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PERFIL FENOTÍPICO E GENOTÍPICO DA RESISTÊNCIA AOS ANTIMICROBIANOS EM Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica E ESTAFILOCOCOS
COAGULASE-NEGATIVA &$03,1$6
DIEGO BORIN NÓBREGA
PERFIL FENOTÍPICO E GENOTÍPICO DA RESISTÊNCIA AOS ANTIMICROBIANOS EM Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica E ESTAFILOCOCOS
COAGULASE-NEGATIVA
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Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Biologia Mara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972
Nóbrega, Diego Borin,
N669p N_APerfil fenotípico e genotípico da resistência aos antimicrobianos em
Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica e estafilococos coagulase-negativa / Diego Borin Nóbrega. – Campinas, SP : [s.n.], 2016.
N_AOrientador: Marcelo Brocchi.
N_ATese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia.
N_A1. Testes de sensibilidade bacteriana. 2. Antibióticos beta-lactâmicos. 3. Genes. 4. Klebsiella pneumoniae. 5. Resistência beta-lactâmica. I. Brocchi, Marcelo,1967-. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Phenotypic and genotypic profile of antimicrobial resistance in Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica and coagulase-negative Staphylococcus Palavras-chave em inglês:
Microbial sensitivity tests Beta lactam antibiotics Genes
Klebsiella pneumoniae Beta-lactam resistance
Área de concentração: Microbiologia
Titulação: Doutor em Genética e Biologia Molecular Banca examinadora:
Marcelo Brocchi [Orientador] Alessandro dos Santos Farias Vera Lúcia Mores Rall
Paulo Francisco Domingues Claudio Chrysostomo Werneck
Data de defesa: 20-04-2016
Programa de Pós-Graduação: Genética e Biologia Molecular
Campinas, 20 de abril Ge 2016
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Marcelo Brocchi, Professor Associado do Instituto de Biologia da Universidade
Estadual de Campinas.
Prof. Dr. Claudio Chrysostomo Werneck, Professor Doutor do Instituto de Biologia da
Universidade Estadual de Campinas.
Dr. Alessandro dos Santos Farias, Pesquisador do Instituto de Biologia da
Universidade Estadual de Campinas.
Profa. Dra. Vera Lúcia Mores Rall, Professora Adjunta do Instituto de Biociências da
Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho.
Prof. Dr. Paulo Francisco Domingues, Professor Adjunto da Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia de Botucatu da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho.
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
AGRADECIMENTOS
Agradeço à FAPESP (processo 2012/10608-3) e ao CNPq (processo 248857/2013-4) pelo financiamento do presente estudo.
RESUMO
A resistência antimicrobiana é um problema comumente encontrado em medicina humana e veterinária. Agentes como Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica e estafilococos coagulase-negativa (ECN) são alvo de pesquisas na detecção e identificação de genes de resistência aos antimicrobianos. O presente estudo visou estabelecer o perfil de resistência fenotípico e genotípico em: (i) amostras de S. enterica isoladas de animais domésticos e pacientes humanos no Estado de São Paulo; (ii) amostras de K. pneumoniae isoladas de fezes e leite de bovinos leiteiros em rebanhos Brasileiros; e (iii) amostras de ECN isoladas de leite bovino de rebanhos leiteiros Canadenses. Ainda, estudar associações entre os respectivos perfis e a origem dos isolados, os diferentes sistemas de produção, os estratos de células somáticas do tanque, e estabelecer associações entre a utilização de antimicrobianos e resistência aos mesmos em isolados de ECN. Neste projeto, 166 isolados de K. pneumoniae oriundos de 24 propriedades leiteiras, 153 S. enterica oriundos de carcaças de frangos de corte e pacientes humanos e 1.859 amostras de ECN isoladas de leite de vacas em rebanhos Canadenses foram submetidos ao antibiograma e à detecção molecular de genes de resistência, associados ao respectivo perfil. Ainda, foram obtidas associações dos perfis de resistência com a origem dos isolados. No caso de S. enterica, resistência foi comumente observada para estreptomicina, tetraciclina, combinação de sulfametoxazol / trimetoprim e amoxicilina. Os genes mais comumente encontrados de acordo com estes perfis foram aadA, tetC, sul1 e blactx-m, sendo este, para nosso conhecimento, o primeiro relato do gene qnrB em S. enterica isolada de humanos no Brasil. Os perfis observados foram distintos em isolados humanos e animais corroborando com estudos prévios que demonstram diferentes mecanismos de resistência em medicina humana e veterinária, com o primeiro demonstrando maiores proporções de resistência para diversas drogas. Nos isolados de K. pneumoniae, foi detectada uma associação entre a origem do isolado (leite ou fezes) e a resistência para estreptomicina, cloranfenicol, tetraciclina e sulfametoxazol. Perfis multirresistentes foram observados apenas em isolados de origem clínica (leite mastítico). Os genes comumente encontrados incluíram tetD, tetB e sul2.
Tratando-se de isolados de ECN, resistência às sulfonamidas foi o perfil mais comumente observado (18,65%) seguido pela penicilina, tetraciclina e eritromicina (11,95%, 11,29% e 6,5% respectivamente). Entre as Províncias Canadenses, Alberta apresentou a menor prevalência de resistência às sulfonamidas, apesar de a prevalência de isolados multirresistentes ter sido constante nas diferentes Províncias. Nos diferentes tipos de instalações, isolados de tie-stalls tiveram maior chance de serem multirresistentes em comparação com isolados de free-stall. A utilização de antimicrobianos foi associada à presença de isolados multirresistentes, especialmente no caso do cloranfenicol e macrolídeos. Os genes blaZ e mecA (beta-lactâmicos), str e aadE (aminoglicosídeos),
ermA e ermC (macrolídeos), tetK e tetL (tetraciclinas) foram os mais comumente
observados.
Palavras chaves: antibiograma, beta-lactâmicos, genes, Klebsiella pneumoniae, multirresistência, Salmonella enterica.
ABSTRACT
Antimicrobial resistance is a major concern in both human and veterinary medicine. Agents such as Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica and coagulase-negative
Staphylococcus (CNS) are subject of researches involving detection and identification of
antimicrobial resistance genes. The present study aimed to establish the phenotypic and genotypic resistance profile in: (i) S. enterica isolated from domestic animals and human patients from São Paulo State; (ii) K. pneumoniae isolated from bovine feces and milk in Brazilian dairy herds and; (iii) CNS samples isolated from lactating cows in Canadian dairy herds. Still, study associations between resistance profiles and different sources, barn types, bulk tank somatic cell count and to establish associations between antimicrobial usage and resistance in CNS. In this project, 166 K. pneumoniae isolates from 24 dairy farms, 153 S. enterica isolates originating from broiler carcasses and human patients and 1,859 CNS isolates from Canadian dairy herds were subjected to antimicrobial susceptibility tests and molecular detection of resistance genes according to the respective phenotypic profile. Still, associations between resistance profile and the origin of the isolates were determined. For S. enterica, non-susceptibility was commonly observed for streptomycin, tetracycline, sulfamethoxazole and amoxicillin. Genes commonly observed according to the distinct profiles were aadA, tetC, sul1 and blactx-m according to the respective profile. For our knowledge, this is the first report of the presence of qnrB gene in S. enterica isolated from human patients in Brazil. Profiles were distinct for human and animal isolates, with the first showing a higher proportion of non-susceptibility for several drugs. For K. pneumoniae isolates, it was observed an association between the source (milk; feces) and non-susceptibility for streptomycin, chloramphenicol, tetracycline and sulfamethoxazole. Multidrug resistance (MDR) was observed only for clinical mastitis isolates. Genes commonly observed included tetD, tetB and sul2. For CNS isolates, non-susceptibility to sulfonamides was the most commonly observed (18.65%) followed by penicillin, tetracycline and erythromycin (11.95, 11.29 and 6.5% of isolates tested, respectively). Alberta showed the lowest prevalence of sulfonamides non-susceptibility, although the prevalence of MDR isolates was constant across different Provinces. Samples from tie-stalls had higher odds of being MDR than
samples from free-stalls. Antimicrobial usage was associated with the presence of MDR, especially for chloramphenicol and macrolides. blaZ and mecA (beta-lactams), str and
aadE (aminoglycosides), ermA and ermC (macrolides), tetK and tetL (tetracyclines) genes
were the most commonly observed.
