Efeito do glicerol sobre a entalpia de ligação da tripsina bovina com o íon benzamidínio entre 5 e 30°C de temperatura

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLANDIA INSTITUTO DE GENETICAE BIOQUÍMICA

CURSO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

EFEITODO GLICEROLSOBRE A ENTALPIA DE LIGAÇÃO DATRIPSINABOVINA COM O ÍON BENZAMIDÍNIO

ENTRE5E 30ºC DE TEMPERATURA

YARA ALMEIDA VIANA

Monografia apresentada à Coordenação do Curso de _{Ciências Biológicas, da Universidade Federal} de _{Uberlândia, para a obtenção} do _grau de Bacharel em Ciências Biológicas

Uberlândia—MG

ii

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLANDIA INSTITUTO DE GENETICAE BIOQUÍMICA

CURSO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

EFEITODO GLICEROLSOBRE A ENTALPIA DE LIGAÇÃO DATRIPSINABOVINA COMO ÍON BENZAMIDÍNIO

ENTRE 5 E 30ºCDE TEMPERATURA

YARA ALMEIDA VIANA Estudante

PROF.DR. NILSON PENHA SILVA Orientador

Monografia apresentada à Coordenação do Curso de Ciências Biológicas, da Universidade Federal de _{Uberlândia, para a obtenção} do _grau de Bacharel em Ciências Biológicas

Uberlândia—MG

iii

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLANDIA INSTITUTO DE GENÉTICAE _BIOQUÍMICA

CURSO DE CIENCIAS BIOLOGICAS

EFEITO DO GLICEROL SOBRE A _ENTALPIADE LIGAÇÃO

DA _TRIPSINABOVINA COMO ION BENZAMIDINIO ENTRE 5 E30ºC DE TEMPERATURA

YARA ALMEIDAVIANA

Prod Dr. NilsonPenha Silva O ' _ta

' _!“

Prof. DK _{Eloízio Júlio Ribeiro}

Có-Orientador

V/VI

%%

Adm

Ááwwágg

“Profª. Maôa_{Magnólia Juqu/u'eiraléf}E _y

Có—Orientadora

iv

Aos meus pais, Essi Fernandes Viana e Maria MadalenaA. _{Viana, pelo amor incondicional,} hojee _sempre; à minha irmã, Vanessa Almeida Viana, pela alegria que trouxe aomeu cotidiano.

AGRADECIMENTOS

A Deus, que na sua infinita bondade e sabedoria tem conduzido-me sempre pelos

melhores caminhos;

Ao professor Nilson Penha Silva, pela paciênciae profissionalismo. A sua competênciae integridade tornam bem sucedidaarealizaçãode_{qualquer trabalho acadêmico;}

Á Universidade Federal de _{Uberlândia, por disponibilizar} a infra estrutura necessária à realização deste trabalho epela concessão da bolsade _{iniciação científica;}

Aos professoresque efetivamente contribuíram para a minha formação acadêmica;

A coordenadora do _curso de _{Ciências Biológicas, Ana Maria Coelho Carvalho, pelo} empenho em melhorar a qualidade do nosso curso;

Á Tânia Miranda Magalhães, a amiga que ajudou-me a _{superar as dificuldades} do cotidiano, mostrando-se sempre generosa,leal eotimista;

Aos colegas do Laboratório de Enzimologia, Miguel Antônio Facury, Adriana Borges e Fabrício Cintra, pelo ambientedetrabalho descontraídoeagradávelque proporcionaram; Aos amigos, Ana Flávia Vitorino, Gilvan Duarte, Juliana Meola, Karine Rezende, Rodrigo Magrin, Sandra Gracielle,Sílvio Oliveirae Willian Lopes. Sem a ajudade vocês, tudo seria mais difícil;

Ás secretárias do INGEB, Sebastiana Abadia Inácio e Maria Marlene Macedo, pelo atendimento cordial e pela evidente disposição para auxiliar sempre na resolução dos problemas.

