INSTRUÇÕES DE
UTILIZAÇÃO –
BBL Enterotube II
IA-273176.01 Rev.: Jan. 2007
BD BBL Enterotube II
UTILIZAÇÃO PRETENDIDA
O BBL Enterotube II é um sistema de identificação pronto a usar para a identificação de
Enterobacteriaceae e de uma variedade de outros bastonetes gram-negativos negativos para a oxidase.
PRINCÍPIOS E EXPLICAÇÃO DO PROCEDIMENTO
Método microbiológico.
As Enterobacteriaceae têm um papel importante como agentes infecciosos. Este grupo de bactérias utiliza hidratos de carbono principalmente por fermentação e por oxidação. São positivas para a catalase e quase todas elas são negativas para a oxidase [Recentemente, foi proposta a inclusão da Plesiomonas shigelloides nas Enterobacteriaceae com base na sequenciação de rRNA 16S e porque contém o antigénio comum enterobacteriano.1,2 Anteriormente, este organismo que é positivo para a oxidase, foi incluído na família Vibrionaceae]. A identificação de Enterobacteriaceae baseia-se em reacções bioquímicas conforme descritas por Ewing e por Farmer. Para mais pormenores, consultar a bibliografia.1-11
Embora uma enorme variedade de géneros e espécies tenha sido descrita ao longo dos anos, os organismos que são isolados de amostras clínicas pertencem a um número entre 20 e 25 espécies há muito bem conhecidas.1
O BBL Enterotube II é um tubo de plástico compartimentado e autónomo que contém doze meios diferentes que permitem a determinação de 15 reacções bioquímicas (glucose, produção de gás a partir de glucose, lisina descarboxilase, ornitina descarboxilase, H2S, indol, adonitol, lactose, arabinose, sorbitol, Voges-Proskauer (VP), dulcitol, fenilalanina deaminase (PA), ureia e citrato). O fio de inoculação incluído permite a inoculação de todos os compartimentos num único passo a partir de uma ou de algumas colónias simples de um isolado. A combinação de reacções resultante, juntamente com o Guia de Interpretação (livro de códigos), permite a identificação de Enterobacteriaceae clinicamente
significativas.
O Guia de Interpretação (livro de códigos) do BBL Enterotube II foi elaborado utilizando os dados de percentagens contidos nas referências dos testes bioquímicos realizados pelo BBL Enterotube II.3-11 O Bloco de Resultados e a Tabela das Cores das Reacções permitem uma verificação rápida das reacções positivas obtidas com o BBL Enterotube II. Os números positivos verificados são totalizados,
localizando-se depois o número composto no Guia de Interpretação para identificar os organismos. Quando dois ou mais organismos estão listados, os testes de confirmação necessários para a sua identificação adicional são também indicados.
O fluxograma seguinte demonstra como se pode utilizar o teste de oxidase para fazer a diferenciação entre os membros da família das Enterobacteriaceae e as bactérias gram-negativas não fermentadoras positivas ou negativas para a oxidase, e fermentadoras positivas para a oxidase, e quando se utiliza o BBL Enterotube II ou o BBL Oxi/Ferm Tube II:
Cultura pura em meio não selectivo ↓
Teste de oxidase
positivo negativo
↓ ↓
Inocular o BBL Oxi/Ferm Tube II Inocular o BBL Enterotube II
↓ ↓
Glucose anaeróbia Glucose
Positivo Negativo Positivo Negativo*
Aeromonas spp., Plesiomonas shigelloides, Vibrio spp. Achromobacter spp., Alcaligenes spp., Bordetella bronchiseptica, Moraxella spp., Pasteurella spp., etc. Enterobacteriaceae Acinetobacter spp., Stenotrophomonas maltophilia, etc. * Estas espécies podem ser identificadas com o sistema BBLEnterotube II, mas poderá ser necessária a utilização
REAGENTES
BBL Enterotube IISubstratos, outros ingredientes activos e coloração dos meios não inoculados:
• Meio 1 (glucose): Glucose (20,0 g/L) contida num meio de base apropriado, com vermelho de cresol como indicador de pH. O meio é coberto com cera para criar condições anaeróbias e permitir a detecção de formação de gás. Não inoculado: vermelho.
• Meio 2 (lisina): Lisina (10,0 g/L) contida num meio de base apropriado, com púrpura de bromocresol como indicador de pH. O meio é coberto com cera para criar condições anaeróbias. Não inoculado: amarelo.
• Meio 3 (ornitina): Ornitina (10,0 g/L) contida num meio de base apropriado, com púrpura de
bromocresol como indicador de pH. O meio é coberto com cera para criar condições anaeróbias. Não inoculado: amarelo.
