Agonistas adrenérgicos ß2

CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

Agonistas adrenérgicos ß

e produção animal:

II - Relação estrutura-actividade e farmacocinética

ß

- Adrenergic agonist and animal producti

II - Structure-activity relationship and pharmacokinetic

Fernando Ramos* e Maria Irene Noronha da Silveira

Centro de Estudos Farmacêuticos da FCT - Laboratório de Bromatologia, Nutrição e Hidrologia Faculdade de Farmácia - Universidade de Coimbra 3000 - 295 Coimbra

Resumo: O presente trabalho constitui a segunda parte de uma revisão sobre agonistas adrenérgicos ß

e produção animal e nele são apresentados a relação estrutura-actividade dos referidos fármacos, bem como a sua farmacocinética. Na relação estrutura-actividade é analisada a importância da cadeia lateral e do anel aromático, bem como dos diferentes substituintes, quer em relação à potência de cada um dos fármacos, quer em relação à sua selectividade para os receptores ß. As etapas de absorção, distribuição, metabolização e elimi- nação constituem o objecto da revisão efectuada quanto à far- macocinética. A absorção, após administração dos fármacos por via oral, é especialmente estudada ao nível das diferentes par- tes do tracto gastro-intestinal. Os tempos de semi-vida dos agonistas adrenérgicos ß

e a repartição destes pelos diferen- tes tecidos e órgãos são relacionados na etapa de distribuição, enquanto que na metabolização se dá especial atenção aos metabolitos de fase II, ortometilados, glucoronoconjugados e sulfoconjugados. A fase de eliminação, especialmente por via renal, conclui este artigo de revisão, sendo dado particular destaque à influência da acção simultânea de fármacos de outros grupos na velocidade de eliminação dos agonistas adrenérgicos ß

.

Summary: This paper is the second part of a review on ß

- adrenergic agonists and animal production. Structure-activity relationship of the referred drugs is described as well as their pharmacokinetic. Aromatic ring and lateral chain drug struc- ture as well as different substitutes are described in order to know its structure-activity relationship, mainly selectivity and potency for ß-receptors. Absorption, distribution, meta- bolisation and elimination steps are the main subjects of the pharmacokinetics review. Absorption studies in the different parts of gastro-intestinal tract are related as a consequence of oral drugs administration. ß-agonists half-life and its tissues and organs repartition are studied on distribution step. Phase II metabolites, namely derivatives of O-methylation, glucuro- nidation and sulphation are described on metabolisation step.

Finally, special attention is done for the influence of different drugs simultaneous action in the ß-agonists kidney elimination.

especial, levanta um conjunto de preocupações rela- cionadas com a sua segurança/toxicidade, concreta- mente quanto à presença dos seus resíduos na carne e vísceras.

Nesse sentido, e após abordagem, num primeiro artigo, do mecanismo de acção dos agonistas adre- nérgicos ß

(Ramos e Silveira, 2000), o presente trabalho constitui a segunda parte da revisão sobre o referido grupo de medicamentos e nele são apresen- tados a sua relação estrutura-actividade e a sua farmacocinética, por forma a contribuir para um melhor conhecimento dos fármacos em estudo.

Relação estrutura-actividade

As moléculas que actuam como agonistas adrenér- gicos ß

apresentam uma estrutura essencialmente constituída por duas partes: o anel catecol base ou modificado e uma cadeia lateral com o grupo etano- lamina. Como atribuições primárias das suas acções é conferido ao anel uma importância ligada à potência, enquanto à cadeia lateral é imputada a selectividade (Dove e Franke, 1991; Morgan, 1990).

Os mecanismos químicos envolvidos na potência ficam a dever-se, principalmente, a ligações de hidrogénio e a transferência de cargas ou seja, no fundo, a interacções promovidas por electrões. A afinidade para os receptores ß depende fundamental- mente das propriedades hidrofóbicas e/ou estereos- selectivas da cadeia lateral aminada. Estas propriedades podem ser também devidas ao anel aromático e vice-versa (Dove e Franke, 1991;

Witkamp e van Miert, 1992).

Assim, verifica-se que para uma feniletanolamina ter actividade biológica ao nível dos referidos recep- tores é necessário que apresente um anel aromático substituído, uma amina carregada positivamente na cadeia lateral com um substituinte volumoso e um grupo hidroxilo no carbono ß em posição levógira, conforme esquematicamente se representa na figura 1 (Guimarães, 1994; Ruffolo et al., 1995; Smith, 1998; Witkamp e van Miert, 1992).

As substituições no anel aromático têm uma

*Correspondente: e-mail: fjramos@ci.uc.pt

Introdução

A quantidade de fármacos utilizada na produção

animal tem vindo a crescer exponencialmente,

sobretudo devido às novas formas de pecuária inten-

siva. O uso desses fármacos como promotores do

crescimento, e dos agonistas adrenérgicos ß

em

entanto, mantendo o H na posição 3, a ocupação da posição 5 por Cl, Br, CF

, OCH

(metoxi) ou CONH

(carbonilamina) provoca uma diminuição da potência, continuando a tomar o clembuterol como referência. Quando os dois Cl são substituídos por dois F há um aumento de potência, diminuindo essa mesma potência quando a substituição é feita por dois Br, I ou CN (Asato et al., 1984).

A selectividade para os receptores ß

pode ser aumentada, segundo Brès et al. (1985), fazendo-se a substituição do anel benzénico por um anel piridínico, como acontece com o pirbuterol, figura 3.

No que respeita à amina secundária na cadeia late- ral, e como se referiu atrás, figura 1, se o agonista adrenérgico ß

não se apresentar sob a forma iónica não terá actividade biológica ao nível do receptor.

Tal facto, porém, é impossível de ocorrer uma vez que, mesmo que os fármacos em análise fossem administrados sob a forma livre, o pH do estômago, ainda que de herbívoros, ou do sangue, logo promo- veriam a sua protonação, atendendo ao pKa da amina da cadeia lateral (fenoterol - 10,0; salbutamol - 9,3;

clembuterol - 9,7 e terbutalina - 10,1) (Smith, 1998) e ao facto de para valores de pH iguais ou inferiores a pKa – 2, cerca de 99% das moléculas se encontra- rem carregadas positivamente (Ramos et al., 1996) O tipo de substituintes da amina da cadeia lateral condiciona a actividade dos fármacos, parecendo esta aumentar com o tamanho daqueles, pelo menos até certo volume (Brès et al., 1985; Hochhaus e Möllmann, 1992; Witkamp e van Miert, 1992). Na série de substituintes monociano ou clorociano no anel aromático consegue-se mesmo estabelecer um efeito decrescente da acção ß

ao nível bronquiolar da seguinte ordem: terbutil > isopropil > terpentil >

ciclobutil > ciclopropil > ciclopentil, conforme o

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influência preponderante na vida dos agonistas adre- nérgicos ß

, quer em mamíferos, quer em aves, bem como ao nível da eficácia no receptor. A actividade das substâncias que apresentam um ou mais grupos fenol no anel aromático (A, B ou C, figura 1) está relacionada com a “visibilidade” desse(s) grupo(s), sendo conseguida através de ligações por pontes de hidrogénio entre o fenol e o grupo hidroxilo da seri- na existente no receptor. Na figura 2 encontra-se esquematizada uma das melhores formas de exem- plificar o que atrás fica dito: o bambuterol (x), pró-droga da terbutalina (z), necessita de ser hidroli- sado por uma estearase, no caso a butirilcolinesterase, para ser activo ao nível dos receptores ß

(Lindberg et al., 1989; Morgan, 1990).

