UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Instituto de Biologia
LIVIA DE LIMA THOMAZ
GERAÇÃO DE CÉLULAS DENDRÍTICAS TOLEROGÊNICAS APÓS TRATAMENTO COM CLOROQUINA: PARTICIPAÇÃO DA VIA NÃO CANÔNICA DO FATOR DE
TRANSCRIÇÃO NUCLEAR-B (NF-B)
GENERATION OF TOLEROGENIC DENDRITIC CELLS AFTER TREATMENT WITH CHLOROQUINE: PARTICIPATION OF NONCANONICAL NUCLEAR FACTOR-B
(NF-B) SIGNALING PATHWAY
CAMPINAS 2018
GERAÇÃO DE CÉLULAS DENDRÍTICAS TOLEROGÊNICAS APÓS TRATAMENTO COM CLOROQUINA: PARTICIPAÇÃO DA VIA NÃO CANÔNICA DO FATOR DE
TRANSCRIÇÃO NUCLEAR-B (NF-B)
GENERATION OF TOLEROGENIC DENDRITIC CELLS AFTER TREATMENT WITH CHLOROQUINE: PARTICIPATION OF NONCANONICAL NUCLEAR FACTOR-B
(NF-B) SIGNALING PATHWAY
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Mestra em Genética e Biologia Molecular, na área de Imunologia.
Dissertation presented to the Biology Institute of the State University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Master's Degree in Genetics and Molecular Biology in the Immunology Area.
Orientadora: Profa. Dra. Liana Verinaud Coorientador: Dr. Rodolfo Thomé
Este exemplar corresponde à versão final da dissertação defendida pela aluna LIVIA DE LIMA THOMAZ e orientada pelo PROFA. DRA. LIANA VERINAUD
CAMPINAS 2018
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Biologia Mara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Generation of tolerogenic dendritic cells after treatment with
Chloroquine : participation of noncanonical nuclear factor- κB (NF- κB) signaling pathway Palavras-chave em Inglês:
Dendritic cells NF-kappa B
Área de concentração: Imunologia
Titulação: Mestra em Genética e Biologia Molecular
Banca examinadora:
Liana Maria Cardoso Verinaud [Orientador] Eva Burger
Thalita Rocha
Data da defesa: 06-03-2018
Programa de Pós Graduação: Genética e Biologia Molecular
Thomaz, Livia de Lima, 1990-
T368g Geração de células dendríticas tolerogênicas após tratamento com cloroquina : participação da via não canônica do fator de transcrição nuclear- κB (NF- κB) / Livia de Lima Thomaz. – Campinas, SP : [s.n.], 2018.
Orientador: Liana Maria Cardoso Verinaud. Coorientador: Rodolfo Thomé.
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia.
1. Células dendríticas. 2. NF-kappa B. I. Verinaud, Liana Maria Cardoso, 1959-. II. Thomé, Rodolfo, 1987-. III. Universidade Estadual de Campinas. Instituto
COMISSÃO EXAMINADORA
Profa. Dra. Liana Verinaud
Prof. Dra. Thalita Rocha
Prof. Dra. Eva Burger
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica da aluna.
À minha família, por todo amor e apoio dado a mim durante todo o período do meu Mestrado.
Ao meu amor Ramon, por ficar ao meu lado e me ajudar a superar as dificuldades dessa etapa da minha vida. Sem sua ajuda, eu não conseguiria chegar até aqui.
À minha orientadora, Profa. Dra. Liana Verinaud, por me aceitar como sua aluna e por confiar no meu trabalho.
Aos meus colegas de laboratório Amanda Bonfanti, Thiago Alves da Costa, Rodolfo Thomé, Janine Silva, Larissa Camargo da Rosa e Catarina Raposo por dividirem comigo o conhecimento de vocês. Em especial, agradeço à Gabriela Peron, por toda a ajuda e conversas, principalmente nas horas mais difíceis.
Agradeço também ao meu colega Pedro Firmino Dias pela amizade e ajuda com os experimentos de Western Blot.
Aos professores membros da minha banca de qualificação e de defesa de Mestrado pela contribuição dada ao meu trabalho e crescimento profissional.
RESUMO
As células dendríticas (DCs) são importantes para a regulação do funcionamento do sistema imune. No estado maduro, as DCs induzem respostas imunes; no estado imaturo, as DCs induzem tolerância e, por este motivo, também são chamadas de DCs tolerogênicas (tolDcs). Dados anteriores do nosso grupo de pesquisa demonstraram que o tratamento com Cloroquina (CQ), fármaco utilizado no controle da malária, é capaz de induzir tolDCs. Estudos acerca do papel da via do fator nuclear kappa B (NF-B) na função e atividade de DCs evidenciam que tal via é importante para o processo de maturação das DCs. Além disso, é descrito que o reconhecimento de antígenos (Ags) pelas DCs resulta na ativação de membros da família do NF-B. O NF-B pode ser ativado por duas vias diferentes, a canônica e a não canônica. A primeira está envolvida principalmente com a ativação de genes relacionados com a inflamação, enquanto a segunda regula genes necessários para a ativação de DCs e linfócitos T e B. Neste sentido, este projeto tem por finalidade avaliar a influência da via não canônica do NF-B na indução de tolDCs pela CQ. Inicialmente, foi feita uma validação dos efeitos da CQ sobre as DCs. A análise de caracterização fenotípica e funcional de DCs esplênicas mostrou que o tratamento de camundongos com a CQ resultou na indução de tolDCs. Tais células apresentaram perfil imaturo e elevada expressão gênica de citocinas anti-inflamatórias. Outro aspecto observado foi a capacidade dessas tolDCs modularem a resposta dos linfócitos T CD4+, que apresentaram reduzida proliferação e produção de citocinas características de células T reguladoras. A participação da via não canônica no efeito da CQ foi investigada em DCs diferenciadas e tratadas in vitro. Observamos que a CQ promove uma redução na ativação dessa via, já que houve uma menor expressão do componente p52 no núcleo das DCs mesmo na presença de um ativador da via, o lipopolissacarídeo (LPS). O envolvimento da via não canônica foi confirmado através de análises fenotípicas e funcionais das DCs. As características das células tratadas in vitro com CQ e CQ + LPS foram as mesmas anteriormente observadas nas DCs de camundongos tratados com CQ. Além disso, a transferência adotiva dessas DCs para camundongos nos quais se induziu EAE mostrou que o potencial terapêutico das DCs tratadas tanto com CQ quanto com CQ + LPS foi semelhante. Coletivamente, nossos dados indicam que a ação da CQ na promoção de tolDCs ocorre, em parte, devido a uma diminuição da ativação da via não canônica do NF-B.
ABSTRACT
Dendritic cells (DCs) are important for the regulation of the immune system functioning. In the mature stage, the DCs induce immune responses and, in the immature stage, DCs induce tolerance being also called tolerogenic DCs (tolDCs). Previous data from our research group showed that the treatment with Chloroquine (CQ), which is a drug used to control malaria, could induce tolDCs. Studies on the role of nuclear B factor (NF-B) pathway in the functioning and in the activity of DCs deserve attention due to recent literature findings which evidence the importance of such a pathway in the DC maturation process. Moreover, the antigen recognition by DCs results in the activation of NF-B family members. The NF-B can be activated by two different pathways, the canonical and the noncanonical. The first is associated with the activation of inflammation-related genes, whereas the second regulates genes necessary to the activation of DCs and lymphocytes T and B. In this sense, this project aims to evaluate the influence of noncanonical NF-B pathway in the induction of tolDCs by CQ. Initially, a validation of the CQ effects on DCs was performed. The analysis of phenotypic and functional characterization of splenic DCs showed that the treatment of mice with CQ induced tolDCs. Such cells presented an immature profile and an increased gene expression of anti-inflammatory cytokines. Another observed aspect was the tolDCs modulation capacity on the T CD4+ lymphocyte responses, which presented a reduced proliferation and a regulatory cell profile. The noncanonical pathway participation in the CQ effect on DCs was investigated in DCs differentiated and treated in vitro. It was found that CQ promotes a reduction in this pathway activation, since there was a lower expression of the component p52 in the DC nucleus even in the presence of a pathway activator, the lipopolysaccharide (LPS). The involvement of non-canonical NF-B pathway was confirmed by the phenotypic and functional analysis of these DCs. The characteristics of DCs treated with CQ and CQ + LPS were the same previously observed in DCs obtained from CQ-treated mice. Furthermore, the adoptive transfer of such DCs to mice in which the EAE induction was done showed that the therapeutic potential of DCs treated with CQ and CQ + LPS was similar. Collectively, our data show that the induction of tolDCs by CQ result at least in part from the reduction of noncanonical NF-B pathway activation.