Keywords: antibiogram, beta-lactams, genes, Klebsiella pneumoniae, multidrug-resistance, Salmonella enterica.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Frequência absoluta e relativa de isolados de Salmonella enterica obtidos de
diferentes origens (aves domésticas e isolados clínicos humanos) e microrregiões do Estado de São Paulo, Brasil ... 25
Tabela 2. Frequência absoluta (N) e relativa (%) das espécies de Staphylococcus
coagulase-negativas utilizadas no presente estudo ... 26
Tabela 3. Frequência absoluta (N) e relativa (%) e os respectivos limites inferior e superior
do intervalo de confiança (95%) (LI95% - LS95%) da susceptibilidade aos antimicrobianos em cepas de Klebsiella pneumoniae isolada de fezes e leite de vacas em 24 propriedades leiteiras. ... 36
Tabela 4. Perfil de resistência aos antimicrobianos de cepas de K. pneumoniae isoladas
de fezes e leite em 24 propriedades leiteiras. ... 37
Tabela 5. Frequência absoluta (N) e relativa (%) de amostras avaliadas e amostras
positivas de Klebsiella spp. para a detecção de genes de resistência utilizando-se a técnica da PCR de acordo com o perfil de resistência observado fenotipicamente. ... 39
Tabela 6. Frequência absoluta (N) do perfil de resistência antimicrobiana genotípicos em
amostras de K. pneumoniae isoladas de fezes e quartos intramamários (Leite) em 24 propriedades leiteiras de acordo com a quantidade de classes distintas de antimicrobianos aos quais as respectivas amostras foram consideradas resistentes (Resistência) ... 40
Tabela 7. Frequência absoluta (N) e frequência relativa (%) de amostras de S. enterica
sensíveis ou resistentes à estreptomicina (S), gentamicina (CN), amoxacilina (AML), ciprofloxacina (CIP), tetraciclina (TE), cefoxitina (FOX), cloranfenicol (C), meropenem (MEM), cefotaxime (CTX), enrofloxacina (ENR), sulfametoxazol / trimetropim (STX) e ceftadizime (CAZ). ... 41
Tabela 8. Frequência absoluta (N) e relativa (%) e os respectivos limites inferior e superior
susceptibilidade aos antimicrobianos das cepas de S. enterica isoladas de aves domésticas ou pacientes humanos. ... 43
Tabela 9. Frequência absoluta (N) e relativa (%) dos perfis de resistência aos
antimicrobianos em cepas de S. enterica isoladas de aves domésticas e pacientes humanos... 44
Tabela 10. Frequência absoluta (N) e relativa (%) de amostras de Salmonella spp.
avaliadas e amostras positivas para a detecção de genes de resistência utilizando-se a técnica da PCR de acordo com o perfil de resistência observado fenotipicamente. ... 45
Tabela 11. Frequência absoluta (N) dos perfis de resistência genotípicos observados em Salmonella enterica isolada de aves domésticas e pacientes humanos de acordo com a
quantidade de classes distintas de antimicrobianos aos quais as respectivas amostras foram consideradas resistentes (Resistência). ... 46
Tabela 12. Frequência absoluta (N) e relativa (%) e os respectivos limites inferior e
superior do intervalo de confiança (95%) (LI95% - LS95%) dos resultados do teste de susceptibilidade aos antimicrobianos das cepas de Staphylococcus coagulase-negativa isolados de leite de vacas no Canadá. ... 48
Tabela 13. Prevalência (em 100 amostras) e os respectivos limites inferiores e superiores
do intervalo de confiança (95%) da resistência a, pelo menos, um princípio ativo (SDR) ou a três ou mais classes de princípios ativos (MDR) em amostras de Staphylococcus coagulase-negativa (ECN) isoladas de leite de vacas Canadenses de acordo com a espécie em questão. ... 49
Tabela 14. Prevalência (Prev) da resistência às diferentes classes de antimicrobianos em Staphylococcus coagulase-negativas isolados em quatro diferentes Províncias
Canadenses. ... 50
Tabela 15. Valores de odds ratio (OR) e seus respectivos limites superiores (UB95%) e
inferiores (LB95%) do intervalo de confiança (95%) comparando a chance de isolamento de um Staphylococcus coagulase-negativa resistente à diferentes classes de antimicrobianos em tie-stall com diferentes sistemas de criação de bovinos leiteiros. .. 51
Tabela 16. Proporção de rebanhos com, pelo menos, 1 isolado de Staphylococcus
coagulase-negativa resistente às diferentes classes / drogas de acordo com a contagem de células somáticas do leite do tanque (Baixo CCS = contagem média ao longo de 2007 - 2008 < 150.000 células / mL; Média CCS = contagem média ao longo de 2007 - 2008 > 150.000 células / mL e < 250.000 células / mL; Alto CCS = contagem média ao longo de 2007 - 2008 > 250.000 células / mL. ... 52
Table 17. Modelos finais de generalized estimating equations utilizando-se
separadamente o uso de antimicrobianos (AMU) das diferentes classes como previsores e resistência antimicrobiana (definida como multirresistência) de estafilococos coagulase-negativas (ECN) como outcome considerando-se o efeito de fatores introduzidos como possíveis confounders ou modificadores. ... 54
Tabela 18. Frequência absoluta (N) e relativa (%) da presença dos genes codificadores
de enzimas de resistência aos antimicrobianos em cepas de Staphylococcus
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ... 15 2. REVISÃO DA LITERATURA ... 17 3 OBJETIVOS ... 23 3.1 Objetivos Gerais ... 23 3.2 Objetivos Específicos ... 23 4 MATERIAL E MÉTODOS ... 24 4.1 Amostras Bacterianas ... 24
4.2 Perfil de Resistência Fenotípico ... 27
4.2.1 Salmonella enterica e Klebsiella pneumoniae ... 27
4.2.1.1 Perfil de resistência... 27
4.2.1.2 Detecção fenotípica da produção de beta lactamases do tipo AmpC ... 28
4.2.1.3 Detecção fenotípica da produção de ESBLs ... 28
4.2.1.4 Detecção fenotípica da produção de carbapenemases ... 29
4.2.2 Staphylococcus coagulase-negativa ... 29
4.2.1.1 Perfil de resistência inicial ... 29
4.3 Perfil de Resistência Genotípico ... 29
4.3.1 Salmonella enterica e Klebsiella pneumoniae ... 29
4.3.2 Staphylococcus coagulase-negativa ... 32
4.4 Análise Estatística ... 32
5 RESULTADOS ... 35
5.1 Klebisella pneumoniae ... 35
5.1.1 Perfil de resistência fenotípico ... 35
5.1.2 Perfil de resistência genotípico ... 38
5.2 Salmonella enterica ... 40
5.2.1 Perfil de resistência fenotípico ... 40
5.2.2 Perfil de resistência genotípico ... 44
5.3 Staphylococcus coagulase-negativa ... 47
5.3.1 Perfil de resistência fenotípico ... 47
5.3.2 Utilização de antimicrobianos vs perfil fenotípico ... 52
5.3.3 Perfil de resistência genotípico ... 55
6.1 Salmonella enterica e Klebsiella pneumoniae ... 57
6.2 Staphylococcus coagulase-negativa ... 64
7 CONCLUSÕES ... 69
8 REFERÊNCIAS ... 70
1. INTRODUÇÃO
A resistência aos antimicrobianos é um grave problema de saúde pública, comumente associada às falhas em terapias, aumento dos custos dos tratamentos e na morbidade e mortalidade de pacientes. A emergência de infecções clínicas causadas por bactérias multirresistentes causa grande preocupação mundial (Peirano et al., 2009; Ferrari et al., 2011; Kumarasamy e Krishnan, 2012; Nobrega e Brocchi, 2014).
Salmonella enterica é uma bactéria responsável por quadros de infecções intestinais e extra intestinais (Ohmani et al., 2010). S. enterica multirresistentes são frequentemente descritas na literatura, sendo constante alvo de estudos epidemiológicos (Sjolund-Karlsson et al., 2011; Tamang et al., 2011; Bado et al., 2012).
No contexto de bovinocultura leiteira, a mastite bovina é a principal enfermidade associada ao uso de antimicrobianos (Pol e Ruegg, 2007). Enterobactérias do gênero Klebsiella são comumente encontradas no ambiente de criação de bovinos leiteiros, sendo K. pneumoniae considerada responsável por quadros de mastites clínicas em animais (Hogan e Larry Smith, 2003).