• Meio 4 (H2S/indol): Tiossulfato de sódio (4,7 g/L), citrato de amónio férrico (0,6 g/L) e triptofano (1,2 g/L) num meio de base apropriado. Não inoculado: Bege a âmbar claro.
• Meio 5 (adonitol): Adonitol (20,0 g/L) contido num meio de base apropriado, com vermelho de cresol como indicador de pH. Não inoculado: vermelho.
• Meio 6 (lactose): Lactose (20,0 g/L) contido num meio de base apropriado, com vermelho de cresol como indicador de pH. Não inoculado: vermelho.
• Meio 7 (arabinose): Arabinose (20,0 g/L) contida num meio de base apropriado, com vermelho de cresol como indicador de pH. Não inoculado: vermelho.
• Meio 8 (sorbitol): Sorbitol (20,0 g/L) contido num meio de base apropriado, com vermelho de cresol como indicador de pH. Não inoculado: vermelho.
• Meio 9 (Voges-Proskauer): Glucose (20,0 g/L) contida num meio de base apropriado. Não inoculado: incolor a âmbar claro.
• Meio 10 (dulcitol/PA): Dulcitol (20,0 g/L), fenilalanina (7,0 g/L) e citrato de amónio férrico (0,5 g/L) contidos num meio de base apropriado, com azul de bromotimol como indicador de pH. Não inoculado: verde.
• Meio 11 (ureia): Ureia (20,0 g/L) contida num meio de base apropriado, com vermelho de fenol como indicador de pH. Não inoculado: bege a âmbar claro.
• Meio 12 (citrato): Citrato de sódio (2,0 g/L) contido num meio de base apropriado, com azul de bromotimol como indicador de pH. Não inoculado: verde.
PRECAUÇÕES
. Apenas para uso profissional.
Não utilizar tubos que apresentem sinais de contaminação microbiana, descoloração, destacamento da cera dos respectivos meios, secura, fissuras ou outros sinais de deterioração.
Qualquer das condições seguintes pode interferir com a exactidão do BBL Enterotube II: desidratação ou liquefacção, levantamento da cera das superfícies dos meios, qualquer alteração das cores dos meios em relação às indicadas em “Não inoculado” na secção REAGENTES, e qualquer indicação de
crescimento nas superfícies dos meios.
As seguintes precauções dizem respeito aos compartimentos individuais indicados:
• Glucose: A sobreposição de cera neste compartimento produz o grau de anaerobiose necessário para permitir apenas a reacção de fermentação verdadeira característica de todas as
Enterobacteriaceae. Se este meio permanecer vermelho após a inoculação e a incubação, a estirpe não pertence às Enterobacteriaceae. Exemplos de não-Enterobacteriaceae negativas para a oxidase que não fermentam a glucose em condições anaeróbias no BBL Enterotube II são as espécies de Acinetobacter negativas para a glucose. Embora estes organismos possam ser diferenciados das Enterobacteriaceae utilizando o BBL Enterotube II (no Guia de Interpretação, utilizar a base de dados para os não fermentadores negativos para a oxidase), o BBL Oxi/Ferm Tube II pode ser necessário para a sua identificação mais detalhada.
• Fenilalanina (PA): O meio pode adquirir uma tonalidade mais escura de verde após a incubação. Tal deve ser considerado negativo.
Advertência: Quando preparar e manusear indol e reagentes VP, siga as instruções de manuseamento apropriadas e as declarações de Riscos e Segurança.
Consultar as INSTRUÇÕES GERAIS DE UTILIZAÇÃO para informação sobre os procedimentos de manuseamento asséptico, os riscos biológicos e os procedimentos de eliminação do produto usado.
ARMAZENAMENTO E PRAZO DE VALIDADE
Após recepção, conservar o BBL Enterotube II no escuro a uma temperatura entre 2 e 8°C, dentro da caixa original, até ao momento da utilização. Evitar congelar e aquecer excessivamente. Os tubos podem
ser inoculados até ao prazo de validade e incubados durante o tempo de incubação recomendado. Os tubos provenientes de embalagens abertas podem ser utilizados até ao prazo de validade. Os tubos abertos devem ser imediatamente utilizados.
CONTROLO DE QUALIDADE PELO UTILIZADOR
Inocular o BBL Enterotube II com as estirpes descritas abaixo. Para inoculação, incubação e leitura, proceder conforme descrito em Procedimento do teste.