Por outro lado, o núcleo catecol permite uma rápida desactivação através da metilação na posição 3 pela COMT, catecolamina orto-metil transferase, o que limita o efeito destas substâncias. Os grupos resorcinol, terbutalina e fenoterol, ou simples fenol na posição 4, salmeterol e salbutamol, não são substractos da COMT e por isso não são inactivados por esse meca- nismo (Hochhaus e Möllmann, 1992; Smith, 1998;

Morgan, 1990; Witkamp e van Miert, 1992). Para evitar a inactivação, resultante quer da sulfatação, quer da glucoronoconjugação, como veremos mais à frente, sintetizaram-se compostos com substituintes de átomos de halogéneo em vez de hidroxilos, de que o clembuterol e análogos são exemplo. Os átomos de halogéneos, sendo compatíveis com a ligação ao receptor, previnem a rápida desactivação metabólica que ocorre com os grupos hidroxilo do anel aromático. As substituições por halogéneos aumentam a lipofilia da porção aromática em relação aos agonistas adrenérgicos hidroxilados, prolongando, assim, a duração da sua acção (Brès et al., 1985;

Morgan, 1990; Smith, 1998).

Asato et al. (1984) afirmam que a substituição de um dos cloros do clembuterol por fluor (F), trifluor- metil (CF

) ou ciano (CN) resulta num aumento de potência, o que só é confirmado para o CN por En- gelhardt (1984). Contudo, este efeito é fortemente atenuado se substituirmos o segundo cloro por bromo (Br) ou por outro ciano (Engelhardt,1984).

Um aumento de potência é, também, referido quando o cloro na posição 3 é substituído por hidro- génio (H) e o outro, na posição 5, por F ou CN. No

Ramos F e Silveira M

Figura 1 - Esquema de feniletanolamina com actividade no receptor ß

.

Figura 2 - Fórmulas estruturais do bambuterol (x) e da terbuta- lina (z).

Figura 3 - Fórmula estrutural do pirbuterol.

substituinte da amina da cadeia lateral (Engelhardt, 1984).

Um grupo N-aril-alquil na cadeia lateral parece favorecer a especificidade para os receptores ß

, conforme o afirmam Ruffolo et al. (1995) e Grandi et al. (1998), assegurando estes últimos, ainda, que a substituição na posição 3 do anel aromático afecta a afinidade para os referidos receptores chegando mesmo a definir a seguinte ordem decrescente, Cl >

OCH

> NO

>> H, o que parece sugerir que a capacidade lipofílica é importante na afinidade para o receptor ß

, uma vez que o cloro é o mais lipófilo dos substituintes ensaiados.

Finalmente, verifica-se que o grupo hidroxilo da cadeia lateral ligado ao carbono ß em relação à amina, nomeadamente a sua configuração estereosselectiva levógira (Hieble et al., 1995; Smith, 1998), é imprescindível quer para a potência, actividade intrínseca, quer para a afinidade, propriedade extrín- seca (Brès et al., 1985; Dove e Franke, 1991; Wi- tkamp e van Miert, 1992).

Farmacocinética

A farmacocinética, definida genericamente como estudo quantitativo do comportamento dos fármacos no organismo, enquadra-se, tradicionalmente, em quatro etapas: Absorção, distribuição, metabolização e eliminação.

Absorção

A absorção, chegada do fármaco ao sangue, depende, fundamentalmente, da via de administração.

Os agonistas adrenérgicos ß

são bastante utilizados por via inalatória em medicina humana, uma vez que para o fim a que mais frequentemente se destinam, acção a nível bronco-pulmonar, é a que apresenta mais vantagens, apesar das diferenças de indivíduo para indivíduo (Hocchaus e Möllmann, 1992).

A utilização dos fármacos referidos em medicina veterinária, e sobretudo como promotores do cresci- mento animal, recorre, principalmente, à via oral, onde o pH do tracto gastro-intestinal influencia o local de absorção. O pH do estômago, independente- mente da espécie ou da idade do animal, favorece a formação de um catião na amina alifática, enquanto a natureza mais neutral do duodeno, jejuno e íleo, principalmente estes dois últimos, promovem a redução da extensão da ionização e aumentam a absorção passiva através da mucosa intestinal (Smith, 1998).

Yuge et al. (1984), num estudo com ratos, demons- traram o que atrás se disse provando que o mabuterol, administrado oralmente, não é absorvido no estômago, sendo, no entanto, facilmente absorvido no intestino delgado.

A absorção gastro-intestinal do mabuterol no Homem é, também, completa (Anónimo, 1987), o mesmo se verificando para o clembuterol que se consegue determinar no plasma vinte minutos após a sua administração oral (Meyer e Rinke, 1991), atin- gindo um máximo de concentração plasmática 2 a 3

horas após a toma (Boenisch e Quirke, 1992).

Witkamp e van Miert (1992), num artigo de revisão, referem que a absorção humana de agonistas adre- nérgicos ß

, após administração oral, varia entre 10 - 20% para a terbutalina, 30% para ritodrina, 40 - 50% para salbutamol, 80 - 90% para clembuterol e 90% para mabuterol, permitindo estes dados concluir pela utilização de clembuterol e de mabuterol quando se pretende a via oral para administração. Na figura 4 podem ser observadas as fórmulas estruturais de clembuterol, mabuterol, salbutamol e ritodrina.

A nível parenteral, importa chamar a atenção para o caso da terbutalina onde a via sub-cutânea permite uma muito mais rápida absorção do que a via oral e com uma biodisponibilidade praticamente total, o que, como já foi referido, não acontece com a via oral (Morgan, 1990).

Distribuição

A distribuição, como o nome indica, está relacio- nada com os movimentos dos fármacos desde o san- gue até aos mais diversos sítios, sejam eles de acção, metabolização, eliminação ou, mesmo de armazena- mento.

A actividade plasmática dos agonistas adrenérgi- cos ß

mostra tempos de semi-vida (t

) bastante variáveis. A título de exemplo, refira-se que no Ho- mem, o tulobuterol, cuja estrutura química se repre- senta na figura 5 juntamente com as do formoterol e do salmeterol, apresenta um tempo de semi-vida de 2,4±0,4 horas (Chasseaud e Wood, 1986), o salbuta- mol 5 horas, o formoterol 8 a 12 horas, o salmeterol 12 horas (Löfahl, 1990), enquanto clembuterol (Ya- mamoto et al., 1985) e mabuterol (Anónimo, 1987) apresentam um período mais longo, cerca de 30 ho- ras. O clembuterol apresenta, ainda, uma semi-vida que pode ser de 10 ou 24 horas, respectivamente em coelhos e em ratos (Yamamoto et al., 1985), vinte em avestruzes (van der Merwe et al., 1998) e cerca

Figura 4 - Fórmulas estruturais de clembuterol, mabuterol, salbu-

tamol e ritodrina

de três (Dave et al., 1998) ou dezoito (Meyer e Rinke, 1991), em bovinos. O cimaterol em bovinos e o fenoterol em ratos não vão além de 1 e 2 horas, respectivamente, implicando, nestes últimos dois casos, a administração oral frequente para manter o nível plasmático necessário à produção do efeito desejado (Byrem et al., 1992). Na figura 6 represen- tam-se as fórmulas estruturais do cimaterol e do fenoterol.