ABREVIATURAS E SIGLAS
ACK do inglês, ammonium-chloride-potassium
Ag Antígeno
APC Células apresentadoras de antígenos APC do inglês, allophicocyanin (aloficocianina)
BSA do inglês, bovine sérum albumin (soro albumina bovino) CD do inglês, cluster of differentiation
cDNA do inglês, complementary deoxyribonucleic acid
(ácido desoxirribonucléico complementar)
CEMIB Centro multidisciplinar para investigação biológica CEUA Comissão de Ética para o Uso de Animais
CFA do inglês, Freund's Complete Adjuvant (adjuvante completo de Freund)
CO2 Dióxido de carbono
CQ Cloroquina
DAMPs do inglês, damage-associated molecular patterns (padrões moleculares associados a danos)
DAPI do inglês, 4',6-diamidino-2-phenylindole (4',6-diamidino-2-fenilindol) DC do inglês, dendritic cell (délula dendrítica)
DNCB Dinitroclorobenzeno
EAE Encefalomielite Autoimune Experimental ECL do inglês, enhanced chemiluminescence
EDTA do inglês, ethylenediamine tetraacetic acid (ácido etilenodiamino tetra-acético)
ELISA do inglês, enzyme-linked immunosorbent assay (ensaio de imunoabsorção enzimática)
EM Esclerose Múltipla
ERK do inglês, extracellular signal-regulated kinase (quinase regulada pela ação extracelular)
FITC do inglês, fluorescein isothiocyanate (isotiocianato de fluoresceína) FSC do inglês, forward scatter
GM-CSF do inglês, granulocyte macrophage colony-stimulating factor (fator estimulador de colônia de granulócito-macrófago)
HLA do inglês, human leukocyte antigen (antígeno leucocitário humano) HRP do inglês, horseradish peroxidase
IDO indoleamina 2,3 dioxigenase IFN-α Interferon alfa
IFN-γ Interferon gama
IL Interleucina
imDCs do inglês, immature dendritic cells (células dendríticas imaturas) IMDM do inglês, Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium
JAK/STAT do inglês, Janus kinase/signal transducers and activators of
transcription(Janus quinase/Sinal transdutor e ativador de transcrição) JNK do inglês, c-Jun N-terminal kinase (c-Jun N-terminal quinase)
KHCO3 Bicarbonato de potássio
LC do inglês, Langerhans cells (células de Langerhans)
LPS Lipopolissacarídeo
MAPK do inglês, Mitogen Activated Protein Kinases (proteína quinase ativada por mitógeno)
MAPK p38 do inglês, mitogen-activated protein kinase p38 (proteína quinase ativada por mitógeno p38)
mDCs do inglês, mature dendritic cells (células dendríticas maduras) MFI
do inglês, mean fluorescence intensity (intensidade média de fluorescência)
MHC do inglês, major histocompatibility complex (complexo de histocompatibilidade principal)
miR microRNA
MOG do inglês, myelin oligodendrocyte glycoprotein (Glicoproteína de oligodendrócito associada com a mielina)
MTT do inglês, 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (brometo de 3-(4,5-dimetiliazol-2- il)-2,5-difeniltetrazólio)
mTOR do inglês, mammalian target of rapamycin (proteína alvo da rapamicina em mamíferos)
Na2EDTA do inglês, ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate
NaCl Cloreto de sódio
NEMO do inglês, nuclear factor-kappa-B essential modulator NF-B do inglês, nuclear factor-kappa B (fator nuclear kappa B) NH4Cl Cloreto de amônio
NiCl2 Cloreto de níquel
NiSO4 Sulfato de níquel
NK do inglês, natural killer
NLR do inglês, nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors (receptores com domínio de ligação de nucleotídeos e oligomerização) NO do inglês, nitric oxide (óxido nítrico)
NOD
do inglês, nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors (receptores do tipo de oligomerização de ligação a nucleotídeos)
PAMPs do inglês, pathogen-associated molecular patterns (padrões moleculares associados a patógenos)
PAP do inglês, prostatic acid phosphatase (fosfatase ácida prostática) PBS
do inglês, phosphate buffered saline (solução salina tamponada com fosfato)
PCR do inglês, polymerase chain reaction (reação em cadeia da polimerase) PD-L1 do inglês, programmed death-ligand 1
PerCP eFLuor 710 do inglês, peridinin chlorophyll-eFluor 710 (clorofila peridinina eFluor 710)
PI3K/Akt do inglês, phosphatidylinositol 3' -kinase/protein kinase B
(fosfatidilinositol-3-quinase/proteína quinase B)
PRRs do inglês, pattern recognition receptors (receptores de reconhecimento padrão)
PVDF do inglês, polyvinydilene difluoride
RIPA do inglês, radioimmunoprecipitation assay
RLR do inglês, RIG-I-like receptors (receptores tipo RIG-I) RNA do inglês, ribonucleic acid (ácido ribonucleico)
RORγt do inglês, transcription factor RAR-related orphan receptor gamma (fator de transcrição órfão gama relacionado a RAR)
RPM Rotações por minuto
SBF Soro fetal bovino
SDS-PAGE do inglês, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel eletrophoresis SNC Sistema Nervoso Central
SSC do inglês, Side scatter
STAT do inglês, signal transducers and activators of transcription TBS do inglês, tris-buffered saline
TCR do inglês, T-cell receptor (receptor de célula T)
TGF-β do inglês, transforming growth factor-beta (fator de transformação do crescimento beta)
Th1 do inglês, type 1 T helper cell (célula T auxiliar tipo 1) Th2 do inglês, type 2 T helper cell (célula T auxiliar tipo 2) Th17 do inglês, type 17 T helper cell (célula T auxiliar tipo 17) TLR do inglês, Toll-like receptor (receptor do tipo Toll)
TNF-α do inglês, tumor necrosis factor alpha (fator de necrose tumoral-alfa) tolDCs do inglês, tolerogenic dendritic cells (células dendríticas tolerogênicas) Treg do inglês, regulatory T cell (célula T reguladora)
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Resposta imunogênica induzia pelas DCs. ... 19
Figura 2. Resposta tolerogênica induzida pelas DCs. ... 20
Figura 3. Estrutura química da CQ ... 23
Figura 4. Vias canônica e não canônica do NF-B ... 27
Figura 5. Desenvolvimento da EM. ... 32
Figura 6. Hipótese sobre a participação da via não canônica do NF-B nas DCs tratadas com CQ... ... 34
Figura 7. Procedimentos relacionados ao objetivo I. ... 44
Figura 8. Fluxograma de procedimentos relacionados ao objetivo II ... 44
Figura 9. Fluxograma de procedimentos relacionados ao objetivo III. ... 45
Figura 10. Diminuição na expressão dos marcadores de superfície em DCs após tratamento in vivo com CQ. ... 47
Figura 11. Expressão gênica aumentada de citocinas anti-inflamatórias e expressão gênica reduzida de citocinas pró-inflamatórias em DCs obtidas de camundongos tratados com CQ. ... 48
Figura 12. Redução na proliferação de linfócitos T CD4+ naive cultivados com DCs obtidas de camundongos tratados com CQ. ... 49
Figura 13. Produção característica de citocinas por linfócitos Tregs em cocultura com DCs obtidas de camundongos tratados com CQ. ... 50
Figura 14. Ativação da via não canônica em DCs após 0,5h de tratamento. ... 52
Figura 15. Ativação da via não canônica em DCs após 1h de tratamento. ... 53
Figura 17. Comparação do perfil de ativação da via não canônica em DCs após 0,5h, 1h e 18h
de tratamento com CQ. ... 55