ORGANISMOS
Gl u c ose Gás Lis in a Orn it ina H2 S Ind o l Adonitol Lacto se Ar abin ose Sorbi to l VP Dulci tol Fe n il -al an in a Ur ei a Ci trato Biocódigos aceitáveis Proteus mirabilis ATCC 12453 + +/- - + + - - - - - - - + + +/- 66007 / 66006 / 46007 Proteus vulgaris ATCC 6380 +/(+) +/- - - + + - - - - - - + + + 63007 / 43007 Providencia alcali-faciens ATCC 9886 + +/- - - - + + - - - - - + - -/+ 61404 / 41405 / 41404 / 61405 Serratia marcescens ATCC 13880 + +/- + + - - +/- - - + + - - - + 74461 / 54461 / 74061 / 54061 Escherichia coli ATCC 25922 + +/- + + - + - + + + - - - 75340 / 55340 Klebsiella pneumoniae ATCC 27736 + +/- + - - - + + + + + + - -/+ + 50771 / 70771 / 70773 / 50773 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 - - - - -/+ -/(+) + ** A P. aeruginosa é positiva para a oxidase e, portanto, não está incluída nas bases de dados do BBL Enterotube II. No entanto, esta estirpe é útil como organismo de controlo para detectar reacções negativas nos compartimentos da glucose e do gás.
+= positivo; − = negativo; (+) fracamente positivo; +/- = positivo ou (raramente) negativo; +/(+) = positivo ou (raramente) fracamente positivo; -/+= negativo ou (raramente) positivo.
PROCEDIMENTO
Materiais fornecidosBBL Enterotube II. Microbiologicamente controlado.
Bloco de Resultados e Tabela das Cores das Reacções do BBL Enterotube II. Materiais não fornecidos
Guia de Interpretação (livro de códigos) do BBL Enterotube II, documento no. CM-273176.CE, que está dividido em três bases de dados. (1) Não fermentadores negativos para a oxidase, (2)
Enterobacteriaceae – método sem VP e (3) Enterobacteriaceae – método com VP.
São comercializados pela BD os seguintes reagentes: Reagente de indol de Kovacs (Indole Dropper Reagent, 50 ampolas, n°. de cat. 261185) e reagentes Voges-Proskauer (Voges-Proskauer A Dropper Reagent, 50 ampolas, n°. de cat. 261192; Voges-Proskauer B Dropper Reagent, n°. de cat. 261193). Materiais e reagentes para realizar os testes suplementares conforme mencionado no Guia de Interpretação do BBL Enterotube II.
Sistema de identificação BBL Oxi/Ferm II (no.de cat. 212116) para a identificação de não-Enterobacteriaceae.
Meios de cultura auxiliares, reagentes e equipamento de laboratório conforme descrito. O reagente de Kovacs pode ser preparado no laboratório como se segue
Álcool amílico ou isoamílico 75 mL
p-dimetilaminobenzaldeído 5 g
Ácido clorídrico, concentrado 25 mL
Dissolver p-dimetilaminobenzaldeído (o reagente deve apresentar uma cor amarelo claro) em álcool e, a seguir, adicionar lentamente o ácido. O reagente preparado deve apresentar uma cor amarelo palha e deve ser conservado num frasco castanho, refrigerado, para garantir a estabilidade máxima. Qualquer reagente que apresente uma cor castanho-escuro não deve ser utilizado.
Os reagentes Voges-Proskauer podem ser preparados como se segue: Solução de alfa-naftol a 5%
Alfa-naftol 5 g
Etanol (álcool etílico), absoluto 100 mL Solução de hidróxido de potássio a 20%
Água 100 mL
Hidróxido de potássio (concentrado) 20 g
Creatina 300 mg
Após a preparação, os reagentes Voges-Proskauer são estáveis em frascos bem fechados durante duas semanas a uma temperatura entre 2 e 8°C no escuro.
Tipos de amostra
O BBL Enterotube II é um sistema de identificação bioquímica e não deve ser utilizado directamente com as amostras clínicas. Utilizar isolados de meios apropriados (consultar Procedimento do teste). O BBL Enterotube II pode ser utilizado para identificar bastonetes gram-negativos aeróbios e
facultativamente anaeróbios (Enterobacteriaceae) isolados de qualquer amostra. Procedimento do teste
Para a inoculação do BBL Enterotube II, pode utilizar-se crescimento de ágares MacConkey (MAC), azul-de-metileno e eosina (EMB), Salmonella Shigella (SS) ou entérico Hektoen (HE), ou de meios não selectivos de ágar sangue. A cultura utilizada para a inoculação deve ter pelo menos 18 h, mas em geral não deve ter mais de 48 h. Certifique-se de que o isolado que irá ser identificado com o BBL Enterotube II é uma cultura pura de um bastonete gram-negativo. O BBL Enterotube II deve ser utilizado apenas com isolados negativos para a oxidase uma vez que os organismos positivos para a oxidase (não-Enterobacteriaceae) requerem a utilização do BBL Oxi/Ferm Tube II para a sua identificação.