A distribuição dos agonistas adrenérgicos ß

atra- vés de ligação às proteínas plasmáticas é baixa ou mesmo quase nula, excepção feita naturalmente a clembuterol e outros mais lipossolúveis. Esta propriedade explicará que, a nível sanguíneo, a presença deste tipo de fármacos ocorra durante curtos períodos de tempo, podendo-se, em contra- partida, encontrar a sua presença mais prolongada em quase todos os outros tecidos (Morgan, 1990;

Morgan et al., 1986; Price e Clissold, 1989).

O mabuterol pode ser encontrado, sobretudo, no fígado, pulmões e rins, quando a administração é oral, ou pulmões, rins e orgãos secretores, como as suprarrenais e o pâncreas, quando a administração é endovenosa (Yuge et al., 1984).

A maior parte do salbutamol administrado a bovi- nos pode ser encontrada nos tecidos, fígado, rim, músculo, pulmão, baço e cérebro, sob a forma livre.

Apenas no coração parece haver mais salbutamol sulfatado que livre (Montrade et al., 1992).

Saux et al. (1986) estudaram a distribuição do clembuterol e do salbutamol, em diversos tecidos caninos, administrados por via endovenosa nas con- centrações de 5 e 50 µg/kg, respectivamente. O clembuterol e, em menor grau, o salbutamol apre- sentam boa difusão pulmonar e brônquica, 3 a 4 vezes ou 1,5 a 2 vezes melhor que no plasma, respectivamente. O clembuterol, mais lipossolúvel, tem pouca difusão no músculo cardíaco, 0,6 vezes quando comparado com o plasma, enquanto o salbu- tamol apresenta uma difusão elevada no miocárdio, 2,5 vezes, tomando o plasma como referência.

A pele preta de vitelos contém cerca de seis vezes mais clembuterol que a pele branca e a nível ocular a iris e a retina/coróide concentram a grande maioria de resíduos deste agonista adrenérgico ß

, ficando a dever-se esta fixação de clembuterol à quantidade de tecido pigmentado que possuem o pêlo negro e a retina, sobretudo (Dürsch et al., 1993; Howells et al., 1994; Meyer e Rinke, 1991; Sauer e Anderson, 1994). Pulmão, fígado e rim são os tecidos, para além dos já referidos, aqueles onde, a seguir, se encontra mais clembuterol (Smith, 1998; Smith e Paulson, 1997).

A passagem da barreira hemato-encefálica é uma capacidade atribuída ao clembuterol (Bareille et al., 1997; Lafontan et al., 1988; Saux et al., 1986), veri- ficando-se que o salbutamol é referido como quase não sendo capaz de ultrapassar a supracitada barreira em cães (Saux et al., 1986) ou como conseguindo penetrá-la no Homem (Lulich et al., 1986; Price e Clissold, 1989), fixando-se, contudo, mais ao nível da glândula pineal e da pituitária do que no cérebro propriamente dito (Caccia e Fong, 1984). Por outro lado, Fernandes (1995) avança com a hipótese de uma paralisia dos membros posteriores de suínos atribuída a agonistas adrenérgicos ß

(Lafontan et al., 1988) poder, também, corroborar a passagem da barreira hemato-encefálica, uma vez que tal paralisia seria resultante de uma perturbação da actividade dos neurónios, devida aos citados fármacos.

Curiosamente, na circulação fetal humana, parece existir uma protecção a elevadas doses na circulação materna, nomeadamente de terbutalina, salbutamol e fenoterol, que não são observáveis no feto, o que possibilita que não seja necessário eventuais ajustes terapêuticos ao nível da dose durante a gravidez (Hochhaus e Möllmann, 1992; Price e Clissold, 1989).

O mabuterol, apesar de mais lipófilo que os anteriores, também não apresenta uma passagem sig- nificativa da barreira placentária (Anónimo, 1987;

Yuge et al., 1984) o que permite alargar a conclusão anterior aos agonistas adrenérgicos ß

no geral.

Metabolização

As catecolaminas fisiológicas adrenalina e nora- drenalina são, em geral, inactivadas por dois passos metabólicos importantes, nomeadamente a orto-metilação fenólica do anel aromático via COMT e a desaminação oxidativa da cadeia lateral através da MAO, monoaminoxidase, conforme se

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Figura 5 - Fórmulas estruturais de tulobuterol, formoterol e salmeterol

Figura 6 - Fórmulas estruturais de cimaterol e fenoterol

pode observar na figura 7 (Guimarães, 1994; Gustin et al., 1989).

Acresce que, embora tal não seja evidente na figura 7, a adrenalina sofre principalmente os efeitos da COMT, sendo os seus principais metabolitos, para além do VMA (3), metadrenalina (2) e MOPEG (5), enquanto a noradrenalina sofre preferencialmente a desaminação, originando, para além do VMA (3), metabolito final das duas catecolaminas, normeta- drenalina (2) e DOPEG (4), sendo os aldeídos e o áci- do di-hidroximandélico apenas metabolitos de transição para qualquer dos casos (Guimarães, 1994).

A metabolização dos agonistas adrenérgicos ß

, enquanto derivados das catecolaminas fisiológicas, tenderá a seguir os mesmos passos. Contudo, e como já se verificou anteriormente, outros aspectos há a considerar. Assim, dada a presença de muitos grupos OH na estrutura dos fármacos em estudo, as reacções de fase I, oxidação, hidroxilação ou desalquilação, por exemplo, que têm como principal objectivo aumentar a polaridade das moléculas com vista à sua eliminação, não são, geralmente, observáveis (Sauer et al., 1996).

As reacções de metabolização serão, portanto, sobretudo de fase II, conjugação dos grupos polares iniciais através de derivados ortometilados, glucoro- noconjugados ou sulfoconjugados, dando origem a metabolitos normalmente desprovidos de actividade (Brès et al., 1985).

Os fármacos que não apresentam estrutura catecol, mas apresentam grupos hidroxilo no anel aromático, sofrem metabolização por glucoronconjugação ou sulfoconjugação, sendo o fígado e o tracto digestivo os locais privilegiados para a sua efectivação (Peyrin et al., 1986; Smith, 1998; Witkamp e van Miert, 1992). As enzimas que promovem a conjugação dos agonistas adrenérgicos ß

são a PST, fenolsulfo- transferase, que cataliza a reacção de esterificação entre um OH fenólico e um grupo sulfato, sendo as posições passíveis de sulfoconjugação a 3 e a 4 do anel aromático, embora esta última seja a preferida (Peyrin et al., 1986; Morgan, 1990; Smith, 1998;

Witkamp e van Miert, 1992). A UDPGT, uridina difosfato glucoroniltransferase, é a enzima responsável pela glucoronoconjugação (Peyrin et al., 1986).

