Caracterização fenotípica e funcional das células dendríticas obtidas de

Atualmente, sabe-se que as DCs podem ser imunogênicas ou tolerogênicas (Banchereau et al., 2000). Quando as DCs se tornam tolerogênicas, elas têm a capacidade de controlar as respostas inflamatórias por promoverem a diferenciação de células Tregs (Vigouroux et al., 2004; Menges et al., 2002). Entre os diversos métodos de indução de tolDCs descritos na literatura, temos a abordagem farmacológica. Recentemente, nosso grupo de pesquisa mostrou que a CQ possui um efeito indutor de tolerância nas DCs (Thomé et al., 2013; Thomé et al., 2014). Assim, inicialmente foi feita a validação dos efeitos da CQ sobre as DCs.

5.1.1 Células dendríticas esplênicas de camundongos tratados com Cloroquina apresentam perfil tolerogênico

Os camundongos foram tratados com a CQ e as DCs esplênicas foram avaliadas em relação aos marcadores de superfície MHC II, CD80 e CD86. Na análise da citometria de fluxo, o marcador de superfície CD11c permite a identificação das DCs dentre as células esplênicas totais e, os marcadores MHC II, CD80 e CD86 permitem verificar o estado de maturação das DCs. Dessa forma, as DCs foram identificadas pelo gate duplo positivo para CD11c e MHC II. O estado de maturação das DCs foi avaliado pela frequência das células positivas para MHC II, CD80 e CD86, assim como pela intensidade média de fluorescência (Mean Fluorescence

Os resultados indicam que o tratamento dos camundongos com CQ reduziu a frequência de células MHC II/CD11c duplo positivas e também de células CD80 e CD86 positivas em relação ao grupo de animais estimulados (Figura 10A). Na avaliação do MFI, observamos que houve uma redução significativa para os marcadores MHC II e CD86 nos animais tratados com a CQ quando comparado ao grupo controle estimulado e, apesar da redução na expressão do marcador CD80 não ter sido significativa estatisticamente, também houve uma redução de sua expressão nas DCs tratadas com CQ (Figura 10B).

Figura 10. Diminuição na expressão dos marcadores de superfície em DCs após tratamento in vivo com CQ. (A) A frequência dos marcadores de superfície das DCs (MHC II, CD80 e CD86) apresentou-se reduzida nas DCs obtidas de camundongos tratados com a CQ em relação aos animais estimulados. Os números apresentados nessa parte da figura indicam a porcentagem de células positivas para determinado marcador avaliado. (B) As intensidades médias de fluorescência do MHC II, CD80 e CD86 foram avaliadas e indicaram que houve redução na expressão de todos os marcadores, sendo essa redução mais pronunciada para o MHC II e CD86. Os dados dos gráficos representam a média ± desvio padrão de três experimentos, n = 5, *p ≤ 0,05 em relação ao grupo estimulado. Grupo controle basal: camundongos tratados com PBS 1x, Grupo controle estimulado: camundongos imunizados com a emulsão de MOG e CFA, Grupo de estudo: camundongos tratados com CQ e depois imunizados com a emulsão de MOG e CFA.

Tais resultados sugerem que as DCs de camundongos tratados com a CQ adquiriram um fenótipo imaturo característico de tolDCs. Para confirmar esses achados, foram feitos ensaios para detecção de citocinas expressas pelas DCs e também produzidas por linfócitos T CD4+ _após

contato com essas células.

A

5.1.2 Células dendríticas esplênicas de camundongos tratados com Cloroquina apresentam aumento da expressão gênica de citocinas anti-inflamatórias

Após o tratamento dos camundongos com CQ, as DCs esplênicas foram isoladas para avaliação da expressão gênica das citocinas por PCR em tempo real. Os resultados mostraram que o tratamento com de camundongos com a CQ promoveu um aumento significativo na expressão gênica das citocinas anti-inflamatórias IL-10 e IL-27, em relação ao grupo estimulado. Em contrapartida, a expressão gênica de citocinas pró-inflamatórias TNF-α e IL-6 apresentaram- se reduzidas quando comparadas ao grupo estimulado (Figura 10).