1. Preparar uma folha do bloco de codificação para o isolado introduzindo o nome do doente, o número da amostra e a data.
Nota: Poderá ser decidido pelo utilizador se vão ser utilizadas as bases de dados com ou sem VP. Dependendo desta decisão, utilizar o lado da frente ou o lado de trás do bloco de codificação. Se se optar pela base de dados sem VP, poderá ser necessário efectuar a reacção VP como um teste suplementar dos organismos seleccionados.
2. Pegar num tubo BBL Enterotube II e introduzir o nome do doente, o número da amostra e a data na etiqueta.
3. Retirar as duas tampas. A ponta do fio de inoculação está sob a tampa branca. Não flamejar o fio. 4. Colher uma colónia bem isolada directamente com a ponta do fio de inoculação do BBL Enterotube
II (Figura 1). Deve observar-se uma quantidade visível de inóculo na ponta e na parte lateral do fio. Evitar tocar no ágar com o fio. Utilizar um ou mais BBL Enterotube II para colher colónias adicionais, conforme a experiência ditar.
5. Inocular o BBL Enterotube II torcendo primeiro o fio e retirando-o depois através dos doze compartimentos aplicando um movimento giratório (Figura 2).
6. Reintroduzir o fio (sem esterilizar) no BBL Enterotube II, aplicando um movimento giratório através dos 12 compartimentos, até o entalhe do fio estar alinhado com a abertura do tubo (Figura 3). A ponta do fio deve estar visível no compartimento do citrato. Partir o fio no entalhe dobrando. A parte do fio que permanece no tubo mantém condições anaeróbias necessárias para a verdadeira fermentação da glucose, a produção de gás e a descarboxilação da lisina e ornitina.
7. Com a parte partida do fio, puncionar orifícios através da película que cobre as entradas de ar dos últimos oito compartimentos (adonitol, lactose, arabinose, sorbitol, Voges-Proskauer, dulcitol/PA, ureia e citrato) com o fim de suportar o crescimento aeróbio nestes compartimentos (Figura 4). Voltar a colocar as duas tampas.
8. Incubar a uma temperatura entre 35 e 37°C durante 18 a 24 h com o BBL Enterotube II assente na sua superfície plana ou em posição vertical. Permitir a circulação de ar entre os tubos incubados. 9. Interpretar e registar todas as reacções com excepção do indol e do Voges-Proskauer. (Para
instruções completas sobre como ler os resultados do BBL Enterotube II, consultar a secção
Resultados). Todos os outros testes devem ser lidos antes dos testes de indol e de Voges-Proskauer serem realizados uma vez que os reagentes adicionados para estes testes podem alterar o restante das reacções do BBL Enterotube II.
Adição de reagentes Indol e Voges-Proskauer:
1. Coloque o BBL Enterotube II horizontalmente na bancada ou verticalmente num suporte com o compartimento de glucose apontado para baixo. Utilizando uma agulha ou a extremidade partida de um
fio de inoculação de BBL Enterotube II, ou derretendo com um fio de inoculação quente, perfure ou derreta um orifício com cerca de 3 a 4 mm de diâmetro na película de plástico por cima dos
compartimentos de Indol/H2S e de VP.
2. Para realizar o teste de indol: Adicione 3-4 gotas de reagente de Kovacs (n°. de cat 261185 ou preparado no laboratório; consulte a secção Materiais não fornecidos) no compartimento de H2S/indol e adicione o reagente ao compartimento. Deixe o reagente entrar em contacto com a superfície do meio. Um teste positivo é indicado pelo desenvolvimento de uma cor vermelha no reagente adicionado em 10 segundos.
3. Para realizar o teste de Voges-Proskauer: Este teste é obrigatório se optar pela base de dados com VP. Poderá também ser necessário realizar este teste se for necessário como teste de confirmação quando se utiliza a base de dados sem VP.
Quando utilizar os reagentes preparados em laboratório (consulte a secção Materiais não fornecidos), adicione duas gotas de solução de hidróxido de potássio a 20% com creatina a 0,3% e três gotas de alfa-naftol a 5% em álcool etílico absoluto. Um teste positivo é indicado pelo desenvolvimento de uma cor vermelha em 20 minutos. Não espere mais de 20 minutos até observar os resultados!