ÍNDICE

1_{—Introdução}

2-Objetivo

3-MaterialeMétodos

3.1-Preparo das soluções utilizadas

3.2-Efeito de osmólitos sobrea formaçãode _{complexos enzima-inibidor} 3.3-Cálculo das constantesde_{dissociação dos complexos EI}

3.4-Determinação da variaçãode entalpia padrãode vanºtHoff 4-Resultadosediscussão 5-Conclusão 6-Referências Bibliográficas 01 05 06 06 06 07 07 10 15 16 vii

vi

RESUMO

As macromoléculas e a atividade biológica das proteínas são _{frequentemente} preservadas por pequenos solutos orgânicos denominados osmólitos. O _glicerol e' _um

reconhecido osmólito que protege as células contra condiçõesde _{estresse como} a_presençade agentes desnaturantes e temperaturas elevadas. O objetivo deste trabalho foi _investigar o efeito de glicerol a 1 mol.L'l sobre a variação de entalpia de van,t Hoff_{(AHºVH) para a}

formação do complexo tripsina bovina com o íon benzamidínio no intervalo de _temperatura de 5 _{e 30} ºC. Os gráficos de 1/A410nm em funçãode 14 diferentes concentrações do. inibidor,

na presença de _{duas diferentes concentrações} do substrato Benzoil-D,L-Arginina-para-Nitroanilida foram usados para determinação dos valores das constantes de _{dissociação} do complexo enzima-inibidor (Ki). A dependência de ln Ki_{em função} de 1/T foi _{utilizada para} calcular a variação de_entalpiadevan,t Hoffna presençade 1 mol.L'1 de glicerol. Na ausência

de osmólitose na presençade _{glicerol a} 1 mol.L'1 os valoresde _AHºvH foramde _—11,7$ 1,24

e —12,29 $ 1,03 kcalmol'l.Em suma, a incorporaçãode 1 mol.L'l de glicerolnão _promoveu

nenhuma alteração na variação de entalpia de vanºt Hoff_{para a formação do complexo} enzima-inibidor.

1-_INTRODUÇÃO

Muitos mecanismos de _{resposta a condições ambientais de estresse, como calor,} radicais livres, altas concentrações de sais e congelamento, têm em comum o fato de _serem regulados por compostos conhecidos como osmólitos (Yancey et al., 1982; Somero, 1986). Essas substâncias, cuja concentração pode variar de _{dezenas a centenas de} milimol.L'1, permitem queas proteínas mantenhamsuas _{atividades porque atuam como estabilizadores da} estrutura proteica, sem comprometer a eficiência dos mecanismos catalíticos _que ocorrem dentro da célula (Yancey etal. 1982; _Yancey, 1985).

Os osmólitosdeocorrência natural são _{quimicamente classificados em três grupos:(1)} poliálcoois, como glicerole sorbitol; (2) aminoácidose _{seus derivados, como as metilaminas}

betaínae sarcosina;e (3) açúcares, como sacaroseetrealose (Yancey et al., 1982).

Considerando-se o _{aspecto íimcional, ainda há uma outra classificação para estes} solutos. Aqueles que exercem pequenos efeitos sobre a função proteica são classificados como soluto compatíveis. Já os osmólitos que combatem os efeitosque solutos deletérios têm sobre as proteínas são _{denominados solutos neutralizantes (Borowitza} & _Brown, 1974; Yancey et al., 1982).

A atividade osmorregulatória está amplamente distribuída na natureza. Plantas, bactérias, mamíferose invertebrados marinhos, apesar de _{apresentarem uma grande distância} dentro da escala evolutiva, utilizam-se desses solutos para estabilizar sua estrutura proteica (Somero, 1986).

A complexação do dímero de _triptofano ao seu alvo no DNA de Escherichia coli depende da presença de moléculas de _{água, que têm um importante papel termodinâmico} neste processo. Pequenas concentraçõesde _{betaína contribuem para que a água permaneça na}

superficiedo _{complexo dímero-DNA (Brown et al.,1999).}

O _{osmólito B-hidroxicetoína, extraído de marinococus, a uma concentração de 3} mol.L'1 _{aumentou a temperatura de desenovelamento da Ribonuclease A bovina em mais de}

12 _{Kelvin, o que sugere que este osmólito possa atuar de forma bastante eficiente como}

estabilizador de _{processos que envolvem enzimas aplicadas na presença de desnaturantes ou} em temperaturas elevadas(Knapp, Ladenstein& _{Galinski, 1999).}

O inibidor de _{quimotripsina e de citocromo} C de _coração de cavalo são _proteínas estabilizadas com sucesso na presençade _{elevadas concentrações de glicina. Este processo é} caracterizado por uma considerável redução na proporção das constantesde troca de _prótons amidínicos sem que ocorra entretanto uma alteração na estrutura tridimensional dessas proteínas(Foord& _{Leatherbarrow, 1998).}