Figura 18. Pureza dos extratos nucleares e citoplasmáticos de DCs... 56 Figura 19. Redução na expressão do componente p52 no núcleo das DCs tratadas com CQ. ... 57 Figura 20. Expressão reduzida de marcadores de superfície em DCs diferenciadas e tratadas in vitro com a CQ. ... 58 Figura 21. O tratamento das DCs in vitro com a CQ aumenta a expressão gênica de citocinas
anti-inflamatórias. ... 59
Figura 22. O tratamento das DCs in vitro com a CQ reduz a expressão gênica de citocinas
pró-inflamatórias. ... 60
Figura 23. Redução na proliferação de linfócitos T CD4+ naive e encefalitogênicos cultivados com DCs tratadas com CQ. ... 61
Figura 24. Produção de citocinas nas coculturas de linfócitos T CD4+ naive com DCs tratadas in
vitro com CQ. ... 62 Figura 25. Produção de citocinas nas coculturas de linfócitos T CD4+ encefalitogênicos com DCs tratadas in vitro com CQ. ... 63
Figura 26. Avaliação do peso dos camundongos com EAE que receberam DCs tratadas com
CQ……….. ... 65
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 16
1.1 Células Dendríticas ... 16
1.2 Respostas imunológicas iniciadas pelas células dendríticas... 18
1.3 Cloroquina ... 22
1.4 Vias de sinalização relacionadas com a atividade das células dendríticas ... 24
1.5 Uso de células dendríticas como terapia para doenças ... 28
2. JUSTIFICATIVA ... 34
3. OBJETIVOS ... 35
4. MATERIAIS E MÉTODOS ... 36
4.1 Camundongos ... 36
4.2 Tratamento dos camundongos com a Cloroquina ... 36
4.3 Preparo das amostras das células esplênicas ... 36
4.4 Diferenciação e tratamento de células dendríticas a partir de precursores da medula óssea... ... 37
4.5 Avaliação dos marcadores de superfície das células dendríticas ... 38
4.6 Cocultura ... 38
4.7 Ensaio de proliferação de linfócitos T CD4+ ... 39
4.8 Ensaio de detecção de citocinas secretadas na cocultura ... 39
4.9 Extração de RNA e conversão em DNA complementar ... 40
4.11 Imunofluorescência ... 41
4.12 Preparo do extrato nuclear das células dendríticas ... 41
4.13 Immunoblotting ... 42
4.14 Citometria de fluxo do p52 do extrato nuclear das células dendríticas ... 42
4.15 Transferência adotiva das células dendríticas tratadas in vitro para camundongos . 43 4.16 Indução da Encefalomielite Autoimune Experimental ... 43
4.17 Análise estatística ... 43
4.18 Resumo dos procedimentos ... 43
5. RESULTADOS ... 46
5.1 Caracterização fenotípica e funcional das células dendríticas obtidas de camundongos tratados com a Cloroquina ... 46
5.1.1 Células dendríticas esplênicas de camundongos tratados com Cloroquina apresentam perfil tolerogênico... 46
5.1.2 Células dendríticas esplênicas de camundongos tratados com Cloroquina apresentam aumento da expressão gênica de citocinas anti-inflamatórias ... 48
5.1.3 Células dendríticas esplênicas de camundongos tratados com Cloroquina alteram a resposta de linfócitos TCD4+ ... 49
5.2 Participação da via não canônica do NF-B na indução de células dendríticas tolerogênicas pela Cloroquina ... 51
5.2.1 Cloroquina altera perfil de ativação da via não canônica do NF-B em células dendríticas ... 51
5.2.3 Células dendríticas diferenciadas e tratadas in vitro com Cloroquina apresentam aumento
da expressão gênica de citocinas anti-inflamatórias ... 59
5.2.4 Células dendríticas tratadas in vitro com Cloroquina diminuem a proliferação de linfócitos T CD4+ ... 61
5.3 Participação da via não canônica do NF-B no efeito terapêutico das células dendríticas tratadas in vitro com a Cloroquina ... 64
5.3.1 Inibição da via não canônica do NF-B está relacionada com a melhora no quadro clínico da Encefalomielite Autoimune Experimental... 64
6. DISCUSSÃO ... 67
7. CONCLUSÃO ... 73
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 74
ANEXO I - MANUSCRITO – TRABALHO EM PARALELO ... 100
ANEXO II - DECLARAÇÃO DA COMISSÃO ÉTICA NO USO DE ANIMAIS (CEUA) ... 100
1. INTRODUÇÃO 1.1 Células Dendríticas
As células dendríticas (DCs) são conhecidas como iniciadoras e moduladoras da resposta imune (Banchereau e Steinmann, 1998) e compreendem uma família de células apresentadoras de antígenos (APCs) profissionais (Winzler et al., 1997). Tais células estão distribuídas em diferentes regiões anatômicas, incluindo a pele, o baço, os linfonodos, o timo, o fígado e o sangue (Banchereau et al., 2000). As DCs podem ser classificadas em diferentes subconjuntos de acordo com sua origem, localização, produção de citocinas e função (Mildner e Jung, 2014). Em relação à origem, as DCs podem se diferenciar a partir de um progenitor comum mieloide ou linfoide e gerar DCs dos subtipos convencional ou plasmocitoides (Martín et al., 2000). A localização, a produção de citocinas e a função desempenhada estão relacionadas com o subtipo diferenciado (Mildner e Jung, 2014).
Nos camundongos, as DCs expressam marcadores de superfície dos tipos cluster of
differentiation (CD) e major histocompatibility complex (complexo principal de histocompatibilidade), em particular, CD11c e MHC II. Esses marcadores, combinados com CD4, CD8α, CD11b e CD205, dão origem a cinco subconjuntos de DCs convencionais. Três dessas subpopulações encontram-se no baço (DCs de origem linfoide CD4 -CD8αhighCD205+CD11b-; DCs de origem mieloide CD4+CD8α-CD205-CD11b+; DCs de origem
mieloide CD4-CD8α-CD205-CD11b+). Apesar da população de origem linfoide também ser
encontrada na zona de células T do baço, tais células são predominantes no timo (Vremec e Shortman, 1997). As populações mieloides, que se localizam na zona marginal entre a polpa branca e vermelha do baço e dos linfonodos (Vremec et al., 2000), são estimuladoras eficientes de células T CD4+ e CD8+ e também podem direcionar para respostas imunes com participação de células T auxiliares tipo 2 (type 2 T helper – Th2) (Yasumi et al., 2004). Além dessas populações, há também outras duas localizadas no tecido intersticial: subconjuntos de DCs mieloides CD4-CD8α-CD205+CD11b+ e de células de Langerhans (LCs) mieloides CD4
-CD8αlowCD205highCD11b+. As LCs são encontradas nos linfonodos drenantes da pele, e a outra
subpopulação, nos demais linfonodos. As DCs plasmocitoides de camundongos são encontradas no baço, medula óssea, timo e linfonodos e expressam B220, Cr-1, CD8α, CD11c, CD205 e
MHC II (Sato e Fujita, 2007). A função principal desse subtipo de DCs é a produção de IFN-α após uma infecção viral (Nakano, Yanagita e Dee Gunn, 2001). Em humanos, as DCs expressam MHC de classe II, também denominado human leukocyte antigen (sistema antígeno leucocitário humano – HLA) e CD4, sendo as células CD11c+ de DCs mieloides e a as células CD11c- de DCs plamocitoides. As DCs mieloides expressam CD4+CD1a+CD11chighBDCA-1/CD1c+ e CD4+CD1a-CD11clowBDCA-3/CD141+, ambas com capacidade de estimular células T (Narbutt et al., 2004). Os subconjuntos de DCs plasmocitoides expressam MHC II+CD11c -CD4+CD45RA+CD123+ILT3+ILT1- (Colonna, Trinchieri e Liu, 2004). Além de serem produtoras
de IFN-α (Nakano, Yanagita e Dee Gunn, 2001), essas DCs também são capazes de induzir respostas Th1, Th2 e também tolerância (Ito et al., 2007).
