) e Enterococcus faecalis (ATCC 29212) e as leveduras Candida albicans (ATCC 90028)

e Candida tropicalis (ATCC 13803). Os microrganismos foram cedidos pelo Laboratório de Microbiologia Clínica, Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas na Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

A padronização do inóculo dos microrganismos foi executada segundo o

Clinical and Laboratory Standards Institute (COCKERILL et al., 2012; REX et al.,

2008). Suspensões dos microrganismos citados anteriormente foram preparadas em salina estéril a 0,9% de acordo com a escala 0,5 McFarland, correspondente a 108

UFC/mL para bactérias e 106_{UFC/mL para fungos. Em seguida, esta suspensão foi}

diluída na proporção de 1:100 (v/v) em caldo Mueller Hinton, sendo a concentração utilizada para avaliação da atividade antimicrobiana.