Cloroquina altera perfil de ativação da via não canônica do NF-B em células

De acordo com dados da literatura que mostram que a ativação da via não canônica do NF-B está relacionada com a maturação das DCs, nossa hipótese é que a CQ estaria inibindo a ativação dessa via. Assim, para todas as análises subsequentes foi incluído o LPS no tratamento das DCs, como controle positivo de ativação da via.

Primeiramente, foram conduzidos ensaios de imunofluorescência para investigar a presença do p52 no núcleo das DCs diferenciadas e tratadas in vitro com CQ, LPS e CQ + LPS. Os tratamentos foram mantidos por 0,5h, 1h e 18h.

Os resultados após 0,5h de tratamento mostraram que a presença da molécula p52 no núcleo das DCs tratadas com CQ é mais baixa em relação às DCs tratadas com LPS. Além disso, mesmo quando as DCs foram cultivadas com CQ + LPS, observou-se uma menor ativação da via comparada à ativação nas células tratadas apenas com LPS (Figura 14).

Figura 14. Ativação da via não canônica em DCs após 0,5h de tratamento. O núcleo das células foi marcado com DAPI (azul) e a presença do componente p52 (verde) foi detectada nas DCs. Barra de escala: 50 μm para todas as imagens (A). A intensidade integrada da fluorescência de p52 no núcleo foi avaliada. Os dados representam a média ± erro padrão de três experimentos, *p < 0,05 comparados ao grupo tratado com LPS (B). Notou-se que a presença do p52 no núcleo das DCs tratadas com CQ é menor em relação às DCs tratadas com LPS. No tratamento das células com CQ + LPS observou-se que a presença do p52 no núcleo se manteve reduzida, indicando que a CQ parece influenciar a ativação da via não canônica do NF-B.

Após 1h de tratamento, observou-se novamente que a maior ativação da via permaneceu para o grupo de DCs tratadas com LPS (Figura 15).

Figura 15. Ativação da via não canônica em DCs após 1h de tratamento. O núcleo das células foi marcado com DAPI (azul) e a presença do componente p52 (verde) foi detectada nas DCs. Barra de escala: 50 μm para todas as imagens (A). A intensidade integrada da fluorescência de p52 no núcleo foi avaliada. Os dados representam a média ± erro padrão de três experimentos, *p < 0,05 comparados ao grupo tratado com LPS (B). Notou-se que a presença do p52 no núcleo das DCs tratadas com CQ e com CQ+LPS é menor em relação às DCs tratadas com LPS.

O terceiro tempo de tratamento testado foi de 18h. P ara os grupos que receberam tratamento com a CQ, ocorreu novamente uma menor ativação da via em comparação as DCs tratadas com LPS (Figura 16).

Figura 16. Ativação da via não canônica em DCs após 18h de tratamento. O núcleo das células foi marcado com DAPI (azul) e a presença do componente p52 (verde) foi detectada nas DCs. Barra de escala: 50 µm para todas as imagens (A). A intensidade integrada da fluorescência de p52 no núcleo foi avaliada. Os dados representam a média ± erro padrão de três experimentos, *p ≤ 0,05 comparados ao grupo tratado com LPS (B). Novamente, a presença do p52 no núcleo das DCs tratadas com CQ e com CQ + LPS é menor em relação às DCs tratadas com LPS.

Na comparação entre os tempos de tratamento testados, notou-se que a ativação da via nas DCs tratadas com CQ e CQ + LPS apresentou pouca variação. A análise das DCs tratadas com LPS indicou um aumento na presença do p52 no núcleo das células com a progressão dos

tempos de tratamento. Esse resultado confirma dados da literatura os quais relatam que tal via apresenta um perfil de ativação lento (Mordmuller et al., 2003) (Figura 17).

Figura 17. Comparação do perfil de ativação da via não canônica em DCs após 0,5h, 1h e 18h de tratamento com CQ. (A) O núcleo das células foi marcado com DAPI (azul). A presença do componente p52 (verde) foi detectada nas DCs após a sobreposição das marcações para todos os tempos e tipos de tratamento. Barra de escala: 50 µm para todas as imagens. (B) A comparação da intensidade integrada da fluorescência de p52 nuclear foi avaliada para as DCs tratadas com CQ em relação aos grupos tratados com LPS. Os dados representam a média ± erro padrão de três experimentos, *p ≤ 0,05 comparados ao grupo tratado com LPS. A ativação da via não canônica foi mais elevada para o tempo de tratamento de 18h e para o grupo DC-LPS.

Dessa forma, concluímos que o tempo de tratamento de 18h permitiu uma melhor avaliação do efeito da CQ sobre a via não canônica nas DCs. Posteriormente, para confirmar que o tratamento das DCs com CQ resulta em uma menor ativação dessa via, foram feitos ensaios de citometria de fluxo que avaliaram a expressão do componente p52 no núcleo das células.

DCs diferenciadas in vitro e tratadas por 18h foram submetidas ao processo de separação do núcleo e citoplasma das células para avaliação da expressão do p52 no extrato nuclear. Para confirmar que a técnica de separação resultava em extratos nucleares puros, fez-se a técnica de immunoblotting com amostras de DCs sem tratamento. O anticorpo anti-histona 3 foi utilizado como marcador de núcleo e o anticorpo anti-alfa-tubulina foi utilizado como marcador de citoplasma. Os resultados indicaram que ambas as frações nucleares e citoplasmáticas estavam puras (Figura 18) e, portanto, que os extratos nucleares poderiam ser utilizados para avaliação da presença nuclear do p52.

Figura 18. Pureza dos extratos nucleares e citoplasmáticos de DCs. Após separação do núcleo e citoplasma das DCs, a pureza dos extratos foi detectada por immunoblotting. N refere-se ao extrato nuclear e C ao extrato citoplasmático.

Em seguida, a expressão do p52 no extrato nuclear das DCs tratadas com CQ e CQ + LPS foi avaliada e comparada à expressão observada em DCs tratadas com LPS. A análise indicou que as DCs tratadas com CQ isoladamente e também na presença do LPS apresentaram uma menor expressão do p52 em relação as DCs tratadas somente com LPS (Figura 19).

Figura 19. Redução na expressão do componente p52 no núcleo das DCs tratadas com CQ. A presença do p52 foi detectada dentro da gate feita nos núcleos das células marcados com DAPI. Observou-se menor ativação da via não canônica do NF-B nas DCs tratadas com CQ (A). Na comparação do MFI entre os diferentes tratamentos, notou-se que a CQ promoveu uma redução na ativação da via não canônica do NF-B nas DCs (B). Os dados representam a média ± desvio padrão de seis experimentos, *p ≤ 0,05 comparados ao grupo tratado com LPS.

Os resultados apresentados sugerem que a CQ promove uma redução na ativação da via não canônica do NF-B. Para comprovar que o efeito da CQ depende, em parte, da inibição da via não canônica do NF-B, os ensaios a seguir têm por objetivo avaliar se a indução de tolDCs observada nos experimentos in vivo se mantém na presença de um ativador da via, o LPS.

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