A trealose, um açúcar de _{notáveis propriedades estabilizantes, é capaz de prevenir} completamente o colapso da mioglobina ao evitar o _escape de _{pequenas moléculas} de _água que são vitais para preservar a estabilidade interna dessa proteína (Sastry & _{Agmon, 1997).} Além disso, promove a estabilização estrutural das membranas ao interagir com os fosfolipídeos de _{sua bicamada lipídica, diminuindo a transição termotrópica de fase da} membrana_{seca, mantendo assim sua permeabilidade durante a reidratação(Araújo,1996).}

Em algumas células endoteliais, astrócitos e células da medula espinhal, a hiperosmolaridade induzao acúmulode _{mioinositol, resultado} de _{um aumento na velocidade} máxima do _{co-transportador} de _{sódio-mioinositol (SMIT) e do aumento da expressão deste} gene. Em doenças como a síndrome de Down são encontrados distúrbios relacionados à acumulação de mioinositol(Warskulat, Weik& _{Haiissinger, 1997).}

Já as _{ceramidas, esqueletos estruturais dos esfmgolipídeos, capazes} de _desempenhar múltiplas atividades biológicas, predominantemente associadas à supressão do crescimento, também são _capazesde _{ativar uma proteína-quinase que desempenha um papel central numa}

variedade de _{respostas ao estresse. Recentemente, o supressor de tumor p53, um dos} reguladores centrais de _{resposta ao DNA danificado, mostrou-se capaz de induziro acúmulo} de _{ceramida (Dbaibo, 1997).}

A N—óxido-trimetilamina _{(TMAO) exerce um importante papel na manutenção dos} microtúbulos em concentrações bastante próximas das iisiológicas, porque interfere na atuação da proteína TAU, que associada aos microtúbulos influencia no _processo de nucleação, polimerização e manutenção durante a reunião de _{tubulina, inclusive na presença} de _{agentes caotrópicos. O mecanismo de ação deste osmólito ainda é desconhecido,} entretanto, evidências sugerem que a TMAO possa forçar algumas proteínasa se enovelarem eresistiremà _{desnaturação (Tseng}& _{Graves, 1998).}

Atuahnente, todas essas estratégias utilizadas pelos organismos vivos para estabilizarem suas estruturas proteicas têm sido exploradas pela indústria farmacêutica. Já estão sendo realizados testes clínicos com uma insulina inalável, encapsulada em açúcar. Esta mesma metodologia têm sido utilizada experimentalmente para preservar proteínas de valor terapêutico, tais como a calcitonina, usada no tratamento da osteoporose,e a crl-anti-tripsina, usada no tratamento do _{enfisema pulmonar. No futuro, drogas e suplementos alimentares} serão _{encapsulados em açúcares principalmente para serem enviados para países que possuem} escassos meiosde_{refrigeração}etransportede_{proteínas frágeis(Potera,1998).}

O _glicerolé _capaz de _{prevenir a inativação pelo calor das enzimas fosfoenolpiruvato} carboxilase (PEPCªªº), malato desidrogenase (MDH)e nitrato redutase (NR)de Salsola soda. Esta proteção está diretamente relacionada à concentraçãode glicerol utilizada (Nikolopoulos & _{Manetas, 1991). O equilíbrio} de _formação de _complexos de _{tripsina bovina com o} íon benzamidinio, um inibidor clássico desta enzima, também pode ser afetado coma adição de 0,5 mol.L'1 de _{glicerol, sacarose, sorbitolebetaína (Souza—Penha,1998).}

O _{presente trabalho avaliouo} efeitodo _{glicerol sobre} a variação de _entalpia de vanºt Hoff_para o equilíbriode _formaçãode _{complexo entre}&tripsina bovinae o íon benzamidínio

apartir das constantesde _{dissociação}do_{complexo enzima-inibidor, determinadas entre} 5e 30 ºCde_temperatura.