A sulfoconjugação é predominante em bovinos (Montrade et al., 1992) e em humanos (Brès et al., 1985; Hochhaus e Möllmann, 1992; Lin et al., 1977;

Price e Clissold, 1989), ocorrendo nestes últimos, no caso de administração oral, logo ao nível da parede intestinal, antes, por isso, da absorção, dando origem a esteres sulfúricos bastantes estáveis.

A glucoronação parece ter um papel de menor importância, pelo menos em humanos, onde só parece acontecer com ritodrina usada como tocolítico, veri- ficando-se a existência, neste caso, de conjugados glucorónicos e sulfatados, em partes iguais, que não parecem possuir actividade farmacológica (Morgan,

Figura 7 - Principais etapas de biotransformação das catecolaminas (Adaptado de Guimarães, 1994).

Legenda:

1 - Adrenalina(R = CH3) / Noradrenalina (R = H)

2 -Metadrenalina(R=CH3)/Normetadrenalina(R=H)

3 - Ácido 3-metoxi 4-hidroximandélico (VMA)

4 - Di-hidroxifeniletilglicol (DOPEG)

5 - 3-metoxi 4-hidroxifeniletilglicol (MOPEG)

1990; Witkamp e van Miert, 1992). Porém, Delahaut et al. (1993) afirmam que o salbutamol na urina de bovinos aparece sobretudo sobre a forma de gluco- rónido, enquanto Hochhaus e Möllmann (1992), no coelho e no rato, atestam a importância da gluco- roconjugação sobre a sulfoconjugação.

Não se pense, porém, que a falta de grupos hidro- xilo no anel aromático é sinónimo de ausência de biotransformação.

O tulobuterol, figura 5, sem qualquer função OH e sem substituintes nas posições 3, 4, 5 e 6 do anel aromático, é metabolizado pelo Homem e pelo rato através de uma reacção de fase I, hidroxilação no anel aromático, com formação de 4-hidroxitulobuterol e 5-hidroxitulobuterol, sobretudo, mas também de dois metabolitos menores, o 3-hidroxitulobuterol e o 4-hidroxi-5-metoxitulobuterol (Brès et al., 1985).

Os estudos da metabolização do tulobuterol em caninos, ratos, coelhos e cobaias demonstraram que este fármaco apresentava metabolitos hidroxilados que poderiam vir a sofrer conjugação posterior ou mesmo a acção da COMT, sobretudo na posição 3 (Matsumura et al., 1982).

Schmid e colaboradores, citados por Boenish e Quirke (1992) e por Smith (1998), num estudo com caninos, demonstraram que o clembuterol também era sujeito a metabolização por conjugação glucoró- nica do ß-hidroxilo e da amina alifática e sulfatação da amina aromática.

No entanto, quer o estudo citado no parágrafo anterior, quer os realizados por Horiba et al. (1984) com mabuterol em ratos e por Zalko et al. (1996) com clembuterol em bovinos e em ratos, demonstra- ram que a via oxidativa era a mais importante e que originava, sobretudo, transformações na cadeia lateral.

O mesmo grupo (Zalko et al., 1998) num estudo mais recente com ratos, encontrou um metabolito importante resultante da oxidação da amina primária do clembuterol, (Z) da figura 8, ao mesmo tempo que deparou com diferenças de metabolização entre machos e fêmeas.

Na figura 8 podemos observar os diferentes passos de metabolização anteriormente referidos, sendo possível esclarecer que, independentemente do fármaco em questão, o metabolito principal é sempre a droga-mãe (ß) que, segundo Sauer et al. (1996) para o caso concreto do clembuterol se estima, no mínimo em 93% da quantidade inicial administrada.

Os metabolitos A, B, C, D e E são descritos como podendo ser originários de qualquer um dos medica- mentos (Boenisch e Quirke, 1992; Horiba et al., 1984), enquanto os compostos 1 e 2 são referidos como tendo o mabuterol por percursor (Horiba et al., 1984) e os S, T, U, V, W, X, Y e Z como possuindo a sua base no clembuterol (Boenisch e Quirke, 1992;

Zalko et al., 1998).

Como se verifica, enquanto nos casos do mabuterol e do clembuterol se encontram, especialmente, meta- bolitos com origem na cadeia lateral, nos agonistas adrenérgicos ß

com grupos hidroxilo no anel aro- mático encontram-se, sobretudo, conjugados gluco- rónicos e sulfatados.

Eliminação

A eliminação de agonistas adrenérgicos ß

está dependente da via de administração. Assim, a admi- nistração por via parenteral leva, fundamentalmente, à excrecção renal sem qualquer modificação da dro- ga-mãe, enquanto por via oral a metabolização prévia surge quase como inevitável na maioria dos casos (Morgan, 1990).

Vários estudos demonstram a afirmação anterior, como por exemplo:

A eliminação do salbutamol, após administração oral, faz-se preferencialmente sob a forma conjugada, 48,2%, enquanto que sob a forma livre se encontra apenas 31,8% do fármaco administrado. Quando a administração é endovenosa, acontece precisamente o contrário, 64,2% de salbutamol é excretado inalte- rado e só 12,0% é eliminado sob a forma conjugada (Morgan et al., 1986);

O mabuterol, 24 horas após a administração, seja per os, seja por via endovenosa, é eliminado pelos ratos na urina em cerca de 60% e 22 a 26% nas fezes (Anónimo, 1987; Yuge et al., 1984). No Homem, porém a excreção faz-se, sobretudo, por via urinária, 80%, com a via fecal a ser apenas de 3% (Anónimo, 1987);

A eliminação de clembuterol em bovinos, tal como em coelhos, caninos e ratos, ocorre fundamental- mente por via urinária e sob a forma de composto inalterado (Boenisch e Quirke, 1992);

A nível da excreção pelas fezes verifica-se, também, que o clembuterol em bovinos apresenta uma elimi- nação reduzida com valores inferiores a 2,5% da quantidade global administrada (Smith e Paulson, 1997) e que em ratos essa quantidade não pode ser ignorada, já que atinge percentagens de 20 e 30%, respectivamente para machos e fêmeas (Zalko et al., 1998);

O cimaterol, 8 horas após administração oral em vitelos, é apenas recuperado em 18,3% na urina (Byrem et al., 1992).

No que diz respeito à excreção biliar de agonistas adrenérgicos ß

ou dos seus metabolitos, ela parece ser específica de cada espécie e de cada composto em particular.

Por exemplo (Morgan, 1990; Smith, 1998):

A ractopamina, figura 9, em perus e ratos tem uma elevada excreção biliar, 35 a 60%, enquanto em suí- nos a sua eliminação é predominantemente urinária, 88%;

A eliminação biliar do salmeterol é importante em cães e ratos, 42 a 72%;

A terbutalina em ratos tem uma excreção biliar substancial, 30%, mas bastante menor em humanos e em cães, aproximadamente 2%.

A terbutalina, por sua vez, foi encontrada no leite de mulheres que amamentavam em concentrações similares às que existem biodisponíveis no plasma, logo muito pouco, o que originaria, em média, uma dose equivalente a cerca de 1% da do adulto, não tendo sido observados quaisquer efeitos adversos nos lactentes (Morgan, 1990). O salbutamol e o clembuterol, para além da terbutalina, foram

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também encontrados em leite de vaca (Smith, 1998), admitindo-se, ainda, que o mabuterol possa ser eliminado pelo leite da mulher que amamente (Anó- nimo, 1987).