Quando utilizar Dropper Reagents, adicione 3 a 5 gotas de reagente Voges-Proskauer A (n°. de cat. 261192) e 1 a 2 gotas de reagente Voges-Proskauer B (n°. de cat. 261193). Uma reacção positiva é indicada pelo desenvolvimento de uma cor vermelho-cereja dentro de 5 a 15 minutos. Uma descoloração de cor cobre ou acastanhada é interpretada como um resultado negativo. Não espere mais de 15 minutos até observar os resultados!
Resultados
Seguir as instruções indicadas abaixo para identificar o isolado. Na Tabela 1 são dadas informações sobre o aspecto das reacções positivas e negativas.
Nota: Se não for observada nenhuma alteração de cor ou se for observada uma cor laranja no compartimento de glucose e o crescimento for evidente devido às alterações de cor noutros
compartimentos, o organismo não é um membro da família das Enterobacteriaceae. (Consultar a secção PRECAUÇÕES).
1. Após 18 a 24 h de incubação, interpretar todas as reacções. Com excepção do indol e do VP, ler as reacções de uma forma sequencial comparando as cores dos meios no tubo após a incubação com as apresentadas no esquema de cores na capa do bloco de codificação e (eventualmente) com um BBL Enterotube II não inoculado, que deve ser colocado primeiro à temperatura ambiente (Figura 5). Todas as reacções que devem ser positivas podem ser de intensidade igual, superior ou inferior às cores indicadas na Tabela das Reacções das Cores.
2. Indicar cada resultado de teste positivo fazendo um círculo à volta do número que aparece por baixo do compartimento apropriado no Bloco de Resultados (Figura 6).
3. Por último, realizar os testes de indol e VP. Se forem positivos, fazer um círculo em volta dos números apropriados na folha preparada. O teste de VP é obrigatório apenas se se utilizar a base de dados com VP.
4. Somar todos os algarismos assinalados com um círculo dentro da secção entre parênteses e introduzir a soma no espaço fornecido por baixo das setas (Figura 6).
5. Procurar o número de cinco algarismos no Guia de Interpretação (livro de códigos) e procurar a(s) melhor(es) resposta(s) na coluna intitulada “ID Value“. Certificar-se de que se vai utilizar a base de dados certa [(1) Não fermentadores negativos para a oxidase, (2) Enterobacteriaceae – método sem VP e (3) Enterobacteriaceae – método com VP. No exemplo ilustrado na Figura 6, obtém-se a identificação como Klebsiella pneumoniae.
Figura 4 Figura 5
(A)
(B)
Figura 6: Bloco de Resultados do BBL Enterotube II (A= base de dados com VP; B= base de dados sem VP)
Tabela 1: Aspecto de reacções negativas e positivas no BBL Enterotube II REACÇÕES
Reagentes Negativa Positiva
OBSERVAÇÕES COMPARTIMENTO 1 Glucose vermelho (a cor-de-laranja) amarelo (a dourado)
Glucose (GLU): Os produtos finais da fermentação bacteriana da glucose
são ácido ou ácido e gás. A mudança no pH devido à produção de ácido é indicada por uma alteração na cor do indicador no meio, de vermelho (alcalino) para amarelo (ácido). Qualquer grau de amarelo deve ser interpretado como uma reacção positiva; o cor-de-laranja deve ser considerado negativo. Produção de gás cera não levantada cera levantada
Produção de gás (GAS): É evidenciada pela separação definitiva e
completa da sobreposição de cera da superfície do meio de glucose, mas não por bolhas presentes no meio. Uma vez que a quantidade de gás produzido por diferentes bactérias varia, a quantidade de separação entre o meio e a sobreposição irá também variar com a estirpe que está a ser testada.
Tabela 1(cont.)
REACÇÕES
Reagentes Negativa Positiva
OBSERVAÇÕES COMPARTIMENTO 2
Lisina amarelo púrpura Lisina descarboxilase (LYS): A descarboxilação bacteriana da lisina,
que resulta na formação do produto final alcalino cadaverina, é indicada por uma alteração na cor do indicador no meio, de amarelo pálido (ácido) para púrpura (alcalino). O meio permanece amarelo se não se verificar a descarboxilação da lisina.
COMPARTIMENTO 3
Ornitina amarelo púrpura Ornitina descarboxilase (ORN): A descarboxilação da ornitina, que resulta na formação do produto final alcalino putrescina, é indicada por uma alteração na cor do indicador no meio, de amarelo pálido (ácido) para púrpura (alcalino). O meio permanece amarelo se não se verificar a descarboxilação da ornitina.