2- OBJETIVO

Analisaro_{efeito do glicerola l mol.L'1 sobre a variação da entalpiade vanªtHoff} para a ligação de _{tripsina bovina com o íon benzamidínio, em tampão tris-HCI a 0,1 mol.L'1,}

pH 8,0, a partir das constantes de _{dissociação} do _{complexo enzima-inibidor, no intervalo de} temperaturade 5_{a 30 ºC.}

3-MATERIALE MÉTODOS

3.1- _{Preparo das soluções utilizadas - As soluções de tripsina bovina foram} utilizadas a _{uma concentração} de 2 _{mg/mL em HCl pH 3,0. Todas as reações ocorreram em} tampão tris-HCl 0,1 mol.L'1, contendo CaClz _a 2 mmol.L'l _{e glicerol na concentração l} mol.L'1em pH 8,0. O glicerol foi _{incorporado ao tampão antes de ajustar o pH e o volume} final da solução. O _{substrato utilizado foi o Benzoil—D,L-Arginina-para-Nitroanilida} (BApNA). As soluções de _{BApNA foram semanalmente preparadas em uma concentração} estoque de 0,1 mol.L'1 _{em dimetilsulfóxido. As reações de hidrólise enzimática do BApNA}

ocorreram na presença de _{benzamidina em tampão tris-HC] pH 8,0. As reações foram} interrompidas pela adiçãode_{ácido acético a 60%v/v.}

Os _{reagentes utilizados para o preparo destas soluções foram provenientes da Sigma,} Aldrich, Fluka e Merk. As medidas de _{massa foram feitas em uma balança de precisão} analítica marca AND, modelo HR-120.A homogeneização do tampão foi _{realizada em um} agitador termostatizado da marca Quirnis e o pH foi _{ajustado com um peagâmetro marca} analyser, modelo pH20. Todas as pipetas, beckers, provetas e balões volumétricos utilizados parao_{preparo das soluções eram da marca Pyrex.}

3.2— Efeito do glicerol _{sobre a formação de complexos de tripsina}

com o íon benzamidínio- Em um experimento típico, foram usadas duas séries com _{15 tubos de ensaio}

cada uma, como substrato a 200e400mmol.L'1, _{respectivamente. Inicialmente cada tubo das} séries81 _e 82recebeu 1 mL da respectiva soluçãode uso do _{substrato. Depois cada um dos}

15

tubos de cadasérie _{recebeu respectivamente 1,3; 1,3; 1,2; 1,1; 1,0; 0,9; 0,8; 0,7; 0,6; 0,5; 0,4;} 0,3; 0,2 0,1 e 0,0 mL da solução do _{tampão. Em seguida foi adicionado a cada tubo um} volume da soluçãode benzamidinaa 0,001 mol.L'1_{em tampão pH 8,0 (0,0; 0,0; 0,1; 0,2; 0,3;}

0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0; 1,1; 1,2 e 1,3 _mL), de forma _{que o volume total da solução} presente em cada tubo fosse igual a 2,3 ml. Após atingir o _{equilibrio térmico da solução à} temperatura do _{experimento em banho termostatizado com refrigeração, marca Marconi} modelo MA 184, foiadicionado 0,2mL _{de tripsina a 2,0 mg/mL a cada um desses tubos com} o auxílio _{de pipetas automáticas reguláveis Oxford modelo Sampler System, excetoao tubo} 1 de cada série, _{que recebeu 0,2 mL de HC] pH 3,0. Após 10 minutos de incubação foi} adicionado a cada um desses tubos 0,5 mL de _{ácido acético a 60%}v/v. O _graudehidrólisedo substratofoi _{determinado pela leitura da absorvância da para-nitroanilida em 410nm, contra} otubo brancode _{sua respectiva}série _{(tubo número 1) em espectrofotômetro Micronal modelo} B442.

3.3- Cálculo _{das constantes de dissociação dos complexos EI - As constantes de} dissociação dos complexos EI foram determinadas pelo valor da abscissa do ponto de cruzamentode _{duas retas} (81 e 82) em gráficosde UV_{contra a concentraçãodo inibidor, cada}

reta representando um conjuntode 14ensaios cinéticosde _velocidade,de _{acordo com método} de Dixon (1953)e as descrições detalhadas de _{Rogana, Penha-Silvae Mares-Guia (1989).} Aos pontos experimentais utilizados para determinação das constantes de _{dissociação} do complexo EI foram atribuídos pesos estatísticos decrescentes(14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5,

4, 3, 2 e l), a partir do tubo número 1, _{que produziu o} maior e mais confiável valor de absorvância.