Os estafilococos coagulase-negativa (ECN) são considerados patógenos secundários em bovinocultura leiteira, principalmente quando comparados com patógenos como Staphylococcus aureus, estreptococos e coliformes. Porém, ECN são os patógenos mais comumente isolados de quartos mamários em praticamente todos os continentes (Piepers et al., 2007; Sampimon et al., 2009; Taponen e Pyorala, 2009; Thorberg et al., 2009; De Freitas Guimaraes et al., 2013). Infecções intramamárias (IIM) causadas por ECN aumentam significativamente a contagem de células somáticas (CCS) nos animais (Makovec e Ruegg, 2003) e, portanto, apresentam grande importância diante de regulamentações cada vez mais estritas em termos de limites de CCS em tanques de refrigeração.
O estabelecimento do perfil de resistência fenotípico e genotípico aos antimicrobianos pode servir como guia para tratamentos empíricos, permitindo uma otimização de recursos em sistemas de saúde e em propriedades leiteiras. Do ponto de vista epidemiológico, diferentes perfis são esperados para diferentes origens dos isolados, principalmente por existir uma forte associação entre a utilização de
antimicrobianos e a resistência. O estabelecimento destes perfis de resistência, portanto, tem grande valor epidemiológico.
2. REVISÃO DA LITERATURA
A terapia antimicrobiana transformou a prática médica e veterinária de uma abordagem centrada no diagnóstico para uma abordagem centrada no tratamento, possibilitando a cura de diversas enfermidades. Porém, poucos anos após o advento dos antimicrobianos, o fenômeno conhecido por resistência reduziu muito a eficácia desta nova abordagem (Paphitou, 2013).
O uso imprudente destas substâncias é comumente associado à emergência de bactérias multirresistentes (Smith et al., 2002). Em 2010, o Brasil foi um dos três países com a maior utilização de antimicrobianos em produção animal (Van Boeckel et al., 2015). O uso de antimicrobianos durante a secagem de vacas ou o tratamento ineficaz de casos de mastites exerce pressão seletiva e colabora com a manutenção de genes de resistência aos antimicrobianos. Ainda, resíduos dos antimicrobianos selecionam bactérias resistentes no ambiente e, pela transferência de material genético, outras bactérias podem adquirir genes de resistência (Wedley et al., 2011). No Canadá, os beta-lactâmicos são os antimicrobianos mais comumente utilizados em propriedades leiteiras. Penicilinas, cefalosporinas, lincosamidas e macrolídeos são administrados via intramamária na lactação e no período seco para o tratamento e prevenção da mastite bovina (Saini et al., 2012b).
Apesar da utilização em medicina humana de antimicrobianos em casos de infecções causadas por S. enterica ser incomum, esta pode ser extremamente necessária diante de quadros de infecções invasivas em idosos e crianças. Beta-lactâmicos e fluoroquinolonas são frequetemente empregados nestas ocasiões (Paphitou, 2013).
A produção de enzimas beta-lactamases é o principal mecanismo de resistência aos beta-lactâmicos (Bal et al., 2010; Barguigua et al., 2013). Estas enzimas agem catalisando a hidrólise do anel beta-lactâmico, inativando a molécula. O desenvolvimento de cefalosporinas de terceira geração auxiliou no combate às bactérias produtoras de beta-lactamases. Porém, uma nova classe de enzimas capaz de hidrolisar até mesmo estes novos antimicrobianos tem sido relatada frequentemente na literatura. Estas enzimas são conhecidas como beta-lactamases de espectro estendido ou
ampliado (ESBLs), sendo derivadas de beta-lactamases comuns. Os genes que codificam as ESBLs são geralmente encontrados em plasmídeos, destacando-se os genes que codificam as ESBL do tipo CTX-M (gene blactx-m), TEM (blatem), PER (blaper), VEB (blaver) e SHV (blashv) (Paterson et al., 2003; Jemima e Verghese, 2008). Terapias excessivas e má conduzidas com beta-lactâmicos são tidas como responsáveis pela emergência e disseminação de beta-lactamases (Bradford, 2001).
As beta-lactamases do tipo AmpC provêm ao seu portador um maior espectro de resistência do que as ESBLs (Jacoby, 2009) e pertencem a outra subclasse de enzimas, diferindo tanto estruturalmente como funcionalmente das ESBLs. A diferenciação entre bactérias produtoras de ESBLs de outras produtoras de enzimas do tipo AmpC é necessária principalmente por aspectos de vigilância epidemiológica, e pode ser realizada por técnicas fenotípicas como a disco-difusão dupla sinérgica modificada (Ruppe et al., 2006). As beta-lactamases AmpC mais comumente encontradas são as do tipo MOX, CMY, ACC e FOX (Perez-Perez e Hanson, 2002).
As carbapenemases são beta-lactamases responsáveis pela hidrólise das carbapenemas, que são drogas de escolha utilizadas no tratamento de infecções causadas por enterobactérias produtoras de ESBLs (Bouchillon et al., 2013). A utilização das carbapenemas e consequente seleção de bactérias produtoras de carbapenemases limita em muito o arsenal terapêutico disponível para o tratamento de infecções causadas por estas bactérias (Avlami et al., 2010). Três grandes grupos de carbapenemases são conhecidos de acordo com a classificação estrutural de Ambler: Ambler classe A (tipos IIM-, SME-, GES- e KPC-); Ambler classe B ou metallo-β-lactamases (tipos IMP, VIM, SPM e NDM) e Ambler classe D oxacilinases (tipo OXA-, principalmente a OXA-48 e OXA-23) (Peirano et al., 2009).
Outros antimicrobianos cujos alvos diferem dos beta-lactâmicos também são comumente empregados na indústria leiteira nacional. Diferentes genes tet foram descritos como responsáveis por conferir resistência à tetraciclina em enterobactérias. Os mais frequentes tipos são os pertencentes às classes A, B. C. D e G (Pezzella et al., 2004; Kim et al., 2011). Genes de resistência ao florfenicol como o genes catA, floR, e
cm1A são responsáveis pela codificação de sistemas de efluxo da droga (Chen et al.,
A resistência às fluoroquinolonas pode ser consequência de quatro mecanismos: 1- Modificação da molécula alvo; 2- Exportação de droga via bomba/canais; 3- Proteção do alvo; 4- Modificação da droga via enzimática. Resistência por modificação do alvo da droga ocorre principalmente por mutações que ocorrem em regiões determinantes de resistências às quinolonas na DNA girase, codificadas principalmente pelos genes gyrA e gyrB. Um mecanismo transmissível de canais de efluxo é mediado pelo gene qepA, carreado em plasmídeos (Cavaco et al., 2008a). Os genes qnr A, B e S conferem proteção do alvo (proteção das topoisomerases e redução da afinidade destas às quinolonas). O gene aac(6')-Ib codifica uma variante da enzima aminoglicosídeo acetiltransferase que possui a capacidade de modificar a ciprofloxacina (Kim et al., 2009). O trimetoprim atua como inibidor por competição da diidrofolato redutase, fundamental nas células bacterianas para a síntese de ácido fólico e consequente crescimento bacteriano. Os genes do tipo dfr codificam diidrofolato redutase mutantes, que são menos sensíveis ao trimetoprim (Lee et al., 2001). Já os genes tipo sul, codificam enzimas resistentes à ação das sulfonamidas (Dahmen et al., 2010).
Aminoglicosídeos como a gentamicina e kanamicina são empregados principalmente em hospitais, no tratamento de septicemias. Estes antimicrobianos atuam inibindo a síntese proteica. A disseminação de determinantes de resistência para este grupo de drogas é, portanto, alarmante do ponto de vista de saúde pública (Jakobsen et
al., 2008). O gene aac3-(IV) codifica a produção de enzimas de resistência à apramicina,
um aminoglicosídeo utilizado exclusivamente em medicina veterinária. Este gene já foi encontrado em bactérias isoladas de humanos (Saenz et al., 2004), justificando o monitoramento da resistência desta classe de antimicrobianos em amostras oriundas de animais domésticos.
Recentemente, o uso de antimicrobianos em animais de produção e sua associação com a emergência de bactérias resistentes na cadeia alimentar tem sido alvo de grande preocupação. Bactérias multirresistentes já foram isoladas de leite mastítico (Locatelli et al., 2009; Locatelli et al., 2010), produtos cárneos (Sunde et al., 2009), aves (Yuan et al., 2009; Bortolaia et al., 2010a; Bortolaia et al., 2010b; Hiroi et al., 2011), equinos (Rankin et al., 2005; Damborg et al., 2011), suínos (Tian et al., 2009; Zou et al., 2011), bezerros, vacas e ambiente de animais leiteiros (Liebana et al., 2006; Wittum et
al., 2010; Watson et al., 2011) e em diversas outras localidades. Para animais de
produção, a administração de tratamentos sistêmicos colabora com a manutenção de genes relacionados à resistência antimicrobiana e favorece a seleção de isolados multirresistentes no ambiente, pois resíduos de antimicrobianos são eliminados via leite, fezes e urina dos animais (Bengtsson et al., 2009). Coliformes são agentes ambientais com contato com população bacteriana bastante diversa. Estes agentes são capazes de transferir material genético de um para o outro (Sunde e Norstrom, 2006). Ainda, micro-organismos produtores de enzimas que conferem resistência podem ser encontrados naturalmente no solo e em fezes dos animais, mesmo sem indício de tratamentos prévios (Kojima et al., 2005; Radhouani et al., 2010), justificando o monitoramento de isolados de diversas origens.