No organismo, as DCs apresentam-se como células imaturas com grande capacidade endocítica e fagocítica. As DCs imaturas (imDCs) circulam pelo sangue e pelos tecidos linfoides em busca de invasores (Banchereau et al., 2000) cujo reconhecimento é feito por receptores de reconhecimento padrão (Pattern-recognition receptors – PRRs) presentes na superfície das DCs (Janeway, 1989). Os PRRs promovem a opsonização, a endocitose, a ativação do sistema complemento e de cascatas de coagulação, a ativação de vias de sinalização inflamatórias e a indução de apoptose (Janeway e Medzhitov, 2002). Esses receptores reconhecem Padrões Moleculares Associados a Patógenos (Pathogen-associated molecular pattern - PAMPs), que representam moléculas conservadas nos patógenos (Janeway, 1989) ou Padrões Moleculares Associados a Danos (Damage-associated molecular pattern molecules – DAMPs), que se caracterizam por danos ao tecido ou às células (Bianchi, 2007). Os PRRs incluem os receptores tipo Toll (Toll-like receptors - TLRs), receptores tipo NOD (NOD-like receptors - NLRs) e os receptores tipo RIG-I (RIG-I-like receptors - RLRs) (Rubartelli e Lotze, 2007). Dentre esses, os mais estudados são os receptores tipo Toll, que compreendem 10 tipos em humanos (TLRs 1-10) e 12 tipos em camundongos (TLRs 1-9 e 11-13) (Kaisho e Akira, 2006). As DCs mieloides expressam os TLRs 2, 3, 4 e 7, e as DCs plasmocitoides expressam os TLRs 7 e 9. O TLR2 pode formar um dímero com o TLR1 e reconhecer lipopeptídeos triacetilados de bactérias ou, ainda, formar um dímero com o TLR6 e reconhecer lipopetídeos diacetilados de bactérias. O TLR3 forma um homodímero e reconhece RNA dupla-fita de vírus e o homodímero de TLR4 é o receptor para o lipopolissacarídeo (LPS), um produto da parede de bactérias Gram-negativas. O TLR7 se liga ao RNA viral de simples fita, e o TLR9 é o receptor para motivos de DNA
contendo CpG não metilados presentes em bactérias e vírus (O’Neill e Bowie, 2007). Após a ligação do patógeno a um receptor na DC, a resposta imunológica é iniciada.
1.2 Respostas imunológicas iniciadas pelas células dendríticas
A resposta imunológica iniciada pelas DCs pode ser a indução da imunidade ou da tolerância (Banchereau et al., 2000). Primeiramente, em ambos os casos, ocorre o reconhecimento dos patógenos e a ativação das DCs. Uma vez ativadas, tais células realizam o processamento do antígeno (Ag), apresentando-o em sua superfície na forma de complexos peptídeo-MHC. Ags intracelulares, tais como os vírus, são processados no citosol das DCs e ligados à molécula de MHC classe I para reconhecimento por linfócitos T CD8+ citotóxicos. Já os Ags extracelulares, tais como as bactérias, são capturados, processados e apresentados na forma de complexos com a molécula de MHC classe II para reconhecimentos por linfócitos T CD4+ auxiliares (Th) (Banchereau e Steinmann, 1998).
Paralelamente ao processamento do Ag, ocorre a maturação das DCs que é caracterizada por mudanças na capacidade de processamento de Ags, aumento na expressão de moléculas coestimuladoras CD80 e CD86 (Inaba et al., 1994) e no rearranjo de moléculas de adesão que as tornam suscetíveis à migração para órgãos linfoides (Winzler et al., 1997). A maturação das DCs depende de vários sinais, incluindo o próprio reconhecimento de patógenos ou danos aos tecidos, expressão de moléculas coestimuladoras e também da produção de citocinas (Banchereau e Steinmann, 1998) e da ligação de moléculas de ativação, como o CD40 (Elgueta et al., 2009). O potencial para as DCs induzirem a resposta imune ou a tolerância está diretamente relacionado com o estado de maturação das mesmas (Li e Shi, 2015).
Quando a resposta promovida for a imunidade, ocorrerá a diferenciação de linfócitos T naive em células efetoras, após a maturação completa das DCs (Barratt-Boyes e Thomson, 2005). O tipo de linfócito induzido dependerá da classe de Ag reconhecida, conforme descrito anteriormente, e do padrão de citocinas liberadas pelas DCs. Os linfócitos Th são responsáveis por regular a atividade de outras células efetoras imunes, incluindo células T CD8+ citotóxicas
Ag-especificas e células B, assim como macrófagos não Ag-específicos, eosinófilos e células
Natural Killer (NK) (Banchereau et al., 2000). A diferenciação de células Th1 é promovida a
de IFN-γ (Trinchieri, Pflanz e Kastelein, 2003). Consequentemente, ocorre ativação do principal fator de transcrição relacionado com a diferenciação em Th1, o T-bet (Lugo-Villarieno et al., 2003). Já a liberação de IL-4 pelas DCs induz a diferenciação de células T CD4+ naive em células Th2 por ativar o fator de transcrição STAT6 (Kaplan et al., 1996). Por sua vez, os linfócitos Th17 são diferenciados na presença de IL-6, IL-17, IL-21, IL-23 e TGF-β e com a ativação do fator de transcrição órfão gama relacionado a RAR (RORγt) (Awasthi et al., 2007). O resumo de como a resposta imunogênica ocorre está na figura abaixo (Figura 1).
Figura 1. Resposta imunogênica induzia pelas DCs. No organismo, as DCs circulam pelo corpo como sentinelas em busca de invasores, nesse estágio tais células apresentam-se como células imaturas, caracterizadas pela baixa expressão de marcadores de superfície e pela alta capacidade fagocítica. Quando encontram um agente estranho, elas o capturam e migram para os órgãos linfoides secundários para apresentar o Ag processado para os linfócitos T CD4+
naive. Nesse percurso, as DCs passam pelo processo de maturação que resulta na perda da capacidade fagocítica e no
início da expressão das moléculas usadas na apresentação de Ag (MHC e CD80/CD86). Ao final desse processo, tais células adquirem o fenótipo maduro. As DCs maduras liberam diferentes tipos de citocinas que auxiliam na ativação das células T CD4+ naive em células T efetoras. Na presença de bactérias extracelulares, as DCs liberam 12 e IL-18 e induzem a diferenciação de linfócitos Th1. Helmintos, por exemplo, estimulam a liberação de IL-4 pelas DCs que, por sua vez, promovem a diferenciação de linfócitos Th2. Já os linfócitos Th17 são diferenciados na presença de citocinas como IL-6, IL-23 e TGF-β, presentes em transtornos inflamatórios crônicos e autoimunes. Além de promover a diferenciação em diferentes subconjuntos de linfócitos T auxiliares, as DCs também podem promover a diferenciação de linfócitos T CD8+ citolíticos (CTL) e de células B, com o auxílio das células Th1.
No caso da indução de tolerância, as DCs não sofrem o processo de maturação completo, permanecendo com características fenotípicas e funcionais características das imDCs (Barratt-Boyes e Thomson, 2005). Nesse caso as DCs são denominadas tolDCs e expressam pouco as moléculas coestimuladoras e MHC II além de não secretarem citocinas inflamatórias,
impossibilitando a ativação completa de linfócitos (Kim e Diamond, 2015). Lutz e Schuler (2002) ainda citam um estágio intermediário de desenvolvimento das DCs que resulta na indução de tolerância, denominado semi-maduro, no qual as DC expressam as moléculas de MHC II e coestimuladoras e apresentam uma alteração no padrão de citocinas produzidas, caracterizada pela liberação principalmente da citocina anti-inflamatória IL-10, porém não produzem citocinas pró-inflamatórias, tais como IL-12 e TNF-α. O esquema da resposta tolerogênica induzida pelas DCs encontra-se na Figura 2.
Figura 2. Resposta tolerogênica induzida pelas DCs. Em alguns casos as DCs não sofrem o processo de maturação completo e permanecem no estado imaturo, ou seja, apresentam baixa expressão dos marcadores de superfície MHC (sinal 1) e CD80/CD86 (sinal 2) e não produzem citocinas. Entretanto, algumas DCs sofrem um processo de maturação parcial, resultando na expressão dos marcadores de superfície (MHC e CD80/CD86), mas com alteração no padrão de citocinas (sinal 3) produzidas caracterizado, principalmente, pela liberação de IL-10. Nesse caso, as DCs são classificadas como semi-maduras. Nessas situações, as DCs não estão aptas a fornecerem os três sinais necessários para o início das respostas imunogênicas, direcionando a diferenciação dos linfócitos T CD4+ naive em linfócitos T reguladoras (Treg).
A tolerância imunológica é definida como a capacidade do sistema imune de não reagir frente a Ags próprios, prevenindo respostas destrutivas ao próprio organismo e, ao mesmo tempo, preservando a imunidade protetora (Schwartz, 2012). Há dois caminhos para que a tolerância do sistema imunológico seja mantida, a tolerância central e a tolerância periférica. No
primeiro caso, apenas precursores de células T no timo e precursores de células B na medula óssea, que não apresentarem afinidade por Ags próprios continuam no processo de diferenciação celular (Bolon, 2012). A tolerância periférica é importante para a eliminação de células autorreativas que escaparam da tolerância central, por exemplo, devido à falta de determinados Ags nos órgãos linfoides primários (Hämmerling et al., 1993). A indução da tolerância periférica ocorre através de vários mecanismos, incluindo a deleção de células T; a anergia de células T; a expressão de moléculas imunomoduladoras como, por exemplo, PD-L1 (Morelli e Thomson, 2007); a produção de fatores imunossupressores como IL-10, TGF-ß, IDO (Ezzelarab e Thomson, 2011), IL-27 (Ilarregui et al., 2009) e NO (Serbina et al., 2003); e a indução de Tregs (Maldonato e Andrian, 2010). A resposta de tolerância induzida pelas tolDCs envolve, principalmente, o mecanismo de tolerância periférica com a participação de linfócitos Tregs.