3.4- _{Determinação da variação}de _{entalpia padrão} de van*t _{Hoff para a formação} dos complexos EI - A dissociação do _complexode _{tripsina bovina com o íon benzamidínio} ocorre segundo a reação reversível EI

i

E + I, _{caracterizada por uma constante} de equilíbrio, dada pela expressão:

[E][1]

Keq

:

_,

[EI]

que éidênticaao valor da constantede _inibição,K;. A constantede _formaçãodo _complexoBI

e'_{poisiguala l/Ki. Logo, a variaçãode energialivre padrão de}

formação dos complexosBI e'

dada pela expressão:

AGº = RT ln Ki,

onde Ré_{a constante universal dos gases (1,987 cal/mol.K)eT éa temperatura absoluta, dada} em graus Kelvin. Colocando-se esta equação em igualdade com a seguinte equação derivada da segundalei_{da termodinâmica,}

AGº = AHº -TASº, temos_que:

RT lnK]- = AHº _- TASº,

ou mais simplesmente:

que é a equação de vanªt Hoff_para a formaçãode _complexos de _{tripsina bovina com o} íon benzamidínio. Esta equação representa uma reta onde AHº/R corresponde à inclinação e

-ASº/Re'a interseção da reta no_{eixo y.}

Locando os valoresde ln Ki_{obtidos a}5, 10, 15, 20, 25 e 30 ºC em função dos inversos dos valores das temperaturas em graus Kelvin, foi obtida a variação da entalpia padrão de van7tHoff_{para a ligação de tripsina bovina com}o íon benzamidínio na presença de glicerol a

] mol.L'1.

O coeficiente de _{correlação entre as variáveis estudadas} foi determinado a partir da expressãode _Cembrowski& _{Sullivan (1996).}

Este trabalho foi _{integralmente desenvolvido no} Laboratório de _{Enzimologia do} Instituto deGenéticaeBioquímica da Universidade FederaldeUberlândia.

10

4- _{RESULTADOS E DISCUSSÃO}

Os _{valores de K;, determinados na presença}

de _glicerol ] _{a mol.L'l a partir da}

dependência de 1/A410 _{um com a concentração do}

íon benzamidínio estão representados na Tabela 1. _{Na presença de glicerol a 1 mol.L'l,}

o _{aumento da temperatura provocou um} aumento nos valores da constante de _{dissociação do complexo enzima-inibidor. Este} comportamento_{já era esperado (Hymes, Cuppett & Canady,}

1969; _{Mares-Guia,Nelson&}

Rogana,1977; _{Rogana, Penha-Silva& Mares-Guia,1989),}

uma vezque O calor aumenta a

agitação dos grupamentos quimicos da proteína, prejudicando assima manutençãode _ligações estabilizantes de _{sua estrutura, bem como sua interação com ligantes. Desta}

forma, _a população relativa da enzima livre no equilíbrio aumenta como _{aumento da temperatura, o} que pode serjustificado pelo aumento na constantede_{dissociaçãodo complexoEI.}

Os _{solutos envolvidos na estabilização da estrutura proteica}

e _{na manutenção da sua} simetria estruturalsão _{preferencialmente excluídos do domínio da proteína. Estes mecanismos} de exclusão de _{solutos podem envolver interações que dependem exclusivamente das} propriedades do soluto _{ou podem ser determinados pela natureza química da superfície das} proteínas e _{da sua interação com as moléculasdo soluto.}

Também existem casos em que os dois mecanismos atuam simultaneamente_{(Timasheff& Arakawa,1989).}

Quando a proteína é _{inerte em relação ao soluto, a interação proteína-soluto vai} depender inteiramente da acessibilidade das moléculasdo solutoao contato maisíntimo _com a proteína. SegundoKauzmann _{(1949), citado por Timasheff& Arakawa (1989), ocorreria} uma exclusão estéricado _{soluto à primeira camada de hidratação da proteína. Assim,} formar-se-ía uma camada impermeável ao soluto ao _{redor da proteína (Timasheff& Arakawa,}

