Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas

LGN 5799 - SEMINÁRIOS EM

GENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS

Departamento de Genética

Avenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: 13400-970 - Piracicaba - São Paulo - Brasil

COMPARAÇÕES E NOVAS ABORDAGENS NO

DESENVOLVIMENTO DE MARCADORES MICROSSATÉLITES

Aluna: Milene Möller

Orientador: José Baldin Pinheiro Co-orientadora: Maria Imaculada Zucchi

Sumário

 Importância

 Aplicações

 Distribuição

 Funções

 Evolução

 Vantagens X Desvantagens

 Métodos desenvolvimento

 Comparação métodos

 Desenho primers

 Considerações finais

 Alta variação intra-alélica: multialélicos

SSR (65 alelos) X SNP (bialélicos)

 Falta de conhecimento da técnica

 Espécies não modelos

 Década 80 Perspectiva...

Crop Science 48: 606-616 (2008)

Mapeamento

Genético

Conservação

Estrutura

populações

Parentesco

Mapeamento

QTL´s

SAM

Aplicações dos Microssatélites

Microssatélites

Diversidade

Genética

 Genomas de procariotos e eucariotos

Escherichia coli Levedura Caenorhabditis elegans

Drosophila melanogaster

Arabidopsis thaliana

Seqüências de 1 a 6 nucleotídeos com repetições em tandem

AAAAAAAAAAAAAAAAA  (A)₁₇ Mono CTCTCTCTCTCTCTCT  (CT)₈ Di

CTACTACTACTACTA  (CTA)₅ Tri

Funções no genoma – Teorias...

1) DNA “lixo” e sua função é neutra

2) Possui função no genoma e sofre pressão de seleção

1) DNA “lixo” e sua função é neutra

• Abundantes em regiões não codantes do DNA

Normal 6 – 35 repetições Afetado 36 – 121 repetições Normal 6 –53 repetições Afetado 60 – 200 repetições Doença de Huntington´s (CAG) Região codante X Fragil (CGG)

Região não codante

2) Possui função no genoma e sofre pressão de seleção

Seleção negativa para outros motivos microssatéllites Motivos trinucleotídeos: regiões codantes

Arabidopsis

G _EST G _EST G _EST G _EST G _EST

Arroz Soja Milho Trigo

Q u a n ti d a d e /M p b

Tamanho genoma Cópias únicas

Morgante et al. 2002

 Regiões genômicas X expressas

EST imperfeito EST perfeito

G imperfeito G perfeito

Distribuição dos Microssatélites

Arabidopsis Arroz Soja Milho Trigo

Q u a n ti d a d e /M p b T a m a n h o g e n o m a h a p ló id e ( M p b )

Q u a n ti d a d e /M p b

% cópia simples de DNA

Arabidopsis

Arroz Soja

Milho Trigo

Freqüência observada SSR perfeito Freqüência estimada SSR perfeito Freqüência observada SSR imperfeito Freqüência estimada SSR imperfeito

...

Evolução dos Microssatélites

1) Inserção / Substituição

2) “Slippage”

 Banco de Dados de genes humanos  Inserções (186): 70% (130) inserções duplicações de bases adjacentes

4/5 repetições 2 repetições 3 repetições Inserções R e p e ti ç õ e s g e ra d a s (% ) Bases 29% 23% 3% 37% 16%16% 88% 4% Motivo da Repetição 55% 69% 92% Di Tri Tetra TGCATAA

TGCAcaTAA – 2 repetições

CGATGATT CGATGATgatT – 3 repetições ATCTCTCG ATCTCTCtcG – 4 repetições GACTCTAA GACTtgCTAA – sem SSR

1) Inserção / Substituição

 Substituições (9070)  26,2% (2377) SSR

Evolução dos Microssatélites

CTTA

G

ATC

CTTA

c

ATC – Sem SSR

1) Inserção / Substituição

ATGT

T

TA

A

TGTg

TA – 2 repetições

CGTGTG

A

C

C

GTGTGt

C – 3 repetições

R e p e ti ç õ e s g e ra d a s p o r in s e rç õ e s (% ) Bases Motivo da Repetição 4/5 repetições 2 repetições 3 repetições 1,7% 2,4% 18,5% 16,2% 23,4% 100% 100% 100% Di Tri Tetra