Diferentes sistemas de produção podem impactar a incidência de enfermidades como as mastites (Olde Riekerink et al., 2008). Sistemas de tie-stalls e
free-stalls podem estar associados com a prevalência de IIM causadas por ECN e
consequentemente com a maior utilização de antimicrobianos e posterior emergência de isolados resistentes. Ainda, rebanhos bem manejados possuem como reflexo uma baixa celularidade do tanque de expansão indicando um controle mais rígido da mastite bovina. A relação destes fatores (sistemas de produção e células somáticas do tanque de expansão) com a resistência aos antimicrobianos, ainda não é totalmente estabelecida.
No Brasil, a resistência aos antimicrobianos em isolados oriundos de quadros de mastite bovina é alvo de diversos relatos (Duarte et al., 2005; Silva et al., 2014). Infelizmente, informações sobre a utilização de antimicrobianos em propriedades leiteiras são de difícil obtenção. É de fundamental importância ressaltar que existe pouca evidência de que terapias antimicrobianas bem conduzidas são responsáveis pelo aumento da prevalência de isolados resistentes (Erskine et al., 2002). Em contrapartida, a resistência antimicrobiana pode ser menor em isolados de mastites subclínicas do que em isolados oriundos de mastites clínicas devido ao fato de casos subclínicos não serem tratados comumente (Bal et al., 2010). A associação do uso de antimicrobianos e a emergência / prevalência de isolados resistentes, apesar de bem estabelecida para tratamentos indiscriminados, ainda é controversa no caso de tratamentos bem-sucedidos. Amostras de K. pneumoniae oriundas de quadros de IIM, em teoria, são mais
expostas aos antimicrobianos do que amostras de K. pneumoniae oriundas de fezes, principalmente devido ao fato de terapias de secagem serem, em sua grande maioria, intramamárias. Desta maneira, o monitoramento do perfil de resistência em isolados de
K. pneumoniae obtidos de diferentes localidades em propriedades leiteiras é de suma
importância para a melhor compreensão deste tópico.
Ainda neste tópico, existe grande controvérsia quanto à questão relativa à utilização de antimicrobianos em medicina veterinária e a emergência de isolados resistentes em medicina humana. Apesar de a grande maioria da comunidade científica concordar com esta associação, parte sugere que a maior parte dos problemas de resistência em medicina humana advém de tratamentos mal conduzidos em humanos, e que a influência de terapias em animais é mínima (Phillips et al., 2004). Argumentos que corroboram com este ponto de vista existem. Bactérias isoladas de animais não persistem em seres humanos (Sorensen et al., 2001), e modelos matemáticos mostram forte evidência de que o uso prudente de antimicrobianos em medicina humana reduzirá em muito a emergência de isolados resistentes. Neste cenário, a eliminação do uso de antimicrobianos em animais com a finalidade de reduzir a emergência de resistência em medicina humana não seria recomendada (Smith et al., 2002). Em contrapartida, existe forte evidência de que o uso de antimicrobianos em animais de produção tem efeito potencial em medicina humana (Karp e Engberg, 2004). A transferência de isolados e material genético entre espécies é bem documentada (Van Loo et al., 2007; Wannaprasat
et al., 2011; Gandolfi-Decristophoris et al., 2013), sendo que isolados de humanos e
animais apresentam similaridades genotípicas (Guenther et al., 2010; Guenther et al., 2012). Desta maneira, o estabelecimento do perfil de resistência fenotípico e genotípico de S. enterica de origem humana e animal fornece mais uma importante informação para auxiliar o entendimento desta questão controversa.
O conhecimento do perfil de resistência em isolados humanos e de animais domésticos pode guiar tratamentos empíricos, diminuindo o período médio de estadias em hospitais (Fraser et al., 2006). A identificação de genes de resistência e o estabelecimento do perfil de resistência fenotípico em bactérias de diferentes origens (fezes, sangue, carcaças de animais, leite) fornece importante informação epidemiológica auxiliando no combate à disseminação de mecanismos de resistência. Ainda, diferenças
nos perfis de resistência de acordo com a origem dos isolados podem auxiliar no estabelecimento de medidas específicas de vigilância. Embora estudos recentes conduzidos em outros países apontem para a presença de genes de resistência em amostras bacterianas oriundas de animais domésticos (Hammad et al., 2008; Locatelli et al., 2010; Thungrat et al., 2015), informações sobre a presença destes em amostras isoladas no Brasil ainda são escassas.
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivos Gerais
Estabelecer o perfil de resistência fenotípico e genotípico de K. pneumoniae isoladas de propriedades de leite bovino, S. enterica isoladas de humanos e carcaças de frangos e ECN isolados de bovinos leiteiros Canadenses em diferentes estratos avaliados, como a CCS do tanque de expansão, Província e tipo de instalações utilizados.
3.2 Objetivos Específicos
Estudar associações entre os respectivos perfis e a origem dos isolados. A hipótese avaliada é a de que existe uma associação entre a origem do isolado e o perfil de resistência.
Estudar a associação entre a utilização de antimicrobianos e a resistência aos mesmos em ECN isolados de rebanhos Canadenses. A hipótese avaliada é de que existe uma associação positiva entre utilização de antimicrobianos e resistência aos mesmos em ECN.
Estudar a associação entre os diferentes sistemas de produção, estratos de CCS do tanque e Províncias Canadenses com a resistência aos antimicrobianos em ECN isolados de rebanhos Canadenses.
4 MATERIAL E MÉTODOS
As análises laboratoriais foram conduzidas no Departamento de Genética, Evolução e Bioagentes do Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP e no Departamento de Saúde em Produção Animal da Universidade de Calgary no Canadá.
4.1 Amostras Bacterianas
A origem das cepas de K. pneumoniae utilizadas foram estocadas em freezer -80o C. As amostras são oriundas de 24 propriedades de bovinos leiteiros localizadas nos
Estados de São Paulo (14 propriedades), Minas Gerais (6 propriedades), Goiás (3 propriedades) e Bahia (1 propriedade). Em 12 dos 24 rebanhos participantes, amostras de fezes frescas (240) foram cultivadas no período de 2 anos (2011-2012), sendo que em 85 amostras foi isolada a bactéria K. pneumoniae. Todos os 24 rebanhos enviaram, no mesmo período, amostras de leite de mastite clínica segundo critérios próprios de cada rebanho, totalizando 81 amostras. Estas amostras foram cultivadas em laboratório particular e os patógenos identificados previamente de acordo com protocolos padronizados (Nmc, 1999).
As amostras de Salmonella enterica provenientes de diversas localidades (Tabela 1) foram estocadas em freezer -80o C. As amostras utilizadas são de diferentes
origens, incluindo 74 amostras de carcaças de frangos cedidas pelo Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública da Universidade Estadual Paulista (UNESP) Câmpus de Botucatu e pelo Instituto de Tecnologia de Alimentos (ITAL) de Campinas, e 79 amostras clínicas isoladas de pacientes humanos (fezes e sangue), cedidas pelo Hospital das Clínicas da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) e pelo Hospital Universitário da Universidade de São Paulo, Campus de Ribeirão Preto (USP Ribeirão), perfazendo um total de 153 amostras. Informações referentes aos pacientes não foram obtidas no presente estudo.