Diversos estudos têm sido realizados com o objecti- vo de avaliar a influência de vários medicamentos, quando administrados simultaneamente, na excreção de agonistas adrenérgicos ß

. Stevenson et al. (1990) fizeram o estudo da influência da furosemida na eli- minação de diversos fármacos do plasma e da urina,

incluindo clembuterol, em cavalos de corrida. Se em relação ao plasma, os autores não conseguiram deter- minar o clembuterol, com ou sem furosemida, em re- lação à urina determinaram uma diminuição da sua concentração, embora a atribuissem a um efeito de di- luição provocado pelo aumento da quantidade de uri- na devido à furosemida e não a nenhuma alteração na excreção urinária do clembuterol propriamente dita.

Witkamp et al. (1996), num estudo com salbutamol em ratos, confirmaram este efeito da furosemida.

Figura 8 - Etapas do metabolismo do clembuterol e do mabuterol (adaptado de Boenisch e Quirke, 1992 e

Horiba et al., 1984)

Atendendo que a excreção do clembuterol se faz preferencialmente por via renal e sob a forma catió- nica, seria de prever que as substâncias capazes de influenciar o transporte catiónico renal interferissem naquela excreção urinária. Assim, a eliminação de clembuterol, num estudo com vitelos, foi reduzida para cerca de 35%, 80% ou 85% quando houve administração simultânea, respectivamente, de tri- metoprim, famotidina ou probenecide. Contudo, mesmo aquando da administração de trimetoprim, probenecide ou pirazinamida, conseguiu-se determinar o clembuterol, pelo que a sua utilização não pode ser

“mascarada” pelos medicamentos referidos (Gleix- ner et al., 1996 e 1997).

A cimetidina, pelo contrário, quando administrada simultaneamente com o clembuterol, aumenta para 500% a eliminação renal deste (Gleixner et al., 1997), enquanto a dexametasona, nas mesmas condições que a cimetidina, diminui a excreção fecal do agonista em causa (Groot et al., 1998). Já quanto ao probenecide e ao salbutamol, nas primeiras oito horas após a admi- nistração, Witkamp et al. (1996), verificaram um aumento da concentração de salbutamol na urina, num valor de cerca de 2 vezes superior ao grupo de controlo, que atribuíram à diminuição da quantidade de urina excretada provocada pelo probenecide.

Também o pH urinário pode afectar a reabsorção tubular dos agonistas adrenérgicos ß

tendo em aten- ção o valor do pKa do grupo amina da cadeia lateral (9 -10) o que nos leva a concluir que quanto mais elevado for o pH da urina maior reabsorção haverá (Guimarães, 1994; Witkamp et al., 1996). Nos resul- tados obtidos com bicarbonato de sódio e cloreto de amónio, substâncias co-administradas com salbutamol a ratos, não houve alteração significativa do pH da urina, quando comparada com o grupo de controlo (Witkamp et al., 1996).

No mesmo estudo (Witkamp et al., 1996), o feno- barbital, medicamento capaz de induzir a metaboli- zação através de oxidação ou de conjugação, foi o único dos fármacos ensaiados que provocou uma ligeira diminuição do salbutamol excretado na urina, sobretudo a partir do segundo dia de administração.

Duma forma geral, podemos então dizer que a eliminação dos agonistas adrenérgicos ß

se faz mais rapidamente no plasma e na urina do que nos tecidos, com o clembuterol a ser eliminado mais lentamente que o salbutamol (Witkamp e van Miert, 1992), parecendo ser a truta o animal em que mais lentamente é excretado (Smith, 1998).

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Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro. Apartado 202. 5001-911 Vila Real Codex. Portugal.

A identificação, caracterização e registo de estados patológicos de suíno em matadouro constitui uma fonte de dados importante para o controlo da condição sanitária das explorações. Para tal, existem actualmente vários sistemas de classificação das lesões encontradas em matadouro, de forma a que a informação resultante seja organizada, de forma objectiva, precisa e minuciosa, permitindo a sua eficiente utilização. A aplicação deste sistema de monitorização pelos veterinários responsáveis pela sanidade animal nas explora- ções, constitui uma ferramenta válida para o controlo e melhoria do perfil sanitário das explorações pelas quais são responsáveis. O presente trabalho descreve, de uma forma resumida, alguns dos sistemas de classificação de lesões e/ou estados patológicos que podem ser encontradas em matadouro, nomeadamente Pneumonia enzoótica, Pleurisia, Rinite atrófi- ca, Hepatite parasitária ( , Nefrite interstic i a l multifocal, Sarna sarcóptica ( ) e A r t r i t e s .

Disease surveillance in slaughterhouse it’s an im- portant source of data for health condition control of the pigs’

herds. For this purpose there are several classification systems of the lesions found in slaughterhouse, enabling to organise, with precision and in detail, the information found.

Only in this way, this information can be efficiently used by the veterinary responsible for the animal health status. T h e main aim of this work is to help these veterinarians to imple- ment this slaughter-monitoring system, using it as a robust tool to improve sanitary conditions of the herds for which they are responsible. To reach the aim of this work, it will be succinctly described some of the classification systems of le- sions or pathologies that could be found in the slaughter-hou- se, such as Enzootic pneumonia, Pleurisy, Atrophic rhinitis, Ascarid liver lesions ( , Multiples interstitial nephrites, Sarcoptic mange ( ) and Arthritis.

uma vez que permite identificar a ocorrência de doen- ças subclínicas nos efectivos, estimar a prevalência e quantificar a gravidade de lesões que representam manifestações de doenças. Permite, ainda, avaliar os benefícios obtidos pela implementação de novas práticas de maneio, alterações no ambiente e esquemas terapêuticos e imunoprofilácticos, bem como definir prioridades de acções no serviço de assistência técnica e identificar factores de risco associados a doenças.

O registo e classificação das patologias no mata- douro é uma das componentes do Sistema Integrado de Controlo de Qualidade, no qual o matadouro desempenha um papel central possibilitando o registo organizado das lesões observadas nos animais abati- dos, tendo em consideração a sua exploração de origem (GIL, 2000). Para tal, existem actualmente vários sistemas de classificação das lesões encontra- das em matadouro que permitem sistematizar a informação recolhida. Esta informação deve ser recolhida para uma ficha organizada para o efeito, como por exemplo a apresentada na figura 1.

O presente trabalho descreve, de uma forma resu- mida, sistemas de classificação para algumas das lesões e/ou patologias encontradas em matadouro, nomeadamente Pneumonia enzoótica, Pleurisia, Rinite atrófica, Hepatite parasitária ( , Nefrite intersticial multifocal, Sarna sarcóptica e Artrites.

As lesões características de Pneumonia enzoótica

( ) surgem como áreas

de consolidação (hepatização) do parênquima pul- m o n a r, principalmente a nível dos lobos apicais e cardíacos (Fig. 2) (TAYLOR, 1986 e POINTON

., 1992).