Figura 11. Expressão gênica aumentada de citocinas anti-inflamatórias e expressão gênica reduzida de citocinas pró-inflamatórias em DCs obtidas de camundongos tratados com CQ. Houve uma indução de um ambiente anti-inflamatório devido ao aumento na expressão gênica de citocinas IL-10 e IL-27 e à redução da expressão gênica de TNF-α e IL-6, após tratamento com CQ, em relação ao grupo estimulado. Os dados representam a média ± desvio padrão de três experimentos, n=5, *p ≤ 0,05 comparados ao grupo estimulado. Grupo controle basal: camundongos tratados com PBS 1x, Grupo controle estimulado: camundongos imunizados com a emulsão de MOG e CFA, Grupo de estudo: camundongos tratados com CQ e depois imunizados com a emulsão de MOG e CFA.

Esses dados indicam que a CQ exerce um papel sobre a expressão de moléculas envolvidas na inflamação de modo a proporcionar um ambiente anti-inflamatório, característico de tolDCs.

5.1.3 Células dendríticas esplênicas de camundongos tratados com Cloroquina alteram a resposta de linfócitos TCD4+

A avaliação da capacidade de apresentação de Ags a linfócitos T CD4+ naive foi feita a partir da cocultura entre DCs isoladas dos camundongos tratados e linfócitos T CD4+ naive isolados de camundongos naive. Os resultados mostram que o tratamento dos camundongos com a CQ promoveu uma redução na proliferação dos linfócitos T CD4+ _{naive quando comparada}

com a proliferação do grupo controle estimulado (Figura 12).

Figura 12. Redução na proliferação de linfócitos T CD4+ _{naive cultivados com DCs obtidas de camundongos} tratados com CQ. A proliferação das células T foi menor no grupo que continha as DCs obtidas de camundongos tratados com CQ em relação ao grupo de camundongos estimulados. Os dados representam a média ± desvio padrão de três experimentos, n=5, *p ≤ 0,05 comparados ao grupo estimulado. Grupo controle basal: camundongos tratados com PBS 1x, Grupo controle estimulado: camundongos imunizados com a emulsão de MOG e CFA, Grupo de estudo: camundongos tratados com CQ e depois imunizados com a emulsão de MOG e CFA.

Além do perfil de proliferação, experimentos adicionais foram realizados para avaliação do perfil de diferenciação dos linfócitos T CD4+ naive cultivados com as DCs. Após o

período de incubação, a presença de citocinas no sobrenadante da cultura foi analisada por meio de ensaios ELISA. Os resultados indicam que os linfócitos T CD4+ cultivados com DCs de animais tratados com CQ apresentaram produção menor das citocinas pró-inflamatórias IFN-γ e

IL-17 em relação à produção de citocinas dos animais estimulados. Por outro lado, a citocina IL- 10 se apresentou mais elevada no grupo tratado com a CQ (Figura 13). A produção de tais citocinas pelos linfócitos T CD4+ cultivados isoladamente foi baixa ou até mesmo inexistente, evidenciando que a produção dessas moléculas é dependente da interação DC-T.

Figura 13. Produção característica de citocinas por linfócitos Tregs em cocultura com DCs obtidas de camundongos tratados com CQ. Observou-se que, em relação ao grupo estimulado, a produção das citocinas pró- inflamatórias IFN-γ e IL-17 foi menor nos linfócitos T CD4+ _{cultivados com DCs tratadas com CQ, ao contrário da} citocina IL-10 que se mostrou aumentada nesse grupo. Os dados representam a média ± desvio padrão de três experimentos, n=5, *p ≤ 0,05 comparados ao grupo estimulado. Grupo controle basal: camundongos tratados com PBS 1x, Grupo controle estimulado: camundongos imunizados com a emulsão de MOG e CFA, Grupo de estudo: camundongos tratados com CQ e depois imunizados com a emulsão de MOG e CFA.

Os ensaios realizados in vivo corroboram resultados anteriores do nosso grupo de que a CQ possui um efeito indutor de tolDCs. O próximo passo foi avaliar o mecanismo de ação envolvido com o efeito indutor de tolerância pela CQ.

5.2 Participação da via não canônica do NF-B na indução de células dendríticas