Tabela 1. Frequência absoluta e relativa de isolados de Salmonella enterica obtidos de diferentes origens (aves domésticas e isolados
clínicos humanos) e microrregiões do Estado de São Paulo, Brasil
Região Origem Aves Humanos % Centro-Sul 40 0 26,1 Sudoeste 34 7 25,5 Noroeste 0 72 47,1 Total 74 79 100
Os isolados de ECN (Tabela 2) são oriundos do National Cohort of Dairy Farms (NCDF) conduzido pelo Canadian Bovine Mastitis Research Network (CBMRN). Estes foram previamente identificados pelo sequenciamento dos genes 16S e rpoB. Noventa e um rebanhos bovinos leiteiros comerciais localizados em 4 diferentes Províncias (Alberta, Ontario, Quebec e Províncias Marítimas) foram selecionados com base no número e raça dos animais, participação em programa nacional de monitoramento de qualidade de leite e outros critérios (Reyher et al., 2011). Resumidamente, 91 rebanhos foram selecionados para serem representativos de três estratos de CCS do tanque de expansão, da composição do sistema de produção da Província com os três diferentes tipos mais comumente observados de sistemas de instalações (free-stall, tie-stall e bedded pack
herds), do sistema de ordenha e da raça dos animais de acordo com a Província (Saini et al., 2012b).
Tabela 2. Frequência absoluta (N) e relativa (%)
das espécies de Staphylococcus coagulase-negativa utilizadas no presente estudo
Espécie N % S. chromogenes 945 50,83 S. simulans 269 14,47 S. xylosus 264 14,2 S. haemolyticus 183 9,84 S. epidermidis 68 3,66 S. cohnii 55 2,96 S. sciuri 37 1,99 S. gallinarum 8 0,44 S. capitis 7 0,38 S. saprophyticus 6 0,32 S. agnetis 5 0,27 S. arlettae 4 0,22 S. warneri 4 0,22 S. equorum 1 0,05 S. hominis 1 0,05 S. hyicus 1 0,05 S. succinus 1 0,05 Total 1.859 100
Amostras de leite foram coletadas de Fevereiro de 2007 à Dezembro de 2008 seguindo protocolos padronizados (Reyher et al., 2011). O estudo resultou na estocagem de aproximadamente 6.000 ECN oriundos de quadros de IIM, dos quais 1.859 foram selecionados para o presente estudo (Tabela 2). O protocolo de seleção baseou-se na escolha aleatória de um ECN de determinada espécie por animal, de maneira que isolados da mesma espécie repetidos no mesmo animal não fossem selecionados simultaneamente.
4.2 Perfil de Resistência Fenotípico
Todas as amostras bacterianas foram submetidas ao teste do antibiograma para estabelecer o perfil de resistência. A escolha dos antimicrobianos e os protocolos foram realizados de acordo com a espécie bacteriana.
4.2.1 Salmonella enterica e Klebsiella pneumoniae
4.2.1.1 Perfil de resistência
Para cada amostra bacteriana uma suspensão foi preparada utilizando-se solução salina a 0,9%, ajustando-se a turbidez para a escala 0,5 de MacFarland. Após a homogeneização da suspensão, esta foi semeada em placa de Petri contendo ágar Müeller-Hinton (Oxoid®) utilizando-se swab estéril, o qual foi previamente umedecido com a suspensão bacteriana, retirando-se o excesso por compressão contra as paredes do tubo. A inoculação no ágar foi feita em toda a extensão da placa e repetida por três vezes, girando-se a placa. Após 15 minutos, os discos de difusão foram colocados sobre o ágar com o auxílio de uma pinça. Os antimicrobianos avaliados foram: amoxicilina (10 µg), cefoxitina (30 µg), cefotaxima (30 µg), ceftazidima (30 µg), meropenem (10 µg), cloranfenicol (30 µg), enrofloxacina (5 µg), ciprofloxacina (5 µg), tetraciclina (30 µg), estreptomicina (10 µg), gentamicina (10 µg) e sulfametoxazol / trimetoprim (25 µg). O diâmetro dos halos de inibição foi medido após a incubação à temperatura de 37o C, por
18 a 24 horas. O controle das reações foi realizado utilizando-se Escherichia coli 25922, sensível a todos os princípios avaliados.
No caso específico de S. enterica, segundo o CLSI os aminoglicosídeos podem parecer ativos “in vitro” resultando em perfil sensível dos isolados sendo que clinicamente estes antimicrobianos são ineficazes para tratamento de salmoneloses. Desta maneira, recomenda-se relatar todos os isolados como resistentes. Como o presente estudo objetivou encontrar genes de resistência relacionados ao perfil fenotípico, optou-se por utilizar os resultados “in vitro” obtidos, visto que o mecanismo de resistência aos aminoglicosídeos demonstrado por S. enterica que resulta na resistência
inata aos mesmos é diferente da presença dos genes avaliados no presente estudo. Do ponto de vista epidemiológico, a presença destes genes é de grande importância.
4.2.1.2 Detecção fenotípica da produção de beta lactamases do tipo AmpC
A detecção fenotípica da produção de beta-lactamases do tipo AmpC foi realizada pela prova de disco-difusão dupla sinérgica modificada (DDDSM) (Ruppe et al., 2006) e pela utilização de discos cefoxitina/cloxacilina (30 µg / 200 µg) (Tan et al., 2009). Foram submetidas a esta prova amostras resistentes a, pelo meno cefoxitina, cefotaxime ou ceftazidime.
4.2.1.3 Detecção fenotípica da produção de ESBLs
Os isolados resistentes ou intermediários a qualquer um dos beta-lactâmicos avaliados (ampicilina, cefoxitina, cefotaxime, meropenem e ceftazidime) foram submetidos à identificação fenotípica da produção de ESBL. As amostras produtoras de ESBL foram identificadas utilizando-se o teste de disco-difusão dupla associada (DDDA), utilizando-se espaçamento de 20 mm entre os discos.
O preparo do inóculo foi feito conforme item 4.2.1.1. Para o método de disco de aproximação foram utilizados: amoxicilina/ácido clavulânico (20 µg /10 µg), aztreonam (30 µg), ceftriaxona (30 µg), ceftazidima (30 µg), cefotaxima (30 µg) e cefpodoxima (30 µg) (Oxoid®). Para esta metodologia, o disco de amoxicilina/ácido clavulânico (20 µg /10 µg) foi colocado a 20 mm (centro a centro) de cada antimicrobiano avaliado.
O diâmetro dos halos de inibição foi medido após a incubação à temperatura de 37o C, por 18 a 24 horas (halos de inibição > 22 mm para cefpodoxima, > 27 mm para
aztreonam, > 27 mm para cefotaxima, > 25 mm para ceftriaxona e > 22 mm para ceftazidima). O teste foi considerado positivo quando houve ampliação do halo de inibição para algum beta-lactâmico ou a formação de uma terceira zona irregular de inibição, a zona fantasma (ghost zone), entre o disco composto e o disco de beta-lactâmico. O controle de qualidade foi realizado utilizando-se as amostras de K. pneumoniae ESBL ATCC 700603 e Escherichia coli 25922.
4.2.1.4 Detecção fenotípica da produção de carbapenemases
Os isolados resistentes ou parcialmente resistentes ao meropenem foram submetidos à identificação fenotípica da produção de carbapenemases. A detecção foi realizada pelo teste de Hodge modificado (TMH) (Anderson et al., 2007). A superfície de uma placa de ágar Mϋller-Hinton (Oxoid®) foi inoculada com uma suspensão de E. coli ATCC 25922 ajustada à um décimo da escala 0,5 MacFarland com a utilização de um
swab esterelizado. Após breve secagem, um disco de imipenem (10 µg) foi disposto no
centro da placa e as amostras teste foram semeadas em estrias partindo do centro da placa até a sua borda. As placas foram incubadas por 24 horas à 37o C. A presença de
uma zona irregular de inibição ao redor do disco de imipenem associado à estria da amostra teste foi considerada como resultado positivo. O controle de qualidade foi realizado utilizando-se as amostras de K. pneumoniae ESBL ATCC 700603 e Escherichia
coli 25922.
4.2.2 Staphylococcus coagulase-negativa
4.2.1.1 Perfil de resistência inicial
O perfil de resistência fenotípico em amostras de ECN foi determinado em todos os 1.859 isolados utilizando-se o sistema Sensititre® (Thermo Scientific Microbiology). Foi avaliada a resistência à vinte e cinco antimicrobianos: ampicilina, cloranfenicol, clindamicina, daptomicina, eritromicina, gentamicina, ciprofloxacina, levofloxacina, linezolida, moxifloxacina, oxacilina, penicilina, quinupristina / dalfopristina, rifampicina, tetraciclina, tigeciclina, sulfametoxazol / trimetoprim, vancomicina, nitrofurantoína, cefoxitina, pirlimicina, penicilina / novobiocina, cefalotina, ceftiofur e sulfadimetoxina.