Quando se avalia o significado da pneumonia em suínos, deve considerar-se paralelamente a influên- cia de determinadas patologias e infecções secundá- rias. Por exemplo, s abe-se que o aumento da prevalência de Rinite atrófica e de Ascaridiose está associado a um concomitante aumento de pneumonia e que existe uma correlação positiva entre a preva- lência de pneumonia e a de pleurisia, sugerindo que

*Correspondente: e-mail: mmvpinto@utad.pt

Existem muitos estados patológicos que compro-

metem negativamente os índices de produtividade e

a rentabilidade das suiniculturas, os quais podem ser

monitorizados em matadouro, através do exame

periódico de um número de animais representativo

do efectivo (MORÉS ., 2000). Segundo POIN-

TON . (1992) e MORÉS . (2000) este sistema

de monitorização assume uma importância r e l e v a n t e ,

Neste sistema, as lesões de hepatização pulmonar são classificadas utilizando-se a graduação apresen- tada no Quadro 1.

o controlo da primeira reduza a incidência da segun- da. De salientar também que a prevalência e o grau de lesão de pneumonia é um excelente indicador das condições de exploração dos animais, como por exemplo uma deficiente ventilação (POINTON

, 1992).

Existem inúmeros sistemas de classificação das lesões de pneumonia enzoótica. Neste trabalho, fare- mos referência ao sistema de classificação descrito por MORÉS . (2000), o qual avalia independen- temente cada lobo pulmonar, sendo este dividido em quatro partes iguais, correspondendo cada uma a 25% do lobo (Fig. 3).

Exemplo de uma ficha para a recolha de dados no matadouro

Pulmão com focos de hepatização nos lobos apical e cardíaco.

(Fonte: AFIS: Arquivo Fotográfico de Inspecção Sanitária - UTA D ) .

Divisão dos lobos pulmonares para classificação das lesões. (Adaptado de MORÉS ., 2000).

Sistema de classificação das lesões de pneumonia enzoótica (Adaptado de MORÉS . 2000).

Segundo POINTON . (1992) a natureza das lesões (aguda ou crónica) deve ser também avaliada e registada.

Segundo POINTON . (1992) e CUBERO . (1997) alguns dos agentes etiológicos primários responsáveis pela pleurisia, associada ou não à infla-

APICAL ESQUERDO

APICAL DIREITO

CARDIACO ESQUERDO

CARDIACO DIREITO

ACESSÓRIO

DIAFRAGMÁTICO ESQUERDO

DIAFRAGMÁTICO DIREITO

pode verificar-se a existência de focos característicos de necrose no parênquima pulmonar, os quais podem estar encapsulados e abcessos pulmonares. Podem o b s e r v a r-se ainda pleurisia e pericardite fibrinosa com aderências (SOBESTIANSKY ., 1999).

Os prejuízos que advêm da pleuropneumonia são, para além da elevada mortalidade na forma aguda, o fraco desenvolvimento dos animais na forma crónica e as rejeições no matadouro (TAYLOR, 1986; POIN- TON ., 1992; SOBESTIANSKY ., 1999).

As lesões de rinite atrófica (Fig. 4), provocadas

por e estirpes toxigénicas

de , podem ser classificadas

recorrendo aos sistema proposto por ITP (1994), no qual, cada concha nasal, assim como o tabique nasal, são avaliados entre 0 e 4, segundo os critérios des- critos nos Quadros 3 e 4.

A classificação final, obtida pela adição dos valo- res obtidos para cada uma das quatro conchas e para o tabique, fica compreendida entre 0 e 20.

Para avaliar o grau das lesões é necessário seccionar transversalmente o focinho a nível do 1º pré-molar (Fig. 5).

Sistema de classificação das lesões de rinite atrófica refrentes à deformação sofrida pelo tabique nasal (Adaptado de ITP, 1994).

mação de outras serosas, são ,

, ,

, e

. Julgamos importante acrescentar que quando a inflamação de várias serosas não é acompanha de artrite, será pouco provável que os responsáveis etiológicos sejam

e , uma vez que estes dois

agentes apresentam uma elevada afinidade pelas ar- ticulações (POINTON ., 1992).

A classificação adoptada neste trabalho, descrita no quadro seguinte, prevê a presença ou ausência de lesão, a localização da pleurisia (costal e/ou visceral) e o seu carácter agudo ou crónico.

Quando a pleurisia apresenta lesões características

da infecção por ,

ainda que não seja classificada separadamente, deve ser registada como pleuropneumonia.

Esta pleuropneumonia, é uma entidade clínica independente, normalmente restrita à cavidade torá- cica, na qual os lobos diafragmático e cardíaco direitos são envolvidos com maior frequência e a pleura adjacente às lesões pulmonares está, invariavelmente, afectada (POINTON ., 1992).

Nos casos agudos, que conduzem a uma elevada mortalidade, as lesões encontradas são áreas de consolidação pulmonar de aspecto hemorrágico, recobertas por espessa camada de fibrina, para além de exsudação serofibrinosa e fibrino-sanguinolenta nas cavidades pleural e pericárdica. Na forma crónica, aquela que surge mais frequentemente em matadouro,

et al

Sistema de classificação das pleurisias (Adaptado de POINTON ., 1992 e MORÉS ., 2000).

Lesão de rinite atrófica (Adaptado de ITP, 1994)

Sistema de classificação das lesões de rinite atrófica para cada concha nasal (Adaptado de ITP, 1994).

A monitorização destas lesões pode ser usada para controlar a eficácia dos programas de desparasitação.

Para além dos custos directos da infestação por ascaris, existe um potencial efeito indirecto desta parasitose no aumento do índice de conversão e na exacerbação das patologias respiratórias devido às migrações lar- vares. Os prejuízos que advêm das rejeições dos fígados no matadouro devem ser igualmente consi- derados (TAYLOR, 1986; BERNARDO ., 1990;

P O I N TON ., 1992; SOBESTIANSKY . , 1999; MORÉS ., 2000).

A importância do registo das lesões de nefrite intersticial multifocal resulta destas poderem estar associadas à leptospirose (BAKER ., 1989).

P O I N TON . (1992) referem o isolamento de Leptospira em 83% de 42 rins reprovados na inspecção sanitária por presença de nefrite intersticial mult i f o- cal. Estas lesões podem ser classificadas utilizando-se a graduação apresentada no Quadro 6.

Local de secção do focinho para avaliar as lesões das conchas nasais e apresentação esquemática do corte transversal do focinho (Adaptado de ITP, 1994).

Representação esquemática de vários graus de lesão de rinite atrófica e sua respectiva classificação (Adaptado de ITP, 1994).

A Figura 6 apresenta, de uma forma esquemática, alguns exemplos de vários graus de lesão de rinite atrófica segundo o sistema anteriormente mencionado.

(

O fígado parasitado pode ser avaliado de acordo com o número de focos de hepatite intersticial pro- vocadas por ("manchas leitosas"), uti- lizando-se a graduação referida no Quadro 5.

Classificação das lesões de hepatite intersticial pro- vocadas por (Adaptado de MORÉS . 2000).

Hepatite intersticial multifocal compatível com (“manchas leitosas”) (Fonte: AFIS).

Classificação das lesões de nefrite intersticial multi- focal (Adaptado de POINTON, , 1987)

et al

Nefrite intersticial multifocal (Fonte: AFIS).