COMPARTIMENTO 4
H2S bege a
âmbar claro
preto Produção de ácido sulfídrico (H2S): O ácido sulfídrico é produzido por
bactérias capazes de reduzir os compostos com enxofre como, por exemplo, as peptonas e o tiossulfato de sódio presentes no meio. O ácido sulfídrico reage com os sais de ferro também presentes no meio para formar um precipitado negro de sulfureto de ferro normalmente ao longo da linha de inoculação. Algumas estirpes de Providencia podem produzir uma coloração castanha difusa neste meio a qual, no entanto, não deve ser confundida com a verdadeira produção de H2S indicada pela presença
da cor negra.
Nota: O precipitado negro pode esbater-se ou reverter para negativo se o BBL Enterotube II for lido ao fim de 24 h de incubação.
Formação de indol
incolor cor-de-rosa/vermel ho
Formação de indol (IND): A produção de indol a partir do metabolismo
do triptofano pela enzima bacteriana triptofanase é detectada pelo desenvolvimento de uma cor rosa a vermelha após a adição do reagente de indol de Kovacs, o qual é adicionado no compartimento ao fim de 18 a 24 h de incubação do tubo (consulte a secção Procedimento de teste) COMPARTIMENTOS 5,6,7,8 Adonitol, lactose, arabinose, sorbitol vermelho (a cor-de-laranja) amarelo (a dourado)
Adonitol (ADON), lactose (LAC), arabinose (ARAB), sorbitol (SORB):
A fermentação bacteriana de adonitol, lactose, arabinose e sorbitol, que resulta na formação de produtos finais ácidos, é indicada por uma alteração na cor do indicador presente no meio, de vermelho (alcalino) para amarelo (ácido). Qualquer sinal de amarelo deve ser interpretado como uma reacção positiva; o cor-de-laranja deve ser considerado negativo. COMPARTIMENTO 9 Voges-Proskauer incolor a âmbar claro
vermelho Voges-Proskauer (VP): O acetilmetilcarbinol (acetoína) é um produto
intermédio na produção de butileno glicol na fermentação da glucose. A produção de acetoína é detectada após a adição de reagentes VP depois da incubação (consulte a secção Procedimento de teste). A presença de acetoína é indicada pelo desenvolvimento de uma cor vermelha dentro de 5 a 20 minutos.
COMPARTIMENTO 10 Dulcitol verde amarelo (a
dourado)
Dulcitol (DUL): A fermentação bacteriana de dulcitol, que resulta na
formação de produtos finais ácidos, é indicada por uma alteração na cor do indicador presente no meio, de verde (alcalino) para amarelo ou amarelo pálido (ácido).
PA qualquer tonalidade de verde preto-cinzento fumado
Fenilalanina deaminase (PA): Este teste detecta a formação de ácido
pirúvico a partir da deaminação da fenilalanina. O ácido pirúvico formado reage com um sal de ferro presente no meio para produzir uma cor característica preto a cinzento fumado. Não é necessário adicionar cloreto de ferro pois o meio já contém um sal de ferro.
COMPARTIMENTO 11
Ureia bege a
âmbar claro
rosa claro a rosa
Ureia (UREA): A urease, uma enzima possuída por diversos
microrganismos, hidrolisa a ureia em amónia fazendo com que a cor do indicador no meio mude de amarelo (ácido) para vermelho-púrpura (alcalino). O teste de urease é fortemente positivo para as espécies de Proteus e pode ser evidente logo ao fim de 4 a 6 h após a incubação; é fracamente positivo (cor rosa claro) ao fim de 18 a 24 h de incubação para as espécies de Klebsiella e Enterobacter.
COMPARTIMENTO 12
Citrato verde azul Citrato (CIT): Este teste detecta os organismos que são capazes de utilizar o citrato, sob a forma do seu sal de sódio, como a única fonte de carbono. Os organismos capazes de utilizar o citrato produzem metabolitos alcalinos que mudam a cor do indicador, de verde (ácido) para azul-escuro (alcalino). Qualquer grau de azul deve ser considerado positivo.
NOTA: Certos microrganismos nem sempre produzirão a alteração de cor ideal positiva “forte”. As tonalidades mais claras da mesma cor básica também devem ser consideradas positivas.
CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO E LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO
O BBL Enterotube II foi especificamente concebido para identificar bastonetes gram-negativos que são negativos para a oxidase e só deve ser utilizado para diferenciar membros da família dasEnterobacteriaceae. Um número limitado de não fermentadores negativos para a oxidase também podem ser identificados com o sistema, mas para estes organismos recomenda-se a utilização do BBL
Oxi/Ferm Tube II.