Estudos mostram que as DCs imaturas (Vigouroux et al., 2004) e semi-maduras (Menges et al., 2002) podem promover a diferenciação de células Treg CD4+CD25+ naturais e Tregs CD4+ induzidas secretoras de IL-10 (Tr1) in vitro e in vivo. As células Tregs podem ser diferenciadas na presença de IL-10 e IL-27 (Awasthi et al., 2007). Pot et al. (2009) descrevem que o mecanismo relacionado com a indução de Treg por IL-10 ainda não está completamente elucidado, entretanto, mencionam que a citocina IL-27 promove a diferenciação em Tr1 através da ativação dos fatores de transcrição c-Maf, IL-21 e ICOS. Contudo, Gregori et al. (2010), identificaram uma população de DCs produtoras de IL-10 (denominadas DC-10) capazes de induzir tolerância por promover a diferenciação de células T naive em células Tr1. Restaurar a tolerância imunológica para evitar reações do organismo a Ags próprios motivam pesquisas para o desenvolvimento de diferentes estratégias que visam a manter as DCs com características tolerogênicas.
O uso de patógenos na promoção de tolDCs vem sendo estudado. A Bordetella
pertussis, agente causador da coqueluche, promove uma inibição da produção de IL-12 e um
aumento na produção de IL-10 pelas DCs e induz a diferenciação de linfócitos T naive em linfócitos Tr1 (McGuirk, McCann e Mills, 2002). Assim como nesse último estudo, os efeitos descritos nas DCs após contato com a B. pertussis também foram observados com o uso da subunidade B da toxina colérica recombinante em DCs humanas (D’Ambrosio et al., 2008). Além da indução por patógenos, recursos de engenharia genética também têm sido utilizados para a indução de tolDCs. A regulação da expressão de genes relacionados com muitas funções
biológicas pode ser alcançada com o uso de microRNA (miR). No caso das DCs, foi descoberto que miR-155 (Ceppi et al., 2009), miR-21 e miR-34 (Hashimi et al., 2009) são capazes de controlar as funções dessas células. Zheng et al. (2012) mostraram que o miR-23b induz tolDCs
in vitro devido à inibição das vias de sinalização NF-B e Notch1. Outra estratégia é o uso de
agentes biológicos, tais como as citocinas. Boks et al. (2011) compararam os efeitos da vitamina D3, da dexametasona, da rapamicina e das citocinas TGFβ e IL-10 sobre a indução de tolDCs.
Apesar de todas as substâncias promoverem um fenótipo de tolDCs estável, a citocina IL-10 resultou em tolDCs mais potentes, com alta liberação de IL-10 e reduzida capacidade de ativação das células T. Ainda, apenas as tolDCs induzidas por IL-10 foram capazes de induzir células Tregs. Por fim, há a abordagem farmacológica.
Muitos agentes anti-inflamatórios e imunossupressores têm como mecanismo de ação o desenvolvimento de tolDCs (Adorini et al., 2004). Basicamente, tais medicamentos promovem uma inibição da maturação das DCs com redução na expressão das moléculas coestimuladoras e secreção de citocinas que promovem a ativação do sistema imune. Como exemplos, podemos citar o ácido acetilsalicílico (Hackstein et al., 2001), o ácido butírico (Millard et al., 2002) e análogos da vitamina D (Griffin et al., 2000; Pena e Adorini, 2000). Nosso grupo de pesquisa mostrou que a Cloroquina (CQ) também age sobre as DCs induzindo um perfil tolerogênico.
1.3 Cloroquina
Em 1891, o grupo de pesquisa de Paul Ehrlich testou o uso de análogos da CQ para o tratamento de pacientes com malária. Em seguida, outros compostos foram estudados até a descoberta da resoquina, a partir da qual foi possível realizar a síntese da CQ (Al-Bari, 2015). Estudos indicaram que a CQ é um dos agentes mais efetivos para o tratamento da malária, e variações na sua estrutura química levaram à descoberta da hidroxicloroquina, um composto três vezes menos tóxico que a CQ (Wolf, Wolf e Ruocco, 2000). A estrutura química da CQ é representada na figura 3.
N C l H N C H3 H N C H3 C H3
Figura 3. Estrutura química da CQ. Fórmula molecular: C18H26ClN3; nomenclatura IUPAC: 4-(7-cloro-4-quinolilamino) pentildietilaminoildietilamina.
Um marco histórico no estudo dos análogos da CQ ocorreu durante a segunda guerra mundial, quando observou-se que soldados que eram medicados com tais compostos para a profilaxia da malária apresentavam melhora de erupções cutâneas e da artrite reumatoide, indicando que os compostos poderiam ser utilizados para o tratamento de outras doenças. Atualmente, a CQ e seus análogos são usados para o tratamento de desordens reumáticas, cancerígenas, dermatológicas, imunológicas e doenças infecciosas (Mushtaque e Shahjahan, 2014).
O tratamento de pacientes com lúpus eritematoso sistêmico com a CQ e hidroxicloroquina auxiliou no controle da doença, reduziu o acúmulo de danos e teve um efeito benéfico na sobrevivência dos pacientes (Ruiz-Irastorza et al., 2010). A CQ e seus análogos também têm sido estudados como complemento nos regimes radioterápicos e quimioterápicos para o tratamento de câncer. Tais compostos inibem a ação dos lisossomos ou do aparecimento dos efeitos de sensibilidade que surgem quando algumas drogas quimioterápicas são usadas em combinação com a radioterapia (Vlahopoulos et al., 2014). Além disso, foi mostrado que o tratamento de pacientes portadores de lesões associadas à estomatite ulcerativa crônica com a CQ resultou na remissão de tais lesões. Esse efeito tornou o uso de análogos da CQ a primeira linha de tratamento para a estomatite ulcerativa crônica (Rodriguez-Caruncho e Marsol, 2014). A CQ também tem sido aplicada na terapia de desordens imunológicas.
Esse medicamento possui efeitos anti-inflamatórios devido à regulação da produção do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), à sinalização em macrófagos (Weber e Levitz, 2000) e à modulação do padrão de produção de citocinas (Karres et al., 1998). Em estudos anteriores do nosso grupo de pesquisa, verificamos que as DCs moduladas pela CQ possuem um efeito
terapêutico quando utilizadas como tratamento de camundongos portadores da Encefalomielite Autoimune Experimental (EAE) – o modelo experimental animal para o estudo da Esclerose Múltipla (EM). Os animais tratados apresentaram um desenvolvimento menos severo da doença em relação aos animais não tratados (Thomé et a., 2013). Na avaliação do efeito da CQ sobre as DCs observamos que esse composto promoveu alterações morfológicas importantes nas DCs, tais como a redução dos prolongamentos celulares em análises ultraestruturais por microscopia eletrônica de varredura. Além disso, verificou-se uma diminuição na expressão de moléculas envolvidas na apresentação de Ags a linfócitos T (Thomé et al., 2014). Após verificarmos que a CQ modulava as DCs para um perfil tolerogênico, passamos a investigar quais mecanismos estariam envolvidos nesse efeito. O primeiro aspecto avaliado foi o estado de ativação de algumas vias de sinalização.
1.4 Vias de sinalização relacionadas com a atividade das células dendríticas
A descoberta de que elementos das vias de sinalização são ativados durante o desenvolvimento das DCs possibilitou o desenvolvimento de estratégias para alterar a função dessas células para um perfil tolerogênico. Patil et al. (2010) apresentam uma revisão completa de todas as vias de sinalização presentes nas DCs, além de um mapa interativo disponível na internet que compila tais vias e suas interações. Diversos estudos sobre o envolvimento de vias de sinalização na diferenciação, sobrevivência e função das DCs, tais como as vias Proteína Quinase Ativada por Mitógeno (Mitogen-activated protein knase - MAPK), Janus quinase/Sinal transdutor e ativador de transcrição (Janus kinase/signal transducers and activators of transcription - JAK/STAT), Fosfatidilinositol3quinase/proteína quinase B (Phosphatidylinositol 3'
-kinase/protein kinase B - PI3K/Akt) e Fator Nuclear Kappa B (NF-B) têm sido conduzidos nos
últimos anos (Yang e Yi, 2009).