As lesões de dermatite por hipersensibilidade ao

ácaro var agente etiológico

da sarna sarcóptica, podem ser classificadas utilizan- do-se a classificação apresentada no Quadro 7, e que se encontra representada na Figura.

Classificação das lesões de dermatite (Adaptado de POINTON ., 1992 e MORÉS ., 2000).

Representação esquemática de vários níveis de severi- d a d e de sarna (Adaptado de MORÉS ., 2000).

Segundo CARGILL e DOBSON (1979) cit. por P O I N TON . (1992) a sarna sarcóptica pode comprometer a produção por uma redução na taxa de crescimento e um aumento no índice de conver- são devido à hipersensibilidade aos ácaros.

As artrites purulentas (Fig. 11) e as poliartrites (Fig.

12), representam uma das principais causas de re- provação dos suínos. Tal facto foi comprovado por CUBERO . (1997), os quais concluíram que a poliartrite foi a principal causa de reprovação de 661

- Lesões compatíveis com hipersensibilidade a sarna (Nível 1) (Fonte: AFIS).

Artrite purulenta (Fonte: AFIS).

exploração, os quais, em colaboração no matadouro, possam utilizar a inspecção sanitária como uma fon- te de dados mais objectivos e precisos relativamente às lesões e estados patológicos encontrados, factor importante para monitorizar o estado sanitário das explorações, caminhando assim para o que se enten- de por inspecção integrada.

Agradecemos à Dra. Alexandra Campos a sua con- tribuição em material fotográfico que muito serviu para enriquecer a apresentação deste trabalho.

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Poliartrite (Fonte: AFIS).

suínos inspeccionados em matadouro. A i m p o r t â n c i a do reconhecimento desta entidade lesional no mata- douro deve-se à sua associação a determinados agentes infecciosos, nomeadamente

, , s p p . ,

e e ao facto de estar asso- ciada a um elevado número de reprovações em matadouro.

Uma vez que na bibliografia consultada não encontramos nenhum sistema de classificação para as artrites, sugere-se que para graduar este tipo de lesão se tenha em conta a fase evolutiva da inflamação (artrite aguda ou crónica), assim como o número de articulações afectadas.

A actual inspecção sanitária praticada pelos M é d i-

cos Veterinários Oficiais nos matadouros, regida p e l a

legislação vigente, permite conhecer as principais cau-

sas de reprovação total ou parcial das carcaças e suas

vísceras, transparecendo, apenas, a prevalência das

lesões e/ou patologias mais evidentes, carecendo es-

tas de uma classificação (grau de lesão) objectiva

(quantitativa e qualitativa). Perante tais factos deve-

ria existir uma conjugação de esforços entre o Vete-

rinário Inspector Sanitário e o responsável pela

R E V I S T A P O R T U G U E S A

DE

CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

RPCV (2001) 96 (540) 183-189

Efeito da Ribavirina na replicação do vírus da peste suína africana Effect of Ribavirin on the African swine fever virus replication

M. Luísa Valdeira

Departamento de Microscopia Electrónica do Laboratório Nacional de Investigação Veterinária, Estrada de Benfica, 701, 1500 Lisboa e Centro de Genética e Biologia Molecular da Faculdade de Farmácia de Lisboa. Av. das Forças Armadas, 1600 Lisboa.

Resumo: Foi estudado o efeito de diferentes concentrações de Ribavirina na infecção pelo vírus da peste suína africana (VPSA) em células CV

. Os resultados indicam que a infec- ciosidade do VPSA é inibida a concentrações de Ribavirina superiores a 15 µg/ml que não são tóxicas para a célula hospedeira. Estudos de incorporação de timidina, uridina e metionina radioactivas em células infectadas na presença da droga indicam que a síntese do RNA e das proteínas virais são afectadas, enquanto que o DNA viral se mantém inaltera- do. A observação por microscopia electrónica de células infectadas a vários tempos, em presença da Ribavirina, mos- tra que a morfogénese do vírus se processa de igual modo nas células infectadas sem qualquer tratamento, no entanto o apa- recimento de estruturas aberrantes e de unidades de membrana de forma irregular nas áreas de replicação viral é relevante, quando as células são tratadas com o antiviral. O possível mecanismo inibidor será discutido.

Summary: The effect of different concentrations of Ribavi- rin was studied in CV

cells infected with African swine fever virus. Ribavirin inhibits the infectivity of ASFV at a concen- tration of 15 µg/ml, that is not toxic for the host cells. Incor- poration studies of radioactive tymidine, uridine and methionine in infected and drug treated cells indicate that the viral RNA and protein synthesis are inhibited, but viral DNA is made in the same extend. Samples of infected cells, at dif- ferent times post-infection, treated with Ribavirin, were fixed, processed and observed by electron microscopy. The results indicate that the morphogenesis of the virus is done in the same way in presence or absence of the drug. However, in the first case, we could observe more aberrant structures and irregular unit membranes inside replication areas. The possible inhibitor mechanism will be discussed.

infectados cronicamente ou em espécies animais resistentes ao vírus não neutralizam o vírus (De Boer, 1967), assim todos os esforços para produzir uma vacina têm falhado. Por esta razão é importante a pesquisa de compostos com actividade antiviral que possam ser úteis como agentes profiláticos ou terapêuticos.

A Ribavirina (1- ß- D- ribofuranosido - 1,2,4- tria- zol- 3 - carboxamida) é um ribonucleósido purínico sintético (Wikowski et al., 1975) que é actualmente usado como fármaco de excelência para o tratamen- to de várias infecções virais. É um antiviral de largo espectro com baixa toxicidade que raramente causa resistência a vírus DNA e RNA (Sidwell, 1980 e De Clercq, 2001). Pode ser administrado por via oral, intravenosa ou em forma de nebulizador. Assim, está a ser administrado a doentes para o tratamento das infecções respiratórias causadas pelo vírus sincicial respiratório (Shigeta, 2001), em combinação com o interferão-alfa para infecções crónicas de hepatites B e C (Carreno et al., 2001 e Fang et al., 2001), de adenovírus (McCarthy et al. 1995 e Bordigoni et al., 2001), de Hantavirus (Rodriguez-Rodriguez, e Ra- mirez-Ronda, 1995 e Murphy et al., 2001), do vírus Machupo da família Arenoviridae (Kilgore, 1997) e do vírus La Crosse (McJunkin et al. 1997). Igual- mente são descritas inibições pela Ribavirina do ví- rus herpes por Hahn et al. (2001), do vírus da febre hemorrágica por Fisher-Hoch et al. (1995), do vírus West Nile por Jordan et al. (2000), dos enterovírus por Rawlinson (2001) e do vírus Nipah por Chong et al. (2001).