Características do desempenho
O BBL Enterotube II foi avaliado em vários estudos externos. Os dados publicados indicam uma exactidão de identificação de 87 a 99%.12-14
Reprodutibilidade: Um total de dez organismos foram testados em duplicado durante três dias por três laboratórios independentes utilizando o BBL Enterotube II. Três (30%) dos organismos revelaram biocódigos idênticos com todos os replicados em cada laboratório testado. Cinco (50%) dos organismos revelaram ligeiras variações nos biocódigos mas produziram uma identificação idêntica dos organismos com cada replicado. Dois (20%) dos organismos revelaram ligeiras variações nos biocódigos com identificação idêntica com dois dos 18 replicados destes organismos a resultarem em biocódigos não identificáveis. Em todos os replicados,
a concordância de identificação foi de 98,9%.
Num estudo de 247 estirpes anteriormente identificadas (incluindo culturas ATCC conhecidas), estas foram analisadas utilizando o sistema de identificação BBL Enterotube II. Na inoculação inicial, nove organismos revelaram discrepâncias bioquímicas. Após a reinoculação, oito destas discrepâncias foram resolvidas. Em cinco casos, o resultado resolvido foi equivalente ao resultado inicial do método de referência. Em três casos, o resultado resolvido foi equivalente ao resultado inicial do BBL Enterotube II. Em um caso, o resultado resolvido foi diferente de qualquer dos resultados iniciais. O teste bioquímico discrepante foi resolvido mediante a utilização de um terceiro método que produziu um resultado semelhante ao do BBL Enterotube II.
As amostras do estudo estão resumidas na Tabela 2. É fornecida uma listagem dos géneros, espécies, número de estirpes testadas e da percentagem de organismos que produzem reacções bioquímicas positivas.
Limitações do procedimento
O BBL Enterotube II foi concebido para os grupos taxonómicos fornecidos. Outros grupos taxonómicos além dos que são referidos na Tabela 3 não se destinam a ser utilizados neste sistema.
Os biocódigos do BBL Enterotube II não podem ser utilizados para estabelecer a identidade fenotípica entre isolados provenientes de amostras iguais ou diferentes.
Os resultados bioquímicos obtidos com o BBL Enterotube II podem diferir de outros métodos e do material publicado.
São necessários testes serológicos para confirmação da Salmonella e da Shigella spp. Os isolados destes organismos devem ser enviados para os laboratórios de referência apropriados para se efectuar a serotipagem completa e a vigilância epidemiológica.
A identificação de bactérias gram-negativas deve ser efectuada tendo em consideração características adicionais como, por exemplo, a origem da amostra, a história do doente, a morfologia microscópica e das colónias, a serologia e os padrões de sensibilidade antimicrobiana.
A identificação de isolados raros deve ser repetida ou deverão realizar-se testes adicionais para verificar a identificação desses organismos.
Algumas estirpes de organismos podem exibir reacções bioquímicas atípicas devido a requisitos nutricionais invulgares ou a mutações, podendo ser difíceis de identificar.
Alguns organismos podem necessitar de um período superior a 24 h de incubação para uma identificação correcta.
Embora tenha sido recentemente proposta a inclusão da Plesiomonas shigelloides na família das Enterobacteriaceae, esta espécie não está incluída nas bases de dados do BBL Enterotube II.1,2 Em vez
disso, este organismo deve ser testado utilizando o sistema e a base de dados do BBL Oxi/Ferm Tube II.