11

A adiçãode _{solutos também pode perturbar a tensão superficial da}

água. Desta forma, eles tendem _{a ser excluídos da superficie da proteína, que torna-se preferencialmente} hidratada. Este mecanismo é _{comum na exclusão de açúcares, aminoácidos}

e sais estabilizantes da estrutura(Timasheff& _{Arakawa, 1989).}

O _{glicerol, especificamente, parece ser excluído da superficie da proteína por um} efeito de natureza solvofóbica.O _{contato entre a misturade glicerole a água com as regiões} não polares da proteína é _{entropicamente mais desfavorável do que o}

contato da água pura com os grupos não-polares. Por isso, o _{glicerol tende a ser excluído da superfície da proteína}

(Timasheff& _{Arakawa, 1989). Com certeza, a presença do}

glicerol junto à água na fase volumosa do solvente torna também entropicamente desfavorável_{o contatodoanel benzênico} do íon _{benzamidinio, de naturezanão polar, com o solvente,}

o _{que favoreceria sua exclusão} da fase _{volumosa do solventee inclusão nos sítios hidrofóbicosde}

ligaçãodo centro ativo da tripsina bovina.

Este efeito, _{justificaria um aumento na estabilidade relativa do complexo EI} em relação à enzimae inibidorlivres, _{em uma dada temperatura, na presença de glicerol. Assim,} seria previsível um aumento em Kfe _{respectivamente uma diminuição emKi na presença de} concentrações crescentes de _{glicerol. Desta maneira, os valores de - AGº de formação dos} complexos El deveriam sofrer uma elevação com o _{aumento da concentração} de _{glicerol, o} quede_{fato ocorre (Magalhães, 2000).}

Na presença de _{glicerol, a dependência de ln Ki com l/T produziu uma reta, que foi} utilizada para determinação da variação de _entalpia de vanªt Hoff _{para a formação} do complexo EI, _{conforme mostrado na Figura} 1. O valor médio do AHºvH _{determinado na}

presençade _{glicerol a} 1 mol.L'l _no intervalo de temperatura considerado

(30, 25,20, 15, 10 _e

Sº C) foi de—12,3 $ 1,03 kcalmol'l.Este valor não _{difere significativamente do valor médio} de—11,7$ 1,24kcalmol'1 determinadono intervalode 10, 20 e 30ºC registrado na literatura

12

(Souza-Penha, 1998), uma vez que as _{diferenças entre os valores individuais situam-se} dentro dos desvios padrões obtidos. Isto significa quea dependência térmicado _equilíbriode formaçãodo _{complexo EInão foi afetado entre os limitesde}

5 e 30 _{ºC pela incorporaçãode} 1

molL'1 de _{glicerol no solvente. O efeito de concentrações crescentes deste soluto sobre} a variaçãode _{entalpiade van7t Hoffestá em curso no Laboratório de}

Enzimologia do Instituto de _{Genéticae Bioquímica da Universidade Federalde}

Tabela1

Efeito de glicerol & 1 mol.L'l sobre as constantes de

dissociação (K;), dado em umolL'l, _{dos complexos de} tripsina como íon benzamidínio em tampão tris-HCI_{a 0,1} mol.L'l, pH 8,0, com CaClz _a 2 mmol.L'1, _{em diferentes} temperaturas. T(K) _K; 278,15 _22,30 33,00 17,54 283,15 _37,40 52.60 28,10 288,15 _71,90 56,00 61,40 293,15 _75,50 89,00 91,20 298,15 _113,80 78,40 83,50 303,15 _190,40 163,41 161,25

14 InKÍ -10,0 — -10,5

-

'

. -11,0 — I 0,00325 0,00330 0,00335 0,00340 0,00345 0,00350 0,00355 0,00360 1/T

Figura 1 - _{Dependênciade ln} Kl-_com l/T _{na presençade l mol.L'1 de glicerol de acordo com}

a equação de vanªt Hoff. Os _{dados experimentaisajustaram—se} & reta de regressão linear dada

15

5- CONCLUSÃO

Ovalorde AHºvH_{na presença deglicerol na concentração de 1 mol.L'1 foi de}

— 12,3 ir 1,03kcal.mol'l_{no intervalode 5a 30 ºC detemperatura. Como este valor não difere}

de forma estatisticamente significante do valor de — 11,7 $ 1,24 kcalmol'l, obtido por Souza-Penha

(1998) na ausênciado _{osmólito no intervalo de 10 a 30 ºC, isto significa que}

a _presença de glicerol a l _{mol.L'l não afetou a dependência térmicado equilibriode}

formaçãodo _complexo enzima-inibidor entre5_{e 30 ºC.}

16

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