A via MAPK é composta por quinases da família das serina/treonina que têm função na transdução de sinais mitogênicos para fatores de crescimento tais como o epidermal, além do envolvimento com a indução de diferenciação celular (Nakamura et al., 1996). Existem três tipos de MAPK identificados em mamíferos: quinase regulada pela ação extracelular (Extracellular
Signal–Regulated Kinases - ERK) (Boulton et al., 1991); c-jun terminal quinase (Jun N-terminal kinases - JNK) (Kyrlakis et al., 1994); e proteína quinase ativada por mitógeno de
mamífero p38 (MAPK p38) (Cuenda e Rousseau, 2007). Foi demonstrado que o tratamento das DCs com cloreto de níquel (NiCl2)ativou a ERK e a MAPK p38 nas DCs e, que a inibição do
MAPK p38 impediu o aumento da expressão de CD83, CD86 e HLA-DR induzido pelo NiCl2
(Aiba et al., 2003). Miyazawa et al. (2008) identificaram que diferentes vias de sinalização regulam a ativação de DCs por alérgenos. Neste estudo, foi mostrado que o tratamento de DCs com dinitroclorobenzeno (DNCB) e sulfato de níquel (NiSO4) resultou em uma inibição da ERK
e do MAPK p38 com diminuição na expressão de marcadores de superfície DCs, tais como CD86 e CD40. A via de sinalização JAK/STAT também participa do processo de maturação das DCs.
Zhao et al. (2016) mostraram que o tratamento de camundongos portadores de colite experimental com a curcumina resultou no bloqueio do sinal para ativação JAK/STAT. Observou-se uma limitação na maturação das DCs, com alterações na secreção de citocinas e também na apresentação de Ags. Os autores concluíram que o efeito de inibição da ativação das DCs pela curcumina ocorre devido à modulação dessa via de sinalização. A literatura também descreve a participação da via PI3K/Akt na função das DCs. A quinase Akt é uma proteína quinase serina/treonina específica, cuja ativação resulta da atividade da Fosfatidilinositol-3-quinase, que aproxima a Akt de suas quinases ativadoras (Sarkar et al., 2004). A Akt está envolvida com a via PI3K-Akt-proteína alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) e outras vias de sinalização (Zhang et al., 2013). Essa quinase está relacionada com o desenvolvimento e a diferenciação das DCs. Van der Laar et al. (2010) mostraram que a Akt parece ser importante para o desenvolvimento de DCs mieloides e que as DCs geradas sob inibição dessa via apresentaram funcionalidade prejudicada. A sobrevivência das DCs também sofre influência da Akt. No estudo de Mattioli et al. (2009) foi demonstrado que a leptina atua como fator de sobrevivência para DCs humanas através da ativação dessa via de sinalização. Além das vias de sinalização relacionadas acima, há uma vasta literatura sobre o papel do NF-B na ativação das DCs. Adorini et al. (2004) chama a atenção para o fato de que diversas moléculas cujo alvo de ação são as DCs compartilham a característica de inibir o NF-B.
O reconhecimento de danos ou invasores pelas DCs resulta na ativação de membros da família do NF-B (Re e Strominger, 2004). O NF-B é conhecido pela sua função na regulação transcricional de genes importantes para as funções de DCs (Rescingo et al., 1998). NF-B é um nome coletivo dado para fatores de transcrição diméricos induzíveis, constituídos por membros da família Rel (RelA ou p65; RelB e c-Rel), NF-B1 (p105/p50) e NF-B2
(p100/p52) (Caamaño e Hunter, 2002). Os membros dessa família formam homodímeros e heterodímeros, exceto o RelB que forma apenas heterodímeros com p50 ou p52. Tais complexos se ligam ao DNA e promovem a ativação de diferentes genes (Ryseck et al., 1992). Em uma revisão da literatura, Baltimore (2011) cita que o NF-B desempenha funções críticas em muitos processos fisiológicos normais e patológicos, compilando aspectos da biologia do NF-B
O NF-B pode ser ativado por duas vias diferentes, a canônica e a não canônica. A via canônica é acionada por produtos microbianos e citocinas pró-inflamatórias (Karin e Bem-Neriah, 2000) e requer a participação do complexo IKK, constituído por duas subunidades quinase (IKKα e IKKß) e uma subunidade reguladora (IKKγ ou NEMO). O IKK fosforila o inibidor do NF-B (IB-α), que sofre ubiquitinação e degradação no proteassoma. Desse modo, ocorre a liberação do dímero p50/p65 para o núcleo, ocasionando a transcrição de genes pró-inflamatórios genes inflamatórios, tais como das citocinas IL-6 e IL-1β e, genes relacionados com a imunidade inata, por exemplo, ICAM-1 e VCAM-1, que são moléculas de adesão que participam do início da resposta inflamatória (Gilmore e Herscovitch, 2006). A via não canônica pode ser ativada pelo CD40 ligante (CD40L) (Coope et al., 2002), pelo fator de ativação da célula B (BAFF) (Bonizzi e Karin, 2004) ou pelo LPS (Bhattacharyya et al., 2010), entre outros. Após a ativação, o complexo IKK (formado por um homodímero de quinases IKKα) promove a fosforilação, a ubiquitinação e o processamento do p100 em p52 (Senftleben et al., 2001). Em seguida, ocorre a translocação do complexo p52-RelB para o núcleo da célula e a subsequente transcrição de genes controlados por elementos promotores específicos (Ghosh; May; Kopp, 1998). Como resultado, a via não canônica regula genes necessários para a ativação de linfócitos T e B (Lawrence, 2009) e DCs (Burkly et al., 1995) e o desenvolvimento e manutenção de órgãos linfoides secundários (Bonizzi e Karin, 2004). A figura 4 ilustra as duas vias de ativação do NF-B.
Figura 4. Vias canônica e não canônica do NF-B. A via canônica é acionada por produtos microbianos (por exemplo, o LPS) e citocinas pró-inflamatórias (por exemplo, o TNF-α). O início da ativação da via requer a participação do complexo IKK, constituído por duas subunidades quinase (IKKα e IKKß) e uma subunidade reguladora (IKKγ ou NEMO). O IKK fosforila o inibidor do NF-B (IB-α), que sofre ubiquitinação e degradação no proteassoma. Como resultado, ocorre a liberação do dímero p50/p65 para o núcleo, ocasionando a transcrição de genes pró-inflamatórios e resulta na transcrição de genes envolvidos com a resposta inflamatória. A via não canônica é ativada por fator de ativação de células B (BAFF), pela linfotoxina β, pelo LPS, entre outros. Em seguida, o complexo IKK (homodímero de quinases IKKα) promove a indução do processamento do componente p100 em p52. Posteriormente, o complexo p52-RelB transloca para o núcleo da célula e induz a transcrição de genes envolvidos com a ativação de células T, células B, DCs e com o desenvolvimento de órgãos linfoides secundários.
Estudos indicam que o componente RelB está relacionado com a diferenciação de DCs e a interrupção da sua expressão bloqueia o desenvolvimento das DCs (Burkly et al., 1995). Wu et al. (1998) demonstraram que o RelB é importante especificamente para o desenvolvimento de DCs mieloides CD8α- e não afeta o desenvolvimento de DCs linfoides CD8α+. Camundongos
deficientes para RelB indicaram que este membro do NF-B possui uma função anti-inflamatória (Xia et al., 1997). Xia et al. (1999) sugerem que a ação anti-inflamatória do RelB decorre da regulação da estabilidade de IkBα e, consequentemente, limita a ativação da via canônica. Além disso, a atividade do RelB nas DCs é regulada por p100, um precursor do p52 da via não canônica, e camundongos deficientes para p100 apresentaram um aumento do RelB e da atividade estimuladora de células T (Speirs et al., 2004). A maturação das DCs é uma etapa crítica para a ativação de respostas de células T e envolve a ativação de fatores de transcrição do NF-B.