Tabela 2: Resultados da avaliação do desempenho
Organismos
No. test
ad
o
GLU GÁS LYS ORN H2
S IND AD O LA C AR A SOR DU L PA UR E CIT ACINETOBACTER A. anitratus 1 0 0 0 0 0 0 0 0 100 0 0 0 0 0 A. Iwoffii* 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Burkholderia B. cepacia 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100 CEDECEA C, davisae 1 100 0 0 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100 C. lapagei* 1 100 0 0 0 0 0 0 100 0 0 0 0 0 100 CITROBACTER C: amalonaticus 1 100 100 0 100 0 100 0 0 100 100 0 0 100 100 C: freundii 4 100 100 0 0 100 0 0 50 100 100 0 0 50 50 ESCHERICHIA E: coli 83 100 92 100 78 0 99 0 88 99 100 1 0 0 0 GRUPOS ENTÉRICOS Grupo entérico 60* 2 100 100 0 100 0 0 0 0 100 0 0 0 0 0 ENTEROBACTER E. aerogenes 5 100 100 100 100 0 0 100 80 100 100 0 0 0 100 E. amnigenus bio 1 2 100 0 100 0 0 0 0 100 100 0 0 0 0 100 E. cloacae 10 100 100 10 90 0 0 10 100 100 100 20 0 10 80 EWINGELLA E: americana 1 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100 HAFNIA H. alvei* 3 100 100 100 100 0 0 0 0 100 0 0 0 0 0 KLEBSIELLA K. oxytoca* 8 100 0 100 0 0 100 100 100 100 100 38 0 100 100 K. ozaenae 4 100 100 100 0 0 100 100 100 100 100 50 0 50 100 K. pneumoniae 20 100 100 100 0 0 0 65 100 100 100 30 0 100 100 KLUYVERA K: ascorbata* 1 100 100 100 100 0 100 0 100 100 0 0 0 0 100 MORGANELLA M: morganii 2 100 100 0 100 0 100 0 0 0 0 0 100 100 50 PROTEUS P. mirabilis* 4 100 75 0 100 100 0 0 0 0 0 0 100 100 100 PROVIDENCIA P: rettgeri* 2 100 0 0 0 0 100 100 0 0 0 0 100 100 100 P: stuartii* 1 100 0 0 0 0 100 0 0 0 0 0 100 0 100 SALMONELLA Espécies de Salmonella 41 100 100 100 98 100 0 0 0 100 100 100 0 0 100
Salmonella (ariz) IIIa 5 100 100 100 100 100 0 0 0 100 100 0 0 0 80
SERRATIA S. liquefaciens 3 100 100 100 100 0 0 0 67 100 100 0 100 100 67 S. marcescens* 5 100 20 100 100 80 0 0 0 0 80 0 0 0 100 S. plymuthica 1 100 0 0 0 0 0 0 100 100 100 0 0 0 0 SHIGELLA Shigella srgps A,B,C 10 100 0 0 0 0 20 0 0 20 0 0 0 0 0 S. sonnei 17 100 0 0 100 0 0 0 0 100 0 0 0 0 0 YERSINIA Y. enterocolitica 1 100 0 0 0 0 0 0 0 100 100 0 0 100 0 Y. frederiksenii 2 100 100 0 100 0 100 0 100 100 100 0 0 0 0 Y. ruckeri 2 100 0 50 100 0 0 0 0 0 100 0 0 0 0
Tabela 3: Grupos taxonómicos de Enterobacteriaceae incluídos nas bases de dados do BBL Enterotube II
Buttiauxella agrestis Hafnia alvei Salmonella serotype Pullorum
Cedecea davisae Hafnia alvei biogroup 1 Salmonella (arizonae) IIIa
Cedecea lapagei Klebsiella pneumoniae Salmonella (diarizonae) IIIb
Cedecea neteri Klebsiella oxytoca Serratia marcescens
Cedecea species 3 Raoultella (Klebsiella) ornithinolytica
(group 47)
Serratia marcescens biogroup 1
Cedecea species 5 Klebsiella ozaenae Serratia liquefaciens
Citrobacter freundii Klebsiella rhinoscleromatis Serratia rubidaea
Citrobacter koseri (diversus) Kluyvera ascorbata Serratia odorifera biogroup 1
Citrobacter amalonaticus Kluyvera cryocrescens Serratia odorifera biogroup 2
Citrobacter farmeri Leclercia adecarboxylata Serratia plymuthica
Edwardsiella tarda Leminorella sp. Serratia ficaria
Edwardsiella tarda biogroup 1 Moellerella wisconsensis Serratia fonticola
Edwardsiella hoshinae Morganella morganii Shigella serogroups A, B, C
Edwardsiella ictaluri Morganella morganii biogroup 1 Shigella sonnei
Enterobacter aerogenes Obesumbacterium proteus biogroup 2 Tatumella ptyseos
Enterobacter asburiae Pantoea agglomerans (Enterobacter
agglomerans complex)
Yersinia enterocolitica
Enterobacter cloacae Proteus mirabilis Yersinia frederiksenii
Enterobacter gergoviae Proteus vulgaris Yersinia intermedia
Enterobacter sakazakii Proteus penneri Yersinia kristensenii
Enterobacter cancerogenus (taylorae) Proteus myxofaciens Yersinia pestis
Enterobacter amnigenus biogroup 1 Providencia rettgeri Yersinia pseudotuberculosis
Enterobacter amnigenus biogroup 2 Providencia stuartii Yersinia ruckeri
Escherichia coli Providencia alcalifaciens Yokenella regensburgeri
Escherichia coli (AD), inactive Providencia rustiganii Enteric group 58
Escherichia fergusonii Salmonella species Enteric group 59
Escherichia hermanii Salmonella serotype Typhi Enteric group 60
Escherichia vulneris Salmonella serotype Choleraesuis
Escherichia blattae Salmonella serotype Paratyphi A
Ewingella americana Salmonella serotype Gallinarum
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