1) Inserção / Substituição

2) “Slippage”

Evolução dos Microssatélites

3) Crossing over desigual durante meiose

 Polimorfismo: diferença no número repetições

Polimorfismo dos marcadores SSR

NNNNNNNNNNNNNNCGCGCGCGNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNGCGCGCGCNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNCGCGCGCGCGCGCGNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNGCGCGCGCGCGCGCNNNNNNNNNNNNNN

X

Regiões conservadas

_PCR

 Distribuição no genoma

 Simples (PCR)

 Altamente variável - multialélico

 Marcador co-dominante

 Reprodutibilidade

 Transferibilidade

 Automatizados

 Desvantagens:

 Alto custo inicial

 Tempo

Digestão Clonagem vetor + inserto Hibridização Membrana nylon Seqüenciamento Extração plasmidial colônias + Transformação Transferência membrana

Método Tradicional

Figura adaptada Zane et al. 2002

DNA genômico

Seleção tamanho

Ligação adaptadores

Amplificação

RAPD

Gel agarose

Transferência membrana

Sonda SSR

Southern blot

Seqüenciamento

PCR Screening a

Método Baseado RAPD (2)

Seqüenciamento Amplificação RAPD Clonagem vetor + inserto Transformação Lunt et al. 1999

Figura adaptada Zane et al. 2002

DNA genômico PCR Screening M13F M13R a M13F b M13R SSR 1 2 3 4 a b a b a b a b M

Seleção tamanho

Biblioteca Primária Digestão

Transformação Clonagem

DNA contendo Uracila Primer específico com repetição Hibridização Membrana nylon Transferência membrana Seqüenciamento Biblioteca secundária enriquecida Ostrander et al. 1992

Figura adaptada Zane et al. 2002

Método Extensão Primer (1)

Crescimento colônias

Transformação

Seqüenciamento Primer biotinilado Screening PCR Seleção SSR Denaturação Região repetitiva Extensão primer biotinilado Transformação Biblioteca secundária enriquecida

Ligação adaptadores Sonicador DNA genômico

Método Hibridização Seletiva (1)

Denaturação DNA Biblioteca enriquecida Amplificação PCR Karagyozov et al. 1993

Figura adaptada Zane et al. 2002

Seq. direto Clonagem

Transformação

Sonda ligada a filtro

Hibridização Seletiva Amplificação PCR Southern blot PCR Screening

Ligação adaptadores Sonda biotinilada Hibridização Seletiva Amplificação Denaturação DNA Digestão

imã Estreptavidina Bead magnética

Seleção fragmentos SSR

Denaturação

Método Hibridização Seletiva (2)

Ligação adaptadores Sonda biotinilada Hibridização Seletiva Amplificação Denaturação DNA Digestão enriquecida Amplificação PCR Clonagem

Método Hibridização Seletiva (2)

Clonagem

Ligação adaptadores Sonda biotinilada Hibridização Seletiva Amplificação Denaturação DNA Digestão enriquecida Amplificação PCR Transformação Clonagem

Método Hibridização Seletiva (2)

Extração Plasmidial Transformação Crescimento Bactérias

Amp X-gal

IPTG

Seleção das colônias +

Ligação adaptadores Sonda biotinilada Hibridização Seletiva Amplificação Denaturação DNA Digestão enriquecida Amplificação PCR Transformação Clonagem Seqüenciamento Extração plasmidial

Diniz et al.2007 DNA genômico Digestão Ligação adaptadores Amplificação PCR Sonda biotinilada Clonagem vetor + inserto

Hibridização Seletiva: Duplo enriquecimento

Amplificação PCR Sonda biotinilada Amplificação PCR 10 – 25 ciclos Transformação Seqüenciamento Extração plasmidial

(Seleção rápida por AFLP de seqüências contendo repetições) DNA genômico Digestão MseI Ligação Adaptadores MseI Amplificação PCR MseI+N Sonda biotinilada Transformação Clonagem Amplificação PCR MseI+N Seqüenciamento Extração plasmidial

Seqüência

Busca

regiões SSR

Desenvolvimento marcadores EST-SSR

 Bancos de dados : regiões expressas do genoma (EST)