A maturação das DCs ocorre, em parte, devido à transcrição de genes controlados pelo NF-B e, portanto, esse fator é um elemento-chave na determinação do fenótipo das DCs (O’Sullivan e Thomas, 2002). O RelB desempenha um papel na sobrevivência e na maturação das DCs (Shih et al., 2012) e também na função de apresentação de Ags pelas DCs (Tak e Firestein, 2001). Os resultados obtidos por Shih et al. (2012) indicam que o RelB também é um efetor na via canônica em DCs, sendo observado um aumento de sua expressão durante a diferenciação das DCs e uma elevada atividade na via não canônica implicando não apenas na formação esperada do dímero RelBp52, mas também na formação do dímero RelBp50. Em outro estudo, verificou-se que o LPS induz a maturação das DCs, em termos de aumento das moléculas de MHC classe II e de B7-2, e que isso ocorre de modo dependente da translocação nuclear do NF-B (Rescingo et al., 1998). De acordo com Iruretagoyena et al. (2006), os fenótipos imaturo e tolerogênico das DCs podem ser induzidos pelo bloqueio farmacológico do NF-B e essa abordagem pode ser útil para aumentar a capacidade das DCs na promoção da tolerância a Ags próprios. Assim, a inibição da ativação do NF-B tem sido uma estratégia para manter as DCs em um estado imaturo e promover a resposta imune de tolerância.
1.5 Uso de células dendríticas como terapia para doenças
As DCs desempenham uma importante função na iniciação de respostas imunes celulares e, consequentemente, seu uso como terapia para o câncer e para doenças infecciosas tem se tornado promissor. Em um ambiente tumoral, as células malignas crescem silenciosamente e, por essa razão, não promovem a ativação do sistema imune. Dessa forma, as vacinas de DCs têm por finalidade ativar tais células com Ags tumorais por métodos ex vivo, a fim de evitar que o sistema imune fique irresponsivo frente às células tumorais (Bol et al., 2016).
O primeiro Ag associado a um tumor humano foi identificado em melanomas (van der Bruggen et al., 1991). O uso de DCs derivadas de monócitos pulsadas com peptídeo do tumor em pacientes em estágio avançado de melanoma maligno resultou em respostas citotóxicas tumor-específicas, com regressão do tumor (Thurner et al, 1999). Em outro estudo clínico com pacientes portadores de melanoma, foi identificado que a vacinação com DCs pulsadas com peptídeo do melanoma induziu respostas imunes do tipo Th1 específicas para o peptídeo do tumor humano (Schuler-Thurner et al., 2002). O uso de DCs para o tratamento de tumores sólidos
também tem sido avaliado. O câncer de próstata é um exemplo de tumor sólido candidato à imunoterapia com DCs. Small et al. (2000) mostraram que a administração de DC pulsadas com uma proteína composta pela fusão do Fator Estimulador de Colônias de Granulócitos e Macrófagos (Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor - GM-CSF) com a fosfatase ácida prostática (Prostatic Acid Phosphatase - PAP) em pacientes com câncer de próstata promoveu uma redução nos níveis do Ag prostático específico. Um estudo clínico avaliou a resposta de 21 pacientes com câncer de próstata metastático à vacinação com DCs pulsadas com o xenoantígeno PAP de camundongo. Ao final do estudo, verificou-se que 6 dos 21 pacientes tiveram a doença estabilizada e que todos os pacientes desenvolveram imunidade de células T ao PAP, demonstrando que a imunização com o xenoantígeno foi capaz de quebrar a tolerância a Ags próprios (Fong et al., 2001). Além das pesquisas sobre o uso das vacinas para o tratamento de câncer, a literatura também descreve o uso das DCs como terapia para doenças infecciosas.
Vacinas contra doenças infecciosas foram uma descoberta inovadora para a medicina. Entretanto, alguns agentes infecciosos como o vírus HIV e o parasita Plasmodium falciparum, evadem os mecanismos de defesa imune e tornam falhas as abordagens da vacinação padrão (Berger e Schultz, 2003). O trabalho de Urban et al. (1999) concluiu que o agente causador da malária P. falciparum promove uma inibição da maturação das DCs e de sua habilidade de ativar linfócitos T. Contudo, a literatura também apresenta alguns trabalhos nos quais o uso de vacinas de DCs tiveram resultados promissores. Lopez et al. (2000) desenvolveram um modelo de imunização com DCs de camundongos infectados com o vírus influenza. Os animais que foram vacinados com essas DCs e posteriormente desafiados com o vírus eliminaram a infecção mais rapidamente que os animais não imunizados. Schön et al. (2001) mostraram que a imunização de camundongos com DCs pulsadas com o vírus herpes simples tipo 2 resultou no desenvolvimento de respostas imunes antivirais protetoras. Os autores ainda apontam que tais achados podem ser usados como ponto de partida para o desenvolvimento de vacinas contra outros tipos de doenças sexualmente transmissíveis por vírus. O uso de vacinas como terapia para o câncer e para doenças infecciosas visa a manter as características imunogênicas das DCs. Por outro lado, devido a suas funções de inibir a ativação do sistema imune, as tolDCs têm despertado a atenção de pesquisadores para seu uso como inibidores da rejeição de enxertos e como terapia de doenças autoimunes.
Recentemente, o efeito de agentes imunossupressores comumente utilizados para o tratamento de rejeição de enxertos e de doenças autoimunes tem sido relacionado com a indução de tolDCs (Adorini et al., 2004). A tolerância ao transplante cardíaco feito em camundongos foi prolongada pela combinação da indução de Tregs e de tolDCs. Nesse estudo, é sugerido que ocorre uma interação bidirecional na qual as tolDCs promovem a diferenciação de células Tregs e que as Tregs, por sua vez, estimulam a diferenciação de tolDCs (Min et al, 2003). Mirenda et al. (2004) realizaram um estudo com camundongos que receberam rins transplantados. Os animais foram tratados com DCs imaturas nas quais foi induzida a tolerância através do uso de dexametasona. Tais DCs foram capazes de induzir células Tregs culminando na sobrevivência dos rins transplantados. Taner et al. (2005) mostraram que não houve rejeição a um enxerto de coração feito em camundongos após recebimento de DCs imaturas do hospedeiro pulsadas com aloantigenos, devido à indução de células T reguladoras Ag específicas. DCs alogênicas de ratos foram induzidas ao perfil imaturo pela transfecção da forma negativa do IKK2 para bloquear a ativação do NF-B, resultando na indução de potentes células Tregs. O transplante dessas DCs prolongou a sobrevivência do aloenxerto de rim sem a necessidade do uso de terapia imunossupressora (Tomasoni et al., 2005). Além das pesquisas sobre o uso das tolDCs no controle da rejeição a transplantes, encontramos na literatura estudos das tolDCs como terapia para doenças autoimunes.
Doenças autoimunes ocorrem devido à perda da tolerância a Ags próprios resultando no ataque do sistema imune ao organismo do próprio indivíduo (Philips et al., 2017). Uma característica comum entre as doenças autoimunes é a indução de respostas de linfócitos T e B anormais contra Ags próprios (Van Brussel et al., 2014). Por conta dessa característica, o uso de tolDCs como moduladoras das respostas dos linfócitos tem se tornado alvo de diversos estudos.
O diabetes mellitus tipo 1 é uma doença autoimune caracterizada pela perda progressiva das células beta pancreáticas e da produção de insulina. O tratamento dessa patogênese é feito com a reposição de insulina (Nathan et al., 1993). O primeiro estudo clínico usando tolDCs em doenças autoimunes foi para o tratamento do diabetes tipo 1. Nesse caso, monócitos foram isolados dos pacientes e induzidos ao perfil tolerogênico ex vivo para, em seguida, serem injetados por via intradérmica nos pacientes. Ao final do tratamento, observou-se que a introdução de tolDCs foi bem tolerada pelos pacientes, sem aparecimento de reações adversas. Além disso, houve um aumento transitório de células B B220+CD11C- reguladoras
potencialmente benéficas para essa doença (Giannoukakis et al, 2011). A doença de Crohn é uma desordem autoimune que acomete todo o trato gastrointestinal (Bandzar, Gupta e Platt, 2013). Um estudo clínico de fase 1 foi feito para avaliar o efeito da administração intraperitoneal de tolDCs autólogas em 9 pacientes portadores da doença de Crohn. Os pacientes não apresentaram efeitos adversos e, parte deles, exibiu melhora clínica. Houve também um aumento no número de células Tregs circulantes depois das injeções de tolDCs (Jauregui-Amezaga et al., 2015).
Doenças autoimunes inflamatórias também são candidatas ao uso de tolDCs como terapia. Um caso é da artrite reumatoide, caracterizada por uma inflamação que acomete as articulações, principalmente dos pés e das mãos (Smolen, Aletaha, Mclnnes, 2016). Benham et al. (2015) realizaram um estudo clínico utilizando tolDCs para o tratamento da artrite reumatoide. Os pacientes apresentaram uma diminuição das células T pró-inflamatórias e um aumento no número de células Tregs após um mês de tratamento. Outro efeito observado foi a diminuição acentuada dos níveis circulantes da proteína C reativa, indicando uma redução na inflamação nos pacientes. Outra doença autoimune inflamatória estudada como candidata ao tratamento com tolDCs é a EM.