4.3 Perfil de Resistência Genotípico
O teste da PCR foi realizada visando a detecção dos principais genes responsáveis pela codificação das proteínas de resistência, de acordo com o perfil observado fenotipicamente. Amostras resistentes a determinadas drogas (tetraciclina, kanamicina, gentamicina, sulfametoxazol / trimetoprim, ciprofloxacina, enrofloxacina e cloranfenicol) ou positivas nas provas descritas nos itens 4.2.1.2, 4.2.1.3 e 4.2.1.4 tiveram o DNA genômico extraído utilizando-se protocolo baseado em fervura (Lopes et al., 2010). A confirmação da presença de DNA em amostras de Salmonella spp e K.
pneumoniae foi avaliada utilizando-se primers específicos para estes agentes. As
amostras foram submetidas a PCR com primers específicos para genes codificadores de enzimas de resistência de acordo com o perfil de resistência observado (Quadro 1). Amostras positivas na prova da DDDSM e do TMH foram submetidas à identificação de genes associados ao respectivo perfil (Perez-Perez e Hanson, 2002; Poirel et al., 2011; Monteiro et al., 2012). Em todas as reações, controles positivos e negativos próprios foram utilizados.
Quadro 1. Nome, sequência e referência dos primers utilizados na pesquisa dos genes responsáveis por resistência a
antimicrobianos em K. pneumoniae e S. enterica de acordo com o perfil de resistência fenotípico observado.
Resistência Gene Senso (5' - 3') Antisenso (5' - 3') Referência
Beta-lactâmicos
blashv ATGCGTTATATTCGCCTGTGTA TTAGCGTTGCCAGTGCTCGATCAG (Nobrega et al., 2013)
blatem CATTTTCGTGTCGCCCTTATTC CGTTCATCCATAGTTGCCTGAC (Dallenne et al., 2010)
blactx-m ATGTGCAGYACCAGTAARGT TGGGTRAARTARGTSACCAGA (Pagani et al., 2002)
Tetraciclina
tetA GCTACATCCTGCTTGCCTTC CATAGATCGCCGTGAAGAGG (Wedley et al., 2011)
tetB CCTTATCATGCCAGTCTTGC ACTGCCGTTTTTTCGCC (Ryu et al., 2012)
tetC ACTTGGAGCCACTATCGAC CTACAATCCATGCCAACCC (Archambault et al., 2012)
tetD ATGATAAGCAGTTTCATACAACG TCAGTGCATTGCCTCCAATTC (Ryu et al., 2012)
tetG GCTGGATGATGCATTGCGCG ATGGTCTGCGTAGTATTGGC (Archambault et al., 2012)
Fluoroquinolonas
qnrB GGMATHGAAATTCGCCACTG TTTGCYGYYCGCCAGTCGAA (Cattoir et al., 2007)
qnrS CGACGTGCTAACTTGCGTGATA TACCCAGTGCTTCGAGAATCAG (Cavaco et al., 2008b)
aac(6')-Ib TTGCGATGCTCTATGAGTGGCTA CTCGAATGCCTGGCGTGTTT (Kim et al., 2009)
Cloranfenicol
floR TCCTCGCTTCACTGGCGATG ACCAGCCCCAACGAAACCAG (Chen et al., 2012)
catA2 GAACAYTTTGCCCTTTATCGTC TCCTGCTGAAACTTTGCCATCGT (Lu et al., 2011)
cm1A GCGGGCTATCTTTGCGTTTC AAGTAGACTGCCGTGACCGTTCC (Lu et al., 2011)
Sulfonamidas
dfrA5 ATCGTCGATATATGGAGCGTA TCCACACATACCCTGGTCCG (Hu et al., 2011)
dfrA12, dfrA13 CAGGTGAGCAGAAGATTTTT CCTCGAAGGTTTGATGTACC (Obeng et al., 2012)
sul1 TTCGGCATTCTGAATCTCAC ATGATCTAACCCTCGGTCTC (Obeng et al., 2012)
sul2 CGGCATCGTCAACATAACC GTGTGCGGATGAAGTCAG (Obeng et al., 2012)
sul3 GGAAGAAATCAAAAGACTCAA CCTAAAAAGAAGCCCATACC (Dahmen et al., 2010)
Aminoglicosídeos (apenas para S.
enterica)
strA TGGCAGGAGGAACAGGAGG AGGTCGATCAGACCCGTGC (Chuanchuen et al., 2010)
strB GCGGACACCTTTTCCAGCCT TCCGCCATCTGTGCAATGCG (Chuanchuen et al., 2010)
aadA1, aadA2 GTGGATGGCGGCCTGAAGCC ATTGCCCAGTCGGCAGCG (Lanz et al., 2003)
aadB CTAGCTGCGGCAGATGAGC CTCAGCCGCCTCTGGGCA (Chuanchuen et al., 2010)
aac(3)-I ACCTACTCCCAACATCAGCC ATATAGATCTCACTACGCGC (Saenz et al., 2004)
aac(3)-IV GTGTGCTGCTGGTCCACAGC AGTTGACCCAGGGCTGTCGC (Jakobsen et al., 2008)
aphA1 AAACGTCTTGCTCGAGGC CAAACCGTTATTCATTCGTGA (Dahshan et al., 2010)
4.3.2 Staphylococcus coagulase-negativa
No caso dos ECN, a detecção de genes de resistência foi feita pelo sequenciamento de genoma de 439 isolados selecionados aleatoriamente. Resumidamente, o sequenciamento foi conduzido em plataforma MiSeq® (Illumina®), após a preparo da amostragem utilizando o kit Nextera XT DNA Library Prep (Illumina®). O controle de qualidade dos resultados e montagem dos genomas foi realizado seguindo-se protocolos padronizados (Tritt et al., 2012). A anotação dos genomas foi feita em servidor específico para esta função (Aziz et al., 2008). Sequências anotadas foram depositas em servidor próprio da Universidade de Calgary e a presença de genes de resistência foi pesquisada utilizando técnicas de alinhamento local dos genes de resistência mais comumente observados em ECN (blaZ, vanA (tipos A, B e C), tetK, tetL,
tetM, ermA, ermB, ermC, vatA, vatB, vgbA, catA, cfr, str, aadE, aadD, aphA, dfrB, dfrA, dfrG, dfrK, mecA).
4.4 Análise Estatística
Amostras foram classificadas em resistentes ou sensíveis. Amostras consideradas parcialmente sensíveis de acordo com o critério estabelecido pelo Clinical
& Laboratory Standards Institute (Clsi, 2012) foram agrupadas juntamente com amostras
resistentes perfazendo um único grupo. O presente estudo possuiu isolados de S.
enterica intestinais e extra intestinais. Como padrão de interpretação do resultado
depende desta informação (Humphries et al., 2012), no presente estudo todos os isolados foram considerados como extra intestinais. Multirresistência (MDR) foi definida como a presença de resistência a três ou mais diferentes classes de antimicrobianos. Resultados dos testes fenotípicos e genotípicos foram apresentados em tabelas com frequências absolutas e relativas, com intervalos de confiança construídos considerando-se a distribuição binomial das proporções.
Para estudar a associação entre origem do isolado (humanos e aves para S.
enterica, fezes e infecções intramamárias para K. pneumoniae) e resistência
equations), considerando-se a distribuição binomial e utilizando o logit como link, com a
matriz de variância / covariância do tipo compound symmetry para lidar com o cluster de hospital / abatedouro / propriedade leiteira. A presença de um isolado multirresistente foi considerada como o outcome das análises. Variáveis explanatórias incluíram apenas a origem dos isolados. A significância dos coeficientes foi avaliada considerando-se erros padrão robustos na maior variável hierárquica (local de isolamento, propriedade leiteira). No caso de K. pneumoniae, estas análises foram feitas para todos os isolados oriundos de fezes e IIM em um primeiro momento e, posteriormente, apenas para isolados oriundos de rebanhos que enviaram amostras de ambos os tipos (leite e fezes), visto o potencial viés de seleção existente.
A prevalência da resistência antimicrobiana em ECN de acordo com a droga em questão foi calculada utilizando-se e regressão binomial com o método da
quasi-maximum likelihood de Fisher, com o logit como link e a presença da resistência em
questão como outcome. Intervalos de confiança (95%) foram calculados considerando-se erros padrões robustos estimados na variável “rebanho”. Diferenças nos logits das diferentes variáveis (tipo de stall, Províncias, estrato de celularidade do leite do tanque, espécie de ECN) foram consideradas por este método. Os coeficientes associados com cada regressor, bem como os respectivos intervalos de confiança (95%), foram posteriormente convertidos em proporções para apresentação dos resultados.