 Desvantagens:

• Menor polimorfismo

• Pequena quantidade seqüências

• Poucas seqüências microssatélites apropriadas

 Vantagens:

• Rápida • Fácil

• Econômica

• Busca de genes de interesse na sua população

Seleção

Desenho e

SUCEST: Cana-de-açúcar

~ 238.000 seqüências

43.141 clusters

2005 clusters com SSR

30 primers sintetizados

23 primers polimórficos

2 – 15 alelos

Média: 6 alelos/loco

Comparação métodos

Percentagem de clones positivos obtidos para cada método

Zane et al. 2002

Método

% clones +

Tradicional

0,04 - 12

Extensão primer

40 - 50

Hibridização seletiva

20 - 90

Protocolo Billote

~70

Duplo enriquecimento

70 - 100

FIASCO

_{70 - 100}

50 - 95

Colônias Seqüenciadas Colônias sem SSR Não apropriadas para desenho primers Seqüências duplicadas

% Seqüências

Sonda (GACA)₄ Sonda (GATA)₇

Enriquecimento simples

Enriquecimento duplo

Comparações da eficiência dos métodos utilizando

Desenho Primers

2) Condições para desenho do primer: Programa Primer3 • Tamanho produto amplificação: 150 – 250pb

• Tamanho do primer: min 18 – máx 22

• T pareamento primer: min 50ºC – máx 60ºC

• Diferença T pareamento entre primers F e R: 3ºC • Quantidade GC%: min 40 – máx 60

• Qualidade do seqüenciamento • Região repetitiva e primers

Detecções do polimorfismo

 Géis de poliacrilamida

• Colorações - AgNO

Primer M13 com fluorescência (FAM. HEX, ROX, TET)

Primer Foward com cauda M13 Primer Reverse

Fluorescência: primer com cauda M13

8 ciclos finais a 53º  favorecimento M13-fluorescência

• Redução no custo – fluorescência

Enriquecida Não enriquecida

Colônias seqüenciadas com sucesso

Locos SSR únicos

Seqüência apropriada para desenho de primers Marcadores informativos Seqüências duplicadas Ausência SSR -36% Seqüência curta Seqüência inapropriada -46% Ausência amplificação Múltiplas bandas Locos monomórficos -50% Powell et al.2003

-83%

 Identificação forense: 12 SSR

 Identificação de cultivares: 12 SSR

 Publicações estudos diversidade: 50 – 100 alelos

 Mapeamento:

Estudos populações:

Molecular Ecology Notes e Conservation Genetics

8 locos (10-20 indivíduos) – 2 populações

Tamanho genoma

Espécies Estudadas

Construção de Biblioteca de SSR

 Percevejo pequeno da soja (Piezodorus guildinii)  Percevejo marrom da soja (Euschistus heros)  Percevejo verde da soja (Nezara viridula)

 Ferrugem asiática (Phakopsora pachyrhizi)  Pinhão manso (Jatropha curcas)

 Manga (Magnifera indica)

 Mamona (Ricinus communis)  Alho (Allium sativum)

Alecrim (Rosmarinus officinalis)  Cidreira (Lippia alba)

 Gengibre (Zingiber officinalis)

 Quebra-pedra (Phyllanthus niruri)  Ginseng (Panax quinquefolium)  Guaco (Mikania glomerata)

 Inhame (Colocasia esculenta)  Bromélia (Encholirium sp)

Considerações Finais

 Escolha do método de desenvolvimento

 Genômico ou EST

 Método tradicional, alternativo, enriquecimento ou companhia privada  Freqüência de SSR no genoma

 Escolha das sondas

 Planejamento dos gastos e tempo • Desenvolvimento

• Seqüenciamento • Padronização

 Método tradicional

• baixo rendimento

• sp alta freqüência SSR • poucos marcadores

 Métodos extensão primer

• enriquecimento

• rendimento médio/alto • grande número etapas

 Métodos hibridização seletiva

• enriquecimento • rendimento médio/alto

 Companhias privadas

• Genetics Identification Services • University of Georgia • $10.000 até seqüenciamento

 FIASCO

 RAPD

Obrigada!