A EM também é uma desordem autoimune que se caracteriza por uma inflamação crônica (Haines et al., 1996). Gooneekera (2017) apresenta uma estimativa da distribuição global desta doença em 2016, bem como uma previsão dos diagnósticos de EM para 2026. O autor estima que o diagnóstico da EM é de menos de 0,1 para cada 1000 pessoas na África e no Oriente Médio e, de mais de 1,3 para cada 1000 pessoas na Europa e na América do Norte. Além disso, relata-se uma previsão de aumento de 38% dos casos na África e no Oriente Médio até 2026. O diagnóstico da EM pode ser dividido em quatro subtipos, a saber: (i) EM Remitente-recorrente, a forma mais comum, caracterizada por períodos exacerbação dos sintomas da doença seguidos de remissão com diminuição ou perda dos sintomas; (ii) EM Secundária-progressiva, na qual a doença progride com piora, com ou sem períodos de remissão ou plateaus; (iii) EM Progressiva-primária, que afeta aproximadamente 10% dos pacientes e na qual os sintomas iniciam e pioram gradativamente, sem remissão ou melhora; e (iv) EM Progressiva-recidivante, a forma mais rara, afetando menos de 5% dos pacientes e na qual a doença progride desde o início com relapsos ou exacerbações de piora dos sintomas (Goldenberg, 2012).
Nessa patogênese, as DCs da periferia ativam células T, resultando em liberação de citocinas pró-inflamatórias que auxiliam na entrada dessas células T no Sistema Nervoso Central
(SNC). No SNC, essas células T são reativadas por DCs que apresentam epítopos derivados da mielina. Subsequentemente, as células T secretam citocinas pró-inflamatórias que promovem o recrutamento de outras células inflamatórias, incluindo monócitos, células Natural Killer (NK), células T CD8+, células B e outras células T. O resultado é a desmielinização dos axônios, responsável pelos deficit sensoriais e motores característicos da EM (Xie et al., 2015). O resumos dos eventos imunológicos que ocorrem durante o desenvolvimento da EM está contemplado na figura 5.
Figura 5. Desenvolvimento da EM. As DCs da periferia são ativadas e seguem para os órgãos linfoides secundários para ativação das células T CD4+ naive, as quais são diferenciadas em células T efetoras dos tipos Th1 e Th17. As células T diferenciadas migram para o Sistema Nervoso Central (SNC) e são reativadas por DCs ou macrófagos residentes que apresentam epítopos derivados da mielina. Como resultado, as células Th1 e Th17 secretam citocinas pró-inflamatórias (por exemplo, IFN-γ e IL-17) que promovem o recrutamento de outras células inflamatórias. Essas células, principalmente os macrófagos, promovem a degradação da bainha de mielina dos neurônios que resultam nos danos sensoriais e motores característicos dessa doença.
Foram observados acúmulos de DCs mieloides (Serafini et al., 2006) e DCs plasmacitoides (Lande et al., 2008) na leptomeninge e em lesões na substância branca de pacientes com EM. De acordo com Pashenkov et al. (2001), há altos níveis de DCs no início da EM e ocorre uma redução destes níveis conforme a doença progride. Outro estudo revelou que em pacientes com EM não tratados, o número de DCs no líquido cefalorraquidiano aumenta durante uma recaída quando comparado à fase de remissão, sugerindo uma importante função das DCs na patogênese da EM (Longhini et al., 2011). O envolvimento das DCs faz com que as
mesmas se tornem alvo para terapias, as quais podem ser direcionadas para diminuir seu potencial imunogênico ou para aumentar suas características tolerogênicas (Gross, Jonuleit e Wiendl, 2012). Na EAE, as tolDCs alteram a reatividade de células T específicas para mielina e seus perfis de citocinas. A transferência dessas células para humanos pode ser capaz de reestabelecer a tolerância Ag-específica sem promover a imunossupressão geral ou a modulação do repertório imune (Raïch-Regué et al., 2012). A inibição do NF-B ou do IKKß por pequenas moléculas antagonistas produzem tolDCs com capacidade de estimular células Tregs Foxp3+, que
2. JUSTIFICATIVA
Resultados prévios do nosso grupo de pesquisa indicaram que a CQ promove alterações morfológicas e funcionais que correspondem à indução de tolDCs. Além disso, nosso laboratório também avalia a modulação do sistema imune em condições inflamatórias crônicas, utilizando como modelo a EAE. Observamos que o uso de CQ no tratamento de camundongos com EAE promoveu um aumento do número de Tregs na periferia e uma diminuição das DCs. Houve também uma alteração no padrão de produção de citocinas das células infiltrantes do SNC, o que resultou em uma doença mais branda. Tais resultados indicaram que a CQ melhora os parâmetros clínicos e imunológicos da EAE (Thomé et al., 2013).
Temos estudado os mecanismos pelos quais a CQ exerce tais efeitos sobre as DCs e, devido a evidências da literatura de que a via não canônica do NF-B participa da ativação das DCs, a relação dessa via com a indução de tolDCs pela CQ é investigada neste trabalho. Trabalhou-se com a hipótese de que a CQ exerce um papel inibidor sobre a via não canônica, favorecendo a geração de tolDCs (Figura 6).
Figura 6. Hipótese sobre a participação da via não canônica do NF-B nas DCs tratadas com CQ. Espera-se que a CQ promova um bloqueio da via não canônica resultando na indução de tolDCs.
3. OBJETIVOS
O objetivo principal deste projeto é investigar a participação da via não canônica do NF-B na indução de tolDCs após tratamento com a CQ. Tal objetivo apoia-se no alcance das seguintes metas:
I. Validação dos efeitos in vivo da CQ sobre as DCs;
II. Avaliação da participação da via não canônica do NF-B na indução de tolerância em DCs tratadas com CQ in vitro;
III. Avaliação da participação da via não canônica no efeito terapêutico das DCs tratadas in
4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 Camundongos
Os camundongos C57BL/6 fêmeas (6-8 semanas) utilizados nos experimentos foram fornecidos pelo Centro Multidisciplinar de Pesquisa Biológica, da Universidade de Campinas (UNICAMP). Os animais foram mantidos em condição livre de patógenos, em ambiente com temperatura e fotoperíodo controlados, com acesso à comida e à água autoclavadas durante todo o período do estudo. Todos os protocolos envolvendo animais de laboratório estão aprovados e foram executados de acordo com as diretrizes da Comissão de Ética para o Uso de Animais (CEUA/UNICAMP, # 4213-1).
4.2 Tratamento dos camundongos com a Cloroquina
O tratamento dos camundongos com Cloroquina foi feito de acordo com protocolo definido por Thomé et al. (2013). Cada camundongo recebeu 200 µl de solução de CQ (sal de difosfato de cloroquina, Sigma-Aldrich) na concentração de 5 mg/kg, por via intraperitoneal (i.p.) durante cinco dias consecutivos. Três dias após a última dose de CQ, os animais foram imunizados com 200 µg de MOG35-55 emulsificado com 100 µl de Adjuvante Completo de Freund
(CFA, Sigma-Aldrich) contendo 4 mg/ml de Mycobacterium tuberculosis (Difco). A emulsão foi preparada em um volume final de 200 µl, dos quais 100 µl foram administrados no dorso anterior e os outros 100 µl no dorso posterior dos camundongos, por via subcutânea. No grupo controle basal, os camundongos receberam 100 µl de solução salina tamponada com fosfato (Phosphate
buffered saline – PBS) 1x estéril por via i.p. durante cinco dias consecutivos. Os animais do
grupo controle estimulado foram imunizados com a mesma emulsão de MOG35-55 e CFA aplicada
no grupo de estudo. Sete dias após o término dos tratamentos, foi feita a eutanásia dos animais e as células esplênicas foram recolhidas e utilizadas nos ensaios. Cada grupo continha 5 camundongos.
4.3 Preparo das amostras das células esplênicas
Os baços dos camundongos tratados conforme descrito na seção 3.2 foram retirados, cortados em pedaços e tratados individualmente com 500 µl de colagenase D (0,5mg/ml, Roche) a 37˚C, por 30 minutos. Em seguida, o órgão foi macerado sobre coadores com malha de