Para estudar a associação entre a utilização de antimicrobianos em nível de rebanho e bactéria e a resistência antimicrobiana em ECN bem como possíveis associações entre os regressores (Província, tipo de stall. tamanho de rebanho. produção mensal média de leite) e a resistência antimicrobiana em ECN, utilizou-se modelos de GEE. Inicialmente, dados referentes à utilização de antimicrobianos foram convertidos para doses animais diárias (DAA) (Saini et al., 2012c). O outcome das análises foi a presença de um isolado multirresistente (resistência à 3 ou mais classes de antimicrobianos). Interações de variáveis foram introduzidas de acordo com o princípio da plausibilidade biológica e / ou possível efeito de modificação. Nenhuma interação de três variáveis foi considerada no presente estudo. Assumiu-se associação linear entre o
logit de um isolado multirresistente e previsores contínuos. Província foi considerada
nenhum outro previsor neste nível. O número de isolados testados por rebanho foi incluído como previsor, devido ao possível efeito do tipo confounder. A estratégia adotada baseou-se na introdução de todas as variáveis / interações nos modelos iniciais, onde previsores foram removidos um a um com base na significância estatística e possível alteração nos demais previsores. Erros padrão robustos foram calculados utilizando-se
sandwich estimators (Mass e Hox, 2004). Uma matriz de covariância do tipo compound symmetry ou exchangeable foi utilizada no nível de rebanho. Apesar desta estratégia não
lidar propriamente com a auto correlação em estudos de mensurações repetidas, o protocolo de seleção dos isolados somado ao fato da presente metodologia de análise resultar em resultados comparáveis com a utilização de modelos de regressão logística hierárquica com a matriz de correlação do tipo unstructured é considerado um método eficiente de lidar com a análise de dados em estudos de mensurações repetidas (Dohoo
et al., 2008).
Todas as análises foram conduzidas no Stata® 13 (Kohler e Kreuter, 2009;
Statacorp Lp., 2011). Valores de probabilidade (P) igual ou menores do que 0,05 foram considerados significativos.
5 RESULTADOS
5.1 Klebisella pneumoniae
5.1.1 Perfil de resistência fenotípico
Resistência foi comumente observada para amoxacilina (99,4% dos isolados avaliados), tetraciclina (22,3% dos isolados), estreptomicina (20,5% dos isolados) e combinação de sulfametoxazol/trimetoprim (9,6% dos isolados; Tabela 3). De maneira geral, amostras oriundas de casos de mastite foram menos sensíveis do que amostras oriundas de fezes (Tabela 3). Este resultado foi mais evidente para os seguintes antimicrobianos: estreptomicina, tetraciclina, combinação de sulfametoxazol/trimetoprim e cloranfenicol, mesmo desconsiderando-se amostras oriundas propriedades nas quais não foram coletadas fezes. Consequentemente, perfis multirresistentes foram mais comumente observados para amostras oriundas de infecções intramamárias, de acordo com os resultados dos modelos de GEE (P < 0,05).
Para isolados oriundos de fezes, resistência foi observada apenas para amoxacilina (100% dos isolados), tetraciclina (9,4% dos isolados) e estreptomicina (8,2% dos isolados avaliados). Para isolados oriundos de quadros de IIM, perfis resistentes foram observados para todos os princípios avaliados, exceto para o meropenem
e leite de vacas em 24 propriedades leiteiras. Droga1 Resultado Origem Total Fezes Leite N % LI95% LS95% N % LI95% LS95% N % STR Susceptível 78 91,8 82,5 96,3 54 66,7 50,3 79,8 132 79,5 Resistente 7 8,2a 3,7 17,5 27 33,3b 20,2 49,7 34 20,5 GEN Susceptível 85 100 - - 79 97,5 94,8 98,8 164 98,8 Resistente 0 0 - - 2 2,5 1,1 5,2 2 1,2 AML Susceptível 0 0 - - 1 1,2 0 17,3 1 0,6 Resistente 85 100 - - 80 98,8 82,7 99,9 165 99,4 CIP Susceptível 85 100 - - 80 98,8 82,7 99,9 165 99,4 Resistente 0 0 - - 1 1,2 0 17,3 1 0,6 TET Susceptível 77 90,6 82,1 95,3 52 64,2 58,9 69,1 129 77,7 Resistente 8 9,4a 4,7 17,9 29 35,8b 30,9 41,1 37 22,3 FOX Susceptível 85 100 - - 79 97,5 94,8 98,8 164 98,8 Resistente 0 0 - - 2 2,5 1,1 5,2 2 0,12 C Susceptível 85 100 - - 68 83,9 74,4 90,4 153 92,2 Resistente 0 0a - - 13 16,1b 9,6 25,6 13 7,8 MEM Susceptível 85 100 - - 81 100 - - 166 100 CTX Susceptível 85 100 - - 79 97,5 94,8 98,8 164 98,8 Resistente 0 0 - - 2 2,5 1,1 5,2 2 1,2 ENR Susceptível 85 100 - - 80 98,8 82,7 99,9 165 99,4 Resistente 0 0 - - 1 1,2 0 17,3 1 0,6 SXT Susceptível 85 100 - - 65 80,2 71,5 86,8 150 90,4 Resistente 0 0a - - 16 19,8b 13,2 28,5 16 9,6 CAZ Susceptível 85 100 - - 81 100 - - 166 100 DDR2 12 14,12a 5,5 31,8 43 53,1b 33,7 71,5 55 33,1 MDR3 3 3,53a 1,3 9,5 25 30,9b 24,4 38,2 28 16,9
1Estreptomicina (STR), Gentamicina (GEN), Amoxacilina (AML), Ciprofloxacina (CIP), Tetraciclina (TET), Cefoxitina (FOX), Cloranfenicol (C), Meropenem (MEM), Cefotaxime (CTX), Enrofloxacina (ENR), Sulfametoxazol / trimetoprim (STX) E Ceftadizime (CAZ)
2Resistência à, pelo menos, 2 antimicrobianos (DDR); 3Resistência à, pelo menos, três classes de antimicrobianos distintas (MDR)
a-bValores de frequências relativas de resistência à uma mesma droga seguidos de letras diferentes indicam diferença estatisticamente significativa entre isolados de diferentes origens de acordo com os modelos de GEE.
Foi encontrada uma amostra de K. pneumoniae resistente às fluoroquinolonas, oriunda de um quadro de mastite clínica. Quase a totalidade das amostras (165) foi resistente a, pelo menos, um beta-lactâmico (Tabela 4).
Tabela 4. Perfil de resistência aos antimicrobianos de cepas de K. pneumoniae isoladas de fezes e leite em 24 propriedades
leiteiras. Perfil1 Origem Fezes Leite N % N % AML 73 85,9 37 46,2 AML TET 5 5,9 8 10,0 AML S 4 4,7 5 6,2 AML FOX 0 0 2 2,5 AML SXT 0 0 1 1,3 AML S TET 3 3,5 6 7,5 AML TET SXT 0 0 3 3,7 AML TET C 0 0 2 2,5 AML S CTX 0 0 2 2,5 AML S SXT 0 0 1 1,3 AML S SXT C 0 0 2 2,5 AML S TET C 0 0 2 2,5 AML S TET SXT 0 0 1 1,2 AML S TET SXT C 0 0 6 7,5 AML S TET SXT CN 0 0 1 1,3
AML S SXT C CN ENR CIP 0 0 1 1,3
Total 85 100 80 100
1Estreptomicina (S), Gentamicina (CN), Amoxacilina (AML), Ciprofloxacina (CIP), Tetraciclina (TET), Cefoxitina (FOX), Cloranfenicol (C), Meropenem (MEM), Cefotaxime (CTX), Enrofloxacina (ENR), Sulfametoxazol / trimetoprim (STX) E Ceftadizime (CAZ)
De acordo com a metodologia proposta, a prova da DDDA para detecção fenotípica da produção de ESBLs foi aplicada a 165 amostras de K. pneumoniae. Duas amostras de uma mesma propriedade leiteira foram positivas, sendo ambas oriundas de quadros de infecção intramamária. Ambas as amostras foram resistentes ao cefotaxime e sensíveis ao ceftazidime. As demais amostras foram negativas para a prova da DDDA. Duas amostras de K. pneumoniae foram consideradas resistentes à cefoxitina e, posteriormente, submetidas a prova da DDDSM. Ambas as amostras foram consideradas negativas quanto à produção de beta-lactamases do tipo AmpC. Não foi encontrada no presente estudo amostras resistentes ao meropenem.