Vários Autores têm estudado o mecanismo de acção deste antiviral. Streeter et al. (1973) e Fran- chetti e Grifantini (1999) descrevem uma inibição directa na inosina-5’-monofosfato desidrogenase (IMP-DH) impedindo assim a conversão do IMP através da xantina-5’-monofosfato a guanosina-5’- monofosfato (GMP), levando à depleção dos níveis intracelulares de GTP e dGTP. Mas outros mecanis- mos têm sido propostos, tais como a inibição da transcrição e/ou elongação do RNA (Fernandez- Larsson et al., 1989; Toltzis et al., 1988; Jordan et al., 1999; Rankin et al., 1989), a inibição da forma- ção de um “cap” no extremo 5’ do mRNA viral pela mRNA guaniltransferase para o mRNA do vírus da vacina (Goswami et al., 1979) ou um efeito potencia-

Introdução

O vírus da peste suína africana (VPSA) é um vírus DNA icosaédrico com invólucro que replica no cito- plasma de células infectadas. Morfologicamente é muito semelhante aos iridovírus que infectam verte- brados (Carrascosa et al., 1984), mas a estrutura do seu DNA lembra a do genoma dos poxvírus (Viñuela, 1987). Sendo assim, o VPSA é o único membro de uma nova família, Asfarviridae, género Asfivirus.

O VPSA é responsável por uma doença infecciosa

e grave no suíno doméstico que causa grandes

prejuízos económicos (Costa, 1990). Um dos aspe-

ctos mais surpreendentes é que os anticorpos especí-

ficos contra o VPSA detectados em suínos

Materiais e métodos

Células e vírus

As células CV

obtidas de rim de macaco “African Green” (Cercopithecus aethiops) foram mantidas em meio de manutenção Eagle (MEM) com 10% de soro de vitela recém-nascida (NCS) proveniente da Gibco, Scotland e gentamicina (50 µg/ml). A estirpe Lisboa 60 do VPSA (Manso Ribeiro e Rosa Azevedo, 1961) adaptada a crescer em células de macaco foi produzida nestas células (Valdeira et al., 1990).

Compostos químicos

A amostra utilizada de Ribavirina foi cedida gentilmente pelo Dr. W. Kirkpatrick da ICN Pharma- ceuticals (Covina, Califórnia). As soluções a estudar foram preparadas na altura, por dissolução da droga no meio MEM.

Ensaios de citotoxidade

Lamelas com 5x10

células em tubos de Leighton foram tratadas com as diferentes concentrações de Ribavirina durante 24, 48 e 72 horas. Ao fim deste tempo o meio com a droga foi removido, as células lavadas com novo meio, e coradas com azul tripano a 0,1% em tampão PBS-A. As células que coravam (não viáveis) foram contadas para cada concentração do inibidor em 200 células distribuídas por 2 lamelas diferentes.

O efeito citotóxico também foi determinado fazendo o exame microscópico das culturas celulares tratadas com a Ribavirina durante 4 dias, utilizando um mi- croscópio invertido de contraste de fase.

Efeito de diferentes concentrações de ribavirina na replicação do VPSA

Titulação pelo método de Reed e Muench (1938) do vírus produzido em presença do inibidor

5x10

células em monocamada celular recém-con- fluente foram inoculadas com 10 pfu/célula durante 2 h a 4 °C com agitação frequente. Decorrido este tempo, o vírus foi removido e as células foram lava- das e incubadas com novo meio MEM com ou sem a droga. O vírus extracelular foi colhido, clarificado e titulado, quando as células testemunha, infectadas e sem tratamento, apresentavam efeito citopático total à observação microscópica.

Incorporação de timidina, uridina e metionina nas células infectadas

Usaram-se culturas infectadas com 10 pfu/célula em presença de 15 µg/ml de Ribavirina. A diferentes tempos post-infecção o meio foi removido para ser adicionado novo meio com 5% de NCS dialisado contendo 10 µCi/ml de [metil-

H]-timidina (Amers- ham, 50-60 Ci/mmol), 10 µCi/ml de [5 -

H]-uridina (Amersham, 25-30 Ci/mmol) ou meio contendo 5%

da concentração normal de metionina com 1 µCi/ml de [

S] - metionina (Amersham, >800 Ci/mmol).

Foram feitos pulsos de marcação de 30 min, a diferentes tempos de infecção, com os diferentes dor de análogos dos nucleósidos das purinas que

impedem a replicação dos vírus da Imunodeficiência humana e dos vírus herpes (Hartman et al., 1991;

Neyts et al. 1998). Contudo, o efeito observado a maioria das vezes foi a depleção intracelular de GTP e dGTP.

Quanto à sua farmacocinética, sabe-se que após administração oral de 1 g/dia de Ribavirina, o pico de concentração ocorre após 2,5 horas da ingestão. A concentração plasmática varia entre 1,7–5,3 mM, com a concentração média de 3,1 mM. A eliminação da ribavirina é renal, e apenas uma pequena percen- tagem é de eliminação fecal. A meia-vida de elimi- nação é de aproximadamente 24 horas. Estudos em humanos e animais mostraram acumulação do fár- maco nos tecidos, especialmente nos eritrócitos.

Relativamente à sua toxicidade, tem-se investigado a sua actividade teratogénica em animais de experi- mentação. A alta frequência de mal formações congénitas ocorre em ratos, com susceptibilidade para diferentes órgãos e sistemas. Têm sido observa- dos alguns defeitos crânio-faciais. A embriotoxicida- de pode ocorrer quando a via de administração é a oral, possivelmente devido à activação do complexo através do tracto gastro-intestinal ou do metabolismo hepático. No entanto, quando foram dadas várias doses de ribavirina a embriões de camundongos durante estádios diferentes da sua organogénese foi mostrado que a dose de 10 mg/kg não tem nenhum efeito tóxico. Todos os embriões sobreviveram ao tratamento sem malformações ou redução do peso corporal fetal após 18 dias de gestação. Por outro lado, a dose de 200 mg/kg foi altamente letal e uma grande parte dos embriões não sobreviveram, excepto aqueles em estádios avançados de desenvolvimento.

Entretanto, doses entre 50 e 150 mg/kg produziram aumento progressivo na frequência de malformações.

A dose de 175 mg/kg produziu atraso de crescimento (Harnden, 1985; Fields, 1996).

Diferentes estudos descrevem que a replicação do VPSA é inibida pela 5 - iodo - 2’- deoxiuridina (Gil - Fernández et al., 1979), rifampicina (Dardiri et al., 1971; Valdeira e Alves de Matos, 1981), ácido fosfo- noacético (Moreno et al., 1978 e Villinger et al., 1990), drogas lisossomotrópicas, inibidores de prote- ases e da síntese de lípidos (Geraldes e Valdeira, 1985; Valdeira et al., 1998; Bernardes et al., 1998).

Ácidos gordos tais como oleico, linoleico e álcool linolénico (Sola et al., 1986a) e análogos da adenosina (Gil Fernández e De Clerq, 1987) têm sido referidos como inibidores selectivos da replicação deste vírus. A adsorção do VPSA também é inibida pela suramina (Sola et al., 1986b). Recentemente, apenas foram descritos efeitos virucidas contra o VPSA com desinfectantes como: hipoclorito de sódio, sais de amónio quaternário e compostos com iodo (Shirai et al., 2000) e Fabregas et al. (1999) demonstraram o efeito inibidor de extractos de micro algas marinhas contra este vírus.

Deste modo, e na tentativa de encontrar antivirais

eficientes no combate a esta doença, estudamos o

efeito da Ribavirina na replicação do VPSA em célu-

las em cultura por diferentes metodologias.