5.1.2 Perfil de resistência genotípico
A técnica da PCR foi realizada buscando-se a detecção de genes de resistência, de acordo com o perfil avaliado. Os genes mais comumente observados em
K. pneumoniae foram os genes tetB, teG e sul2 associados à resistência às tetraciclinas
Tabela 5. Frequência absoluta (N) e relativa (%) de amostras avaliadas e amostras
positivas de Klebsiella pneumoniae para a detecção de genes de resistência utilizando-se a técnica da PCR de acordo com o perfil de resistência obutilizando-servado fenotipicamente.
Resistência fenotípica Gene Klebsiella pneumoniae
N avaliados N positivos % % do Total
Beta-lactâmicos blatem 4 0 0,0 0,0
blactx-m 4 0 0,0 0,0 blashv 4 2 50,0 1,2 Cloranfenicol floR 14 2 14,3 1,2 cat2 14 1 7,1 0,6 cm1A 14 1 7,1 0,6 Tetraciclina tetA 44 5 11,4 3,0 tetB 44 7 15,9 4,2 tetC 44 1 2,3 0,6 tetD 44 9 20,5 5,4 tetG 44 0 0,0 0,0 Fluoroquinolonas qnrB 1 0 0,0 0,0 qnrS 1 0 0,0 0,0 aac(6’)-Ib 1 0 0,0 0,0 Sulfonamidas dfrA7 19 0 0,0 0,0 dfrA12 19 2 10,5 1,2 sul1 19 1 5,3 0,6 sul2 19 8 42,1 4,8 sul3 19 0 0,0 0,0
Como o número de isolados avaliados pela técnica de PCR depende diretamente do número de amostras positivas nos testes fenotípicos, uma maior quantidade de isolados oriundos de quadros de IIM foram avaliados em comparação com isolados de fezes (Tabela 6). Consequentemente, uma maior diversidade e quantidade de genes de resistência foi encontrada em isolados oriundos de quadros de IIM. 39
Tabela 6. Frequência absoluta (N) do perfil de resistência
antimicrobiana genotípicos em amostras de K. pneumoniae isoladas de fezes e quartos intramamários (Leite) em 24 propriedades leiteiras de acordo com a quantidade de classes distintas de antimicrobianos aos quais as respectivas amostras foram consideradas resistentes (Resistência)
Resistência Fezes Leite
Perfil N Perfil N
1 classe blashv 2 - -
2 classes tetD 1 tetD 2
tetD tetB 2 tetD tetB 1
tetB 1
3 classes ou mais tetC 1 sul2 2
cat 1 floR 1 tetA 1 tetB tetD 3 tetA sul2 3 cm1A sul2 1 dfrA12 sul1 1 dfrA12 sul2 1
floR tetA sul2 1
5.2 Salmonella enterica
5.2.1 Perfil de resistência fenotípico
Entre as 153 cepas avaliadas, 109 (71,2%) amostras de S. enterica foram sensíveis a todos os antimicrobianos avaliados. Resistência foi mais frequentemente observada para estreptomicina (18,3% dos isolados avaliados; Tabela 7), tetraciclina (9,8% dos isolados avaliados) e ciprofloxacina (5,9% dos isolados avaliados). Não foi
encontra amostras resistentes ao meropenem. Quinze amostras de S. enterica foram resistentes à, no mínimo, um beta-lactâmico. Destas, cinco isolados foram positivos na prova da DDDA; duas oriundas de carcaças de frangos e três isolados humanos. Todos os isolados avaliados foram negativos para a produção de beta-lactamases do tipo AmpC e para a produção de carbapenemases. Quarenta e quatro isolados (28,8%) foram resistentes a, no mínimo, um antimicrobiano avaliado, enquanto 15 isolados (9,8%) foram considerados MDR (Tabela 8).
Tabela 7. Frequência absoluta (N) e frequência relativa (%) de amostras de S. enterica sensíveis ou resistentes à estreptomicina (S), gentamicina (CN), amoxacilina
(AML), ciprofloxacina (CIP), tetraciclina (TE), cefoxitina (FOX), cloranfenicol (C), meropenem (MEM), cefotaxime (CTX), enrofloxacina (ENR), sulfametoxazol / trimetoprim (STX) e ceftadizime (CAZ).
Resultado
Antimicrobiano
S CN1 AML CIP TE FOX
N % N % N % N % N % N %
Sensíveis 125 81,7 144 94,1 138 90,2 144 94,1 138 90,2 153 100
Resistentes 28 18,3 9 5,9 15 9,8 9 5,9 15 9,8 0 0
Resultado
Antimicrobiano
C MEM CTX ENR STX CAZ
N % N % N % N % N % N %
Sensíveis 142 92,8 153 100 151 98,7 152 99,3 140 91,5 153 100
Resistentes 11 7,2 0 0 2 1,3 1 0,7 13 8,5 0 0 1Foi considerado os critérios do CLSI para interpretação dos resultados ignorando-se o fato de que esta droga é ineficaz clinicamente, conforme explicado na seção 4.2.1.1
Isolados humanos apresentaram uma maior proporção de resistência do que isolados de aves para amoxacilina (0,165 vs 0,027, P = 0,01), tetraciclina (0,165 vs 0,027,
P < 0,001), cloranfenicol (0,139 vs 0, P < 0,001) e combinação de sulfametoxazol /
trimetoprim (0,165 vs 0, P < 0,001). Resistência aos beta-lactâmicos foi observada em 16,5% dos isolados humanos e 2,7% de isolados de aves. Resultados dos modelos de GEE mostraram que a proporção de resistência à pelo menos um princípio ativo avaliado
não foi diferente em isolados humanos e isolados aviários. Porém, todos os 15 isolados com perfil multirresistente foram de origem humana (Tabela 8; Tabela 9).
aves domésticas ou pacientes humanos. Droga1 Resultado Origem Total Aves Humanos N % LI95% LS95% N % LI95% LS95% N % STR Susceptível 62 83,8 31,8 98,3 63 79,8 63,1 90,0 125 81,7 Resistente 12 16,2 1,7 68,3 16 20,2 9,9 36,8 28 18,3 GEN Susceptível 72 97,3 81,9 99,7 72 91,1 69,4 97,9 144 94,1 Resistente 2 2,7 0,4 18,1 7 8,9 2,1 30,6 9 5,9 AML Susceptível 72 97,3 81,9 99,7 66 83,5 78,1 87,9 138 90,2 Resistente 2 2,7a 0,4 18,1 13 16,5 12,1 21,9 15 9,8 CIP Susceptível 67 90,5 89,2 91,8 77 97,5 0,1 99,9 144 94,1 Resistente 7 9,5 8,3 10,8 2 2,5 0 99,9 9 5,9 TET Susceptível 72 97,3 81,9 99,7 66 83,5 41,1 97,4 138 90,2 Resistente 2 2,7a 0,4 18,1 13 16,5 2,6 58,9 15 9,8 FOX Susceptível 74 100 - - 79 100 - - 153 100 C Susceptível 74 100 - - 68 86,1 31,1 98,8 142 92,8 Resistente 0 0a - - 11 13,9 1,2 68,9 11 7,2 MEM Susceptível 74 100 - - 79 100 - - 153 100 CTX Susceptível 72 97,3 81,9 99,7 79 100 - - 151 98,7 Resistente 2 2,7 0,3 18,1 0 0 - - 2 1,3 ENR Susceptível 74 100 - - 78 98,7 0 100 152 99,3 Resistente 0 0 - - 1 1,3 0 100 1 0,7 SXT Susceptível 74 100 - - 66 83,5 25,5 98,7 140 91,5 Resistente 0 0a - - 13 16,5 1,3 74,5 13 8,5 CAZ Susceptível 74 100 - - 79 100 - - 153 100 SDR2 21 28,4 5,4 73,4 23 29,1 27,9 30,3 44 28,8 MDR3 0 0a - - 15 19,0 5,4 48,8 15 9,8
1Estreptomicina (STR), Gentamicina (GEN), Amoxacilina (AML), Ciprofloxacina (CIP), Tetraciclina (TET), Cefoxitina (FOX), Cloranfenicol (C), Meropenem (MEM), Cefotaxime (CTX), Enrofloxacina (ENR), Sulfametoxazol / trimetoprim (STX) E Ceftadizime (CAZ)
2Resistência à, pelo menos, 1 antimicrobianos (SDR)
3Resistência à, pelo menos, três classes de antimicrobianos distintas (MDR)
a-bValores de frequência relativas de resistência à uma mesma droga seguidos de letras diferentes indicam diferença estatisticamente significativa entre isolados de diferentes origens de acordo com os modelos de GEE
